JP5624980B2 - 再生資源に由来するイソプレンの重合体 - Google Patents

再生資源に由来するイソプレンの重合体 Download PDF

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Description

本願は、２００８年６月３０日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／１３３，５２１の優先権を主張する。米国仮特許出願シリアル番号６１／１３３，５２１の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
イソプレン（２−メチル−ブタ−１，３−ジエン）は、多くの用途で用いられる非常に重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、多数の化学組成物及び重合体の合成での中間生成物または出発物質として用いられる。イソプレンはさらに、ヒトを含む多くの動植物により自然に合成される重要な生物材料である。イソプレンは室温で無色液体であり、また可燃性が高い。イソプレンの構造式は以下である。
Figure 0005624980
立体整理された重合が１９６０年代の初めに商業上可能になった頃から、イソプレンは、シス−１，４−ポリブタジエンの合成における利用で重要な単量体となった。このような立体整理された重合により作られたシス−１，４−ポリイソプレンは、天然ゴムに構造及び特性において類似している。たとえ天然ゴムと全く同一でなくとも、シス−１，４−ポリイソプレンは、多くの用途で天然ゴムの代わりとして用いることが出来る。例えば、合成シス−１，４−ポリイソプレン・ゴムは、タイヤ及び他のゴム製品の製造に広く用いられる。合成シス−１，４−ポリイソプレン・ゴムのこの需要により、世界市場における利用可能なイソプレンの大部分が消費される。残りのイソプレンは、他の合成ゴム、ブロック共重合体及び他の化学製品を構成する際に用いられる。例えば、イソプレンは、ブタジエン−イソプレン・ゴム、スチレン・イソプレン共重合体ゴム、スチレン−イソプレン−ブタジエン・ゴム、スチレン−イソプレン−スチレン・ブロック共重合体及びスチレン・イソプレンブロック共重合体の構成で用いられる。
この数年にわたって、イソプレンを生産するための多くの合成経路が調査されてきた。例えば、触媒が存在する状態でホルムアルデヒドを含むイソブチレンを反応させることによるイソプレンの合成は、米国特許番号３，１４６，２７８、米国特許番号３，４３７，７１１、米国特許番号３，６２１，０７２、米国特許番号３，６６２，０１６、米国特許番号３，９７２，９５５、米国特許番号４，０００，２０９、米国特許番号４，０１４，９５２、米国特許番号４，０６７，９２３及び米国特許番号４，５１１，７５１で記載される。米国特許番号３，５７４，７８０は、混合酸化物触媒を介したメチル−ｔｅｒｔ−ブチル・エーテルの混合物及び通気によるイソプレン生産の別の工程を開示する。次に、メチル−ｔｅｒｔ−ブチル・エーテルは触媒を介してイソブチレン及びメタノールに分割される。生産されたメタノールは、同一の触媒を介して次にイソブチレンと反応するホルムアルデヒドに酸化され、イソプレンを生産する。米国特許番号５，１７７，２９０は、イソプレンを含むジエンを生産する工程を開示する。この工程は、エーテルの最小限の再利用を伴うジエンの高収率の生産に十分な反応条件下で、二種類の機能的に異なる触媒を介して３級アルキル・エーテルの反応混合物及び酸素源を反応させることに関する。
工業的応用で用いられるイソプレンは通常、石油またはナフサの熱分解の副産物として生産されるか、または他の場合に、石油化学ストリームから抽出される。これは比較的費用のかかるエネルギー集約的な工程である。絶えず増加する石油化学系生産物の世界的な需要に伴い、イソプレンの費用が長期間において非常に高いレベルまで高くなり、またその安定供給がいずれにせよ限定されると期待される。言いかえれば、石油化学系供給源からのイソプレンの将来の供給が、予定されたニーズを満たすことが出来ない程不十分となり、その価格は前例がない値にまで上昇するという懸念がある。従って、低コストで、環境に配慮した再生可能資源からイソプレン源を得る必要性が現在ある。
培養中の所定の細胞が、細胞培養地内で利用可能な炭素の約０．００２パーセントより高く、イソプレンへ転換出来ることが分かった。これらの細胞は、（ｉ）イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードし、及び（ｉｉ）プロモーターと操作可能に連結される、異種核酸を有する。いくつかの場合において、これらの細胞は、炭素源、例えば、非限定的に、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、一炭素源、油、動物脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば微生物または植物性タンパク質、またはペプチド）、酵母抽出物、酵母抽出物からの成分、または上記の二個以上の任意の組み合わせ等を含む培養地内で培養される。次に、このような培養地で生産されたイソプレンは、回収され、合成ゴム及び他の有用な高分子材料に重合されることが出来る。
再生可能な、非石油化学系資源から作られる、このタイプのイソプレンを用いて合成される、合成ゴム及び他のイソプレン含有重合体について重要な需要があることが予想される。実際、法人顧客及び消費者は、石油化学の工程に由来したイソプレンで作られたものよりも、このような環境に配慮した供給源に由来するイソプレン含有重合体を購入することを好むと考えられている。顧客は、再生可能資源で作られるこのような環境に配慮した生産物のために特別料金を望んで払うとさらに考えられている。しかしながら、このようなイソプレン含有重合体が、実際に非石油化学系資源から作られていることを確認出来ることは重要である。本発明に係る合成イソプレン含有重合体は、非石油化学系資源に由来する点について確認可能である利点を提供する。さらに、それらは、自然源に由来するゴムと分析的に区別することが出来る。
本発明はより具体的に、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体を開示する。このタイプのポリイソプレンは、ポリイソプレン・ホモ重合体とすることが出来る。
本発明は、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、−３０‰〜−２８．５‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体をさらに明らかにする。このタイプのポリイソプレンはまた、ポリイソプレン・ホモ重合体とすることが出来る。
本発明はまた、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、ポリイソプレンにはタンパク質がなく、前記ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体を開示する。
本発明は、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレン重合体が９９．９％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有し、前記ポリイソプレン重合体が９９．９％未満のトランス−１，４−ミクロ構造の含有量を有し、前記ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体をさらに明らかにする。
本発明は、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレン重合体が２％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有し、前記ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体をさらに開示する。
本発明は、イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレン重合体が２％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有し、前記ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体をさらに明らかにする。
本発明はまた、イソプレン単量体及び少なくとも一の付加的な単量体に由来する反復単位から成る重合体であって、前記重合体がイソプレンに由来する反復単位のブロックを含み、前記反復単位のブロックが−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有する、前記重合体を開示する。
本発明は、イソプレン単量体及び少なくとも一の付加的な単量体に由来する反復単位から成る重合体であって、前記重合体がイソプレンに由来する反復単位のブロックを含み、前記イソプレンに由来する反復単位のブロックが−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記重合体をさらに明らかにする。
本発明はまた、イソプレン単量体に由来する反復単位から成る液体ポリイソプレン重合体であって、ポリイソプレン重合体が５，０００〜１００，０００の範囲内である重量平均分子量を有し、前記液体ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記液体ポリイソプレン重合体を開示する。
本発明はまた、イソプレン単量体に由来する反復単位から成る液体ポリイソプレン重合体であって、前記液体ポリイソプレン重合体が５，０００〜１００，０００の範囲内である重量平均分子量を有し、前記液体ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する、前記液体ポリイソプレン重合体を明らかにする。
本発明はまた、ポリイソプレン・ホモ重合体が持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する方法であって、（Ｉ）ポリイソプレン・ホモ重合体のδ１３Ｃ値を測定する工程、（ＩＩ）ポリイソプレン・ホモ重合体が−３４‰〜−３０‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する場合、または−２８．５‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する場合に、（１）そのシス−ミクロ構造の含有量、（２）その３，４−ミクロ構造の含有量、（３）その１，２−ミクロ構造の含有量、（４）その重量平均分子量、または（５）残留タンパク質、石鹸、脂質、樹脂剤または天然ゴムを示す糖質の存在または不在を測定するためにポリイソプレン・ホモ重合体をさらに分析する工程、及び（ＩＩＩ）ポリイソプレン・ホモ重合体が持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する工程であって、ポリイソプレン・ホモ重合体が（ｉ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値、（ｉｉ）−３０‰〜−２８．５‰の範囲内であるδ１３Ｃ値、または（ｉｉｉ）−３４‰〜−３０‰の範囲内であるδ１３Ｃ値または−２８．５‰〜−２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有するかどうか、及びポリイソプレン・ホモ重合体が、（ａ）１００％未満のシス−ミクロ構造の含有量を有するか、（ｂ）３，４−ミクロ構造を含むか、（ｃ）１，２−ミクロ構造を含むか、（ｄ）１００，０００未満の重量平均分子量を有するか、または（ｅ）残留タンパク質、石鹸、脂質、樹脂剤または天然ゴムを示す糖質がないかどうかを確認する、前記工程を含む前記方法を開示する。
本発明は、イソプレンに由来する反復単位を有する共重合体が持続可能で再生可能な非石油源に由来するイソプレンを含むことを確認する方法であって、（Ｉ）共重合体中の少なくとも一のポリイソプレン・ブロックのδ１３Ｃ値を測定する工程、及び（ＩＩ）共重合体中のイソプレンが持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する工程であって、前記ポリイソプレン・ブロックが（ｉ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値、または（ｉｉ）−３４‰〜−２８．５‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有することを確認する、前記工程を含む前記方法をさらに明らかにする。
図１は、大腸菌内での発現のためにコドン最適化されたクズ・イソプレン・シンターゼ（ｋｕｄｚｕ ｉｓｏｐｒｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）である。ａｔｇ開始コドンはイタリック体、終止コドンは太字、また追加されたＰｓｔＩ部位は下線で示した。 図２は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの遺伝子地図である。 図３は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２）である。ＲＢＳは下線、クズ・イソプレン・シンターゼ開始コドンは太字の大文字、また終止コドンは太字の大文字のイタリック体で示した。このベクター骨格は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂである。 図４は、ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕの遺伝子地図である。 図５は、ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号５）である。 図６は、ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕの遺伝子地図である。 図７は、ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号７）である。 図８Ａは、ベクターを持たない大腸菌ＢＬ２１細胞内でのイソプレンの生産を示すグラフである。 図８Ｂは、ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕを含む大腸菌ＢＬ２１細胞内でのイソプレンの生産を示すグラフである。 図８Ｃは、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを含む大腸菌ＢＬ２１細胞内でのイソプレンの生産を示すグラフである。 図８Ｄは、ｐＥＴＮ−ＨｉｓＫｕｄｚｕを含む大腸菌ＢＬ２１細胞内でのイソプレンの生産を示すグラフである。 図９Ａは、１４リットル流加回分発酵槽内での大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間にわたるＯＤを示すグラフである。 図９Ｂは、１４リットル流加回分発酵内での大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間にわたるイソプレン生産を示すグラフである。 図１０Ａは、パントエ・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）内でのイソプレンの生産を示すグラフである。コントロール細胞は、組み換えクズ・イソプレン・シンターゼのない細胞である。灰色のダイヤはイソプレン合成を表し、黒色の四角はＯＤ６００を表わす。 図１０Ｂは、ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕを発現するパントエ・シトレア内でのイソプレンの生産を示すグラフである。灰色のダイヤはイソプレン合成を表し、黒色の四角はＯＤ６００を表わす。 図１０Ｃは、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを発現するパントエ・シトレア内でのイソプレンの生産を示すグラフである。灰色のダイヤはイソプレン合成を表わし、黒色の四角はＯＤ６００を表わす。 図１１は、組み換えイソプレン・シンターゼを発現するバチルス・ズブチリス内でのイソプレンの生産を示すグラフである。ＢＧ３５９４ｃｏｍＫは、プラスミドのないＢ．ズブチリス株である（天然イソプレン生産）。ＣＦ４４３−ＢＧ３５９４ｃｏｍＫは、ｐＢＳＫｕｄｚｕを含むＢ．ズブチリス株である（組み換えイソプレン生産）。Ｙ軸上のＩＳはイソプレンを示す。 図１２は、ｐＢＳＫｕｄｚｕ＃２のヌクレオチド配列（配列番号５７）である。 図１３は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）内での発現のためにコドン最適化されたクズ・イソプレン・シンターゼのヌクレオチド配列（配列番号８）である。 図１４は、ヤロウィア内での発現のためにコドン最適化されたクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を含むｐＴｒｅｘ３ｇの遺伝子地図である。 図１５は、ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）のヌクレオチド配列（配列番号１１）である。 図１６は、ヤロウィア内での発現のためにコドン最適化された合成クズ（ピュエラリア・モンタナ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ））イソプレン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１２）である。 図１７は、合成ハイブリッド・ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレン・シンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１３）である。ＡＴＧ開始コドンは太字、また終止コドンは下線で示す。 図１８Ａは、ベクターｐＹＬＡ １、ｐＹＬ１及びｐＹＬ２の図式的概略構造を示す。 図１８Ｂは、ベクターｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）の図式的概略構造を示す。 図１８Ｃは、ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）の図式的概略構造を示す。 図１８Ｄは、ベクターｐＹＬＩ（ＫＺ１）の図式的概略構造を示す。 図１８Ｅは、ベクターｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）の図式的概略構造を示す。 図１８Ｆは、ベクターｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）の図式的概略構造を示す。 図１９は、イソプレンまでのＭＶＡ及びＤＸＰの代謝経路を示す（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ他、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、第４４巻、３５７−４２９ページ、２００５年に基づく）。以下の記載は、経路内の各ポリペプチドの代替名及び指定のポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示する参考文献（これらの参考文献の各々は、特に、ＭＶＡ及びＤＸＰ経路のポリペプチドのポリペプチド活性のアッセイに関して、参照により全体が本明細書に組み込まれる。）を含む。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ ２．３．１．９。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８４巻、２１１６−２１２２ページ、２００２年、ＨＭＧＳ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡシンターゼ、ＭｖａＳ、ＥＣ２．３．３．１０。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１８４巻、４０６５−４０７０ページ、２００２年、ＨＭＧＲ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素、ＭｖａＥ、ＥＣ１．１．１．３４。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１８４巻、２１１６−２１２２ページ、２００２年、ＭＶＫ、メバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ１２、ＥＣ２．７．１．３６。アッセイ：Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ、第１９巻、９−１４ページ、１９９１年、ＰＭＫ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ８、ＥＣ２．７．４．２。アッセイ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第１１巻、６２０−６３１ページ、１９９１年、ＤＰＭＤＣ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＭＶＤ１、ＥＣ４．１．１．３３。アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３３巻、１３３５５−１３３６２ページ、１９９４年、ＩＤＩ、イソペンテニル二リン酸デルタ・イソメラーゼ、ＩＤＩ１、ＥＣ５．３．３．２。アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６４巻、１９１６９−１９１７５ページ、１９８９年。ＤＸＰ経路：ＤＸＳ、１−デオキシキシルロース−５−リン酸塩シンターゼ、ｄｘｓ、ＥＣ２．２．１．７。アッセイ：ＰＮＡＳ、第９４巻、１２８５７−６２ページ、１９９７年、ＤＸＲ、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸塩レダクトイソメラーゼ、ｄｘｒ、ＥＣ２．２．１．７。アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２６９巻、４４４６−４４５７ページ、２００２年、ＭＣＴ、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール・シンターゼ、ＩｓｐＤ、ＥＣ２．７．７．６０。アッセイ：ＰＮＡＳ、第９７巻、６４５１−６４５６ページ、２０００年、ＣＭＫ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール・キナーゼ、ＩｓｐＥ、ＥＣ２．７．１．１４８。アッセイ：ＰＮＡＳ、第９７巻、１０６２−１０６７ページ、２０００年、ＭＣＳ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸塩シンターゼ、ＩｓｐＦ、ＥＣ４．６．１．１２。アッセイ：ＰＮＡＳ、第９６巻、１１７５８−１１７６３ページ、１９９９年、ＨＤＳ、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸塩シンターゼ、ｉｓｐＧ、ＥＣ１．１７．４．３。アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、第７０巻、９１６８−９１７４ページ、２００５年、ＨＤＲ、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸塩還元酵素、ＩｓｐＨ、ＥＣ１．１７．１．２。アッセイ：ＪＡＣ、第１２６巻、１２８４７−１２８５５ページ、２００４年。 図２０は、クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子のない（左）、またはそのシンターゼ遺伝子を含む（右）、組み換えＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株によるイソプレン生産のＧＣ−ＭＳ分析の結果を表わすグラフを示す。矢印は、真正イソプレン基準の溶出時間を示す。 図２１は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎの遺伝子地図である。 図２２は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。 図２３Ａは、ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕｋａｎ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は、誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｂは、ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ｋａｎ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｃは、ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ ｋａｎ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｄは、ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ ｋａｎ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｅは、ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｆは、ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｇは、ＢＬ２１／ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間である。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。ダイヤはＯＤ６００、円は合計イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２３Ｈは、ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳｋａｎ内でのグルコースからのイソプレンの生産を示すグラフである。矢印は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘発の時間を示す。ｘ軸は誘発後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース）または比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。黒色のダイヤはＯＤ６００、黒色の三角はイソプレン生産性（μｇ／Ｌ）、また白色の四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表わす。 図２４は、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎの遺伝子地図である。 図２５は、ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号３３）である。 図２６は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙの遺伝子地図である。 図２７は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号４６）である。 図２８は、下流ＭＶＡ経路及びｎｐｒＥ遺伝子座でのＢ．ズブチリス染色体への統合のための酵母ｉｄｉを含むカセットの遺伝子地図を示す。ｎｐｒＥ上流／下流は、統合のためのｎｐｒＥ遺伝子座から各１ｋｂの配列を示す。ａｐｒＥプロモーター（アルカリ性セリン・プロテアーゼ・プロモーター）は、ａｐｒＥ遺伝子のプロモーター（−３５、−１０、＋１の転写開始部位、ＲＢＳ）を示す。ＭＶＫ１は、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＰＭＫは、開始部位の上流にあるバチルスＲＢＳを含む酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＭＰＤは、開始部位の上流にあるバチルスＲＢＳを含む酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＩＤＩは、開始部位の上流にあるバチルスＲＢＳを含む酵母ｉｄｉ遺伝子を示す。ターミネーターは、Ｂ．アミロリケファシエンスに由来するアルカリ性セリン・プロテアーゼ転写ターミネーターを示す。ＳｐｅｃＲは、スペクチノマイシン耐性マーカーを示す。「ａｍｐのｎｐｒＥ上流反復」は、増幅に用いられる上流領域の繰り返し配列を示す。 図２９は、下流ＭＶＡ経路及びｎｐｒＥ遺伝子座でのＢ．ズブチリス染色体への統合のための酵母ｉｄｉを含むカセットのヌクレオチド配列である（配列番号４７）。 図３０は、ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒの遺伝子地図である。 図３１は、ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのヌクレオチド配列である（配列番号４８）。 図３２は、ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒの遺伝子地図である。 図３３は、ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのヌクレオチド配列である（配列番号４９）。 図３４は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎの遺伝子地図である。 図３５は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎのヌクレオチド配列である（配列番号５０）。 図３６は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎの遺伝子地図である。 図３７は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ Ｋａｎのヌクレオチド配列である（配列番号５１）。 図３８は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕの遺伝子地図である。 図３９は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列である（配列番号５２）。 図４０は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３の遺伝子地図である。 図４１は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ Ａ３のヌクレオチド配列である（配列番号５３）。 図４２は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩの遺伝子地図である。 図４３は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩのヌクレオチド配列である（配列番号５４）。 図４４は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳの遺伝子地図である。 図４５は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ（配列番号５５）のヌクレオチド配列である。 図４６は、バイオマス原料からのイソプレン生産を表わすグラフを示す。パネルＡは、トウモロコシ茎葉からのイソプレン生産を示す。パネルＢは、バガスからのイソプレン生産を示す。パネルＣは、針葉樹パルプからのイソプレン生産を示す。パネルＤは、グルコースからのイソプレン生産を示す。また、パネルＥは、追加の供給材料がない細胞からのイソプレン生産を示す。灰色の四角は、植菌後の指定の時間における培養のＯＤ６００測定値を表わす。黒い三角は、植菌後の指定の時間におけるイソプレン生産を表わす。 図４７Ａは、グルコースが添加されていない培養中のＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）によるイソプレン生産を表わすグラフを示す。四角はＯＤ６００を表わす。また、三角は、生産されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表わす。 図４７Ｂは、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％グルコース供給材料転化糖からのイソプレン生産を表わすグラフを示す。四角はＯＤ６００を表わす。また、三角は、生産されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表わす。 図４７Ｃは、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％転化糖供給材料からのイソプレン生産を表わすグラフを示す。四角はＯＤ６００を表わす。また、三角は、生産されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表わす。 図４７Ｄは、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％ＡＦＥＸトウモロコシ茎葉供給材料からのイソプレン生産を表わすグラフを示す。四角はＯＤ６００を表わす。また、三角は、生産されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表わす。 図４８は、イソプレン生産の酵母抽出物の影響を説明するグラフを示す。パネルＡは、異なる量の酵母抽出物が供給された発酵槽内の光学密度のタイムコースを示す。パネルＢは、異なる量の酵母抽出物が供給された発酵槽内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。パネルＣは、流加回分培養内で増殖された大腸菌におけるイソプレン生産に対する酵母抽出物の影響を示す。 図４９は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含む大腸菌細胞を加えた５００Ｌバイオリアクターからのイソプレン生産を説明するグラフを示す。パネルＡは、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを示す。パネルＢは、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。パネルＣは、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクターから生産された総イソプレン量のタイムコースを示す。 図５０は、ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２の遺伝子地図である。 図５１は、ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のヌクレオチド配列である（配列番号５６）。 図５２は、ｐＢＳＫｕｄｚｕ＃２の遺伝子地図である。 図５３Ａは、１４リットル流加回分発酵槽内の組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現するバチルスの発酵時間中の増殖を示すグラフである。黒色のダイヤは、組み換えイソプレン・シンターゼを含まないコントロール株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）を表わす（天然イソプレン生産）。また、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを含むバチルスを表わす（組み換えイソプレン生産）。 図５３Ｂは、１４リットル流加回分発酵槽内の組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現するバチルスの発酵時間中のイソプレン生産を示すグラフである。黒色のダイヤは、組み換えイソプレン・シンターゼを含まないコントロール株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）を表わす（天然イソプレン生産）。また、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを含むバチルスを表わす（組み換えイソプレン生産）。 図５４は、プラスミドｐＥＴ２４ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳの遺伝子地図である。 図５５Ａ及び５５Ｂは、プラスミドｐＥＴ２４ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳのヌクレオチド配列である（配列番号８７）。 図５６は、プラスミドＥＷＬ２３０を構成するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いる制限部位及びＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部位間の互換性のある粘着末端を示す概略図である。 図５７は、プラスミドＥＷＬ２３０の遺伝子地図である。 図５８Ａ及び５８Ｂは、プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列である（配列番号８８）。 図５９は、プラスミドＥＷＬ２４４を構成するためのエンドヌクレアーゼ消化に用いる制限部位及びＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位間の互換性のある粘着末端を示す概略図である。 図６０は、ＥＷＬ２４４の遺伝子地図である。 図６１Ａ及び６１Ｂは、プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列である（配列番号８９）。 図６２は、プラスミドＭＣＭ４８４−４８７の遺伝子地図である。 図６３Ａ−６３Ｃは、プラスミドＭＣＭ４８４のヌクレオチド配列である（配列番号９０）。 図６４Ａ−６４Ｃは、プラスミドＭＣＭ４８５のヌクレオチド配列である（配列番号９１）。 図６５Ａ−６５Ｃは、プラスミドＭＣＭ４８６のヌクレオチド配列である（配列番号９２）。 図６６Ａ−６６Ｃは、プラスミドＭＣＭ４８７のヌクレオチド配列である（配列番号９３）。 図６７Ａ−６７Ｄは、ＭＶＡ経路に由来する遺伝子を発現し、酵母抽出物の供給のない１５Ｌスケールでの流加回分培養槽内で増殖された、大腸菌株（ＥＷＬ２５６）によるイソプレン生産のグラフである。 図６７Ａは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを示す。 図６７Ｂは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。 図６７Ｃは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクターから生産された総イソプレン量のタイムコースを示す。 図６７Ｄは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の、全二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、または代謝活性プロファイルを示す。 図６８Ａ−６８Ｅは、ＭＶＡ経路からの遺伝子を発現し、酵母抽出物の供給を伴う１５Ｌスケールでの流加回分培養槽内で増殖された、大腸菌株（ＥＷＬ２５６）によるイソプレン生産のグラフである。 図６８Ａは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを示す。 図６８Ｂは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。 図６８Ｃは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクターから生産された総イソプレン量のタイムコースを示す。 図６８Ｄは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の容積測定生産性を示す。１．１ｇ／Ｌ／ｈｒの平均値は、酵母抽出物の供給を含めて４０時間（２３−６３時間）維持された。 図６８Ｅは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）、または代謝活性プロファイルを示す。 図６９Ａ−６９Ｄは、ＭＶＡ（経路）を介する異なる炭素源からのイソプレンの生産を示す。 図６９Ａは、唯一の炭素源としてのグルコース、バイオマス加水分解産物、グリセロールまたは酢酸のいずれかの上で、ＭＶＡ経路及びイソプレン・シンターゼの両方を含む、大腸菌ＥＷＬ２５６の増殖を示す。異なる炭素源を培養地中で１％濃度となるように添加した。炭素源が加えられていないネガティブ・コントロールを含めた。増殖を、６００ｎＭでの光学密度で測定した。 図６９Ｂは、唯一の炭素源としてのグルコース、バイオマス加水分解産物、グリセロールまたは酢酸のいずれかの上で増殖される場合の、ＭＶＡ経路及びイソプレン・シンターゼの両方を含む大腸菌ＥＷＬ２５６からのイソプレンの比生産性を示す。異なる炭素源を培養地中で１％濃度となるように添加した。炭素源が加えられていないネガティブ・コントロールを含めた。サンプルを、植菌の１９０分間、２５５分間及び３１７分間後に採取し、細菌により生産されたイソプレンをＧＣ−ＭＳを用いて測定した。 図６９Ｃは、唯一の炭素源としてのグルコースまたはキシロースのいずれかの上で大腸菌ＥＷＬ２５６の増殖を示す。異なる炭素源を培養地中で１％濃度となるように添加した。炭素源が加えられていないネガティブ・コントロールを含めた。増殖を、６００ｎＭでの光学密度で測定した。 図６９Ｄは、唯一の炭素源としてのグルコースまたはキシロースのいずれかの上で増殖される場合の、大腸菌ＥＷＬ２５６からのイソプレンの比生産性を示す。炭素源を培養地中で１％濃度となるように添加した。炭素源が加えられていないネガティブ・コントロールを含めた。サンプルを、植菌の２６０分間、３２２分間及び３８３分間後に採取し、細菌により生産されたイソプレンをＧＣ−ＭＳを用いて測定した。 図７０Ａ及び７０Ｂは、グルコース及び脂肪酸からの大腸菌株によるイソプレンの生産をそれぞれ示す。 図７０Ａについて、ｐＭＣＭ１１８、すなわち、下流メバロン酸経路を持つプラスミドを含むＷＷ４の形質転換体から１１のコロニーを選び、下流経路の存在を確認した。コロニーからの細胞を、０．１％酵母抽出物及び２％グルコースを含むＴＭ３培地内で培養した。誘導された培養の分割量を、４時間の誘発後のイソプレン生産について分析した。コロニーは全て、イソプレンの生産を示した。５０〜９００μＭ濃度の誘導因子を与えることで、細胞密度が３〜４．６倍減少したことから明らかなように、誘導因子ＩＰＴＧには強い増殖抑制効果があった（データには示されず）。前記グラフは、より高値の誘発が、イソプレンのより高い特異的力価をもたらすことを示す。 図７０Ｂについて、生産培養菌を、洗浄された一晩の培養から１〜１０の希釈度で植菌した。培養菌を数時間増殖し、５０μＭ ＩＰＴＧで誘導した。左の棒は、４時間の誘導後に続く、１時間のイソプレン累積アッセイによるイソプレン・アッセイの結果を示す。中央の棒は、同一の培養と同一の誘導期であるが、１２時間のイソプレン累積アッセイにより分析された１時間の正規化数を示す。右の棒は、１３時間誘導された培養の１時間のイソプレン累積アッセイによる値を示す。 図７１は、Ｋｕｄｚｕ．Ｔｓｒ、チオストレプトン耐性遺伝子に由来するイソプレン・シンターゼのクローンニングに用いる、大腸菌ストレプトミセス・シャトルベクターｐＵＷＬ２０１ＰＷ（６４００ｂｐ）の遺伝子地図である。図は、Ｄｏｕｍｉｔｈ他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２６４巻、４７７−４８５ページ、２０００年から引用した。 図７２は、ストレプトミセス・アルブス（ａｌｂｕｓ）野生型株（「ｗｔ」）及びプラスミドｐＵＷＬ２０１ＰＷ（ネガティブ・コントロール）または（クズに由来するイソプレン・シンターゼをコードする）ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを内部に持つ株によるイソプレン生成を示す。 図７３Ａは、Ｍ．マゼイ・アーチャエアル（ｍａｚｅｉ ａｒｃｈａｅａｌ）下流経路オペロンの遺伝子地図である。 図７３Ｂ及び７３Ｃは、Ｍ．マゼイ・アーチャエアル下流経路オペロンのヌクレオチド配列である（配列番号１１３）。 図７４Ａは、Ｍ．マゼイ・アーチャエアル・ローワーイン（Ｌｏｗｅｒｉｎ）ｐＥＴ２００Ｄに由来するＭＣＭ３７６−ＭＶＫの遺伝子地図である。 図７４Ｂ及び７４Ｃは、Ｍ．マゼイ・アーチャエアル・ローワーインｐＥＴ２００Ｄに由来するＭＣＭ３７６−ＭＶＫのヌクレオチド配列である（配列番号１１４）。 図７５Ａ−７５Ｄは、ＲＭ１１６０８−２と比べた、ＥＷＬ２５６のイソプレン生産の増殖及び比生産性を示す。白色のダイヤは増殖（ＯＤ５５０）を表す。塗りつぶされた棒はイソプレンの比生産性を表わす。ｘ軸は、２００μＭ ＩＰＴＧ（図７５Ａ及び７５Ｂ）または４００μＭ ＩＰＴＧ（図７５Ｃ及び７５Ｄ）のいずれかで誘導後の時間（時間）である。Ｙ−１軸は、イソプレンの生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ／時間）である。また、Ｙ−２軸は、波長５５０での光学密度の任意の単位である。培養の実際のＯＤを得るためにＯＤ５５０のこれらの値に６．６６を掛ける必要がある。 図７６は、プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌの遺伝子地図である。 図７７Ａ及び７７Ｂは、プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ（配列番号１２２）のヌクレオチド配列である。 図７８Ａ−７８Ｆは、Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ、Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼ及びｐｇｌ（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールでの流加回分培養槽内で増殖された大腸菌株によるイソプレン生産のグラフである。 図７８Ａは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを示す。 図７８Ｂは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。イソプレンを計算する方法：５９時間生産された累積イソプレン、ｇ／５９時間後の発酵槽容量、Ｌ［＝］ｇ／Ｌ培養液。 図７８Ｃはまた、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。イソプレンを計算する方法：∫（瞬間イソプレン生産速度（ｇ／Ｌ／時間））ｄｔ ｔ＝０〜５９時間［＝］ｇ／Ｌ培養液。 図７８Ｄは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内で生産された合計イソプレンのタイムコースを示す。 図７８Ｅは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の容積測定生産性を示す。 図７８Ｆは、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の、二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）、または代謝活性プロファイルを示す。 図７９Ａは、プラスミドｐＪ２０１：１９８１３の遺伝子地図である。 図７９Ｂ及び７９Ｃは、ｐＪ２０１：１９８１３（配列番号１２３）のヌクレオチド配列である。 図８０は、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを示す。 図８１は、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを示す。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。 図８２は、グルコースが供給された１５Ｌバイオリアクターから生産された総イソプレン量のタイムコースを示す。 図８３は、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクター内の光学密度のタイムコースを図示するグラフである。 図８４は、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価のタイムコースを図示するグラフである。発酵培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの量として、前記力価を定義する。 図８５は、グルコース及び酵母抽出物が供給された５００Ｌバイオリアクターから生産された総イソプレン量のタイムコースを図示するグラフである。
発明の詳細な説明
イソプレンを生産する細胞の培養内でイソプレンを生産するための技術は、２００７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，５７４及び２００７年１２月１３日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，３８６、及び米国特許出願シリアル番号１２／３３５，０７１内で記載される。米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，５７４、米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，３８６及び米国特許出願シリアル番号１２／３３５，０７１の内容は、このような工程によるイソプレンの生産及び回収の技術の開示の目的で参考文献により本明細書に組み込まれる。とにかく、米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，５７４及び米国仮特許出願シリアル番号６１／０１３，３８６及び米国特許出願シリアル番号１２／３３５，０７１は、細胞培養内で増加量のイソプレンを生産するための組成物及びその方法を開示する。これらの組成物及び方法は特に、イソプレン生産の速度を増加させ、生産されるイソプレンの総量を増加させる。例えば、４．８×１０４ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間のイソプレンを生じる細胞培養システムが生産されている（表１）。これらのシステムの効率は、細胞培養培地からイソプレンへ細胞が消費する炭素の〜２３．６モル％収率（１０．７重量％収率）の転換（％炭素収率）により実証される。実施例及び表２で示すように、培養液のリットル当たり、およそ６０．５ｇのイソプレンが生産された。イソプレンは、１．８８×１０５ｎｍｏｌ／ＯＤ／時間（１．８８×１０５ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間）のピーク比速度で生産された。望まれる場合、さらに多く量のイソプレンが本明細書に記載の条件等の他の条件を用いて得ることが出来る。いくつかの実施態様において、再生可能な炭素源がイソプレンの生産に用いられる。本発明の組成物及び方法は細胞当たりの高イソプレン収率、高炭素収率、高イソプレン純度、高生産性、低エネルギー使用量、低生産費用及び投資、及び最小限の副反応を可能にすることから、本発明の組成物及び方法は望ましい。イソプレン生産のための、この効率的かつ大規模な生合成方法は、合成イソプレン系ゴムのためのイソプレン供給源を提供し、天然ゴムの使用の、望ましく廉価な代替案を提供する。
下記でさらに説明するように、細胞により生産されたイソプレンの量は、細胞にイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド（例えば、植物イソプレン・シンターゼ・ポリペプチド）をコードする異種核酸を導入することにより、大幅に増加されることが出来る。イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに転換する。実施例で示すように、異種のピュエラリア・モンタナ（クズ）またはウラジロハコヤナギ（ポプラ）イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドは、大腸菌、パントエ・シトレア、バチルス・ズブチリス、ヤロウィア・リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びトリコデルマ・リーセイのような様々な宿主細胞内で発現された。実施例でさらに示すように、異種のメタノサルシーナ・マゼイ（Ｍ．マゼイ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）が、大腸菌のような宿主細胞内で発現され、イソプレン生産を増加させた。これらの細胞の全ては、異種イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドを持たない対応する細胞よりも、多くのイソプレンを生産した。表１及び２で説明するように、多量のイソプレンが、本明細書に記載の前記方法を用いて生産される。例えば、異種イソプレン・シンターゼ核酸を含むＢ．ズブチリス細胞は、異種核酸（表２）を持たない対応するコントロールＢ．ズブチリス細胞よりも、ほぼ１０倍多くのイソプレンを１４Ｌ発酵槽内で生産した。発酵槽内での大腸菌による培養液のリットル当たり６０．５ｇのイソプレンの生産（ｍｇ／Ｌ、ここで培養液の容量は、細胞培地の容量及び細胞の容量の両方を含む）及びＢ．ズブチリスによる３０ｍｇ／Ｌのイソプレンの生産は、多量のイソプレンを生産出来ることを示す（表２）。望まれる場合、イソプレンはさらに大規模なスケールで生産されることが出来る。または、本明細書に記載の他の条件がイソプレンの量をさらに増加させるために用られることが出来る。表１及び２で列記されたベクター及び実験条件は、下記及び実施例でさらに詳細に記載される。
表１：細胞培養及び本発明の方法を用いた振盪フラスコからのイソプレンの例示的な収率
イソプレン生産を測定するためのアッセイを実施例Ｉ、パートＩＩで記載する。このアッセイについて、サンプルを一以上の時点で振盪フラスコから採取し、３０分間培養した。次に、このサンプル内で生産されたイソプレンの量を測定した。イソプレン生産のヘッドスペース濃度及び比速度を表１で列記し、本明細書でさらに説明する。
Figure 0005624980
 ＊１ｍＬの１ ＯＤ６００で標準化した、１：１９のヘッドスペース容量比で液体を含む密封したヘッドスペース・バイアルで１時間培養した。
表２：細胞培養及び本発明の方法を用いた発酵槽内でのイソプレンの例示的な収率
イソプレン生産を測定するためのアッセイを、実施例Ｉ、パートＩＩで記載する。このアッセイについて、発酵槽のオフガスのサンプルを採取し、イソプレンの量を分析した。イソプレン生産のピーク・ヘッドスペース濃度（発酵中の最も高いヘッドスペース濃度）、力価（培養液のリットル当たりで生産されたイソプレンの累積総量）及びピーク比速度（発酵中の最も高い比速度）を、表２で列記し、本明細書でさらに説明する。
Figure 0005624980
 ＊＊１ｖｖｍ（１容量のオフガス／１Ｌ培養液／分）のオフガス流量で標準化した。
加えて、異種イソプレン・シンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレン生産は、細胞により発現される１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド及び／またはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドの量を増加させることにより増進することが出来る。例えば、ＤＸＳ核酸及び／またはＩＤＩ核酸が細胞に導入されることが出来る。ＤＸＳ核酸は、異種核酸または内因性の核酸の複製コピーとすることが出来る。同様に、ＩＤＩ核酸は、異種核酸または内因性の核酸の複製コピーとすることが出来る。いくつかの実施態様において、ＤＸＳ及び／またはＩＤＩポリペプチドの量は、内因性のＤＸＳ及び／またはＩＤＩプロモーターまたは制御領域を、ＤＸＳ及び／またはＩＤＩ核酸のより多い転写をもたらす他のプロモーター及び／または制御領域に置き換えることにより増加される。いくつかの実施態様において、細胞は、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチド（例えば、植物イソプレン・シンターゼ核酸）をコードする異種核酸、及びイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする内因性の核酸の複製コピーの両方を含む。
コードされたＤＸＳ及びＩＤＩポリペプチドは、イソプレンの生合成のためのＤＸＰ経路の一部である（図１９Ａ）。ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸塩及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸へ転換する。任意特定の理論に縛られることを意図しないが、ＤＸＳポリペプチドの量の増加は、ＤＸＰ経路を通る炭素の流れを増加させ、より多いイソプレン生産をもたらすと考えられている。ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）の相互転換を触媒する。任意特定の理論に縛られることを意図しないが、細胞内のＩＤＩポリペプチドの量の増加は、ＤＭＡＰＰに転換されるＩＰＰの量を増加させると考えられている。（ＤＭＡＰＰは次にイソプレンに転換される。）
例えば、クズ・イソプレン・シンターゼ、Ｓ．セレビシアＩＤＩ及び大腸菌ＤＸＳ核酸を含む大腸菌細胞の発酵が、イソプレンの生産に用いられる。イソプレンの量は、１５時間の経過の間、５０〜３００μｇ／Ｌで変化する（実施例７、パートＶＩＩ）。別の例として、Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼ、上流ＭＶＡ経路及び統合された下流ＭＶＡ経路を含む大腸菌の発酵は、イソプレンの生産に用いられる。イソプレンの量は、６７時間の経過の間、３２〜３５．６ｇ／Ｌで変化する（実施例１０、パートＩＩＩ）。
さらに別の例で、Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼ、ｐｇｌ過剰発現（ＲＨＭ１１１６０８−２）、上流ＭＶＡ経路及び統合された下流ＭＶＡ経路を含む大腸菌の発酵は、、イソプレンの生産に用いられる。イソプレンの量は、４０時間の経過の間、３３．２ｇ／Ｌ〜４０．０ｇ／Ｌまたは５９時間の経過の間、４８．６ｇ／Ｌ〜６０．５ｇ／Ｌで変化する（実施例１３、パート（ｉｉ））。
いくつかの実施態様において、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＳ核酸の存在は、１または２のみのこれらの異種または追加の内因性の核酸を含む対応する細胞と比べ、細胞をより繁殖して増殖させるか、またはより長く生存出来るようにさせる。例えば、異種イソプレン・シンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＳ核酸を含む細胞は、単に異種イソプレン・シンターゼ及びＤＸＳ核酸のみを含む細胞、または異種イソプレン・シンターゼ核酸のみを含む細胞より多く増殖した。また、異種イソプレン・シンターゼ、ＩＤＩ及びＤＸＳ核酸は、大腸菌細胞により維持された高コピー・プラスミド上の強いプロモーターとうまく操作可能に連結された。これは、多量のこれらのポリペプチドが、細胞に対する過量の毒性を引き起こすことなく、細胞で発現されたことを示唆する。特定の理論に縛られることを意図しないが、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ及びＩＤＩ核酸の存在は、異種または追加の内因性ＤＸＳ核酸のみが細胞内に存在する場合では蓄積する潜在的に毒性な一以上の中間生成物の量を減らすことが出来ると考えられている。
いくつかの実施態様において、異種イソプレン・シンターゼ核酸を含む細胞によるイソプレンの生産は、細胞により発現されるＭＶＡポリペプチドの量を増加させることにより増大される（図１９Ａ及び１９Ｂ）。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドは、以下のポリペプチドのうちのいずれかを含む：アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニル・リン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及び二以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）。例えば、一以上のＭＶＡ経路核酸が、細胞に導入されることが出来る。いくつかの実施態様において、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素核酸を含む、上流ＭＶＡ経路を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及びＩＤＩ核酸を含む、下流ＭＶＡ経路を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及びＩＤＩ核酸を含む、ＭＶＡ経路全体を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＭＶＫ、ＰＭＤＣ、ＩＰＫ及びＩＤＩ核酸を含む、ＭＶＡ経路全体を含む。ＭＶＡ経路核酸は、異種の核酸または内因性の核酸の複製コピーとすることが出来る。いくつかの実施態様において、一以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの量は、ＭＶＡ経路核酸のための内在性プロモーターまたは制御領域を、ＭＶＡ経路核酸のより多い転写をもたらす他のプロモーター及び／または制御領域に置き換えることにより増加される。いくつかの実施態様において、細胞は、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸（例えば、植物イソプレン・シンターゼ核酸）、及びイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする内因性の核酸の複製コピーの両方を含む。
例えば、クズ・イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする核酸、及びサッカロミセス・セレビシアＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及びＩＤＩポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞は、６．６７×１０４ｎｍｏｌ／Ｌ培養液／ＯＤ６００／時間の速度でイソプレンを生産した（実施例８を参照されたい）。加えて、エンテロコッカス・フェカーリスＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞の１４リットルの発酵は、２２グラムのメバロン酸（ＭＶＡ経路の中間生成物）を生産した。これらの細胞の振盪フラスコは、リットル当たり２−４グラムのメバロン酸を生産した。これらの結果は、異種ＭＶＡ経路核酸が大腸菌内で活性があることを示す。クズ・イソプレン・シンターゼと同様に上流ＭＶＡ経路及び下流ＭＶＡ経路の両方の核酸を含む大腸菌細胞（ＭＣＭ１２７株）は、下流ＭＶＡ経路及びクズ・イソプレン・シンターゼのみの核酸を含む大腸菌細胞（ＭＣＭ１３１株）と比べ、有意により多くのイソプレン（８７４μｇ／Ｌ培養液／時間／ＯＤ）を生産した（表３を参照されたい）。イソプレン・シンターゼ・ポリペプチド及びＭ．マゼイＭＶＫポリペプチドをコードする核酸は、酵母抽出物の供給がない状態で６７時間の発酵の間、（９．５４×１０４ｎｍｏｌ／Ｌ培養液／ＯＤ６００／時間のピーク比速度（すなわち、９．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ培養液／ＯＤ６００／時間）で）３２０．６ｇのイソプレン、または酵母抽出物の供給がある状態で６８時間の発酵の間、（８．６６×１０４ｎｍｏｌ／Ｌ培養液／ＯＤ６００／時間のピーク比速度で）３９５．５ｇのイソプレンを生産した（実施例１０を参照されたい）。
いくつかの実施態様において、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈されていない連続培養）内の少なくとも約５、１０、２０、５０、７５、１００、２００、３００またはそれ以上の細胞分裂の間、異種のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／またはＭＶＡ経路核酸を維持する。本発明の側面のいくつかの実施態様において、異種または複製コピーの内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸を含む核酸はまた、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタミシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシンまたはクロラムフェニコール抗生物質耐性核酸のような選択マーカーも含む。
実施例７、パートＶＩで示すように、生産されたイソプレンの量は、イソプレンを生産するためにクズ・イソプレン・シンターゼ、Ｓ．セレビシアＩＤＩ及び大腸菌ＤＸＳ核酸を含む大腸菌細胞を用いた細胞培養培地に、酵母抽出物を添加することによりさらに増加されることが出来る。特に、生産されたイソプレンの量は、試験された濃度について、細胞培地内での酵母抽出物の量と直線的に比例した（図４８Ｃ）。加えて、培養液のリットル当たり、およそ０．１１グラムのイソプレンが、酵母抽出物及びグルコースを含む細胞培地から生産された（実施例７、パートＶＩＩＩ）。グルコースが存在する状態での酵母抽出物の量の増加は、酵母抽出物が存在する状態でのグルコースの量の増加よりも、より多くのイソプレンの生産をもたらした。また、酵母抽出物の量の増加は、細胞がより長い時間、多量のイソプレンを生産することを可能にし、細胞の健康状態を改善した。
イソプレン生産を、炭素源としての３タイプの加水分解されたバイオマス（バガス、トウモロコシ茎葉及び軟材パルプ）を用いてさらに実証した（図４６Ａ−Ｃ及び図６９Ａ及び６９Ｂ）。クズ・イソプレン・シンターゼ、Ｓ．セレビシアＩＤＩ及び大腸菌ＤＸＳ核酸を含む大腸菌細胞は、グルコースの等価量（例えば、１％グルコース、ｗ／ｖ）からのイソプレンと同等量の前記加水分解されたバイオマス炭素源からのイソプレンを生産した。Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼ及びＭＶＡ経路を発現する大腸菌細胞は、グルコースの等価量からのイソプレン生産よりも高い初期増殖速度で、アンモニア繊維拡張（ＡＦＥＸ）で前処理されたトウモロコシ茎葉からイソプレンを生産した（図６９Ａ及び６９Ｂ）。望まれる場合、他のバイオマス炭素源も、本発明の組成物及び方法において用いることが出来る。バイオマス炭素源は、多くの従来細胞培地よりも安く、それにより、イソプレンの経済的生産を容易にするため、バイオマス炭素源は望ましい。
加えて、転化糖が、イソプレンの生成のための炭素源として機能することが示された（図４７Ｄ）。
加えて、キシロース、酢酸及びグリセロールも、イソプレンの生成のための炭素源としての機能することが示された（図６９Ａ−６９Ｄ）。例えば、唯一の炭素源としての酢酸上で増殖されたＰ．アルバ・イソプレン・シンターゼ及びＭＶＡ経路を含む大腸菌細胞には、グルコース上での増殖よりも約２倍高いイソプレンの比生産性があった（実施例１０、パートＩＶ、図６９Ａ及び６９Ｂ）。
いくつかの実施態様において、油が細胞培地に含まれる。例えば、油及びグルコース源を含む細胞培地内で培養された場合、クズ・イソプレン・シンターゼ核酸を含むＢ．ズブチリス細胞はイソプレンを生産した（実施例４、パートＩＩＩ）。別の例として、ヤシ油及びグルコース源を含む細胞培地内で培養された場合、上流及び下流ＭＶＡ経路とクズ・イソプレン・シンターゼを含む大腸菌ｆａｄＲ ａｔｏＣ変異細胞は、イソプレンを生産した（実施例１２、パートＩＩ）。いくつかの実施態様において、１以上の油（例えば、２、３、４、５またはそれ以上の油）が、細胞培地に含まれる。任意特定の理論に縛られることを意図しないが、（ｉ）油は、イソプレンへの転換に利用可能な細胞内の炭素の量を増加させることが出来る、（ｉｉ）油は、細胞内のアセチルＣｏＡの量を増加させ、それにより、ＭＶＡ経路を通る炭素の流れを増加させることが出来る、及び／または（ｉｉｉ）油は、細胞に追加の栄養素を提供することができ、これは細胞内の炭素の多くが他の生産物ではなくイソプレンに転換されるために、望ましいと考えられている。いくつかの実施態様において、油を含む細胞培地内で培養された細胞は、自然にイソプレンの生産のためにＭＶＡ経路を用いるか、または、ＭＶＡ経路全体の核酸を含むように遺伝学的に修飾される。いくつかの実施態様において、油は、宿主細胞による油の使用を促進するために細胞培養培地に添加される前に、部分的または完全に加水分解される。
例示的なポリペプチド及び核酸
多様なイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸を、本発明の組成物及び方法で用いることが出来る。
本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの断片及び第１ポリペプチドの一部または全て（例えば、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド）または第２ポリペプチド（例えば、Ｈｉｓタグのような融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド）の一部または全てを含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様において、融合ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有する（例えば、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチド）。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有する、自然発生のポリペプチド（例えば、エンテロコッカス・フェカーリスｍｖａＥ核酸によりコードされたポリペプチド）である。
多様な実施態様において、ポリペプチドは、少なくともまたは約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００またはそれより多くのアミノ酸を有する。いくつかの実施態様において、ポリペプチド断片は、全長ポリペプチドから少なくともまたは約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００またはそれ以上の隣接するアミノ酸を含み、対応する全長ポリペプチドの活性の少なくともまたは約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を有する。特定の実施態様において、ポリペプチドは、任意の自然発生のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドのアミノ酸配列のセグメントまたは全てを含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは、野生型（すなわち、自然界で起こる配列）イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドの配列と比べ、一以上の変異を有する。
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。本明細書で用いる「単離されたポリペプチド」は、例えば、ライブラリーの２、５、１０、２０、５０またはそれ以上の異なるポリペプチドようなポリペプチドのライブラリーの一部でなく、それが自然界で起こる少なくとも一の成分から分離されている。単離されたポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする組み換え核酸の発現により得ることが出来る。
いくつかの実施態様において、ポリペプチドは異種ポリペプチドである。「異種ポリペプチド」は、そのアミノ酸配列が同一の宿主細胞で自然に発現された別のポリペプチドのアミノ酸配列と同一ではないポリペプチドを意味する。
本明細書で用いる「核酸」は、２以上のデオキシリボヌクレオチド及び／またはリボヌクレオチドの一重または二重らせん構造の形態をいう。いくつかの実施態様において、核酸は組み換え核酸である。「組み換え核酸」は、目的の核酸が由来する有機体の自然発生のゲノムにおいて、目的の核酸に隣接する、一以上の核酸（例えば、遺伝子）がない目的の核酸を意味する。従って、この語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組み換えＤＮＡを含むか、または他の配列から独立した分離分子として存在する組み換えＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により生成されたｃＤＮＡ断片）を含む。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、別のポリペプチドの全てまたは一部をコードする別の核酸と操作可能に連結される。それにより、組み換えの核酸は、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド及び別のポリペプチド（例えば、Ｈｉｓタグのような融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド）の全てまたは一部を含む融合ポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、組み換え核酸の一部または全ては、化学的に合成される。
いくつかの実施態様において、核酸は異種核酸である。「異種核酸」は、その核酸配列が同一の宿主細胞で自然に見られる別の核酸の配列と同一ではない核酸を意味する。特定の実施態様において、核酸は、任意の自然発生のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸のセグメントまたは全核酸配列を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、自然発生のイソプレン・シンターゼ核酸ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸から少なくともまたは約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、核酸は、野生型（すなわち、自然界で起こる配列）イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の配列と比べ、一以上の変異を有する。いくつかの実施態様において、核酸は、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の転写または翻訳を増加させる、一以上の変異（例えば、サイレント変異）を有する。いくつかの実施態様において、核酸は、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする任意の核酸の変性変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）である。
「コドン縮退」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ばせずに、ヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コード内での分岐をいう。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチド・コドンの使用頻度において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス（ｃｏｄｏｎ−ｂｉａｓ）」をよく承知している。従って、宿主細胞内での改良された発現のために核酸を合成する場合、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように、核酸を設計することがいくつかの実施態様で望ましい。
例示的なイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸の登録番号は、別表１（別表１の登録番号及びそれらの対応配列は、特に、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で列記される。ケッグ（Ｋｅｇｇ）データベースはまた、多数の例示的なイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列を含む（例えば、「ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ／ｍａｐ／ｍａｐ００１００．ｈｔｍ１」でのワールド・ワイド・ウェブ及びそこの配列を参照されたい。これらは、特に、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸のアミノ酸配列及び核酸配列に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施態様において、一以上のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び／または核酸は、例えば、別表１中の任意の登録番号に相当する任意の配列またはケッグ・データベースで提供される任意の配列等の２００７年１２月１２日または２００８年１２月１１日付けで公に利用可能な配列と同一の配列を有する。さらに例示的なイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸を、下記でさらに説明する。
例示的なイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド及び核酸
上述するように、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに転換する。例示的なイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドは、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド及びイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドを含む。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏでＤＭＡＰＰをイソプレンへ転換するイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法が用いられることが出来る。例示的なアッセイにおいて、細胞抽出液は、実施例１で記載するような振盪フラスコの方法で株（例えば、本明細書に記載の大腸菌／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ株）を増殖することにより調製される。誘導が完了した後、およそ１０ｍＬの細胞は１０分間、７０００×ｇでの遠心によりペレット化され、グリセロールを含まない５ｍｌのＰＥＢに再懸濁される。標準的手順を用いて細胞は、フレンチ圧力セル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を用いて溶解される。あるいは、細胞は、−８０℃での凍結／解凍後にリゾチーム（Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）で処理される。
例えば、Ｓｉｌｖｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、１３０１０−１３０１６ページ、１９９５年で記載されるように、細胞抽出液中のイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド活性を測定することが出来る。この文献は、特にイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド活性のアッセイに関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＭＡＰＰ（シグマ）は、窒素流下で乾燥するまで脱水され、１００ｍＭリン酸カリウム・バッファーｐＨ８．２中、１００ｍＭの濃度に再水和し、−２０℃で保管した。アッセイを行うために、５μｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２溶液、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＡＰＰ、６５μｌの植物抽出物バッファー（ＰＥＢ）（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール及び２ｍＭ ＤＴＴ）が、金属ネジ・キャップ及びテフロン被覆シリコン隔壁を備えた２０ｍｌのヘッドスペース・バイアル（アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中の細胞抽出液２５μｌに添加され、振盪と共に１５分間、３７℃で培養した。この反応は、２００μｌの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することで止められ、実施例１、パートＩＩで記載されるようにＧＣ／ＭＳにより数量化される。
例示的なイソプレン・シンターゼ核酸は、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチドまたはイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。例示的なイソプレン・シンターゼ・ポリペプチド及び核酸は、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する自然発生のポリペプチド及び核酸と同様に、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する変異体ポリペプチド及び核酸を含む。
いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドまたは核酸は、ファボイデアエ亜科のようなファボセア科に由来する。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドまたは核酸は、ピュエラリア・モンタナ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１３７巻、７００−７１２ページ、２００５年）、ピュエラリア・ロバタ（ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ、ヨーロッパクロヤマナラシ、ポプラ・トリコカルパ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）、ウラジロハコヤナギ×トレムラ（ｔｒｅｍｕｌａ）（ＣＡＣ３５６９６）またはウラジロハコヤナギ）（佐々木他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第５７９巻（１１）、２５１４−２５１８ページ、２００５年、Ｍｉｌｌｅｒ他、Ｐｌａｎｔａ、第２１３巻、４８３−４８７ページ、２００１年）、ハコヤナギ（例えば、ポプラ・トレムロイデス（ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ））（Ｓｉｌｖｅｒ他、ＪＢＣ、第２７０巻（２２）、１３０１０−１３１６ページ、１９９５年）またはヨーロッパナラ（クエルカス・ロブフ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｒｏｂｕｆ））（Ｚｉｍｍｅｒ他、ＷＯ９８／０２５５０）に由来するポリペプチドまたは核酸である。これらの文献は、特に、イソプレン・シンターゼ核酸及びイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドの発現に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。適したイソプレン・シンターゼは、ジェンバンク登録番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０及びＡＹ１８２２４１により同定されたものを含むが、それらに限られない。これらは、特に、イソプレン・シンターゼ核酸及びポリペプチドの配列に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラに由来する自然発生のポリペプチドまたは核酸ではない（すなわち、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラに由来する自然発生のポリペプチドまたは核酸以外のイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドまたは核酸である）。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラに由来する自然発生のポリペプチドまたは核酸である。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラに由来する自然発生のポリペプチドまたは核酸ではない。
例示的なＤＸＳポリペプチド及び核酸
上述するように、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドは、ピルビン酸塩及びＤ−グリセリンアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に転換する。例示的なＤＸＳポリペプチドは、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド及びＤＸＳポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドを含む。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏでピルビン酸塩及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸へ転換するＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。例示的なＤＸＳ核酸は、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチドまたはＤＸＳポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。例示的なＤＸＳポリペプチド及び核酸は、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する自然発生のポリペプチド及び核酸と同様に、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する変異体ポリペプチド及び核酸を含む。
例示的なＩＤＩポリペプチド及び核酸
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ・ポリペプチド（イソペンテニル二リン酸デルタ−イソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸塩（ＤＭＡＰＰ）の相互転換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに転換する及び／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに転換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドは、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチドまたはＩＤＩポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドを含む。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏでＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互交換するＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。例示的なＩＤＩ核酸は、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチドまたはＩＤＩポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。例示的なＩＤＩポリペプチド及び核酸は、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する自然発生のポリペプチド及び核酸と同様に、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する変異体ポリペプチド及び核酸を含む。
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドは、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニル・リン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及び２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）を含む。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドは、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド及びＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドを含む。例示的なＭＶＡ経路核酸は、ポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチドまたはＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも一の活性を有する融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸は、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する自然発生のポリペプチド及び核酸と同様に、本明細書に記載の任意の起源有機体に由来する変異体ポリペプチド及び核酸を含む。
特に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼまたはＡＡＣＴ）は、アセチルＣｏＡの二分子をアセトアセチルＣｏＡに転換する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、アセチルＣｏＡの二分子をアセトアセチルＣｏＡに転換するＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ・ポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼまたはＨＭＧＳ）ポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに転換する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに転換するＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ・ポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素またはＨＭＧＲ）ポリペプチドは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸塩に転換する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸塩に転換するＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドは、メバロン酸塩をリン酸化し、メバロン酸−５−リン酸塩を生成する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、メバロン酸塩をメバロン酸−５−リン酸塩に転換するＭＶＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−リン酸塩をリン酸化し、メバロン酸−５−二リン酸塩を生成する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、メバロン酸−５−リン酸塩をメバロン酸−５−二リン酸塩に転換するＰＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤまたはＤＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−二リン酸塩をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に転換する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、メバロン酸−５−二リン酸塩をＩＰＰに転換するＭＶＤポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−リン酸塩をイソペンテニル・リン酸塩（ＩＰ）に転換する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、メバロン酸−５−リン酸塩をＩＰに転換するＰＭＤＣポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
イソペンテニル・リン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチドはイソペンチル・リン酸塩（ＩＰ）をリン酸化し、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を生成する。ポリペプチドの能力の測定により、ポリペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞抽出液中またはｉｎ ｖｉｖｏで、ＩＰをＩＰＰに転換するＩＰＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定するために、標準的方法（例えば、本明細書で記載の方法）が用いられることが出来る。
例示的なＩＤＩポリペプチド及び核酸は、上述のとおりである。
核酸を単離させる例示的な方法
イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸は、標準的方法を用いて単離することが出来る。目的の起源有機体から所望の核酸を（例えば、細菌ゲノム）得る方法は、分子生物学の分野で一般的によく知られている（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６及びその引用文献を参照されたい。これらは、特に、目的の核酸の単離に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、核酸の配列が知られている場合（例えば、本明細書に記載の既知の核酸のいずれか）、適したゲノムライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼ消化により作製されることができ、所望の核酸配列と相補的なプローブでスクリーニングすることが出来る。一旦、配列が単離された場合、ＤＮＡは、標準的なプライマー指向性増幅方法（ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許番号４，６８３，２０２、特に、ＰＣＲ方法に関して、参照によりその全体が組み込まれる）を用いて増幅することができ、適切なベクターを用いた形質転換に適するＤＮＡの量を得ることが出来る。
あるいは、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸（例えば、任意のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／または既知の核酸配列を有するＭＶＡ経路核酸）は、標準的方法を用いて化学的に合成することが出来る。
本明細書に記載の組成物及び方法での使用に適し得る追加のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸は、標準的方法を用いて同定することが出来る。例えば、自然にイソプレンを生産するとして知られる有機体の染色体ＤＮＡのコスミド・ライブラリーは、大腸菌のような有機体内で構築することができ、次に、イソプレン生産のためにスクリーニングすることが出来る。特に、コスミド・ライブラリーは、ゲノムＤＮＡの大型セグメント（３５〜４５ｋｂ）がベクター内に包含される場所で作製され、適切な宿主を形質転換するために使用しても良い。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容出来る点で独特である。一般に、コスミドベクターは、異種ＤＮＡの包含及びそれに引き続く環化に必要なｃｏｓＤＮＡ配列の少なくとも一のコピーを有する。ｃｏｓ配列に加えて、これらのベクターは、ＣｏｌＥ１等の複製起点、及びアンピシリンまたはネオマイシンに耐性の遺伝子等の薬剤耐性マーカーも含有する。適切な細菌宿主の形質転換のためにコスミドベクターを使用する方法は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年）で詳しく記載される。この文献は、特に、形質転換方法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。典型的に、コスミドをクローンニングするには、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して異種ＤＮＡを単離し、適切なリガーゼを使用して、コスミドベクターのｃｏｓ領域に隣接させてライゲートする。次に、線形化した異種ＤＮＡを含有するコスミドベクターは、バクテリオファージ等のＤＮＡ包含媒介物と反応させられる。包含プロセスにおいて、ｃｏｓ部位は切断され、異種ＤＮＡは細菌ウイルス粒子の頭部分内に包含される。次に、これらの粒子は、大腸菌等の適切な宿主細胞に形質移入するために使用される。細胞内に注入されると、異種ＤＮＡは、ｃｏｓ粘着末端の影響下で環化する。このようにして異種ＤＮＡの大型セグメントは、宿主細胞内に導入され発現されることが出来る。
イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸を得る追加の方法は、アッセイ（例えば、本明細書に記載のヘッドスペース・アッセイ）によるか、保存されたアミノ酸長（例えば、少なくとも３個の保存されたアミノ酸）をコードする核酸を標的とするプライマーを用いたＰＣＲにより、メタゲノムライブラリーをスクリーニングすることを含む。保存されたアミノ酸は、既知のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチドのアミノ酸配列を整列させることで同定することが出来る。イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドのために保存されたアミノ酸は、既知のイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドの整列した配列に基づき同定することが出来る。自然にイソプレンを生産するとして見つかった有機体は、（当該技術分野でよく知られている）標準的タンパク質精製方法が行われることができ、また、得られた精製ポリペプチドは、標準的方法を用いて配列決定することが出来る。他の方法も、文献で見られる（例えば、Ｊｕｌｓｉｎｇ他、Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第７５巻、１３７７−８４ページ、２００７年、Ｗｉｔｈｅｒｓ他、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第７３巻（１９）、６２７７−８３ページ、２００７年を参照されたい。これらは、特に、イソプレンの合成に関与する核酸の同定に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。
加えて、標準的な配列アラインメント及び／または構造予測プログラムが、既知のＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸の一次構造及び／または予測されるポリペプチド二次構造の類似性に基づき、追加のＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸を同定するために用いることが出来る。標準的なデータベース、例えば、スイスプロット−トレムブル・データベース（「ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ」のワールド・ワイド・ウェブ、生物情報科学スイス・プロット・グループＣＭＵスイス協会、１ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ｓｅｒｖｅｔ ＣＨ−１２１１ Ｇｅｎｅｖａ ４、スイス）が、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチド及び核酸の同定に用いることが出来る。イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドの二次及び／または三次構造は、標準的構造予測プログラム、例えば、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０ウェスト、１６８ストリート、ＢＢ２１７、ニューヨーク、ニューヨーク州、１００３２、アメリカ合衆国）のデフォルト設定を用いて予測することが出来る。あるいは、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドの実際の二次及び／または三次構造は、標準的方法を用いて決定することが出来る。追加のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸も、既知のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸から生産されたプローブへのハイブリダイゼーションにより同定することが出来る。
例示的なプロモーター及びベクター
本明細書に記載のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸のいずれかは、一以上のベクターに含まれることが出来る。従って、本発明はまた、本明細書に記載のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドのいずれかをコードする一以上の核酸を有するベクターを特徴とする。本明細書で用いる「ベクター」は、目的の一以上の核酸を宿主細胞内で運搬し、望ましいように発現されることが可能な構築物を意味する。ベクターの例は、プラスミド、ウイルス・ベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、コスミド及びファージベクトルを含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、ベクターは、発現制御配列の制御下で核酸を含む。
本明細書で用いる「発現制御配列」は、目的の核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列はプロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導プロモーター、またはエンハンサー等とすることが出来る。「誘導プロモーター」は、環境的または発生的調整下で活性のあるプロモーターである。発現制御配列は、転写される核酸セグメントと操作可能に連結される。
いくつかの実施態様において、ベクターは選択マーカーを含む。「選択マーカー」の語は、導入された核酸またはベクターを含む宿主細胞の選択を容易にする宿主細胞で発現可能な核酸をいう。選択マーカーの例は、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタミシン、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシンまたはクロラムフェニコール）及び／または宿主細胞において代謝優位性、例えば、栄養優位性を与える核酸を含むが、それらに限られない。例示的な栄養選択マーカーは、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ及びｐｙｒ４として当該技術分野で知られるマーカーを含む。トリコデルマの形質転換のためのベクター系に有用なマーカーは、当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、糸状菌の生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ）内の第６章、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ他編集、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ発行、ボストン、マサチューセッツ州、第６章、１９９２年及びＫｉｎｇｈｏｒｎ他、糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ）、Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ発行、Ｃｈａｐｍａｎ及びＨａｌｌ編集、ロンドン、１９９２年を参照されたい。これらは、特に、選択マーカーに関して、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施態様において選択マーカーは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞を窒素源としてのアセトアミド上で増殖させるａｍｄＳ核酸である。選択マーカーとしてのＡ．ニデュランスａｍｄＳ遺伝子の使用は、Ｋｅｌｌｅｙ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第４巻、４７５−４７９ページ、１９８５年及びＰｅｎｔｔｉｌａ他、Ｇｅｎｅ、第６１巻、１５５−１６４ページ、１９８７年で開示される。これら文献は、特に、選択マーカーに関して、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、選択マーカーを持たない細胞の染色体に統合する。
適したベクターは、用いられる宿主細胞と適合するものである。適したベクターは、例えばバクテリア、ウイルス（バクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来ファージ等）、コスミド、酵母または植物に由来することが出来る。このようなベクターを獲得し、使用する手順は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年）を参照されたい。この文献は、特に、ベクターの使用に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。
プロモーターは、当該技術分野でよく知られている。宿主細胞で機能する任意のプロモーターが、宿主細胞内でのイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の発現に用いることが出来る。多様な宿主細胞内でのイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の発現の誘導に有用な開始調節領域またはプロモーターは、多数あり、当業者に周知である（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６及びその引用文献を参照されたい。これらの文献は、特に、目的核酸の発現のためのベクターに関して、参照によりその全体が組み込まれる）。実質的に、これらの核酸の誘導が可能な任意のプロモーターは、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ及びＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア属における発現に有用）、及びｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ，ＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）を含むが、これらに限られず、本発明に適する。
いくつかの実施態様において、グルコースイソメラーゼ・プロモーターが用いられる（例えば、米国特許番号７，１３２，５２７及びその引用文献を参照されたい。これらの文献は、特に、目的のポリペプチドの発現のためのプロモーター及びプラスミド系に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。報告されるグルコースイソメラーゼ・プロモーター変異体は、グルコースイソメラーゼ・プロモーター（米国特許番号７，１３２，５２７）と操作可能に連結された核酸によりコードされたポリペプチドの発現の量を変化するために用いることが出来る。
多様な実施態様において、グルコースイソメラーゼ・プロモーターは、低コピー、中コピー、高コピーのプラスミド（米国特許番号７，１３２，５２７）内に含まれる。多様な実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸は、低コピー・プラスミド（例えば、細胞当たり約１〜約４コピーで維持されるプラスミド）、中コピー・プラスミド（例えば、細胞当たり約１０〜約１５コピーで維持されるプラスミド）または高コピー・プラスミド（例えば、細胞当たり約５０コピー以上で維持されるプラスミド）内に含まれる。いくつかの実施態様において、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸が、Ｔ７プロモーターと操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、Ｔ７プロモーターと操作可能に連結された異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、中コピーまたは高コピーのプラスミド内に含まれる。いくつかの実施態様において、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、Ｔｒｃプロモーターと操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、Ｔｒｃプロモーターと操作可能に連結された異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、中コピーまたは高コピーのプラスミド内に含まれる。いくつかの実施態様において、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、Ｌａｃプロモーターと操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、Ｌａｃプロモーターと操作可能に連結された異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、低コピーのプラスミド内に含まれる。いくつかの実施態様において、異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、内在性プロモーター、例えば、内因性エシェリヒア属、パントエ、バチルス、ヤロウィア、ストレプトミセスまたはトリコデルマ・プロモーター、または内因性アルカリ性セリン・プロテアーゼ、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路プロモーターと操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、内在性プロモーターと操作可能に連結された
異種または追加の内因性イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、高コピー・プラスミド内に含まれる。いくつかの実施態様において、ベクターは、細胞内の染色体に統合しない複製プラスミドである。いくつかの実施態様において、ベクターの一部または全ては、細胞の染色体に統合する。
いくつかの実施態様において、このベクターは、菌性宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、複製され得る任意のベクターである。ベクターの一覧について、菌性遺伝学ストックセンターの株カタログ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ）（ＦＧＳＣ、「ｆｇｓｃ．ｎｅｔ」のワールド・ワイド・ウェブ、これは、特に、ベクターに関して、参照によりその全体が組み込まれる）が参照される。適した発現ベクター及び／または統合ベクターの他の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年、分子生物学の最新プロトコール（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編集、１９８７年、付録３０、セクション７．７．１８）、Ｂｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編集、菌類のその他の遺伝子操作（Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ）、アカデミック出版社発行、３９６−４２８ページ、１９９１年内のｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ他及び米国特許番号５，８７４，２７６に提供されている。これらの文献は、特に、ベクターに関して、参照によりその全体が組み込まれる。特に有用なベクターは、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００及びｐＥＮＴＲ／Ｄを含む。
いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、菌性宿主細胞内で転写活性を示す、適したプロモーターと操作可能に連結される。このプロモーターは、宿主細胞の内因性または異種のポリペプチドをコードする１以上の核酸に由来することが出来る。いくつかの実施態様において、このプロモーターは、トリコデルマ宿主で有用である。適したプロモーターの非限定的な例は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１及びａｍｙを含む。いくつかの実施態様において、このプロモーターは宿主細胞に天然のものである。例えば、いくつかの実施態様において、Ｔ．リーセイが宿主の場合、このプロモーターは天然Ｔ．リーセイのプロモーターである。いくつかの実施態様において、このプロモーターは、Ｔ．リーセイｃｂｈ１である。Ｔ．リーセイｃｂｈ１は、誘導性プロモーターであり、登録番号Ｄ８６２３５でジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託される。これは、特に、プロモーターに関して、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施態様において、このプロモーターは、菌性宿主細胞に対し異種である。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．アワモリ・グルコアミラーゼとＡ．ニガー・グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）の遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第４巻、２３０６−２３１５ページ、１９８４年及びＢｏｅｌ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第３巻、１５８１−１５８５ページ、１９８４年。これらは、特に、プロモーターに関して、参照によりその全体が組み込まれる。）、アスペルギルス・ニガー・アルファ・アミラーゼ、アスペルギルス・オリゼＴＡＫＡアミラーゼ、Ｔ．リーセイｘｌｎ１及びＴ．リーセイ・セロビオ加水分解酵素１（ＥＰ１３７２８０を参照されたい。これは、特に、プロモーターに関して、参照によりその全体が組み込まれる。）に由来するプロモーターを含む。
いくつかの実施態様において、発現ベクターはさらに、終始配列も含む。末端調節領域はまた、宿主細胞に天然の多様な遺伝子に由来することが出来る。いくつかの実施態様において、この終止配列とプロモーター配列は同一の起源に由来する。別の実施態様において、終始配列は宿主細胞に内因的である。特に適したターミネーター配列は、トリコデルマ株（例えば、Ｔ．リーセイ）に由来するｃｂｈ１である。他の有用な菌性ターミネーター配列は、Ａ．ニガー・グルコアミラーゼ核酸またはＡ．アワモリ・グルコアミラーゼ核酸由来のターミネーターを含む（Ｎｕｎｂｅｒｇ他、ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第４巻、２３０６−２３１５ページ、１９８４年及びＢｏｅｌ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、第３巻、１５８１−１５８５ページ、１９８４年を参照されたい。これらは、特に、菌性ターミネーターに関して、参照によりその全体が組み込まれる）。任意に、終止部位が含まれることが出来る。ポリペプチドの有効な発現のために、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの生成をもたらすように、開始コドンから選択された発現制御領域を通して操作可能に連結される。
いくつかの実施態様において、プロモーター、コーディング領域及びターミネーターは全て、発現されるイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸に起因する。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸のコーディング領域は、汎用の発現ベクターに挿入され、それにより、発現構築物プロモーター及びターミネーター配列の転写調節を受ける。いくつかの実施態様において、遺伝子またはその一部分は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸は、標準的技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８２年を参照されたい。これは、特に、適切なＤＮＡ配列のスクリーニング及びベクターの構造に関して、参照によりその全体が組み込まれる）を用いてベクター、例えば、発現ベクター等に組み込むことが出来る。目的の核酸（例えば、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸）、プロモーター、ターミネーター及び他の配列を含むＤＮＡ構築物をライゲートするために使用する方法及びその構築物を適当なベクターに挿入する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、制限酵素は、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸及びベクターを切断するために用いることが出来る。次に、切断されたイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸及び切断されたベクターの互換性をもつ末端は、ライゲートされることが出来る。連結は一般に、好都合な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位がない場合、合成ヌクレオチド・リンカーが一般的方法に従い使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年、及びＢｅｎｎｅｔｔ及びＬａｓｕｒｅ編集、菌類のその他の遺伝子操作（Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ）、アカデミック出版社発行、サンディエゴ、７０−７６ページ、１９９１年を参照されたい。これらは、特に、オリゴヌクレオチド・リンカーに関して、参照によりその全体が組み込まれる）。加えて、ベクターは、既知の組み換え技術（例えば、インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、ゲートウェイ・テクノロジー）を用いて構築することが出来る。
いくつかの実施態様において、自然発生の細胞で一般に見られるよりはるかに多い量でイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸を過剰表現することが望ましい。この結果は、ポリペプチドをコードする核酸のマルチコピープラスミドへの選択的なクローニングにより、または核酸を強力な誘導的または構成的プロモーター下に置くことにより達成されることが出来る。所望のポリペプチドを過剰表現する方法は、分子生物学の当該技術分野で一般的かつよく知られている。例はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年で見られることが出来る。この文献は、特に、クローニング技術に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
以下の資料が、さらに本発明で有用な追加の一般的な方法の記載を含む：Ｋｒｅｉｇｌｅｒ、遺伝子導入及び発現：ラボマニュアル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、１９９０年及びＡｕｓｕｂｅｌ他編集、分子生物学の最新プロトコール、１９９４年を参照されたい。これらは、特に、分子生物学及びクローニング技術に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
例示的な起源有機体
イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸（及びそれらのコードされたポリペプチド）は、自然にイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸を含む任意の有機体から得ることが出来る。上述するように、イソプレンは、様々な有機体、例えば、細菌、酵母、植物及び動物により自然に生成される。有機体は、イソプレンを生産するためのＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路またはＭＶＡ及びＤＸＰの両経路を含む（図１９）。従って、ＤＸＳ核酸は、例えば、ＤＸＰ経路を含むか、またはＭＶＡ及びＤＸＰの両経路を含む任意の有機体から得ることが出来る。ＩＤＩ及びイソプレン・シンターゼ核酸は、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路またはＭＶＡ及びＤＸＰの両経路を含む任意の有機体から得ることが出来る。ＭＶＡ経路核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含むか、またはＭＶＡ及びＤＸＰの両経路を含む任意の有機体から得ることが出来る。
いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の核酸配列は、自然界における以下の有機体のいずれかにより生産される核酸の配列と同一である。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドのアミノ酸配列は、自然界における以下の有機体のいずれかにより生産されるポリペプチドの配列と同一である。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸またはポリペプチドは、本明細書に記載の任意の有機体に由来する変異体核酸またはポリペプチドである。本明細書で用いる「由来する」は、一以上の変異が導入される、核酸またはポリペプチドの起源をいう。例えば、「植物ポリペプチドに由来する」ポリペプチドは、野生型（すなわち、自然界で起こる配列）植物ポリペプチドの配列に一以上の変異を導入することに起因する目的のポリペプチドをいう。
いくつかの実施態様において、起源有機体は菌類である。それらの例は、アスペルギルス属、例えば、Ａ．オリゼ及びＡ．ニガー、サッカロミセス属、例えば、Ｓ．セルビシエ、シゾサッカロミセス属、例えば、Ｓ．ポンベ、及びトリコデルマ属、例えば、Ｔ．リーセイである。いくつかの実施態様において、起源有機体は糸状菌細胞である。「糸状菌」の語は、エウミコチナ（Ｅｕｍｉｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状菌形態をいう（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２年）、入門菌類学（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）、Ｗｉｌｅｙ出版、ニューヨーク州を参照されたい）。これらの菌類は、チチン、セルロース及び他の複合多糖からなる細胞壁を有する植物性菌糸体により特徴付けられる。糸状菌は、形態学的に、生理学的に及び遺伝学的に酵母から区別される。糸状菌による植物性増殖は菌糸伸長により、炭素異化は絶対好気性である。糸状菌の親細胞は、トリコデルマ属、（例えば、トリコデルマ・リーセイ、以前はＴ．ロンギブラキアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として分類されていたヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）の無性の形態、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギ（ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルジアナム（ｈａｒｚｉａｎｕｍ））（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第２０巻、４６−５３ページ、１９８４年、ＡＴＣＣ番号５６７６５及びＡＴＣＣ番号２６９２１）、ペニシリウム属、フミコーラ属（例えば、Ｈ．インソレンス（ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、Ｈ．ラヌギノース（ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）またはＨ．グリセア（ｇｒｉｓｅａ））、クリソスポリウム属（例えば、Ｃ．ラクノウェンス（ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ））、グリオクラディウム属、アスペルギルス属（例えば、Ａ．オリゼ、Ａ．ニガー、Ａ．ソジェ（ｓｏｊａｅ）、Ａ．ジャポニカス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．アワモリ）（Ｗａｒｄ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第３９巻、７３８−７４３ページ、１９９３年及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ他、Ｇｅｎｅｔ、第４１巻、８９−９８ページ、２００２年）、フザリウム属（例えば、Ｆ．ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、Ｆ．グラミナム（ｇｒａｍｉｎｕｍ）
、Ｆ．セレアリス（ｃｅｒｅａｌｉｓ）、Ｆ．オキシスポルイム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｉｍ）またはＦ．ヴェネナタム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ属（例えば、Ｎ．クラッサ）、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ）、ケカビ属（例えば、Ｍ．ミヘイ）、リゾープス属及びエメリセラ属（Ｉｎｎｉｓ他、Ｓｃｉ．、第２２８巻、２１−２６ページ、１９８５年も参照されたい）の種類の細胞とすることが出来るが、それらに限られない。「トリコデルマ」または「トリコデルマ属」または「トリコデルマ種」の語は、以前または現在トルコデルマ属に分類されている任意の真菌属を意味する。
いくつかの実施態様において、菌類は、Ａ．ニジュランス、Ａ．アワモリ、Ａ．オリゼ、Ａ．アキュレアタス（ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．ニガー、Ａ．ジャポニカス、Ｔ．リーセイ、Ｔ．ビリデ、Ｆ．オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＦ．ソラニ（ｓｏｌａｎｉ）である。アスペルギルス株は、Ｗａｒｄ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第３９巻、７３８−７４３ページ、１９９３年及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ他、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ、第４１巻、８９−９８ページ、２００２年で開示される。これらは、特に、菌類に関して、参照によりその全体が組み込まれる。特定の実施態様において、菌類は、Ｔ．リーセイ株のようなトリコデルマ株である。Ｔ．リーセイ株は既知であり、非限定的な例は、ＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７及びＮＲＲＬ１５７０９を含む。これらは、特に、Ｔ．リーセイ株に関して、参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施態様において、宿主株はＲＬ−Ｐ３７の派生物である。ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ他、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２０巻、４６−５３ページ、１９８４年で開示される。これは、特に、Ｔ．リーセイ株に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施態様において、起源有機体は、酵母、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピチア属またはカンディダ属である。いくつかの実施態様において、起源有機体は細菌、例えば、Ｂ．リケニフォルミスまたはＢ．ズブチリスのようなバチルス属の株、Ｐ．シトレア（ｃｉｔｒｅａ）のようなパントエア属の株、Ｐ．アルカリジェネス（ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）のようなシュードモナス属の株、Ｓ．アルブス（ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンスまたはＳ．ルビギノサスのようなストレプトミセス属の株または大腸菌のようなエシェリキア属の株である。
本明細書で用いる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」は、「バチルス」属に属すると当業者により認識される全ての種を含む。これは、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロサーモフィリス、Ｂ．アルカノフィリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウジィ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアギュランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．レンタス及びＢ．スリンギエンシスを含むが、それらに限られない。バシルス属は分類上再編成され続けていることが認識される。従って、前記の属は、現在はゲオバシルス・ステアロサーモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と呼ばれているＢ．ステアロサーモフィリスのような有機体も含むが、それらに限定されない、再分類されている種を含むことが意図される。酸素の存在下で耐性のある内性胞子を生産することは、バシルス属の特徴であると定義されている。もっとも、この特徴は、近年分類されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）及びバージバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）についても当てはまる。
いくつかの実施態様において、起源有機体はグラム陽性菌である。非限定的な例は、ストレプトミセス属（例えば、Ｓ．アルバス（ａｌｂｕｓ）、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリコラー（ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）またはＳ．グリセウス（ｇｒｉｓｅｕｓ））及びバチルス属の株を含む。いくつかの実施態様において、起源有機体は、グラム陰性菌、例えば、大腸菌またはシュードモナス属等である。
いくつかの実施態様において、起源有機体は、植物、例えば、ファボイデアエ亜科のようなファボセア科に由来する植物である。いくつかの実施態様において、起源有機体は、クズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ×ポプラ・トレムラＣＡＣ３５６９６またはウラジロハコヤナギ）（佐々木他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第５７９巻（１１）、２５１４−２５１８ページ、２００５年）、ハコヤナギ（例えば、ポプラ・トレムロイデス）またはヨーロッパナラである。
いくつかの実施態様において、起源有機体は、藻類、例えば、緑藻類、紅藻類、グラウコファイト（ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔｅｓ）、クロララクニオファイト（ｃｈｌｏｒａｒａｃｈｎｉｏｐｈｙｔｅｓ）、ユーグレナ類、クロミスタ（ｃｈｒｏｍｉｓｔａ）または渦鞭毛虫等である。
いくつかの実施態様において、起源有機体は、シアノバクテリア、例えば、形態学に基づき以下の群のいずれかに分類されたシアノバクテリアである：クロオコッカス目、プルーロカプセイル（Ｐｌｅｕｒｏｃａｐｓａｌｅｓ）、ユレモ目、ノストカイル（Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ）またはスチゴネマテイル（Ｓｔｉｇｏｎｅｍａｔａｌｅｓ）。
例示的な宿主細胞
様々な宿主細胞が、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現に用いられ、特許請求された発明の方法でイソプレンを生産が出来る。例示的な宿主細胞は、標題「例示的な起源有機体」下の先の項で列記された有機体のいずれかに由来する細胞を含む。宿主細胞は、自然にイソプレンを生産する細胞、または自然にイソプレンを生産しない細胞とすることが出来る。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いてイソプレンを自然に生産し、前記経路を用いたイソプレンの生産を増進するために、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ及び／またはＩＤＩ核酸が添加される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＭＶＡ経路を用いてイソプレンを自然に生産し、前記経路を用いたイソプレンの生産を増進するために、イソプレン・シンターゼ及び／または一以上のＭＶＡ経路核酸が添加される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いてイソプレンを自然に生産し、一以上のＭＶＡ経路核酸が、ＤＸＰ経路と同様にＭＶＡ経路の一部または全てを用いてイソプレンを生産するために添加される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、ＤＸＰ及びＭＶＡの両経路を用いてイソプレンを自然に生産し、前記両経路の一方または両方によりイソプレンの生産を増進するために、一以上のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸が添加される。
例示的な形質転換法
イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／またはＭＶＡ経路核酸またはそれらを含むベクターは、コードされたイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現に用いられる標準的技術を用いて宿主細胞（例えば、植物細胞、菌性細胞、酵母菌または本明細書に記載された細菌性細胞）に挿入することが出来る。ＤＮＡ構築物またはベクターの宿主細胞への導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション介在及びＤＥＡＥ−デキストリン介在トランスフェクションまたは組み換えファージウイルスを用いたトランスフェクション）、カルシウムリン酸ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコートマイクロ入射核の高速度砲撃、及びプロトプラスト融合等の技術を用いて行われることが出来る。一般的な形質転換技術が、当該技術分野で知られている（例えば、分子生物学の最新プロトコール（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他編集、第９章、１９８７年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年、Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、５３−５６ページ、１９８９年を参照されたい。これらは、特に、形質転換法に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。トリコデルマ内での異種ポリペプチドの発現は、米国特許番号６，０２２，７２５、米国特許番号６，２６８，３２８、米国特許番号７，２６２，０４１、ＷＯ２００５／００１０３６、Ｈａｒｋｋｉ他、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第１３巻、２２７−２３３ページ、１９９１年、Ｈａｒｋｋｉ他、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌ．、第７巻、５９６−６０３ページ、１９８９年、ＥＰ２４４，２３４、ＥＰ２１５，５９４及び分子産業菌学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）内のＮｅｖａｌａｉｎｅｎ他、「トリコデルマの分子生物学、及び同種及び異種の両遺伝子の発現へのその応用（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ）」、Ｌｅｏｎｇ及びＢ
ｅｒｋａ編集、マーセル・デッカー・インク発行、ニューヨーク州、１２９−１４８ページ、１９９２年で記載される。これらの文献は、特に、形質転換及び発現方法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。また、アスペルギルス株の形質転換についてＣａｏ他、Ｓｃｉ．、第９巻、９９１−１００１ページ、２０００年、ＥＰ２３８０２３及びＹｅｌｔｏｎ他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８１巻、１４７０−１４７４ページ、１９８４年）も参照される。これらの文献は、特に、形質転換法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに統合されるか、または染色体外の複製配列として維持されることが出来る。
当該技術分野で知られる任意の方法が、形質転換体の選択に用いられることが出来る。一の非限定的な例において、ａｍｄＳマーカーを含む安定な形質転換体は、不安定な形質転換種からその早い増殖速度と、アセトアミドを含む固形培地上に、不規則な輪郭ではなく、滑らかな輪郭の円状コロニーの形成により区別される。加えて、いくつかの場合において、安定性に関するさらなる試験が、固形の非選択的培地（例えば、アセトアミドを含まない培地）上で形質転換体を増殖させ、この培地からの胞子を集め、アセトアミドを含有する選択的培地上で続けて発芽し増殖するこれらの胞子のパーセンテージを決定することにより行われる。
いくつかの実施態様において、真菌細胞が、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換に関与する方法により形質転換され、その後、既知の方法で細胞壁が再生される。一の特定の実施態様において、形質転換に使用するトリコデルマ属の調製には、菌類の菌糸体由来のプロトプラストの調製を含む。（Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６巻、５３−５６ページ、１９８９年を参照されたい。これは、特に、形質転換法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。）いくつかの実施態様において、菌糸体は発芽した胞子から得られる。この菌糸体は、細胞壁を消化する酵素により処理され、プロトプラストとなる。次に、このプロトプラストは、懸濁培地中で浸透圧安定化剤の存在により保護される。これらの安定化剤は、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらの安定化剤の濃度は、０．８Ｍと１．２Ｍの間で変動する。懸濁培地中の約１．２Ｍのソルビトール溶液での使用が望まれる。
ＤＮＡの宿主トリコデルマ属への取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。一般的に、約１０−５０ｍＭ ＣａＣｌ２の間が取り込み溶液に使用される。取り込み溶液でのカルシウムイオンに加えて、その他の化合物は一般に、ＴＥバッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０バッファー（モルホリンプロパンスルホン酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。任意特定の理論に縛られることを意図しないが、このポリエチレングリコールは、細胞膜を溶解すると信じられ、そのため培地の内容物をトリコデルマ属の株の細胞質へ伝達させ、またプラスミドＤＮＡも核に移される。この融合は頻繁に、宿主染色体に統合されたプラスミドＤＮＡの複数コピーを残す。
トリコデルマ属の形質転換は通常、１０５から１０７／ｍＬ（例えば、２×１０６／ｍＬ）の密度で、プロトプラストまたは透過性処理を受けた細胞を含む懸濁液を使用する。１００μＬの適当な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトールと５０ｍＭ ＣａＣｌ２）のこれらのプロトプラストまたは細胞が目的のＤＮＡと混合される。一般的に、高濃度のＰＥＧが取り込み溶液へ加えられる。０．１から１容量の２５％ＰＥＧ４０００がプロトプラスト懸濁液に加えることが出来る。いくつかの実施態様において、約０．２５容量がプロトプラスト懸濁液に加えられる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等のような添加物も形質転換を促進するために、取り込み溶液へ加えられることが出来る。同様の手順が他の菌類の宿主細胞に利用出来る（米国特許番号６，０２２，７７５と６，２６８，３２８を参照されたい。これらは、特に、形質転換法に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。
一般的に、この混合物は次に、１０〜３０分の間、約０℃で培養される。次に、追加のＰＥＧがこの混合物へ加えられ、所望の核酸配列のさらなる取り込みを促す。２５％ＰＥＧ４０００は一般的に、形質転換混合物の５〜１５倍容量で加えられる。しかし、それより多いまたは少ない量も適当とすることが出来る。２５％ＰＥＧ４０００は、形質転換混合物の約１０倍量が望ましい。ＰＥＧが加えられた後、この形質転換混合物は、ソルビトールとＣａＣｌ２溶液を加える前に室温または氷冷で培養される。次に、このプロトプラスト懸濁液は、増殖培地の溶融分割量に加えられる。増殖培地が増殖選択（例えば、アセトアミドまたは抗生物質）を含む場合、それは、形質転換体のみの増殖を可能にする。
細菌性細胞の形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、コールドスプリングハーバー、１９８９年で記載されるような従来方法に従って行われることが出来る。この文献は、特に、形質転換法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
例示的な細胞培養地
本発明はまた、イソプレンを生産する培養内で細胞または細胞の集団を含む。「培養内の細胞」は、細胞が一回以上の細胞分裂を受けることを可能にする溶液（例えば、細胞培地）内の２以上の細胞を意味する。「培養内の細胞」は、植物組織に分化した細胞を含む活性多細胞植物の一部である植物細胞を含まない。多様な実施態様において、細胞培養は、少なくともまたは約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００またはそれ以上の細胞を含む。
任意の炭素源が、宿主細胞を培養するために用いることが出来る。「炭素源」の語は、宿主細胞または有機体により代謝されることが可能な一以上の炭素含有化合物をいう。例えば、宿主細胞を培養するために用いられる細胞培地は、生存度を維持するか、宿主細胞を増殖するのに適した任意の炭素源も含む。
いくつかの実施態様において、炭素源は、炭水化物（例えば、単糖、二糖類、オリゴ糖または多糖）、転化糖（例えば、酵素的に処理されたショ糖シロップ）、グリセロール、グリセリン（例えば、バイオディーゼルまたは石鹸成形工程のグリセリン副産物）、ジヒドロキシアセトン、一炭素原子源、油（例えば、トウモロコシ、パームまたは大豆油のような植物または植物油）、酢酸、動物脂、動物油、脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸または多価不飽和脂肪酸）、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド（例えば、微生物または植物性タンパク質またはペプチド）、再生可能な炭素源（例えば、加水分解されたバイオマス炭素源のようなバイオマス炭素源）、酵母抽出物、酵母抽出物に由来する成分、重合体、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、琥珀酸塩、乳酸塩、酢酸、エタノールまたは上記の二以上の任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、炭素源は、グルコースを含むが、それに限られない、光合成の生産物である。いくつかの実施態様において、炭水化物は、キシロースまたはグルコースである。
例示的な単糖は、グルコース及びフルクトースを含む。例示的なオリゴ糖は、乳糖及びショ糖を含む。また、例示的な多糖は、デンプン及びセルロースを含む。例示的な炭水化物は、Ｃ６糖質（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトースまたはグルコース）及びＣ５糖質（例えば、キシロースまたはアラビノース）を含む。いくつかの実施態様において、細胞培地は、炭水化物の他、炭水化物以外の炭素源（例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、一炭素原子源、油、動物脂、動物油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源または酵母抽出物由来の成分）も含む。いくつかの実施態様において、細胞培地は、炭水化物の他、ポリペプチド（例えば、微生物または植物性タンパク質またはペプチド）も含む。いくつかの実施態様において、微生物ポリペプチドは、酵母または細菌に由来するポリペプチドである。いくつかの実施態様において、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ（ｊａｔｒｏｐｈａ）、ヤシ、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、辛子、菜種、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ごままたはアマニに由来するポリペプチドである。
いくつかの実施態様において、炭水化物の濃度は、培養液のリットル当たり少なくともまたは約５グラム（ｇ／Ｌ、培養液の容量は、細胞培地の容量及び細胞の容量の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌまたはそれ以上である。いくつかの実施態様において、炭水化物の濃度は、約５０及び約４００ｇ／Ｌの間、例えば、約１００及び約３６０ｇ／Ｌの間、約１２０及び約３６０ｇ／Ｌまたは約２００及び約３００ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施態様において、この炭水化物の濃度は、宿主細胞の培養前及び／または培養中に添加される炭水化物の総量を含む。
例示的な脂質は、飽和、不飽和または分岐したＣ４以上の脂肪酸である一以上の脂肪酸を含む任意の物質である。
例示的な油は、室温で液体の脂質である。いくつかの実施態様において、脂質は一以上のＣ４以上の脂肪酸（例えば、４以上の炭素を有する一以上の飽和、不飽和または分岐した脂肪酸）を含む。いくつかの実施態様において、油は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、辛子、菜種、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ごま、アマニ、油性微生物細胞、ナンキンハゼまたは上記の２以上の任意の組み合わせから得られる。
例示的な脂肪酸は式ＲＣＯＯＨの化合物を含む。ここで、「Ｒ」は炭化水素である。例示的な不飽和脂肪酸は、「Ｒ」が少なくとも一の炭素−炭素二重結合を含む化合物を含む。例示的な不飽和脂肪酸は、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライディック（ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｉｃ）酸及びアラキドン酸を含むが、それらに限られない。例示的な多価不飽和脂肪酸は、「Ｒ」が複数の炭素−炭素二重結合を含む化合物を含む。例示的な飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物を含む。いくつかの実施態様において、炭素源は、一以上のＣ１２−Ｃ２２脂肪酸、例えば、Ｃ１２飽和脂肪酸、Ｃ１４飽和脂肪酸、Ｃ１６飽和脂肪酸、Ｃ１８飽和脂肪酸、Ｃ２０飽和脂肪酸またはＣ２２飽和脂肪酸を含む。例示的な実施態様において、脂肪酸は、パルミチン酸である。いくつかの実施態様において、炭素源は、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の塩、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の派生物または脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の派生物の塩である。適した塩は、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等を含むが、それらに限られない。ジグリセロール及びトリグリセロールは、グリセロールの脂肪酸エステルである。
いくつかの実施態様において、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドの濃度は、培養液のリットル当たり少なくともまたは約１グラム（ｇ／Ｌ、培養液の容量は、細胞培地の容量及び細胞の容量の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌまたはそれ以上である。いくつかの実施態様において、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドの濃度は、約１０及び約４００ｇ／Ｌの間、例えば、約２５及び約３００ｇ／Ｌの間、約６０及び約１８０ｇ／Ｌまたは約７５及び約１５０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施態様において、濃度は、宿主細胞の培養前及び／または培養中に添加される脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドの総量を含む。いくつかの実施態様において、炭素源は、（ｉ）脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリド、及び（ｉｉ）グルコースのような炭水化物の両方を含む。いくつかの実施態様において、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド対炭水化物の比率が、炭素基準量（すなわち、炭水化物炭素当たりの脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド中の一炭素）で約１：１である。特定の実施態様において、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリドの量は、約６０及び１８０ｇ／Ｌの間にあり、炭水化物の量は、約１２０及び３６０ｇ／Ｌの間にある。
例示的な微生物のポリペプチド炭素源は、酵母または細菌に由来する一以上のポリペプチドを含む。例示的な植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、辛子、菜種、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、ごままたはアマニに由来する一以上のポリペプチドを含む。
例示的な再生可能な炭素源は、チーズホエー・パルメエイト（ｃｈｅｅｓｅ ｗｈｅｙ ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、大麦麦芽及び上記のいずれかに由来する成分を含む。例示的な再生可能な炭素源はまた、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵工程の細胞廃物及び大豆、トウモロコシまたは小麦の製粉に由来するタンパク質副産物のようなバイオマス中に存在する酢酸、グルコース、ヘキソース、ペントース及びキシロースを含む。いくつかの実施態様において、バイオマス炭素源は、例えば、草、小麦、麦わら、バガス、サトウキビ・バガス、軟材パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの穂軸または皮、トウモロコシ核、またはトウモロコシ核、トウモロコシ茎葉、スイッチ草、モミガラ生産物に由来する繊維または穀類（例えば、トウモロコシ、モロコシ、ライ麦、ライ小麦、大麦、小麦及び／または醸造用穀類）の湿式または乾式粉砕由来の副産物等であるが、それらに限られない、リグノセルロース系、ヘミセルロース系またはセルロース系材料である。例示的なセルロース系材料は、木材、紙及びパルプ廃棄物、葉状植物及び果実パルプを含む。いくつかの実施態様において、炭素源は、任意の植物の一部、例えば、茎、穀粒、根または塊茎等を含む。いくつかの実施態様において、以下の植物のいずれかの全部または一部が炭素源として用いられる：トウモロコシ、小麦、ライ麦、モロコシ、ライ小麦、米、キビ、大麦、キャッサバ、豆及びエンドウ豆のような豆果、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ及び／またはタピオカ。いくつかの実施態様において、炭素源は、バイオマス加水分解産物、例えば、キシロース及びグルコースの両方を含むバイオマス加水分解産物またはショ糖及びグルコースの両方を含むバイオマス加水分解産物等である。
いくつかの実施態様において、再生可能な炭素源（例えば、バイオマス）は、細胞培養培地に添加される前に、前処理される。いくつかの実施態様において、前処理は、酵素前処理、化学的前処理または酵素及び化学的前処理の両方の組み合わせを含む（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ他、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９６巻（１８）、２０１４−２０１８ページ、２００５年、米国特許番号６，１７６，１７６、米国特許番号６，１０６，８８８を参照されたい。これらは、特に、再生可能な炭素源の前処理に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施態様において、再生可能な炭素源は、細胞培養培地に添加される前に、部分的または完全に加水分解される。
いくつかの実施態様において、再生可能な炭素源（例えば、トウモロコシ茎葉）は、細胞培養培地に添加される前に、アンモニア繊維伸張（ＡＦＥＸ）前処理を受ける（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ他、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第９６巻（１８）、２０１４−２０１８ページ、２００５年を参照されたい）。ＡＦＥＸ前処理中に、再生可能な炭素源は、約５分間、中温（例えば、約６０〜約１００℃）及び高圧（例えば、約２５０〜約３００ｐｓｉ）で液体の無水アンモニアで処理される。次に、圧力は急速に解放される。この工程において、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース脱結晶化及び増加表面積の組み合わされた化学的及び物理的な影響は、セルロース及びヘミセルロースから発酵性糖への完全に近い酵素変換を可能にする。ＡＦＥＸ前処理は、アンモニアのほとんど全てを回収し、再使用出来る利点を有する一方、残りは、後続加工で微生物のための窒素源として役立つ。また、洗浄ストリームは、ＡＦＥＸ前処理に必要とされない。従って、ＡＦＥＸ処理に続く乾燥物質の回収は、本質的に１００％である。ＡＦＥＸは基本的に、乾燥−乾燥工程である。処理された再生可能な炭素源は、長期間、安定であり、酵素加水分解または発酵工程で非常に多い固体添加量で供給されることが出来る。セルロース及びヘミセルロースは、分解がほとんどもしくは全くなく、ＡＦＥＸ工程でよく保存される。ＡＦＥＸ前処理を受けた再生可能な炭素源の酵素加水分解前に、中和の必要はない。ＡＦＥＸ処理された炭素源の酵素加水分解は、続く発酵使用のためのきれいな糖質ストリームをもたらす。
いくつかの実施態様において、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、少なくともまたは約０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０％のグルコース（ｗ／ｖ）と同等である。グルコースの等価量は、炭素源からのグルコース量の測定値の基準としてのグルコースによる標準的なＨＰＬＣ方法を用いて決定することが出来る。いくつかの実施態様において、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、約０．１及び約２０％の間のグルコース、例えば、約０．１及び約１０％の間のグルコース、約０．５及び約１０％のグルコース、約１及び約１０％の間のグルコース、約１及び約５％の間のグルコースまたは約１及び約２％の間のグルコースと同等である。
いくつかの実施態様において、炭素源は、酵母抽出物または酵母抽出物の一以上の成分を含む。いくつかの実施態様において、酵母抽出物の濃度は、培養液（ｇ／Ｌ、培養液の容量は、細胞培地の容量及び細胞の容量の両方を含む）のリットル当たり、少なくとも１グラムの酵母抽出物、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００ｇ／Ｌまたはそれ以上である。いくつかの実施態様において、酵母抽出物の濃度は、約１及び約３００ｇ／Ｌの間、例えば、約１及び約２００ｇ／Ｌの間、約５及び約２００ｇ／Ｌの間、約５及び約１００ｇ／Ｌの間、または約５及び約６０ｇ／Ｌの間である。いくつかの実施態様において、濃度は、宿主細胞の培養前に及び／または培養中に添加される酵母抽出物の総量を含む。いくつかの実施態様において、炭素源は、酵母抽出物（または、その一以上の成分）及びグルコースのような別の炭素源の両方を含む。いくつかの実施態様において、酵母抽出物対別の炭素源の比率が、約１：５、約１：１０または約１：２０（ｗ／ｗ）である。
加えて、炭素源はまた、二酸化炭素またはメタノールのような一炭素原子基質とすることが出来る。単一炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはギ酸塩）からのグリセロール生産は、メチロトローフ酵母（山田他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第５３巻（２）、５４１−５４３ページ、１９８９年を参照されたい。これは、特に、炭素源に関して、参照によりその全体が組み込まれる）及び細菌（Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２４巻、４１４８−４１５５ページ、１９８５年を参照されたい。これは、特に、炭素源に関して、参照によりその全体が組み込まれる）において報告されている。これらの有機体は、メタンからギ酸塩までの酸化状態で、単一の炭素化合物を同化し、グリセロールを生成することが出来る。炭素同化の経路は、リブロース一リン酸を介するか、セリンを介するか、またはキシルロース一リン酸（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、細菌の代謝（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州、１９８６年を参照されたい。これは、特に、炭素源に関して、参照によりその全体が組み込まれる）を介することが出来る。リブロース一リン酸経路は、リブロース−５−リン酸とギ酸塩との凝結を伴い、フルクトース及び最終的に三炭素生産物グリセリンアルデヒド−３−リン酸になる六炭素糖質を生成する。同様に、セリン経路は、メチレンテトラヒドロ葉酸を介して解糖経路に一炭素原子化合物を同化させる。
一個及び二個の炭素基質に加えて、化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン及び代謝活性のための様々なアミノ酸等を含む、多くの他の炭素を利用するメチロトローフ有機体も知られる。例えば、メチルアミンからの炭素を利用し、トレハロースまたはグリセロールを生成するメチロトローフ酵母が知られる（Ｂｅｌｌｉｏｎ他、微生物増殖Ｃｌ化合物（Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．）（Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｌ Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］）、第７版、４１５−３２ページ、Ｍｕｒｒｅｌｌ他編集、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ出版、英国、１９９３年を参照されたい。これは、特に、炭素源に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。同様に、種々のカンジダは、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ他、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１５３巻（５）、４８５−９ページ、１９９０年を参照されたい。これは、特に、炭素源に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。
いくつかの実施態様において、細胞は、生理食塩及び栄養素を含む標準的な培地で培養される（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．他、セルロース分解の生化学及び遺伝学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）、Ａｕｂｅｒｔ他編集、アカデミックプレス、７１−８６ページ、１９８８年及びＩｌｍｅｎ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第６３巻、１２９８−１３０６ページ、１９９７年を参照されたい。これらは、特に、細胞培地に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。例示的な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培養液、サブロー・デキストロース（ＳＤ）培養液または酵母培地（ＹＭ）培養液のような共通の商業上調製された培養地である。他の画定または合成増殖培地も用いられることができ、特定の宿主細胞の増殖のための適切な培地が、微生物学または発酵科学の当業者に知られる。
適切な炭素源に加えて、細胞培地は、適した鉱物、塩、補助因子、バッファー及び培養の増殖またはイソプレン生産の増進に適する当業者に既知の他の成分を望ましいように含む（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６及びその引用文献並びにＷＯ９６／３５７９６及びその引用文献を参照されたい。これらは、特に、細胞培地及び細胞培養条件に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路核酸が、誘導プロモーターの制御下にある場合、誘発剤（例えば、糖質、金属塩または抗生物質）が、イソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するのに有効な濃度で培地に望ましいように添加される。いくつかの実施態様において、細胞培地は、一以上のＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸を有するベクター上で抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン耐性核酸）に対応する抗生物質（例えば、カナマイシン）を有する。
例示的な細胞培養条件
細菌培養の維持及び増殖に適する材料及び方法は、当該技術分野でよく知られている。例示的な技術は、一般的な細菌学のための方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｅｒｈａｒｄｔ他編集、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．（１９９４年）、またはバイオテクノロジーにおけるブロック：工業微生物学の教科書（Ｂｒｏｃｋ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）、シナウアー（Ｓｉｎａｕｅｒ）アソシエーツ・インク、サンダーランド、マサチューセッツ州（これらは、特に、細胞培養技術に関して、参照によりその全体が組み込まれる）で見ることが出来る。いくつかの実施態様において、細胞は、宿主細胞に挿入された核酸によりコードされた、一以上のイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を可能にする条件下の培養地で培養される。
標準的細胞培養条件が、細胞の培養に用いることが出来る（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６及びその引用文献を参照されたい。これらは、特に、細胞培養及び発酵条件に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。細胞は、適切な温度、ガス混合及びｐＨで（例えば、約２０〜約３７℃、約６％〜約８４％ＣＯ２及び約５〜約９に間のｐＨで）増殖及び維持される。いくつかの実施態様において、細胞は、３５℃で適切な細胞培地内で増殖する。いくつかの実施態様において、例えば、所望量のイソプレン生産が達成されるまで、振盪培養または発酵槽内の適切な培地は、およそ２８℃で培養される。いくつかの実施態様において、発酵のためのｐＨ領域は、ｐＨ５．０及びｐＨ９．０の間（例えば、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ８．０または約ｐＨ６．５〜約ｐＨ７．０）である。反応は、宿主細胞の必要条件に基づき好気性か、無酸素症か、嫌気条件系下で行われることが出来る。所与の糸状菌の例示的な培養条件は、当該技術分野内で知られており、科学文献及び／またはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション及び菌性遺伝学（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ストックセンターのような真菌の供給源で見られることが出来る。
多様な実施態様において、細胞は、発酵、例えば、回分発酵、流加回分または連続工程の任意の既知の発酵方法を用いて増殖される。いくつかの実施態様において、発酵の回分法が用いられる。伝統的な回分発酵は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更はなされない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に植菌されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「回分」発酵は炭素源の添加に関する回分であり、ｐＨや酸素濃度等の因子を制御する試みは頻繁になされる。回分系において、当該系の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで常時変化し続ける。回分培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に増加し、最終的には、成長速度が減少または停止する静止期に至る。いくつかの実施態様において、対数増殖期での細胞が、イソプレン生産の大部分を占める。いくつかの実施態様において、静止期での細胞は、イソプレンを生産する。
いくつかの実施態様において、標準的な回分系における変形、例えば、流加回分系が用いられる。流加回分発酵工程は、炭素源が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的な回分系から成る。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、細胞培地中の炭素源の量を制限することが望ましい場合に、流加回分系が有用である。流加回分発酵は、限定量または超過量の炭素源（例えば、グルコース）で行われることが出来る。流加回分系において炭素源濃度を実測することは困難であり、それにより、例えば、ｐＨ、溶存酸素量及びＣＯ２のような廃ガスの分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて炭素源濃度を推定する。回分及び流加回分発酵は、当該技術分野において良く知られ、その例は、ブロック、バイオテクノロジー：工業微生物学の教科書（Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）、シナウアー（Ｓｉｎａｕｅｒ）アソシエーツ・インクで見ることが出来る。この文献は、特に、細胞培養及び発酵条件に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施態様において、連続発酵法が用いられる。連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、等価量のならし培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）が発酵工程から除去される。一般に、連続発酵では、培地は一定の高密度で維持され、細胞は主として対数増殖期にある。
連続発酵により、細胞増殖またはイソプレン生産の濃度に影響を与える一または任意数の因子の調節が可能となる。例えば、一の方法は、一定の割合で提供される炭素源または窒素レベルのような栄養素を制限し、その他全てのパラメーターを加減する方法である。別の方式では、細胞濃度（例えば、培養地濁度により測定される濃度）を一定に保ちつつも、増殖に影響する多くの因子を連続的に変化させることが出来る。連続系は定常状態の増殖条件を維持することから、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞増殖速度と等しくなる必要がある。連続発酵工程における栄養素及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知である。また、様々な方法がブロック、バイオテクノロジー：工業微生物学の教科書（Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）、シナウアー（Ｓｉｎａｕｅｒ）アソシエーツ・インクで詳述される。この文献は、特に、細胞培養及び発酵条件に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施態様において、細胞は全体の細胞触媒として基質上で固定され、イソプレン生産のための発酵条件にさらされる。
いくつかの実施態様において、液体培養のボトルは、液体に酸素を導入し、培養の均一性を維持するためにシェーカーに置かれる。いくつかの実施態様において、インキュベーターは、温度、湿気、振とう速度及び／または培養する他の条件を制御するために用いられる。最も単純なインキュベーターは、通常〜６５℃にまで上昇する調整可能なヒーターを伴う隔離された箱である。より精巧なインキュベーターは、温度を（冷却を介して）低下させる能力、または湿度またはＣＯ２レベルを制御する能力をさらに含み得る。ほとんどのインキュベーターはタイマーを含む。いくつかについては、異なる温度、湿度レベル等を介して循環するようにプログラムすることが出来る。インキュベーターは、卓上サイズから小部屋のサイズまで多様であることが出来る。
望まれる場合、栄養素を補給し、及び／または潜在的に有害な代謝副産物及び死細胞の蓄積を避けるために、細胞培地の一部または全部が変更されることが出来る。懸濁培養の場合には、細胞は、浮遊培養を遠心分離またはろ過し、培養地から分離し、次に、新しい培地内の細胞を再懸濁することが出来る。付着培養の場合には、培地は、吸引により直接採取し交換することが出来る。いくつかの実施態様において、細胞培地は、連続培養（例えば、希釈されていない連続培養）内の少なくとも細胞の一部を少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５またはそれ以上の細胞分裂に分割することを可能にする。
いくつかの実施態様において、構成的または漏出プロモーター（ｌｅａｋｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えば、Ｔｒｃプロモーター）が用いられ、プロモーターと操作可能に連結されたイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するための化合物（例えば、ＩＰＴＧ）は添加されない。いくつかの実施態様において、プロモーターと操作可能に連結されたイソプレン・シンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩまたはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するための化合物（例えば、ＩＰＴＧ）が添加される。
例示的なイソプレンの生産
いくつかの実施態様において、細胞は、細胞によるイソプレンの生産を可能にする条件下の培養地で培養される。「ピーク絶対生産性」は、特定の時間（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）で細胞の培養中のオフガス内のイソプレンの最大の絶対量を意味する。「ピーク絶対生産性到達時点」は、オフガス内のイソプレンの絶対量が特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）、最大である時の発酵操業中の時点を意味する。いくつかの実施態様において、イソプレン量はピーク絶対生産性到達時点で測定される。いくつかの実施態様において、細胞のピーク絶対生産性は、およそ本明細書で開示するイソプレン量のいずれかである。
「ピーク比生産性」は、特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）、一個の細胞当たりで生産されたイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比生産性到達時点」は、細胞当たりで生産されたイソプレンの量が最大である時の特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）の時点を意味する。ピーク比生産性は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学密度により決定された細胞量で総生産性を割ることにより算出される。いくつかの実施態様において、イソプレン量はピーク比生産性到達時点で測定される。いくつかの実施態様において、細胞のピーク比生産性は、およそ本明細書で開示する細胞当たりのイソプレン量のいずれかである。
「ピーク容積測定生産性」は、特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）に培養液の容量（細胞及び細胞培地の容量を含む）当たりで生産されたイソプレンの最大量を意味する。「ピーク容積測定比生産性到達時点」は、培養液の容量当たりで生産されたイソプレンの量が最大である時の特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）の時点を意味する。ピーク容積測定比生産性は、培養液の容量及び時間で総生産性を割ることにより算出される。いくつかの実施態様において、イソプレン量はピーク比生産性到達時点で測定される。いくつかの実施態様において、イソプレン量はピーク容積測定比生産性到達時点で測定される。いくつかの実施態様において、細胞のピーク容積測定比生産性は、およそ本明細書で開示する時間当たりの容量当たりのイソプレン量のいずれかである。
「ピーク濃度」は、特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）に生産されたイソプレンの最大量を意味する。「ピーク濃度到達時点」は、細胞当たりで生産されたイソプレンの量が最大である時の特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）の時点を意味する。いくつかの実施態様において、イソプレン量はピーク濃度到達時点で測定される。いくつかの実施態様において、細胞の最大濃度は、およそ本明細書で開示するイソプレン量のいずれかである
「平均容積測定生産性」は、特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）に培養液の容量（細胞及び細胞培地の容量を含む）当たりで生産されたイソプレンの平均量を意味する。平均容積測定生産性は、培養液の容量及び時間で総生産性を割ることにより算出される。いくつかの実施態様において、平均比容積測定生産性は、およそ本明細書で開示する時間当たりの容量当たりのイソプレン量のいずれかである。
「累計生産性」は、特定の期間の細胞の培養中（例えば、特定の発酵操業中の細胞の培養）に生産されたイソプレンの累積的な総量を意味する。いくつかの実施態様において、イソプレンの累積的な総量が測定される。いくつかの実施態様において、細胞の累計生産性は、およそ本明細書で開示されるイソプレン量のいずれかである。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は少なくともまたは約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１２，５００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１８８，０００またはそれ以上のイソプレンのｎｍｏｌ／細胞の湿重量での細胞のグラム数／時間（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間）でイソプレンを生産する。いくつかの実施態様において、イソプレンの量は、約２から約２００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間の間、例えば、約２から約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１００から約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１５０から約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約５００から約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００から約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約２，０００から約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約５，０００から約１０，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１０，０００から約５０，０００ｎｍｏｌ／ｇＷｃｍ／時間、約５０，０００から約１００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１００，０００から約１５０，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時または約１５０，０００から約２００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間の間である。いくつかの実施態様において、イソプレンの量が約２０から約２００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１００から約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約２００から約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約２００から約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約３００から約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約４００から約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００から約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約２，０００から約２０，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約５，０００から約５０，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約１０，０００から約１００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間、約２０，０００から約１５０，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間または約２０，０００から約２００，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間の間である。
ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間の単位でのイソプレンの量は、米国特許番号５，８４９，９７０で開示されるように測定することが出来る。これらは、特に、イソプレン生産の測定に関して、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、標準気体クロマトグラフィー系、例えば、ｎ−オクタン／ポラシルＣカラム（ｎ−ｏｃｔａｎｅ／ｐｏｒａｓｉｌ Ｃ ｃｏｌｕｍｎ）（オールテック（Ａｌｌｔｅｃｈ）アソシエーツ・インク、ディアフィールド、イリノイ州）有し、ＲＧＤ２酸化第二水銀還元ガス検定器（トレース・アナリティカル（Ｔｒａｃｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）、メンローパーク、カリフォルニア州）が連結された、等温（８５℃）で実施される系を用いて、２ｍＬのヘッドスペース（例えば、培養からのヘッドスペース、例えば、およそ３時間、２００ｒｐｍで振動し、３２℃の密封したバイアル内で培養された２ｍＬの培養液）をイソプレンについて分析する（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他、Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．、第２１巻Ａ、２６８９−２６９２ページ、１９９３年、Ｓｉｌｖｅｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第９７巻、１５８８−１５９１ページ、１９９１年を参照されたい。これらは、特に、イソプレン生産の測定に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。ガスクロマトグラフィー領域単位は、標準的なイソプレン濃度検量線を介してｎｍｏｌイソプレンに転換される。いくつかの実施態様において、細胞の湿重量での細胞のグラム値は、細胞培養のサンプルのＡ６００値を得、次に、既知のＡ６００値を用いた細胞培養の湿重量の検量線に基づきＡ６００値を細胞のグラム数に転換することにより計算される。いくつかの実施態様において、細胞のグラム数は、１のＡ６００値を有する培養液１リットル（細胞培地及び細胞を含む）が、１グラムの細胞湿重量を有していると仮定することにより推測される。前記値は、培養をインキュベートした時間、例えば、３時間で割られる。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００またはそれ以上のイソプレンのｎｇ／細胞の湿重量での細胞のグラム数／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間）でイソプレンを生産する。いくつかの実施態様において、イソプレンの量は、約２から約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間の間、例えば、約２から約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約１００から約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約５００から約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００から約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間または約２，０００から約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間の間である。いくつかの実施態様において、イソプレンの量は、約２０から約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約１００から約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約２００から約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約２００から約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間、約３００から約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間または約４００から約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間の間である。ｎｇ／ｇｗｃｍ／時間でのイソプレンの量は、（下記の式５で記載するように）上述のｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間の単位のイソプレン生産の値に６８．１を掛けることにより計算することが出来る。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００またはそれ以上のイソプレンのｍｇ／培養液のＬ（ｍｇ／Ｌ培養液、ここで、培養液の容量は、細胞及び細胞培地の容量を含む）でイソプレンの累積的な力価（総量）を生産する。いくつかの実施態様において、イソプレンの量は、約２から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液の間、例えば、約２から約１００ｍｇ／Ｌ培養液、約１００から約５００ｍｇ／Ｌ培養液、約５００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液、約１，０００から約２，０００ｍｇ／Ｌ培養液または約２，０００から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液の間である。いくつかの実施態様において、イソプレンの量は、約２０から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液、約１００から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液、約２００から約２，０００ｍｇ／Ｌ培養液、約２００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液、約３００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液または約４００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液の間である。
振盪フラスコまたは同様の培養からのイソプレンのｍｇ／ヘッドスペースのＬにおけるイソプレンの比生産性は、（記載のものとしての例で、例えば、実施例Ｉ、パートＩＩで記載するように）およそ１．０のＯＤ６００値で細胞培養から１ｍ１のサンプルを採取し、２０ｍＬバイアルに入れ、３０分間インキュベートし、次に、ヘッドスペースにおけるイソプレンの量を測定することにより測定することが出来る。ＯＤ６００値が１．０でない場合、ＯＤ６００値で分割することにより１．０のＯＤ６００値に測定値を標準化することが出来る。ｍｇイソプレン／Ｌヘッドスペースの値は３８の因数だけ増加することにより培養液のｍｇ／Ｌ培養液／時間／ＯＤ６００に転換することが出来る。イソプレンのｍｇ／培養液のＬの単位における累積的な力価を得るためにｍｇ／Ｌ培養液／時間／ＯＤ６００の単位内の値に時間数及びＯＤ６００値を掛けることが出来る。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は、約０．１、１．０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００またはそれ以上のイソプレンのｍｇ／培養液のＬ／時間（ｍｇ／Ｌ培養液／時間、ここで、培養液の容量は、細胞及び細胞培地の容量を含む）でイソプレンの平均容積測定生産性を有する。いくつかの実施態様において、イソプレンの平均容積測定生産性は、約０．１から約３，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間の間、例えば、約０．１から約１００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１００から約５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約５００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，０００から約１，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，５００から約２，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２，０００から約２，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２，５００から約３，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間または約３，０００から約３，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間の間である。いくつかの実施態様における、イソプレンの平均容積測定生産性は、約１０から約３，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１００から約３，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２００から約１，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，０００から約３，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間または約１，５００から約３，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間である。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は、約０．５、１．０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、６，０００、６，２５０、６，５００、６，７５０、７，０００、７，２５０、７，５００、７，７５０、８，０００、８，２５０、８，５００、８，７５０、９，０００、９，２５０、９，５００、９，７５０、１０，０００、１２，５００、１５，０００またはそれ以上のイソプレンのｍｇ／培養液のＬ／時間（ｍｇ／Ｌ培養液／時間、ここで、培養液の容量は、細胞及び細胞培地の容量を含む）でイソプレンのピーク容積測定生産性を有する。いくつかの実施態様において、イソプレンのピーク容量測定生産性は、約０．５から約１５，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間の間、例えば、約０．５から約１０ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１．０から約１００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１００から約５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約５００から約１，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，０００から約１，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，５００から約２，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２，０００から約２，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２，５００から約３，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約３，０００から約３，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約３，５００から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約５，０００から約７，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約７，５００から約１０，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１０，０００から約１２，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間または約１２，５００から約１５，００ｍｇ／Ｌ培養液／時間の間である。いくつかの実施態様において、イソプレンのピーク容積測定生産性は、約１０から約１５，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１００から約２，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約１，０００から約５，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約２，５００から約７，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約５，０００から約１０，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間、約７，５００から約１２，５００ｍｇ／Ｌ培養液／時間または約１０，０００から約１５，０００ｍｇ／Ｌ培養液／時間の間である。
発酵槽内のｍｇ／Ｌ培養液／時間における瞬間イソプレン生産速度は、例えば、実施例Ｉ、パートＩＩで記載されるように発酵槽オフガスのサンプルを採取し、イソプレンの量（Ｌガス当たりのイソプレンのｍｇのような単位で）について分析し、また、この値にオフガスが培養液の各リットルを通る速度（例えば、１ｖｖｍ（ガスの容量／培養液の容量／分）は時間当たり６０Ｌガスである。）を掛けることで算出される。従って、１ｍｇ／Ｌガスのオフガス量は、１ｖｖｍの気流で６０ｍｇ／Ｌ培養液／時間の瞬間生産速度に対応する。望まれる場合、単位ｍｇ／Ｌ培養液／時間での値をＯＤ６００値で割ることで、ｍｇ／Ｌ培養液／時間／ＯＤの単位での比速度を得ることが出来る。ｍｇイソプレン／Ｌガスの平均値は、この平均オフガス・イソプレン濃度に発酵中の発酵培養液のリットル当たりで散布されたオフガスの総量を掛けることで、総生産物生産性（発酵培養液のリットル当たりのイソプレンのグラム、ｍｇ／Ｌ培養液）に換算することが出来る。従って、１ｖｖｍで１０時間の０．５ｍｇ／Ｌ培養液／時間の平均オフガス・イソプレン濃度は、３００ｍｇイソプレン／Ｌ培養液の総生産物濃度に対応する。
いくつかの実施態様において、培養内の細胞は、細胞培養培地内の炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、２．０、２．２、２．４、２．６、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２３．２、２３．４、２３．６、２３．８、２４．０、２５．０、３０．０、３１．０、３２．０、３３．０、３５．０、３７．５、４０．０、４５．０、４７．５、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０または９０．０モル％またはそれ以上をイソプレンへ転換する。いくつかの実施態様において、イソプレンへの炭素の転換率（パーセント）は、約０．００２から約９０．０モル％の間、例えば、約０．００２から約０．００５％、約０．００５から約０．０１％、約０．０１から約０．０５％、約０．０５から約０．１５％、約０．１５から約０．２％、約０．２から約０．３％、約０．３から約０．５％、約０．５から約０．８％、約０．８から約１．０％、約１．０から約１．６％、約１．６から約３．０％、約３．０から約５．０％、約５．０から約８．０％、約８．０から約１０．０％、約１０．０から約１５．０％、約１５．０から約２０．０％、約２０．０から約２５．０％、約２５．０％から３０．０％、約３０．０％から３５．０％、約３５．０％から４０．０％、約４５．０％から５０．０％、約５０．０％から５５．０％、約５５．０％から６０．０％、約６０．０％から６５．０％、約６５．０％から７０．０％、約７５．０％から８０．０％、約８０．０％から８５．０％または約８５．０％から９０．０％である。いくつかの実施態様において、イソプレンへの炭素の転換率（パーセント）は、約０．００２から約０．４モル％、０．００２から約０．１６モル％、０．０４から約０．１６モル％、約０．００５から約０．３モル％、約０．０１から約０．３モル％、約０．０５から約０．３モル％、約０．１から約０．３モル％、約０．３から約１．０モル％、約１．０から約５．０
モル％、約２から約５．０モル％、約５．０から約１０．０モル％、約７から約１０．０モル％、約１０．０から約２０．０モル％、約１２から約２０．０モル％、約１６から約２０．０モル％、約１８から約２０．０モル％、約１８から約２３．２モル％、約１８から約２３．６モル％、約１８から約２３．８モル％、約１８から約２４．０モル％、約１８から約２５．０モル％、約２０から約３０．０モル％、約３０から約４０．０モル％、約３０から約５０．０モル％、約３０から約６０．０モル％、約３０から約７０．０モル％、約３０から約８０．０モル％または約３０から約９０．０モル％の間である。
イソプレンへの炭素の転換率（「％炭素収率」とも呼ばれる）は、生産されたイソプレン内のモル炭素を炭素源内のモル炭素（例えば、回分及び流加されたグルコース及び酵母抽出物内の炭素のモル）で割ることにより算出出来る。（式１で示すように）この数に１００％を掛け、パーセント表示にする。
式１
Figure 0005624980
この計算について、酵母抽出物は、５０％ｗ／ｗ炭素を含むと仮定することが出来る。一例として、実施例７、パートＶＩＩＩに記載の５００リットルについて、イソプレンへの炭素の転換率（パーセント）は、式２で示すように計算することが出来る。
式２
Figure 0005624980
本明細書に記載の（実施例７、パートＶＩＩ及びＶＩＩＩ）二の５００リットルの発酵について、イソプレンへの炭素の転換率（パーセント）は、０．０４−０．０６％の間であった。０．１１−０．１６％の炭素収率は、本明細書に記載するような１４リットル系を用いて達成した。
当業者は、イソプレン生産の速度または生産されたイソプレンの量を容易に、他の単位に転換することが出来る。例示的な式は、単位間の相互交換について下記に列記する。
イソプレン生産の速度の単位（合計速度及び比速度）

式３

１ｇイソプレン／Ｌ培養液／時間＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌ培養液／時間（合計容積測定速度）

式４

１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／時間＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌ培養液／時間／ＯＤ６００（この転換は、１のＯＤ６００値を有する培養液の１リットルが、１グラムの細胞湿重量を有すると仮定する。）

式５

１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／時間＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／時間（イソプレンの分子量が所与される）

式６

１ｎｍｏｌイソプレン／ＬガスＯ２／時間＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌ培養液／時間（培養液のＬ当たりの９０Ｌ／時間のＯ２流速で）

式７

１μｇイソプレン／Ｌガスオフガス内のイソプレン＝Ｌ培養液当たり６０Ｌガスの流速（１ｖｖｍ）で６０μｇイソプレン／Ｌ培養液／時間

力価の単位（比生産性及び総力価）

式８

１ｎｍｏｌイソプレン／ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌ培養液／ＯＤ６００（この転換は、１のＯＤ６００値を有する培養液の１リットルが、およそ１５０ｍｇの合計細胞タンパク質を有すると仮定する）（比生産性）

式９

１ｇイソプレン／Ｌ培養液＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌ培養液（総力価）

望まれる場合、細胞の湿重量を含む単位のいずれかを、細胞の乾燥重量を含む対応する単位へ転換するために、式１０を用いることが出来る。

式１０

細胞の乾燥重量＝（細胞の湿重量）／３．３

本発明に包含されるいくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞は、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸を持たないが本質的に同一条件下で増殖された対応する細胞から生産されたイソプレンの量の少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍またそれ以上であるイソプレンの量を生産する。
本発明に包含されるいくつかの実施態様において、イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸及びＤＸＳ、ＩＤＩ及び／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする一以上の異種核酸を含む細胞は、異種核酸を持たないが本質的に同一条件下で増殖された対応する細胞から生産されたイソプレンの量の少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍またそれ以上であるイソプレンの量を生産する。
例示的なイソプレン精製方法
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の任意の前記方法は、イソプレンを回収する工程をさらにを含む。例えば、本発明の組成物及び方法を用いて生産されたイソプレンは、ガス・ストリッピング、分留、吸着／脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱または真空脱着、または固相に固定されたか吸収されたイソプレンの溶媒による抽出のような標準的技術を用いて、回収することが出来る（例えば、米国特許番号４，７０３，００７及び米国特許番号４，５７０，０２９を参照されたい。これらは、特に、イソプレン回収−精製方法に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施態様において、イソプレンの回収は、液体の形態（例えば、イソプレンの原液溶液または溶媒中のイソプレン溶液）でのイソプレンの単離を包含する。ガス・ストリッピングは、連続的な方法での発酵オフガス・ストリームからのイソプレン蒸気の回収を包含する。このような回収は、固相への吸着、液相への分離または直接縮合を含むが、これらに限られない、いくつかの異なる方法で達成出来る。いくつかの実施態様において、蒸気の露点より高い希薄イソプレン蒸気流の膜圧縮は、液体イソプレンの縮合をもたらす。
イソプレンの回収は、一工程または複数工程を包含することが出来る。いくつかの実施態様において、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の回収及び液相へのイソプレンの転換は、同時に行われる。例えば、イソプレンは、オフガス・ストリームから直接圧縮し、液体を生成することが出来る。いくつかの実施態様において、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の回収及び液相へのイソプレンの転換は、連続して行われる。例えば、イソプレンは固相に吸着され、次に、溶媒により固相から抽出されてもよい。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の任意の前記方法は、イソプレンを精製することをさらに含む。例えば、本発明の組成物及び方法を用いて生産されたイソプレンは、標準的技術を用いて精製することが出来る。精製は、イソプレンが生産された際に存在する一以上の成分からイソプレンが分離される工程をいう。いくつかの実施態様において、イソプレンは本質的に純正液体として得られる。精製方法の例は、（ｉ）液体抽出物の溶液からの蒸留及び（ｉｉ）クロマトグラフィーを含む。本明細書で用いる「精製イソプレン」は、イソプレンが生産された際に存在する一以上の成分から分離されたイソプレンを意味する。いくつかの実施態様において、イソプレンは、重量で、少なくとも約２０％であり、イソプレンが生産された際に存在する他の成分がない。多様な実施態様において、イソプレンは、重量で、少なくともまたは約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％または９９％の純度である。純度は、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ解析またはＧＣ−ＭＳ解析のような任意の適切な方法で分析出来る。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の任意の前記方法は、イソプレンを重合する工程をさらに含む。例えば、標準的方法で精製イソプレンを重合し、標準的方法を用いてシス−ポリイソプレンまたは他の下流生産物を生成することが出来る。
追加の方法及び組成物は、２００８年９月１５日に出願された米国仮特許出願番号６１／０９７，１８６、２００８年９月１５日に出願された米国仮特許出願番号６１／０９７，１８９、２００８年９月１５日に出願された米国仮特許出願番号６１／０９７，１６３、及び米国特許出願シリアル番号１２／３３５，０７１で記載される。これらは、特に、イソプレンを生産する組成物及び方法に関して、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明のイソプレンは、石油化学源に由来するイソプレンに適用可能な同様の技術を利用して、合成ゴムを含む有用な重合体に重合することが出来る。このようなイソプレン含有重合体の重合及び回収は、ジエン単量体重合工程に適する多様な方法に従って適切に行なわれる。この方法は、空気及び他の大気汚染、特に、酸素及び湿気を除外する条件下の回分式、半連続式または連続式の操作を含む。イソプレン単量体の重合はまた、回分重合、気相重合、溶液重合、懸濁重合、乳化重合及び沈殿重合系を含むが、それらに限られない、多くの異なる重合反応器系で行なわれてもよい。重合の商業上好ましい方法は通常、溶液重合及び乳化重合である。
重合反応はまた、ありとあらゆる異なる重合開始剤または触媒系を用いて開始することが出来る。使用される開始剤または触媒系は、合成されるイソプレン含有重合体の所望の特性に依存する。例えば、シス−１，４−ポリイソプレン・ゴムが作られる場合、四塩化チタン及びトリエチル・アルミニウムから成るチーグラー・ナッタ触媒系を利用することが出来る。他のタイプのイソプレン含有重合体の合成において、他のタイプの開始剤系が必要とされることが出来る。例えば、イソプレン含有重合体は、遊離基開始剤、レドックス開始剤、アニオン重合開始剤またはカチオン重合開始剤を用いて作ることが出来る。好ましい開始剤または触媒系は、望まれる重合体のミクロ構造、分子量、分子量分布及び鎖の分岐に依存する。好ましい開始剤はまた、イソプレンがホモ重合体化または追加の単量体と共重合されているかどうかに依存する。共重合体の場合、用いられる開始剤はまた、重合体が特定の単量体に由来する反復単位の無作為の分布、無作為ではない分布または先細りの分布を有するように作られることが望ましいかどうかに依存する。例えば、アニオン重合開始剤または制御された遊離基開始剤は通常、イソプレンブロックを有するブロック共重合体の合成で用いられる。
用いる開始剤または触媒系が、用いる重合系のタイプと適合することは重要である。例えば、乳化重合において、遊離基開始剤が通常利用される。溶液重合において、アルキルリチウム化合物のようなアニオン重合開始剤が、重合の開始に通常用いられる。遊離基重合の利点は、イオン重合より厳密でない条件下で反応を通常行うことが出来るということである。遊離基開始系はまた、微量不純物について大きな許容量を示す。
従来の乳化処方も本発明に係るイソプレンの重合で用いることが出来るが、追加の共単量体の包含または重合のパラメータの限定のいずれかから、何らかの限定と修正が生じ得る。スルホン酸塩洗剤を含む当該技術分野で既知のイオン性界面活性剤及びカルボン酸塩、硫酸塩及びリン酸塩含有石鹸が、本発明に有用である。イオン性界面活性剤の量は、有機成分の総重量に基づき計算され、有機成分の重量で１００部当たり、イオン性界面活性剤の重量で約２〜３０部の範囲とすることが出来る。
本発明の実施において有用な遊離基開始剤の例は、「レドックス」開始剤として知られているものであり、例えば、キレート鉄塩、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム及び有機ヒドロペルオキシドの組み合わせが挙げられる。有機ヒドロペルオキシドの代表例は、クメンヒドロペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシ及び第三級ブチルヒドロペルオキシドが挙げられる。第三級ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢＨＰ）、第三級ブチル過酢酸（ｔ−ＢＰＡ）及びアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等の「アゾ」開始剤が好ましい。
遊離基重合で利用される反応温度は通常、０℃〜１５０℃の範囲で維持される。約２０℃から１２０℃の間の温度が一般に好ましい。また、６０℃から１００℃の範囲の温度が一般に最も好ましい。反応の圧力は重要ではない。圧力は通常、単に液相反応条件が維持される十分な高さであり、反応混合物の成分と温度に応じて変化する自己発生的な圧力であることが出来る。あるいは、圧力は、例えば、１０００ｐｓｉまでの高さであることが出来る。
回分式の操作において、重合時間は、数分から数十日まで所望に応じて変えることが出来る。回分式プロセスにおける重合は、単量体がもはや吸収されなくなったときまたは望まれる場合その前に終結させてよく、あるいは所望によりもっと早くてもよく、例えば、反応混合物の粘度が過度に高くなったときに終結させることが出来る。連続式の操作において、重合混合物は、任意の適した設計の反応器または一連の反応器を通過することが出来る。その場合の重合反応は、反応器系での滞留時間を変えることにより適当に調節される。滞留時間は反応器系のタイプに応じて変化し、１０〜１５分から２４時間またはそれ以上の範囲である。反応混合物中の単量体の濃度は、反応混合物の５重量パーセント以上で変化させてよく、これは用いる条件に依存し、２０から８０重量パーセントの範囲が好ましい。
イソプレンの重合はまた、反応条件下で液体であって比較的不活性な適当な有機溶剤中で実施することが出来る。溶媒は、分子当たり、ジエン反応物質と同数の炭素原子を有していてもよく、あるいはそれは異なる沸点範囲のものであってもよい。好ましい有機溶媒は通常、アルカン炭化水素及びシクロアルカン炭化水素である。溶媒は、一以上の芳香族、パラフィンまたはシクロパラフィン化合物から成ることが出来る。これらの溶媒は通常、分子当たり約４炭素原子から分子当たり約１０炭素原子を含む。また、それらは通常、重合の条件下で液体である。適した有機溶媒のいくつかの代表的な例は、ペンタン、イソオクタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、イソヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼン、イソブチルベンゼン、石油エーテル、灯油、石油スピリット、石油ナフサ等を単独でまたは混合物として含む。ベンゼン、トルエン、イソプロピルベンゼン、キシレンのような芳香族炭化水素、またはクロロベンゼン、ブロモベンゼンまたはオルトジクロロベンゼンのようなハロゲン化芳香族化合物も用いられ得るが、ほとんどの場合、好まれない。他の有用な溶媒は、テトラヒドロフラン及びジオキサンを含む。
溶液重合において、重合培地は通常、５から３０重量パーセントの単量体を含む。このような重合培地は、当然、有機溶媒及び単量体から成る。ほとんどの場合、重合培地は、１０から２５重量パーセント単量体を含むことが好まれる。一般に、重合培地は、１５から２０重量パーセント単量体を含むことがより好まれる。
重合は通常、重合体への単量体の本質的に完全な転換に到達するために行なわれる。インクリメントの単量体の追加または連鎖移動剤は、過度のゲル生成を避けるために用いられることが出来る。このような軽微な修飾は、当業者の技術の範囲内である。重合が完了した後、重合体は、スラリーまたは重合体溶液から回収される。簡易ろ過が、希釈剤からの重合体の分離に適切であることが出来る。重合体を希釈剤から分離するための他の方法が、用いられることが出来る。残基を分離するために、反応混合物内のスラリー化と別途にまたは同時に重合体を処理することが出来る。このような処理は、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールのようなアルコール、酸性化されたアルコール、または他の同様の極性液体を用いて行われる。多くの場合において、重合体は、炭化水素溶液内で得られる。また、重合体は、酸性化されたアルコール、例えば、２％の塩酸を含む急速に撹拌されたメタノールまたはイソプロパノールによる凝固により回収されることが出来る。この初期凝固に続き、重合体は、例えば、メタノール等の適切な液体で洗浄されることが出来る。
上述のように、イソプレンはまた、有用な共重合体を構成するために一以上の追加の共単量体と共重合することが出来る。含まれるイソプレン及び包含される他の単量体の相対量に依存して、重合処方または反応条件におけるいくつかの調節が、重合体形成の十分な速度を得るために必要とされる可能性がある。本発明の実施に有用な共単量体の例は、他のジエン単量体、例えば、１，３−ブタジエン及びヘキサジエン等を含む。ビニル芳香族単量体はまた、有用な重合体を構成するイソプレンと共重合することが出来る。このようなビニル芳香族単量体は、スチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、塩化ビニル、酢酸ビニル、塩化ビニリデン、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、ビニルピリジン、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、メタクリル酸、イタコン酸及びアクリル酸を含む。異なる共単量体の混合物もまた、異なる量で用いることが出来る。
イソプレン単量体もまた、一以上の追加の共役ジオレフィン単量体と共重合することが出来る。４から８炭素原子を含むものが、商業目的で一般に好まれる。イソプレンと共重合することが出来る共役ジオレフィン単量体のいくつかの具体的な代表例は、１，３−ブタジエン、２，３−ジメチル−１，３−ブタジエン、ピペリレン、３−ブチル−１，３−オクタジエン、２−フェニル−１，３−ブタジエン等を単独でまたは混合物として含む。
イソプレンと共重合することが出来るエチレン系不飽和単量体のいくつかの代表的な例は、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリル酸メチル等のようなアクリル酸アルキル、一以上の末端ＣＨ２＝ＣＨ−基を有するビニリデン単量体、スチレンのようなビニル芳香族、α−メチルスチレン、ブロモスチレン、クロロスチレン、フルオロスチレン等、α−オレフィン、例えば、エチレン、プロピレン、１−ブテン等、ビニル・ハロゲン化物、例えば、臭化ビニル、クロロエテン（塩化ビニル）、フッ化ビニル、ビニルヨージド、１，２−ジブロモエテン、１，１−ジクロロエテン（塩化ビニリデン）、１，２−ジクロロエテン等、酢酸ビニルのようなビニルエステル、アクリロニトリル及びメタクリロニトリルのようなα、β−オレフィン系不飽和ニトリル、α、β−オレフィン系不飽和アミド、例えば、アクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メタクリルアミド等を含む。機能化された単量体も、有用なゴム状重合体を構成する際にイソプレンと任意に共重合することが出来る。ゴム状重合体に組み込むことが出来るこのタイプの機能化された単量体及び方法は、米国特許番号６，６２７，７２１及び米国特許番号６，９３６，６６９で記載される。米国特許番号６，６２７，７２１及び米国特許番号６，９３６，６６９の内容は、このような機能化された単量体及びイソプレン含有重合体へのそれらの組み込みを記載する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
１以上のジエン単量体と１以上のその他のエチレン系不飽和単量体の共重合体であるゴム状重合体は通常、約５０重量パーセントから約９９重量パーセントの共役ジオレフィン単量体（イソプレンを含む）と、この共役ジオレフィン単量体に加えて約１重量パーセントから約５０重量パーセントのその他のエチレン系不飽和単量体を含む。例えば、スチレン−イソプレン・ゴムのようなイソプレン単量体とビニル芳香族単量体のゴム状共重合体は通常、５０から９５重量パーセントのイソプレンと５から５０重量パーセントのビニル芳香族単量体を含む。
ビニル芳香族単量体はおそらく、イソプレン含有ゴムに一般的に組み込まれるエチレン系不飽和単量体のうちで最も重要なグループである。このようなビニル芳香族単量体は典型的に、８から２０の炭素原子を含む。通常、ビニル芳香族単量体は８から１４の炭素原子を含む。最も広く用いられるビニル芳香族単量体は、スチレンである。利用することが出来るビニル芳香族単量体のいくつかの例としては、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、α−メチルスチレン、４−フェニルスチレン、３−メチルスチレン等がある。
イソプレン含有ゴム状重合体のいくつかの代表的な例は、シス−１，３−ポリイソプレン・ホモ重合体ゴム、３，４−ポリイソプレン・ゴム、スチレン−イソプレン系ゴム（ＳＩＲ）、β−メチルスチレン−イソプレン系ゴム、スチレン−イソプレン−ブタジエン系ゴム（ＳＩＢＲ）、スチレン−イソプレン系ゴム（ＳＩＲ）、イソプレン−ブタジエン系ゴム（ＩＢＲ）、α−メチルスチレン−イソプレン−ブタジエン系ゴム及びα−メチルスチレン−スチレン−イソプレン−ブタジエン系ゴムを含む。ゴム状重合体が２以上の単量体から誘導される繰返し単位から成る場合、イソプレンを含む異なる単量体から誘導されるその繰り返し単位は通常、本質的に無作為な形で分布される。単量体から誘導されたその繰り返し単位は、重合反応により二重結合が通常使い尽くされるという点で、その単量体とは異なる。
ゴム状重合体は、イソプレン及び任意に追加の単量体を重合領域に連続的に装填することにり、回分式プロセスにおいて、あるいは連続式プロセスにより、溶液重合により生産することが出来る。重合領域は典型的には、重合反応器または一連の重合反応器である。重合領域の有機溶剤の全体にわたって単量体、重合体、開始剤及び調節剤が良好に分散した状態が維持されるように、重合領域は通常撹拌される。このような連続的な重合は典型的に、複数反応器系において行なわれる。合成されたゴム状重合体は、重合領域から連続的に回収される。重合領域において達成される単量体の転換率は通常、少なくとも約８５パーセントである。単量体の転換率は、少なくとも約９０パーセントであることが好ましい。
重合は、アルキルリチウム化合物のようなアニオン重合開始剤で開始されることが出来る。用いることの出来るアルキルリチウム化合物は典型的に、ｎ−ブチルリチウムのような１から約８の炭素原子を含むことが出来る。利用されたリチウム開始剤の量は、重合されている単量体、及び合成されている重合体に望まれる分子量に応じて異なる。用いられるリチウム開始剤の量は、重合される単量体に伴って、また合成される重合体について所望される分子量に伴って変化する。しかし、一般に、０．０１〜１ｐｈｍ（１００重量部の単量体当りの重量部）のリチウム開始剤が用いられる。たいていの場合、０．０１〜０．１ｐｈｍのリチウム開始剤が用いられ、０．０２５〜０．０７ｐｈｍのリチウム開始剤を用いることが好ましい。
このようなアニオン重合は、例えば、（アルキルテトラヒドロフルフリルエーテル）のような極性調節剤が存在する状態で任意に行われる。用いることが出来る具体的な極性調節剤のいくつかの代表的な例は、メチルテトラヒドロフルフリル・エーテル、エチルテトラヒドロフルフリル・エーテル、プロピルテトラヒドロフルフリル・エーテル、ブチルテトラヒドロフルフリル・エーテル、ヘキイシルテトラヒドロフルフリル・エーテル、オクチルテトラヒドロフルフリル・エーテル、ドデシルテトラヒドロフルフリル・エーテル、ジエチルエーテル、ジ−ｎ−プロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジ−ｎ−ブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコール・ジメチルエーテル、エチレングリコール・ジエチルエーテル、ジエチレングリコール・ジメチルエーテル、ジエチレングリコール・ジエチルエーテル、トリエチレングリコール・ジメチルエーテル、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチル・モルホリン、またはＮ−フェニル・モルホリンを含む。
極性調節剤対リチウム開始剤のモル比が約０．０１：１から約５：１の範囲内である量で、極性調節剤は通常用いられる。極性調節剤対リチウム開始剤のモル比はより典型的に、約０．１：１から約４：１の範囲内である。極性調節剤対リチウム開始剤のモル比が約０．２５：１から約３：１の範囲内であることが、一般的に好まれる。極性調節剤対リチウム開始剤のモル比が約０．５：１から約３：２の範囲内であることが、一般的に最も好まれる。
このようなアニオン重合で利用される重合温度は、約−２０℃から約１８０℃までの広い範囲にわたって変化し得る。たいていの場合、約３０℃〜約１２５℃の範囲内の重合温度が用いられる。典型的には、重合温度は約４５℃〜約１００℃の範囲内であることが好ましい。典型的には、重合温度は約６０℃〜約９０℃の範囲内であるのが最も好ましい。用いられる圧力は通常、重合反応の条件下で実質的に液相を維持するために十分な圧力である。
イソプレンのこのようなアニオン重合は、イソプレン、及び存在する任意の追加の単量体の本質的に完全な重合を可能にするために十分な時間に通常行われる。イソプレンのこのようなアニオン重合は、イソプレン及び存在するいずれかの追加の単量体の重合を実質的に完了させるために十分な長さの時間で行なわれる。言い換えると、重合は通常、少なくとも約８５パーセントの高い転換率が達成されるまで行われる。次いで重合は通常、アルコール、停止剤またはカップリング剤等の薬剤の添加により停止される。例えば、ハロゲン化スズ及び／またはハロゲン化ケイ素をカップリング剤として用いることが出来る。不斉カップリングが所望される場合、ハロゲン化スズ及び／またはハロゲン化ケイ素は連続的に添加される。スズカップリング剤及び／またはケイ素カップリング剤のこの連続的な添加は通常、重合の大半が起きている領域から離れた反応領域で行なわれる。カップリング剤は通常、所望の程度の転換が達成された後に、別の反応容器内に添加される。カップリング剤は、シクロヘキサン等の炭化水素溶液中で、分散と反応のための適当な混合を行いながら重合混合物に添加することが出来る。言い換えると、カップリング剤は典型的には、高度の転換がすでに達成された後にだけ添加される。例えば、カップリング剤は通常、約８５パーセントより高い単量体の転換率が実現した後にだけ添加されるだろう。典型的には、カップリング剤が添加される前に単量体の転化率が少なくとも約９０パーセントに達することが好ましい。
カップリング剤として用いられるハロゲン化スズは通常、四塩化スズ、四臭化スズ、四フッ化スズまたは四ヨウ化スズ等の四ハロゲン化スズであろう。しかし、三ハロゲン化スズも場合により用いることが出来る。三ハロゲン化スズと結びついた重合体は、最大で三個の枝を有する。これは当然、最大で四個の枝を有する四ハロゲン化スズと結びついた重合体と対比したものである。より高いレベルの分枝を誘発させるためには、四ハロゲン化スズが通常好ましい。一般に、四塩化スズが最も好ましい。
用いることの出来るケイ素カップリング剤は通常、四塩化ケイ素、四臭化ケイ素、四フッ化ケイ素または四ヨウ化ケイ素等の四ハロゲン化ケイ素である。しかし、三ハロゲン化ケイ素も場合によって用いることが出来る。三ハロゲン化ケイ素と結びついた重合体は、最大で三個の枝を有する。これは当然、最大で四個の枝を有する四ハロゲン化ケイ素と結びついた重合体と対比したものである。より高いレベルの分枝を誘発させるためには、四ハロゲン化ケイ素が通常好ましい。一般に、ケイ素カップリング剤の中では四塩化ケイ素が最も好ましい。
ゴム状重合体を結合させるために、ハロゲン化スズとハロゲン化ケイ素の組み合わせを場合によって用いることが出来る。そのようなスズとケイ素のカップリング剤の組み合わせを用いることによって、低いヒステリシス等タイヤ用ゴムのための改善された特性を達成することが出来る。シリカとカーボンブラックの両方を含むタイヤトレッド化合物において、スズとケイ素のカップリング剤の組み合わせを用いることは、特に望ましい。そのような場合、ゴム状重合体の結合に用いられるハロゲン化スズ対ハロゲン化ケイ素のモル比は通常、２０：８０から９５：５の範囲内である。ゴム状重合体の結合に用いられるハロゲン化スズ対ハロゲン化ケイ素のモル比はより典型的に、４０：６０から９０：１０の範囲内である。ゴム状重合体の結合に用いられるハロゲン化スズ対ハロゲン化ケイ素の好ましいモル比は、６０：４０〜８５：１５の範囲内である。ゴム状重合体の結合に用いられるハロゲン化スズ対ハロゲン化ケイ素の最も好ましいモル比は、６５：３５から８０：２０の範囲内である。
概括的かつ例示的に、ゴム状重合体の１００グラム当り約０．０１から４．５ミリ当量の範囲のスズカップリング剤（ハロゲン化スズとハロゲン化ケイ素）が用いられる。望ましいムーニー粘度を得るために、通常は重合体の１００グラム当り約０．０１〜約１．５ミリ当量のカップリング剤を用いることが望ましい。より多い量により、末端に反応性基または不十分な結合を含む重合体が生成する結果になりやすい。最大量の分枝を生成させるためには、１当量のリチウムにつき１当量のスズカップリング剤が最適な量であると考えられる。例えば、カップリング剤として四ハロゲン化スズと四ハロゲン化ケイ素の混合物が用いられる場合、４モルの活性リチウム末端につき１モルのカップリング剤が用いられる。カップリング剤として三ハロゲン化スズと三ハロゲン化ケイ素の混合物が用いられる場合、３モルの活性リチウム末端につき１モルのカップリング剤を用いることが最適である。カップリング剤は、シクロヘキサン等の炭化水素溶液中で、分散と反応のための適当な混合を行いながら反応器中で重合混合物に添加することが出来る。
結合が完了した後、結合したゴム状重合体を安定化するために、第三級キレート化アルキル１，２−エチレンジアミンまたは環状アルコールの金属塩を、重合体セメントに場合によって添加することが出来る。
たいていの場合、ゴム状重合体を安定化させるために、約０．０１ｐｈｒ（１００重量部の乾燥ゴム当りの重量部）から約２ｐｈｒまでのキレート化アルキル１，２−エチレンジアミンまたは環状アルコールの金属塩が重合体セメントに添加される。典型的には、約０．０５ｐｈｒから約１ｐｈｒまでのキレート化アルキル１，２−エチレンジアミンまたは環状アルコールの金属塩が添加される。より典型的には、ゴム状重合体を安定化させるために、約０．１ｐｈｒから約０．６ｐｈｒのキレート化アルキル１，２−エチレンジアミンまたは環状アルコールの金属塩が重合体セメントに添加される。
重合を停止させるために、また活動しているゴム状重合体を「終結させる（ｔｅｒｍｉｎａｔｅ）」ために用いることの出来る停止剤としては、一ハロゲン化スズ、一ハロゲン化ケイ素、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラジアルキルジアミノ−ベンゾフェノン（例えば、テトラメチルジアミノベンゾフェノン等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ−ベンズアルデヒド（例えば、ジメチルアミノベンズアルデヒド等）、１，３−ジアルキル−２−イミダゾリジノン（例えば、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン等）、１−アルキル置換ピロリジノン、１−アリール置換ピロリジノン、約５〜約２０の炭素原子を含むジアルキル−ジシクロアルキル−カルボジイミド、及び約５〜約２０の炭素原子を含むジシクロアルキル−カルボジイミドがある。
停止工程が完了した後、そして場合によって採用する安定化工程が完了した後、ゴム状重合体を有機溶剤から回収することが出来る。結合したゴム状重合体は、例えば、化学的（アルコール）凝固、熱脱溶媒（ｔｈｅｒｍａｌ ｄｅｓｏｌｖｅｎｔｉｚａｔｉｏｎ）またはその他の適当な方法により、有機溶剤及び残留物から回収することが出来る。例えば、約１〜約４の炭素原子を含む低級アルコールを重合体溶液に添加することにより、有機溶剤からゴム状重合体を沈殿させることがしばしば望ましい。重合体セメントからゴムを沈殿させるための適当な低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ノルマルプロピルアルコール及びｔ−ブチルアルコール等がある。重合体セメントからゴム状重合体を沈殿させるために低級アルコールを使用することはまた、リチウム末端基を不活性化させることにより任意の残りの活動している重合体を「終結させる（ｔｅｒｍｉｎａｔｅ）」ことになる。結合したゴム状重合体が溶液から回収された後、結合したゴム状重合体中の揮発性有機化合物の量を低減させるために蒸気ストリッピングを用いることが出来る。さらに、有機溶剤をゴム状重合体からドラム乾燥、押出機乾燥、真空乾燥等の手段により除去することが出来る。
上述のように、天然ゴムとの遊離置換を可能にする程十分に類似した合成シス−１，３−ポリイソプレン・ゴムは、四塩化チタン（ＴｉＣｌ４）から成るチーグラー・ナッタ触媒系及びトリエチル・アルミニウム、Ａｌ−（ＣＨ２−ＣＨ３）３のような有機アルミニウム化合物によるイソプレンの溶液重合により生産することが出来る。このチーグラー・ナッタ触媒系で作られるポリイソプレンゴムは、実質的には１００パーセントのシス・ミクロ構造の含有量を有するヘベアブラジリエンシス（一般のゴムの木）由来の天然ゴムの高シス・ミクロ構造の含有量とほとんど一致する９８パーセント以内の高シス・ミクロ構造の含有量を有する。しかしながら、天然ゴムよりも劣る物理的性質の重合体ミクロ構造の結果のこのわずかな差は、考慮の対照となる。例えば、天然ゴムは通常、合成シス−１，４−ポリイソプレンゴムよりも優れた湿態強度を示す。一方、他の点で、合成シス−１，４−ポリイソプレンゴムは、ヘベアブラジリエンシス、グアユールゴムノキ及びタンポポ・コック・サグヒズ（ｋｏｋ−Ｓａｇｈｙｚ）（ロシアのタンポポ）由来の天然ゴムより優れている。例えば、植物に由来することから、天然ゴムは残留タンパク質、石鹸、樹脂剤及び糖質を含む。これらの残留不純物の存在は、いくつかの応用で非常に不利益になりえる。例えば、ゴム製品内の残留タンパク質の存在は、幾人かの人々の中で重大なアレルギー反応を引き起こす場合があり、ゴム手袋、コンドーム、シリンジ・プランジャー等のようないくつかのゴム含有生産物の製造者にとって大きな懸案事項である。とにかく、本発明の合成ポリイソプレン・ホモ重合体ゴムには、ヘベアブラジリエンシス由来の天然ゴムを含む天然ゴム中にあるタンパク質、石鹸、樹脂剤及び糖質が含まれない。
米国特許番号３，９３１，１３６は、高分子量シス−１，４−ポリイソプレンを生産する工程を開示する。この工程で用いられる触媒は、（Ａ）四塩化チタン、（Ｂ）式ＡｌＲ３の有機アルミニウム化合物（ここで、各Ｒはアルキル基、好ましくは１から８個の炭素原子を含むアルキル基、アリール基、好ましくはフェニル基またはシクロアルキル基、好ましくはシクロヘキシル基を表わす）、及び（Ｃ）式：
Figure 0005624980
のベータ・ジケトン（ここで、Ｒ’及びＲ”は同一または異なることができ、アルキル基またはアリール基を表わす）の３個の構成成分の混合物である、Ｒ’Ｒ”は、１から５個の炭素原子を含むアルキル基またはフェニル基を好ましくは表わす。米国特許番号３，９３１，１３６の内容は、シス−１，４−ポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系及び重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
四塩化チタン及びトリアルキルアルミニウム化合物の混合物から成る触媒系を用いてシス−１，４−ポリイソプレンを合成するための溶液重合技術は、米国特許番号４，４３０，４８７で開示される。この工程において、重合は４，７−ジアザ−デカン−１，１０−ジアミンを用いて停止（ｓｈｏｒｔｓｔｏｐｐｅｄ）される。米国特許番号４，４３０，４８７の内容は、シス−１，４−ポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系及び重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
四ハロゲン化チタン、トリアルキルアルミニウム化合物及びジフェニルエーテルから成る触媒系を用いたイソプレンの重合によるシス−１，４−ポリイソプレンの合成は、望まれないゲルの生成をもたらし得る。米国特許番号５，９１９，８７６は、パラ−スチレン化ジフェニルアミンのようなジアリールアミンが存在する状態でこのような重合を行うことにより、ゲル生成を減少出来ることを開示する。米国特許番号５，９１９，８７６は、少なくとも一のエーテルが存在する状態で、四塩化チタンのような四ハロゲン化チタンと有機アルミニウム化合物を反応させることにより作られる、あらかじめ作製された触媒系を用いて不活性有機溶媒内でイソプレンを重合する工程を含む、低ゲル含有量を有するシス−１，４−ポリイソプレンを合成する方法をより具体的に開示する。ここで、前記重合は、約０℃から約１００℃の範囲内の温度で行われる。また、前記重合は、ジアリールアミンが存在する状態で行われる。米国特許番号５，９１９，８６７の内容は、シス−１，４−ポリイソプレン・ゴムの合成で用いることが出来る触媒系及び溶液重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
シス−１，４−ポリイソプレンは、四塩化チタンと有機アルミニウム化合物を反応させることにより作られる、あらかじめ作製された触媒を利用する気相重合により作ることが出来る。米国特許番号６，０６６，７０５は、以下の工程を含む過程でシス−１，４−ポリイソプレンにイソプレンを重合する気相の方法を開示する：（１）好ましくは少なくとも一のエーテルが存在する状態で、前記イソプレンと、四塩化チタンと有機アルミニウム化合物を反応させることにより作られる、あらかじめ作製された触媒系とを反応領域に入れる工程であって、前記イソプレンが温度及び圧力の適した組み合わせにより前記反応領域で気相に維持される、前記工程、（２）約３５℃から約７０℃の範囲内の温度で、シス−１，４−ポリイソプレンに前記イソプレンが重合することを可能にする工程、及び（３）前記反応領域から前記シス−１，４−ポリイソプレンを回収する工程。パラ−スチレン化ジフェニルアミンのようなジアリールアミンが存在する状態でイソプレン単量体の重合を行うことにより、このような気相重合でのゲル生成を減少出来ることが分かった。米国特許番号６，０６６，７０５の内容は、シス−１，４−ポリイソプレンゴムの合成で用いることが出来る触媒系と気相重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
澄んでいて（透明で）高純度のポリイソプレンゴムは、ネオジム触媒系を利用して合成することが出来る。米国特許番号６，７８０，９４８は、ネオジム触媒系が存在する状態でイソプレン単量体を重合することを含むポリイソプレンゴムの合成方法に関する。ここで、ネオジム触媒系は、（１）約１０分から約３０分間、イソプレンが存在する状態で有機アルミニウム化合物とネオジム・カルボン酸塩を反応させ、ネオジム・アルミニウム触媒成分を生成する工程、及び（２）続いて、少なくとも３０分間、ジアルキル塩化アルミニウムとネオジム・アルミニウム触媒成分を反応させ、ネオジム触媒系を生産する工程により調製される。米国特許番号５，９１９，８６７の内容は、高純度のシス−１，４−ポリイソプレンゴムの合成で用いることが出来る触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号７，０９１，１５０と米国特許番号７，１９９，２０１は、非常に高いシス−ミクロ構造の含有量と高い立体規則性を有する合成ポリイソプレンゴムにイソプレン単量体を重合するためのネオジム触媒系の使用を開示する。このポリイソプレンゴムは圧力下で結晶し、天然ゴムと類似した方法でゴム配合剤に合成されることが出来る。この技術は、ネオジム触媒系が存在する状態でイソプレン単量体を重合することを含むポリイソプレンゴムの合成の工程をより具体的に開示する。ここで、ネオジム触媒系は、（１）有機溶媒内で有機アルミニウム化合物とネオジム・カルボン酸塩を反応させ、ネオジム・アルミニウム触媒成分を生成する工程、及び（２）続いて、基本的なハロゲンとネオジム・アルミニウム触媒成分を反応させ、ネオジム触媒系を生産する工程を含む方法により調製される。この方法の実施において、ネオジム触媒系は、ニッケル含有化合物を通常欠いている。
この方法により作られた合成ポリイソプレンゴムは、イソプレンに由来する反復単位から成る。ここで、合成ポリイソプレンゴムは、９８．０％から９９．５％の範囲内のシス−ミクロ構造の含有量、０．５％から２．０％の範囲内の３，４−ミクロ構造の含有量及び０．０％から０．５％の範囲内のトランス−ミクロ構造の含有量を有する。米国特許番号７，０９１，１５０と米国特許番号７，１９９，２０１の内容は、非常に高いシス−ミクロ構造の含有量と高い立体規則性のシス−１，４−ポリイソプレン・ゴムの合成で用いることが出来るネオジム触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ランタニド二ヨウ化物のような単一成分ランタニド触媒も、非常に高いシス−ミクロ構造の含有量を有するポリイソプレンの合成に用いることが出来る。例えば、ツリウム二ヨウ化物、ジスプロシウム二ヨウ化物及びネオジム二ヨウ化物は、任意の触媒成分の追加を必要とせずに高シス−１，４−ポリイソプレン・ゴムへのイソプレンの重合を開始することが出来る。従って、ランタニド二ヨウ化物は、溶液重合条件下で高シス−１，４−ポリイソプレンへのイソプレン単量体の重合を開始するために用いることが出来る。
米国特許番号４，８９４，４２５は、官能基を持つことができ、７０パーセントより高い１，２−及び３，４−構造単位を含むポリイソプレンを合成する方法を明らかにする。この方法は、触媒としての有機リチウム化合物と助触媒としてのエーテルが存在する状態での不活性炭化水素溶剤中のイソプレンのアニオン重合に関する。ここで、用いられる助触媒は、式Ｒ１−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ２のエチレングリコール・ジアルキルエーテルである。ここで、Ｒ１とＲ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチル基から成る群から選ばれる異なる炭素原子数を有するアルキル基である。また、二種類のアルキル基Ｒ１とＲ２の炭素原子の合計は、５から７の範囲内である。米国特許番号４，８９４，４２５の内容は、高い１，２−及び３，４−ミクロ構造の含有量を有するポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号５，０８２，９０６により記載された触媒系の利用により、短い重合時間後に定量的収率で、結晶化可能な３，４−ポリイソプレンを、有機溶媒中で合成することが出来る。この触媒系を利用して作られた３，４−ポリイソプレンは圧力結晶化が可能であり、改良された静止摩擦と改良された切傷成長耐性を提供するタイヤ・トレッドに用いることが出来る。米国特許番号５，０８２，９０６は、（ａ）有機鉄化合物、（ｂ）有機アルミニウム化合物、（ｃ）キレート化芳香族アミン及び（ｄ）プロトニック酸化合物から成る触媒系が存在する状態で、約−１０℃から約１００℃の範囲内の温度でイソプレン単量体を有機溶媒中で重合する工程を含む３，４−ポリイソプレンを合成する方法を具体的に開示する。ここで、キレート化アミン対有機鉄化合物のモル比は、約０．１：１から約１：１の範囲内である。有機アルミニウム化合物対有機鉄化合物のモル比は、約５：１から約２００：１の範囲内である。また、プロトニック酸化合物対有機アルミニウム化合物のモル比は、約０．００１：１から約０．２：１の範囲内である。米国特許番号５，０８２，９０６の内容は、高い３，４−ミクロ構造の含有量を有し、圧力結晶化が可能なポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号５，３５６，９９７はまた、圧力結晶化可能な３，４−ポリイソプレンの合成の方法に関する。この３，４−ポリイソプレンは、約６５％から約８５％の範囲内のある３，４−ミクロ構造の含有量、約１５％から約３５％の範囲内のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有し、また本質的にトランス−１，４−ミクロ構造または１，２−ミクロ構造を有さない。この３，４−ポリイソプレンは、短い重合時間後に定量的収率で有機溶媒中で合成することが出来る。米国特許番号５，３５６，９９７は、（ａ）有機鉄化合物中の鉄が＋３酸化状態にある有機溶媒可溶性の有機鉄化合物、（ｂ）有機アルミニウム化合物に、水、アルコール及びカルボキシル酸から成る群から選ばれたプロトニック酸化合物を添加することにより調製された部分的に加水分解された有機アルミニウム化合物、及び（ｃ）キレート化芳香族アミンから成る触媒系が存在する状態で、約−１０℃から約１００℃の範囲内の温度で、イソプレン単量体を有機溶媒中で重合する工程を含む３，４−ポリイソプレンの合成の方法を具体的に開示する。ここで、キレート化アミン対有機鉄化合物のモル比は、約０．１：１から約１：１の範囲内、有機アルミニウム化合物対有機鉄化合物のモル比は、約５：１から約２００：１の範囲内である。また、プロトニック酸化合物対有機アルミニウム化合物のモル比は、約０，００１：１から約０．２：１の範囲内である。米国特許番号５，３５６，９９７の内容は、高い３，４−ミクロ構造の含有量を有し、圧力結晶化が可能なポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号５，６７７，４０２は、ナトリウムアルコキシドと極性調節剤が存在する状態で、約３０℃から約１００℃の範囲内の温度で、有機リチウム開始剤を用いてイソプレン単量体を重合する工程を含む３，４−ポリイソプレン・ゴムを調製する方法を明らかにする。ここで、ナトリウムアルコキシド対有機リチウム開始剤のモル比は、約０．０５：１から約３：１の範囲内である。また、極性調節剤対有機リチウム開始剤のモル比は、約０．２５：１から約５：１の範囲内である。米国特許番号５，６７７，４０２の内容は、３，４−ポリイソプレンの合成で用いることが出来る触媒系と重合技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号７，３５１，７６８は、５，０００から１００，０００の範囲内、好ましくは２０，０００から８０，０００の範囲内の重量平均分子量を有する液体ポリイソプレンの合成を開示する。米国特許番号５，６７７，４０２の内容は、液体ポリイソプレンの合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号６，５７６，７２８は、スチレン及びイソプレンを共重合し、スチレンに由来する反復単位のランダム分布を有する低ビニル・スチレン−イソプレン系ゴムを生産する方法を開示する。これらの重合で用いられる開始剤系は、（ａ）リチウム開始剤と（ｂ）（１）ナトリウムアルコキシド、（２）スルホン酸のナトリウム塩及び（３）グリコール・エーテルのナトリウム塩から成る群から選ばれる構成要素とから成る。ルイス塩基のような極性調節剤がないようにすることは、これらの重合で用いられる開始剤系にとって重要である。米国特許番号６，５７６，７２８の内容は、スチレン−イソプレン系ゴムの合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許番号６，３１３，２１６は、以下の工程を含むランダムスチレン−イソプレン系ゴムを合成する方法を開示する：（１）第１重合領域にイソプレン、スチレン、開始剤及び溶媒を連続的に入れる工程、（２）６０から９５パーセントの総転換率で第１重合領域でのイソプレンよびスチレンの共重合を可能にし、活性スチレン・イソプレン鎖を含む重合体セメントを生産する工程、（３）第２重合領域に前記活性スチレン・イソプレン鎖を含む重合体セメント及び追加のイソプレン単量体を連続的に入れる工程であって、転換したイソプレンの総量の５から４０パーセントは、第２重合領域に入れられる前記工程、（４）少なくとも９０パーセントのイソプレン単量体が転換するまで、第２重合領域での共重合が継続することを可能にする工程であって、第２重合領域でのスチレンとイソプレンの総転換率は、最大９８パーセントに限定される前記工程、（５）第２反応領域からの活性鎖末端を有するランダムスチレン−イソプレン系ゴムの重合体セメントを回収する工程、（６）ランダムスチレン−イソプレン系ゴム上の活性鎖末端を死活させる工程、及び（７）重合体セメントからランダムスチレン−イソプレン系ゴムを回収する工程、ここで、第１重合領域と第２重合領域での共重合は、７０℃から１００℃の範囲内の温度で行なわれ、第１重合領域に入れるスチレンの量は、ゴム中に結合するスチレンの総量より少なくとも２パーセント多い。米国特許番号６，３１３，２１６の内容は、スチレン−イソプレン系ゴムの合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
高いビニル含有量を有するイソプレン−ブタジエン共重合体は、米国特許番号５，０６１，７６５に開示された方法を利用して、短い重合時間後に高収率で、有機溶媒中で合成することが出来る。この方法を利用して作られたイソプレン−ブタジエン共重合体は、約−６０℃から約０℃の範囲内のガラス転移温度を有し、改良された静止摩擦と改良された切傷成長耐性を提供するタイヤ・トレッドで用いることが出来る。米国特許番号５，０６１，７６５は、（ａ）有機鉄化合物、（ｂ）有機アルミニウム化合物、（ｃ）キレート化芳香族アミン及び（ｄ）プロトニック酸化合物から成る触媒系が存在する状態で、約−１０℃から約１００℃の範囲内の温度で、イソプレン単量体とブタジエン単量体を有機溶媒中で共重合する工程を含む、高いビニル含有量を有するイソプレン−ブタジエン共重合体を合成する方法をより具体的に開示する。ここで、キレート化アミン対有機鉄化合物のモル比は、約０．１：１から約１：１の範囲内であり、ここで、有機アルミニウム化合物対有機鉄化合物のモル比は、約５：１から約２００：１の範囲内である。また、プロトニック酸化合物対有機アルミニウム化合物のモル比は、約０．００１：１から約０．２：１の範囲内である。米国特許番号５，０６１，７６５の内容は、イソプレン−ブタジエン・ゴムの合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
スチレン、イソプレン及びブタジエンの弾性三量体を合成する技術は、米国特許番号５，１３７，９９８で開示される。これらの弾性三量体は、タイヤ・トレッド・ゴム化合物の利用で優れた組み合わせの特性を示す。タイヤ・トレッドでのこのような三量体の利用により、改良されたウエットスキッド抵抗性を有するタイヤを、転がり抵抗またはトレッド摩耗特性を犠牲にせずに、構築することが出来る。米国特許番号５，１３７，９９８は、以下の工程を含む複数のガラス遷移温度を有し、タイヤ・トレッドの作製での使用で優れた組み合わせの特性を有する、スチレン、イソプレン及びブタジエンの弾性三量体を調製する方法をより具体的に開示する：（ａ）トリピペリジノ・ホスフィンオキシド及びアルカリ金属アルコキシドから成る群から選択される少なくとも一の構成要素及び（ｂ）有機リチウム化合物が存在する状態で、約４０℃以下の温度で有機溶媒中、スチレン、イソプレン及び１，３−ブタジエンを三量体にする工程。米国特許番号５，１３７，９９８の内容は、スチレン−イソプレン−ブタジエン・ゴムの合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
優れた乾燥静止摩擦特性と耐久性を示すレース・タイヤを含む、高性能自動車タイヤのためのトレッドの作製での使用に特に価値がある液体イソプレン−ブタジエン・ゴム（ＩＢＲ）は、米国特許番号６，５６２，８９５で開示される方法により作ることが出来る。このイソプレン−ブタジエン・ゴムは、室温で液体であり、約５重量パーセントから約９５重量パーセントのイソプレン及び約５重量パーセントから約９５重量パーセントの１，３−ブタジエンに由来する反復単位から成る。ここで、イソプレン及び１，３−ブタジエンに由来する反復単位は、本質的に無作為な順序である。このＩＢＲはまた、約３，０００から約５０，０００の範囲内の低い数の平均分子量を有し、約−５０℃から約２０℃の範囲内のガラス転移温度を有する。
これらのイソプレン−ブタジエン共重合体は、有機リチウム開始剤と極性調節剤を利用して合成される。用いられる有機リチウム開始剤の量は、合成される液体イソプレン−ブタジエン重合体で望まれる分子量に依存する。概して、全てのアニオン重合において、生産される重合体の分子量は、利用される開始剤の量に反比例する。比較的低分子量を有する液体イソプレン−ブタジエン重合体が合成されるため、用いられる開始剤の量は比較的多くなる。概して、約０．１〜約２ｐｈｍ（単量体の１００重量部当たりの重量部）の有機リチウム化合物が用いられる。ほとんどの場合、約０．２から約１ｐｈｍの有機リチウム化合物を利用することが好まれ、約０．４から０．６ｐｈｍの有機リチウム化合物を利用することが最も好まれる。任意の場合において、有機リチウム開始剤の量は、約３，０００から約５０，０００の範囲内の数の平均分子量を有する液体イソプレン−ブタジエン重合体の生産をもたらすように選択される。
有機リチウム開始剤の量は、約５，０００から約３０，０００の範囲内の数の平均分子量を有する液体イソプレン−ブタジエン重合体の生産をもたらすように好ましくは選択される。有機リチウム開始剤の量は、約８，０００から約１８，０００の範囲内の数の平均分子量を有する液体イソプレン−ブタジエン重合体の生産をもたらすように最も好ましくは選択される。とにかく、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）のような極性調節剤が存在する状態で、１，３−ブタジエンとスチレンの共重合が行われ、約−５０℃から２０℃の範囲内の高ガラス転移温度へ到達することは重要である。米国特許番号６，５６２，８９５の内容は、液体イソプレン−ブタジエン重合体の合成を説明する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ポリイソプレンのブロックを含むブロック共重合体は、米国特許番号５，２４２，９８４で記載される方法により作ることが出来る。例えば、スチレンとイソプレンの線形２ジブロック重合体（Ｓ−Ｉブロック共重合体）とスチレンとイソプレンの線形３トリブロック重合体（Ｓ−Ｉ−Ｓトリブロック重合体）が、この方法により作ることが出来る。この技術において、単量体は、不活性有機溶媒中のアニオン重合により連続して重合される。通常は、アルキルリチウム化合物のような有機アルカリ金属化合物は、広い温度領域にわたり行い得る重合を開始するために使用される。
ブロックと全体的な重合体の分子量を制御する方法は、米国特許番号３，１４９，１８２及び米国特許番号３，２３１，６３５で記載される。これらは、単量体の量は一定に保つことができ、異なる分子量は触媒の量の変更により達成することが出来るか、または触媒の量は一定に保つことができ、異なる分子量は単量体の量の変更により達成することが出来ると言及する。連続する重合に続き、生産は、プロトン停止剤、例えば、水、アルコールまたは他の試薬等の添加により、または縮合した重合体生成物の核を生成するリチウムラジカルを除去する目的で水素を用いることにより終了する。次に、ブロック重合体生産物は、例えば、熱水または蒸気または両方を利用する凝固により回収される。米国特許番号５，２４２，９８４、米国特許番号３，１４９，１８２及び米国特許番号３，２３１，６３５の内容は、Ｓ−Ｉブロック共重合体及びＳ−Ｉ−Ｓトリブロック重合体を合成するための方法を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のイソプレンで作られた全てのタイプの重合体が、石油化学源に由来していないイソプレンを用いて作られたとして実証可能である。加えて、本発明のイソプレン含有重合体はまた、天然ゴムのような自然源に由来するイソプレン含有重合体と区別出来る。従って、本発明のイソプレン含有重合体は、本明細書に描写されるバイオ再生可能で環境に配慮した原料に由来するとして実証可能である
炭素同位体１３Ｃ及び１２Ｃの比率は、多くの炭素を含むサンプルの潜在的な起源を同定または排除するために用いられることが出来る。以下の理由からこの方法は効果がある：（１）両方のアイソトープは地質年代構造上で安定している、（２）１３Ｃと１２Ｃの比率は、燃焼分析、ガスクロマトグラフィー及びアイソトープ比質量分析の組み合わせを用いて高い精度で測定することが出来る、（３）多くの自然発生の材料の１３Ｃ／１２Ｃ比率は、これらの材料の狭い範囲内の特徴で起こる、及び（４）これらの材料が化学反応を受けることで、多くの材料の１３Ｃ／１２Ｃ比率は、予測可能な方法で変わる。
自然存在比レベルまたはその付近の１３Ｃ／１２Ｃ比率に関する研究は通常、「デルタ値」としてアイソトープデータを記録する。これは、記号δ１３Ｃにより、また標準的基準サンプルと比較した１０００分率（‰）として表わされる。炭素について、参考見本は通常、ピーディーベレマイト（Ｐｅｅ Ｄｅｅ Ｂｅｌｅｍｉｔｅ）である。これは、１．１１２３２８％の１３Ｃ自然存在比を有し、δ１３Ｃ ０．００‰が割り当てられる。デルタ値と１３Ｃ／１２Ｃ比率を関連づける式は、

δ１３Ｃ（‰で）対基準＝［（Ｒサンプル−Ｒ基準）／Ｒ基準］（１０００）、ここで、Ｒサンプルは、サンプルの１３Ｃ／１２Ｃ比率であり、Ｒ基準はピーディーベレマイトの比率である。
炭素のアイソトープ（すなわち、１３Ｃ及び１２Ｃ）は同一の物理過程及び同一の化学反応に参加するが、１３Ｃ及び１２Ｃ間のわずかな質量差は、多くの反応及び過程の間で非常にわずかな比率の差として現れることが出来る。これは、化学反応または物理過程を受けたサンプルの１３Ｃ／１２Ｃ比率間で小さな差異をもたらす。例えば、より軽いアイソトープが急速に消散または離れて拡散すると共に、消散または拡散のような物理過程はより重いアイソトープを識別し、通常オリジナルサンプル中のより重いアイソトープのわずかな濃縮をもたらす。従って、消散または拡散が起こると共に、１３Ｃ／１２Ｃ比率はわずかに増加する。酵素反応を含む化学反応について、状況はより複雑であるが、多くの場合、一方のアイソトープには他方とのわずかな識別があり、これは１３Ｃ／１２Ｃ比率またはδ１３Ｃ値の測定により検出することが出来る。例えば、大気のＣＯ２は、光合成の二種類の非常に異なる機構を介して植物に転換することが出来る。すなわち、Ｃ３植物内で起こるカルビン＝ベンソン経路及びＣ４植物内で起こるハッチ−スラック回路である。δ１３Ｃで測定可能な差を同一のＣＯ２から生成する程十分に、これらの二種類の機構は異なる。Ｃ４植物について、δ１３Ｃは通常、−９‰から−１７‰であり、平均は−１３‰付近である。Ｃ３植物について、δ１３Ｃは通常、−２０‰から−３２‰であり、平均は−２７‰付近である。これらの範囲が非常に異なり、δ１３Ｃ値は、決まって０．０２‰内で測定出来ることから、Ｃ３対Ｃ４植物に由来する植物残渣間を区別ことは比較的簡単である。これは、考古学及び他の分野で無数の応用を有する。これらの分野で、料理や骨格の残がいからの炭素を含む残渣の分析は、ヒト及び他の動物の進化、活動及び食事を追跡するために用いられることが出来る。
より最近、δ１３Ｃ値は、経済不正行為、特に、石油化学に由来した潜在的に有害な化学合成品を含む、他の材料による食料品の粗悪品を検出するために利用されている。例えば、トウモロコシ（コーン）油は、高価な植物油であると考えられ、より安い油でトウモロコシ油を希釈しようとする無法な生産者の試みがある。幸運にも、ほとんどのより安い代換品がＣ３植物または動物に由来している一方、トウモロコシ油はＣ４植物に由来する。従って、代換品の−２５‰〜−３２‰と比べ、真正のトウモロコシ油のδ１３Ｃは−１３．７‰〜−１６．４‰である。より安い代換品によるトウモロコシ油の任意の有意な希釈度もδ１３Ｃの測定により検出することが出来る。同様に、果汁、ワイン、酒精剤及びハチミツ（全てＣ３光合成の生産物）へのショ糖（Ｃ４光合成の生産物）の追加は、δ１３Ｃ値の測定により検出することが出来る。δ１３Ｃ値を介して、合成類似体による天然香味料の粗悪品及び不法な合成ホルモン栄養補助食品の使用を検出することさえ可能である。
本発明は、石油系原料に由来した重合体と容易に区別出来る新規かつアイソトープで特有のイソプレン重合体を生産するために、δ１３Ｃ値を正確に測定する能力を利用する。本発明はまた、天然ゴムと容易に区別出来る新規かつアイソトープで特有のイソプレン重合体を生産するために、δ１３Ｃ値を正確に測定する能力を利用する。本発明の顕著な特徴は、信憑性に適合し、続けて確認出来る広範囲のδ１３Ｃ値を有する新規重合体を提供することである。上述のように、これらの新規重合体は、潜在的なタンパク質性アレルゲンも石油由来の原料も含まない確認可能な生産物で顧客からの増える要求を満たす。
本発明で表わす重合体は、天然ゴム及び石油由来イソプレンを含む合成高分子の両方と比べ、アイソトープで特有のイソプレン単位を含む。ヘベアブラジリエンシス（すなわち、一般の天然ゴムの木）に由来する天然ゴムの場合、δ１３Ｃ値が通常、−２７‰〜約−２８‰の範囲である。砂漠の低木に由来するグワユールゴムは、約−３１‰のδ１３Ｃを有する。両方のゴムは、Ｃ３光合成の生産物で期待されるδ１３Ｃ値を示す。また、両方のゴムは重合体に結合したタンパク質を含むと知られている。
イソプレンの起源に依存し、従来の合成ポリイソプレンは、異なるδ１３Ｃ値を有する。石油精製業からのＣ５ストリームの抽出蒸留に由来するイソプレンについて、δ１３Ｃは、約−２２‰〜約−２４‰である。この範囲は、石油に由来する軽い不飽和炭化水素に標準的である。また、石油系イソプレンを含む重合体は通常、同一のδ１３Ｃを有するイソプレン単位を含む。ホルムアルデヒドを用いたイソブチレンの反応に由来するイソプレンを含む重合体について、ホルムアルデヒドはさらにより負のδ１３Ｃ値を有する原料にしばしば由来するため、δ１３Ｃ値は約−３４．４‰になり得る。
本発明は、非常に異なるδ１３Ｃ値を有するイソプレン含有重合体を提供する。例えば、他の炭素含有栄養素（例えば、酵母抽出物）の必要最低限量を有するトウモロコシ由来のグルコース（δ１３Ｃ−１０．７３‰）の発酵は、δ１３Ｃ−１４．６６‰〜−１４．８５‰を有するポリイソプレンに重合出来るイソプレンを生産する。この重合体のδ１３Ｃは、天然ゴム及び全ての既知の合成ポリイソプレンの正常範囲からかなり外れた新規の範囲内であり、それは、Ｃ４植物に由来する生産物に通常関連する範囲内である。この重合体特有のδ１３Ｃ値は、重合体中の前記イソプレンがトウモロコシ系グルコースに由来し、実際に、Ｃ４植物に由来する生産物である事実の直接の結果である。
Ｃ４植物由来の他の糖質または発酵物を用いて同様の結果を得ることが出来ることは当業者に認識される。例えば、サトウキビからのショ糖（δ１３Ｃ−１０．４‰）、サトウキビからの転化糖（δ１３Ｃ−１５．３‰）、コーンスターチからのグルコース（δ１３Ｃ−１１．１‰）及びトウモロコシ茎葉（δ１３Ｃ−１１．３‰）またはサトウキビ・バガス（δ１３Ｃ−１３．０‰）のいずれかの加水分解からのグルコースは全て、天然ゴムまたは石油系イソプレンを含む合成高分子のいずれかほど負ではないδ１３Ｃ値を有するイソプレン重合体を生成するために用いられるイソプレンを生産するべきである。また、平均δ１３Ｃがおよそ約−１８‰よりも高い発酵性原料の混合を含む、およそ約−１８‰よりも高い（すなわち、約−１８‰よりも負ではない）δ１３Ｃを有する発酵性原料に由来する約−２２‰より負でないδ１３Ｃを有するイソプレン及びイソプレン重合体を生産可能であるべきことは、当業者に認識される。
Ｃ４植物に由来する生産物のδ１３Ｃ値特性を有するイソプレン含有重合体の生産に加えて、特異的にアイソトープで標識されたイソプレン含有重合体を、発酵性の非Ｃ４原料から構成することが出来ることを当業者は認識する。例えば、加水分解された針葉樹パルプ（δ１３Ｃ−２３‰）に由来するグルコースは、Ｃ５画分の抽出蒸留に由来するイソプレン及びホルムアルデヒドを有するイソブチレンの反応に由来するイソプレンで観察される正常範囲の間の特有の範囲内である、−２７‰近くのδ１３Ｃを有する、イソプレン及びポリイソプレンを生産するべきである。また、約−２８‰からおよそ−２０‰のδ１３Ｃ範囲を有する他の糖質の発酵は、約−３２‰から約−２４‰のδ１３Ｃ範囲を有する、イソプレン及びイソプレン重合体を生産するべきであることを当業者は認識する。これらの他の糖質は、加水分解されたセルロースからのグルコース（δ１３Ｃ−２５＋−２‰）、てん菜糖からの転化糖（δ１３Ｃ−２６‰から−２７‰）及びラクトース（δ１３Ｃ−２７‰から−２８‰）を含む（が、それらに限られない）。ヤシ油（δ１３Ｃ−３０‰）を含む、植物油（δ１３Ｃ−３２‰から−２６‰）の発酵は、−３０‰より負のδ１３Ｃを有するイソプレン重合体への到達を提供し得る。
２以上の原料の共発酵は、中間δ１３Ｃ値を有するイソプレンを生産するため、従って、イソプレン含有重合体を生産するために使用出来ることを当業者は認識する。例えば、サトウキビからのショ糖（δ１３Ｃ−１０．４‰）及びてん菜糖からのショ糖（δ１３Ｃ−２７‰から−２６‰）の１：１混合物は、イソプレンを生産し、従って、平均δ１３Ｃ値（すなわち、およそ−１８．５‰）を有する単一源に由来するショ糖から生産された重合体とおよそ同一のδ１３Ｃ値を有するイソプレン含有重合体を生産するべきである。糖質及びビートに由来する転化糖についても同じことが言えるはずである。両方の場合において、サトウキビ及び砂糖大根に由来するショ糖または転化糖から別途調製されたイソプレンの等量を混合し、次に、（共）重合することにより、同一の重合体を合成でき得ることは明白である。また、他の発酵性原料、例えば、酵母抽出物及び植物油剤等と糖質との共発酵が、中間δ１３Ｃ値を有するイソプレンの生産、従って、イソプレン含有重合体の生産に使用され得ることは明白である。例えば、１８１．２：１７．６の比率でのグルコース（δ１３Ｃ−１０．７３‰）及び酵母抽出物（δ１３Ｃ−２７‰から−２６‰）の共発酵は、−２０‰から−１８‰のδ１３Ｃ値を有するポリイソプレンに重合されることが出来るイソプレンを生産する。対照的に、酵母抽出物の必要最低限量を有するグルコースの発酵及びそれに続くイソプレンの重合は、−１５‰から−１４‰のδ１３Ｃ値を有するポリイソプレンを生産する。
他の単量体を有するイソプレンの共重合体について、ポリイソプレンの「ブロック」として重合体バックグラウンドに組み込まれるイソプレンの量に有限があることを当業者は認識する。２以上のイソプレン単位のブロックを形成するイソプレンの傾向（「無作為単量体」においても）は、他の単量体に対するイソプレンの量、重合に用いられる触媒のタイプ及び重合の特異反応条件を含む多くの要因に依存する。重合体骨格に沿ったこれらのブロックの存在は通常、ＮＭＲスペクトロスコピーにより検出出来る。化学分解（例えば、オゾン分解）及びクロマトグラフィーの組み合わせを用いることにより、イソプレンに由来するブロックのδ１３Ｃ値の測定を含め、化学分析のためにこれらのブロックの断片を単離させることは可能である。これは、他の単量体とイソプレンとの共重合体が再生可能／持続可能な原料、特に、Ｃ４植物からの原料に由来するイソプレンを含むかどうかを決定するための方法を提供する。
バイオ再生可能な炭素源を利用する細胞培養からのイソプレン単量体で構成される、本発明のポリイソプレン重合体は、δ１３Ｃ値及び他の重合体特性により同定することが出来る。例えば、以下のイソプレン含有重合体が、本発明の方法を利用して生産されたイソプレン単量体を含むとして確認可能である。
（１）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。前記ポリイソプレン重合体は、−２１‰より高いδ１３Ｃ値を有することができ、また−２０‰より高いδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−２２‰から−１０‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、他の場合において、−２１‰〜−１２‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−２０‰〜−１４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、ポリイソプレン・ホモ重合体ゴムである。
（２）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、−３０‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。前記ポリイソプレン重合体は、−３０‰〜−２９‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３０‰〜−２９‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３０‰〜−２９．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−２９．５‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することができ、さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−２９．０‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、ポリイソプレン・ホモ重合体ゴムである。
（３）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレンはタンパク質がなく、前記ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。いくつかの場合において、このポリイソプレン重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体はポリイソプレン・ホモ重合体ゴムである。
（４）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、９９．９％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有し、９９．９％未満のトランス−１，４−ミクロ構造の含有量を有し、−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。前記ポリイソプレンは、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。前記ポリイソプレン重合体は、９９．８％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有することが出来る。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、９９．７％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、９９．５％未満またはさらに９９％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、９８．５％未満またはさらに９８％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量を有する。このポリイソプレン重合体はまた、２．０未満またはさらに１．８未満の多分散性を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．６未満またはさらに１．５未満の多分散性を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．４未満またはさらに１．２未満の多分散性を有することが出来る。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．１未満の多分散性を有する。
（５）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、２％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有し、−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。前記ポリイソプレン重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。前記ポリイソプレン重合体は、５％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１０％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１５％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有する。さらに他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、２０％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、２５％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有する。このポリイソプレン重合体は、２．０未満の多分散性を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．８未満の多分散性を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．６未満の多分散性を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．５未満またはさらに１．４未満の多分散性を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．２未満またはさらに１．１未満の多分散性を有する。
（６）イソプレン単量体に由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、２％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有し、−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記ポリイソプレン重合体。このタイプのポリイソプレン重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。前記ポリイソプレン重合体は、５％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１０％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１５％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、２０％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、２５％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有する。前記ポリイソプレン重合体は、２．０未満の多分散性を有することが出来る。いくつかの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．８未満の多分散性を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．６未満の多分散性を有する。さらに別の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．５未満の多分散性を有する。多くの場合において、前記ポリイソプレン重合体は、１．４未満またはさらに１．２未満の多分散性を有する。前記ポリイソプレン重合体は、１．１未満の多分散性を有することが可能である。
（７）イソプレン単量体及び少なくとも一の追加の単量体に由来する反復単位から成る重合体であって、前記重量体がイソプレンに由来する反復単位のブロックを含み、前記イソプレンに由来する反復単位のブロックが−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有する、前記重合体。前記ポリイソプレン重合体は、−２１‰より高いδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、ポリイソプレン重合体は、−２０‰より高いδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、ポリイソプレン重合体は、−２２‰から−１０‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。さらに別の場合において、ポリイソプレン重合体は、−２１‰〜−１２‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。多くの場合において、ポリイソプレン重合体は、−２０‰〜−１４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。
（８）イソプレン単量体及び少なくとも一の追加の単量体に由来する反復単位から成る重合体であって、前記重量体がイソプレンに由来する反復単位のブロックを含み、前記イソプレンに由来する反復単位のブロックが−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記重合体。前記共重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、このタイプの共重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、このタイプの共重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。このタイプの共重合体は、イソプレン及び１，３−ブタジエンの弾性共重合体、イソプレン及びスチレンの弾性共重合体、イソプレン及びα−メチルスチレンの弾性共重合体等をすることが出来る。
（９）イソプレン単量体に由来する反復単位から成る液体ポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレン重合体が５，０００から１００，０００の範囲内の重量平均分子量を有し、前記液体ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記液体ポリイソプレン重合体。前記液体ポリイソプレン重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。他の場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。前記液体ポリイソプレン重合体は、２０，０００から８０，０００の範囲内の重量平均分子量を有することが出来る。いくつかの場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、３０，０００から５０，０００の範囲内の重量平均分子量を有する。他の場合において、前記ポリイソプレン重合体は、２．０未満またはさらに１．８未満の多分散性を有する。さらに別の場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、１．６未満またはさらに１．５未満の多分散性を有する。多くの場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、１．４未満またはさらに１．２未満の多分散性を有する。前記液体ポリイソプレン重合体は、１．１未満の多分散性を有することが可能である。
（１０）イソプレン単量体に由来する反復単位から成る液体ポリイソプレン重合体であって、前記液体ポリイソプレン重合体が５，０００から１００，０００の範囲内の重量平均分子量を有し、前記液体ポリイソプレン重合体が−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、前記液体ポリイソプレン重合体。前記液体ポリイソプレン重合体は、−３４‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することが出来る。いくつかの場合において、前記液体ポリイソプレン重合体は、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。さらに別の場合において、液体ポリイソプレン重合体は、−３２‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。前記液体ポリイソプレンは、２０，０００から８０，０００の範囲内の重量平均分子量を有することが出来る。液体ポリイソプレンは通常、３０，０００から５０，０００の範囲内の重量平均分子量を有する。前記液体ポリイソプレンは、２．０未満の多分散性を有することが出来る。いくつかの場合において、液体ポリイソプレン重合体は、１．８未満の多分散性を有する。他の場合において、液体ポリイソプレン重合体は、１．６未満の多分散性を有する。さらに別の場合において、液体ポリイソプレン重合体は、１．５未満またはさらに１．４未満の多分散性を有する。多くの場合において、液体ポリイソプレン重合体は、１．２未満またはさらに１．１未満の多分散性を有する。
本発明は、単に具体例を目的とする以下の実施例により説明され、実施されることが出来る本発明の範囲または方法を制限すると見なすことはできない。別途記載のない限り、部分及びパーセンテージは重量で与えられる。
実施例はまた、上述の本発明の側面及び実施態様を説明及び詳述する。実施例は、単に本発明の例示が意図され、従って、いかなる方法でも本発明を制限すると考えられるべきでない。別途記載のない限り、温度は摂氏度である。また、圧力は大気圧またはその付近である。実施例及び詳細な記載は、限定の目的ではなく例証の目的で提供される。本明細書によって引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、あたかも各々個々の出版物、特許または特許出願が特定的に及び個別に各々参考により本明細書に組み込まれているかのように、参考により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で引用される全ての出版物は、本発明に関して用いられ得る組成物及び方法を記載し開示する目的で参照により明白に本明細書に組み込まれる。上述の発明は明瞭な理解の目的で例証及び例示の方法で詳述されるが、本発明の内容を考慮し所定の変更及び修飾が加えられ、そのような変更及び修飾は特許請求の範囲及び趣旨を逸脱しないことは当業者に明らかである。
本発明の実施において、１３Ｃ分析は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ Ｄｅｌｔａ Ｐｌｕｓ ＸＰ安定同位体比質量分析装置の注入口としてのＣｏｓｔｅｃｈ ＥＣＳ４０１０元素分析計を用いた炭素同位体分析のスズのカップに０．５から１．０ｍｇのサンプルを載せることにより行うことが出来る。Ｎ２にＮＯｘを転換するために、銅反応器（６５０℃）を通して８５ｍＬ／分間でヘリウム・ストリーム中に渡される燃焼ガスと共に１０２０℃で、サンプルをコバルト／酸化コバルト燃焼反応器に入れた。ＣＯ２及びＮ２を、３−ｍ ５Åモレキュラーシーブ・カラムを用いて分離した。次に、Ｔ．Ｂ．Ｃｏｐｌｅｎ他、δ１３Ｃ測定の新規ガイドライン（Ｎｅｗ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ δ１３Ｃ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第７８巻、２４３９−２４４１ページ、（２００６年）の２標準的アプローチを用いたオフ・ライン燃焼及びデュアル・インレット分析によりＶＰＤＢスケールに注意深く較正された二種類の研究室基準（アセトアニリドＢ、−２９．５２＋−０．０２‰ｍ及びコーンスターチＡ、−１１．０１＋−０．０２‰）を用いてＶＰＤＢスケールに１３Ｃ／１２Ｃ比率を較正した。Ｃｏｐｌｅｎの内容は、δ１３Ｃ値を測定するための技術を開示する目的で参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１：組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現する大腸菌でのイソプレンの生産
Ｉ．大腸菌でのクズ・イソプレン・シンターゼの発現ベクターの構築
クズ（ピュエラリア・モンターナ）イソプレン・シンターゼ遺伝子（ＩｓｐＳ）のタンパク質配列を、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（ＡＡＱ８４１７０）から得た。大腸菌コドン使用頻度で最適化されたクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を、ＤＮＡ２．０（配列番号１）から購入した。イソプレン・シンターゼ遺伝子を、ＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化により供給されたプラスミドから採取し、ゲル精製後、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化されたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（インビトロジェン）にライゲートした。イソプレン・シンターゼ遺伝子５’内の終止コドンからＰｓｔＩ部位に構築物を設計した。その結果、構築物が発現された場合、Ｈｉｓタグはイソプレン・シンターゼ・タンパク質に付かない。得られたプラスミド、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕは、シークエンスにより確認された（図２及び３）。
また、イソプレン・シンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン）にクローンニングした。この場合、組み換えイソプレン・シンターゼ・タンパク質がＮ末端Ｈｉｓタグを含むように、イソプレン・シンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂに挿入した。イソプレン・シンターゼ遺伝子を、プライマーセットｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−２Ｆ：５’−ＣＧＴＧＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣ（配列番号３）及びｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−Ｒ：５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号４）を用いたＰＣＲによりｐＴｒｃＫｕｄｚｕから増幅した。これらのプライマーを、前記遺伝子の５’末端のＮｄｅＩ部位及び３’末端のＢａｍＨＩ部位にそれぞれ添加した。上述のプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕを、鋳型ＤＮＡとして用い、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ（ストラタジェン）を生産者の指示に従い用い、プライマーを１０ｐＭｏｌの濃度で添加した。ＰＣＲを、２５μｌの全容積中で行った。ＰＣＲ生産物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＥＴ１６ｂにクローンニングした。ライゲーション混合物を、大腸菌Ｔｏｐ１０（インビトロジェン）及びシークエンスにより選択された適正なクローンに形質転換した。クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子がＴ７プロモーターから発現している、得られたプラスミドを、ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕ（図４及び５）と指定した。
また、クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を、低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２０にクローンニングした。プライマーを、上述のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を増幅するために使用した。フォワードプライマーを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及び大腸菌コンセンサスＲＢＳの５’末端に添加した。ＰｓｔＩクローニング部位は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの終止コドンのちょうど３’に既に存在するため、最終ＰＣＲ生産物がＰｓｔＩ部位を含むように、リバースプライマーを構築した。プライマーの配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒｂｓ−Ｋｕｄｚｕ Ｆ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣ（配列番号６）及びＢａｍＨＩ−Ｋｕｄｚｕ Ｒ：５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号４）である。ＰＣＲ生産物を、１０ｐｍｏｌの濃度でのプライマー及び１ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ）と共にＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いて増幅した。増幅プロトコールは、（９５℃１分間、６０℃１分間、７２℃２分間）の３０サイクルを含んだ。生産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで同様に消化されたｐＣＬ１９２０にライゲートした。ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。いくつかの形質転換体をシークエンスで確認した。得られたプラスミドをｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕと指定した（図６及び７）。
ＩＩ．イソプレン生産の測定
振盪フラスコ培養について、培養物の１ｍｌを、振盪フラスコから２０ｍｌＣＴＣヘッドスペース・バイアル（アジレント・バイアルカタログ番号５１８８ ２７５３、カタログ番号５１８８ ２７５９）に移した。キャップをしっかりとねじり、２５０ｒｐｍで振盪しながらバイアルを相当温度でインキュベートした。３０分後、バイアルをインキュベーターから取り出し、後述のように分析した（このアッセイからのいくつかの実験値について表１を参照されたい）。
発酵槽のイソプレン生産を測定する場合において、サンプルを発酵槽のオフガスから採取し、後述のように直接分析した（このアッセイからのいくつかの実験値について表２を参照されたい）。
前記分析を、ヘッドスペース・モードで操作されるＣＴＣアナリティックス（スイス）ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーに接続されたアジレント６８９０ＧＣ／ＭＳ系を用いて行った。アジレントＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ、０．２５μｍ膜厚）を、検体の分離に用いた。前記サンプラーを、ヘッドスペースガスの５００μＬを注入するために用意した。前記ＧＣ／ＭＳ方法は、キャリヤーガスとしてのヘリウムを１ｍｌ／分の流量で利用した。その注入ポートを５０：１の分割比で、２５０℃で保持した。オーブン温度を、分析の２分間３７℃で保持した。前記アジレント５７９３Ｎ質量選択検出器を、ｍ／ｚ ６７の単イオンモニター（ＳＩＭ）モードで実行した。永久ガスの溶出を可能にするために、前記検出器を１．４から１．７分に切り替えた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）が１．７８分で溶出することが観察された。較正表をイソプレンの絶対量を定量化するために使用し、１μｇ／Ｌから２００μｇ／Ｌまで線形であると分かった。この方法を用いて、その検出限界が５０から１００ｎｇ／Ｌであると推測した。
ＩＩＩ．組み換えイソプレン・シンターゼを発現する大腸菌細胞を含む振盪フラスコでのイソプレンの生産
上述のベクターを、株ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕ、ＢＬ２１／ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕ及びＢＬ２１／ｐＥＴＨｉｓＫｕｄｚｕを生産するために大腸菌株ＢＬ２１（ノバジェン）に導入した。前記株を、ＬＡ（ルリア寒天）及びカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）上に単離のために広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを、２０ｍｌのルリア・ベルターニ培養液（ＬＢ）及びカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２５０ｍｌバッフル振盪フラスコに植菌した。培養を、２００ｒｐｍで振盪させながら２０℃で一晩増殖させた。一晩培養した培養物の前記ＯＤ６００を測定し、培養を、ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（インビトロジェン）３０ｍｌ及びカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２５０ｍｌバッフル振盪フラスコ内でＯＤ６００〜０．０５に希釈した。前記培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００〜０．５−０．８になった時に、４００μＭ ＩＰＴＧを添加し、細胞を２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃でさらに６時間インキュベートした。ＩＰＴＧでの誘導後、０、２、４及び６時間で、培養物の１ｍｌ分割量を集め、ＯＤ６００を測定した。また、上述のように生産されたイソプレンの量を測定した。その結果を図８に示す。
ＩＶ．１４リットル発酵槽でのＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕからのイソプレンの生産
組み換えクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を含む大腸菌からのイソプレンの大規模生産の量を、流加回分培養槽から測定した。発酵培地のリットル当たりの発酵培地（ＴＭ２）の処方は、Ｋ２ＨＰＯ４ １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊ ７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３．２ｇ、酵母抽出物５ｇ、１０００Ｘ修飾微量金属溶液１ｍｌである。全ての成分を一度に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。前記ｐＨを、水酸化カリウム（ＫＯＨ）及び容量に適量で６．８に調節した。前記最終生産物を、０．２２μフィルターでろ過滅菌した（のみで、オートクレーブ滅菌はせず）。１０００Ｘ修飾微量金属溶液の処方は、クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇである。各成分を、１個ずつｄｉＨ２Ｏに溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨ及び容量に適量でｐＨを３．０にし、０．２２μフィルターでろ過滅菌した。
この実験は、ｐＨ６．７及び３４℃の温度の所望の発酵でグルコースからのイソプレン生成をモニターするために１４Ｌバイオリアクター中で行った。冷凍バイアルから採取された大腸菌株ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕの植菌物を、ソイトーン−酵母抽出物−グルコース培地で調製した。植菌物がＯＤ５５０＝０．６に増殖した後、二個の６００ｍｌフラスコを遠心分離機にかけ、その内容物を７０ｍｌ上清に再懸濁し、細胞ペレット（７０ｍｌのＯＤ３．１物質）をバイオリアクターに移した。植菌後の多様な時間でサンプルを採取し、上述のように、生産されたイソプレンの量を測定した。その結果を図９に示す。
実施例２：組み換えポプラ・イソプレン・シンターゼを発現する大腸菌でのイソプレンの生産
ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレン・シンターゼ（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ，Ｊ−Ｐ他（２００５年）、Ｐｌａｎｔａ、第２２２巻、７７７−７８６ページ）の前記タンパク質配列を、ジェンバンク（ＣＡＣ３５６９６）から得た。大腸菌のためにコドン最適化された遺伝子を、ＤＮＡ２．０（ｐ９７９６−ポプラ、図３０及び３１）から購入した。前記イソプレン・シンターゼ遺伝子を、ＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩでの制限エンドヌクレアーゼ消化で供給されたプラスミドから採取し、ゲル精製後、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化されたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂにライゲートした。挿入断片内の終止コドンがＰｓｔＩ部位の前になるように、前記構築物をクローンニングする。それにより、Ｈｉｓタグがイソプレン・シンターゼ・タンパク質に付与されていない構築物をもたらす。前記得られたプラスミドｐＴｒｃＰｏｐｌａｒ（図３２及び３３）を、シークエンスで確認した。
実施例３：組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現するパントエ・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）内のイソプレンの生産
実施例１で記載の前記ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ及びｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕプラスミドを、Ｐ．シトレア（ｃｉｔｒｅａ）（米国特許番号７，２４１，５８７）にエレクトロポレーションした。形質転換体を、それぞれカルベニシリン（２００μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択した。振盪フラスコからのイソプレンの生産及び生産されたイソプレンの量の測定は、組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現する大腸菌株について実施例１で記載するように行った。その結果を図１０に示す。
実施例４：組み換えクズ・イソプレン・シンターゼを発現するバチルス・ズブチリス内のイソプレンの生産
Ｉ．クズ・イソプレン・シンターゼの発現のためのＢ．ズブチリス複製プラスミドの構築
前記クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下で複製プラスミド（クロラムフェニコール耐性カセットを伴うｐＢＳ１９）を用いて、バチルス・ズブチリスａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）内で発現させた。前記イソプレン・シンターゼ遺伝子、ａｐｒＥプロモーター及び転写ターミネーターを別途増幅し、ＰＣＲを用いて融合した。次に、前記構築物をｐＢＳ１９にクローンニングし、Ｂ．ズブチリスに形質転換した。
ａ）ａｐｒＥプロモーターの増幅
前記ａｐｒＥプロモーターを以下のプライマーを用いてバチルス・ズブチリス由来の染色体ＤＮＡから増幅した：

ＣＦ７９７（＋） 開始ａｐｒＥプロモーターＭｆｅＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号５８）

ＣＦ０７−４３（−） ａｐｒＥプロモーターのＫｕｄｚｕ ｉｓｐＳへの融合
５’−ＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡ（配列番号５９）

ｂ）イソプレン・シンターゼ遺伝子の増幅
前記クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子をプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕから増幅した（配列番号２）。前記遺伝子を大腸菌のためにコドン最適化し、ＤＮＡ２．０で合成した。以下のプライマーを用いた：

ＣＦ０７−４２（＋） ａｐｒＥプロモーターのクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子への融合（ＧＴＧ開始コドン）
５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号６０）

ＣＦ０７−４５（−） クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子の３’末端のターミネーターへの融合
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号６１）

ｃ）転写ターミネーターの増幅
バチルス・アミロリケファシエンスのアルカリ性セリン・プロテアーゼ由来の前記ターミネーターを、以下のプライマーを用いて事前に配列決定されたプラスミドｐＪＨＰｍｓ３８２から増幅した：

ＣＦ０７−４４（＋） クズ・イソプレン・シンターゼの３’末端のターミネーターへの融合
５’−ＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号６２）

ＣＦ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンス・ターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号６３）

前記クズ断片を、以下のプライマーを含むＰＣＲを用いてターミネーター断片に融合した：

ＣＦ０７−４２（＋） クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子（ＧＴＧ開始コドン）のａｐｒＥプロモーターへの融合
５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号６１）

ＣＦ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンス・ターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号６３）

クズ・ターミネーター断片を、以下のプライマーを含むＰＣＲを用いてプロモーター断片に融合した：

ＣＦ７９７（＋）開始ａｐｒＥプロモーターＭｆｅＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号６４）

ＣＦ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンス・ターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号６３）

前記融合ＰＣＲ断片を、キアゲン・キットを用いて精製し、制限酵素ＭｆｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この消化されたＤＮＡ断片を、キアゲン・キットを用いてゲル精製し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化され、ゲル精製されたｐＢＳ１９として知られるベクターにライゲートした。
前記ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ及び５０カルベニシリン・プレート上で選択した。合計６個のコロニーを選び、ＬＢ及び５０カルベニシリン中で一晩増殖し、次に、プラスミドをキアゲン・キットを用いて単離した。挿入断片を確認するために、前記プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、３個の適正なプラスミドを以下のプライマーによるシークエンスに用いた。

ＣＦ１４９（＋）ＥｃｏＲＩ ａｐｒＥプロモーターの開始
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号６５）

ＣＦ８４７（＋） ｐＸＸ０４９のシークエンス（ａｐｒＥプロモーターの末端）
５’−ＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＧ（配列番号６６）

ＣＦ０７−４５（−） クズ・イソプレン・シンターゼの３’末端のターミネーターへの融合
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号６１）

ＣＦ０７−４８（＋） クズ・イソプレン・シンターゼのシークエンス用プライマー
５’−ＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号６７）

ＣＦ０７−４９（＋） クズ・イソプレン・シンターゼのシークエンス
５’−ＧＧＣＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号６８）

ｐＢＳ Ｋｕｄｚｕ＃２として指定されるプラスミド（図５２及び１２）をシークエンスにより修正し、ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ、バチルス・ズブチリス宿主株に形質転換した。ＬＡ及び５クロラムフェニコール・プレート上で選択を行った。形質転換体を選び、単一コロニーでＬＡ及び５クロラムフェニコール上に置き、次にＬＡ及び５クロラムフェニコール中でＯＤ６００が１．５に達するまで増殖させた。−８０℃でグリセロールがあるバイアル中に冷凍保存した。得られた株をＣＦ４４３と指定した。
ＩＩ．組み換えイソプレン・シンターゼを発現するＢ．ズブチリス細胞を含む振盪フラスコ内のイソプレンの生産
一晩培養した培養物を、ＬＡ及びクロラムフェニコール（Ｃｍ、２５μｇ／ｍｌ）からのＣＦ４４３の単一コロニーで植菌した。培養物を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃のＬＢ及びＣｍ中で増殖させた。これらの一晩培養した培養物（１ｍｌ）を、２５μｇ／ｍｌの最終濃度で２５ｍｌのグラント（Ｇｒａｎｔｓ）ＩＩ培地及びクロラムフェニコールを含む２５０ｍｌバッフル振盪フラスコに植菌するために用いた。グラントＩＩ培地の処方は、１０ｇのソイトーン、３ｍｌの１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４、７５ｇのグルコース、３．６ｇの尿素、１００ｍｌの１０Ｘ ＭＯＰＳ、１Ｌまでの適量のＨ２Ｏ、ｐＨ７．２である。１０Ｘ ＭＯＰＳの処方は、８３．７２ｇのＭＯＰＳ、７．１７ｇのトリシン、１２ｇのＫＯＨペレット剤、１０ｍｌの０．２７６Ｍ Ｋ２ＳＯ４溶液、１０ｍｌの０．５２８Ｍ ＭｇＣｌ２溶液、２９．２２ｇのＮａＣｌ、１００ｍｌの１００Ｘ微量栄養素、１Ｌまでの適量のＨ２Ｏである。また、１００Ｘ微量栄養素の処方は、１．４７ｇのＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２０、０．１ｇのＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＺｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、１Ｌまでの適量のＨ２Ｏである。振盪フラスコを３７℃でインキュベートし、サンプルを１８、２４及び４４時間で採取した。１８時間後に、ＣＦ４４３のヘッドスペース及びコントロール株を試料採取した。これは、イソプレンの１８時間の蓄積を表す。そのイソプレンの量を実施例１で記載するようにガスクロマトグラフィーで測定した。イソプレンの生産は、組み換えイソプレン・シンターゼの発現により有意に増進した（図１１）。
ＩＩＩ．１４Ｌ発酵槽内のＣＦ４４３によるイソプレンの生産
複製プラスミド上の組み換えクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を含むＢ．ズブチリスによるイソプレンの大規模生産の量を、流加回分培養槽から測定した。クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を発現するバチルス株ＣＦ４４３またはクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を発現しないコントロール株を、大豆食品（カーギル）、リン酸ナトリウム及びカリウム、硫酸マグネシウム及びクエン酸、塩化第二鉄及び塩化マンガンの溶液を含む栄養培地で従来の流加回分発酵槽により培養した。発酵槽前に、培地を、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ及びペクチナーゼを含む酵素の混合物を用いて９０分間柔らかくした（ＷＯ９５／０４１３４を参照されたい）。１４Ｌ回分発酵槽に、６０％ｗｔ／ｗｔグルコース（カーギルＤＥ９９デキストロース、ＡＤＭデルサデックス・グリーンズ（Ｖｅｒｓａｄｅｘ ｇｒｅｅｎｓ）またはダニスコ転化糖）及び９９％ｗｔ／ｗｔ油（西洋家庭大豆油（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｆａｍｉｌｙ ｓｏｙ ｏｉｌ）、９９％ｗｔ／ｗｔは細胞培養培地に添加される前の油の濃度である）を流加した。回分内のグルコースが不検出になった時に、流加を始めた。流加速度は、数時間かけて上昇され、等しい炭素基準量で油を添加し、調節した。ｐＨを、２８％ｗ／ｖ水酸化アンモニウムを用いて６．８−７．４に管理した。発泡した場合、消泡剤を培地に添加した。発酵温度を３７℃に管理し、発酵培養を７５０ｒｐｍで撹拌した。ｐＨ、溶存酸素（ＯＤ）％、気流及び圧力のような多様な他のパラメーターを全過程を通してモニタリングした。溶存酸素％を２０より高く維持した。サンプルを３６時間のタイムコースを通して採取し、細胞増殖（ＯＤ５５０）及びイソプレン生産について分析した。これらの実験結果を、図５３Ａ及び５３Ｂで示した。
ＩＶ．Ｂ．ズブチリス内のクズ・イソプレン・シンターゼ（ｉｓｐＳ）の統合
前記クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下で統合プラスミド（ｐＪＨ１０１−ｃｍｐＲ）にクローンニングした。試験した条件下では、イソプレンは検出されなかった。
実施例５：トリコデルマ内のイソプレンの生産
Ｉ．トリコデルマ・リーセイ内のクズ・イソプレン・シンターゼの発現のためのベクターの構築
ヤロウィア・リポリティカにコドン最適化されたｋｕｄｚｕ ＩＳ遺伝子をＤＮＡ２．０で合成した（配列番号８）（図１３）。このプラスミドを以下のＰＣＲ増幅反応のためのテンプレートとして用いた：１μｌプラスミド・テンプレート（２０ｎｇ／μｌ）、１μｌプライマーＥＬ−９４５（１０μＭ）５’−ＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＧ（配列番号９）、１μｌプライマーＥＬ−９６５（１０μＭ）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号１０）、１μｌ ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、５μｌ １０× ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩフュージョンＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ・バッファー、１μｌ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩフュージョンＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ、４０μｌ水、全反応容量５０μｌ。Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子に対応しなかったが、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのクローンニングに必要とされる、追加の４ヌクレオチドをフォワードプライマーの５’末端に含めた。Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子に対応しなかったが、他のベクター骨格へのクローンニングのために挿入された追加の２１ヌクレオチドをリバースプライマーの５’末端に含めた。ＭＪリサーチＰＴＣ−２００サーモサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応を次のように行った：９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３０秒間（２７サイクルを繰り返す）、最後のサイクル後に７２℃１分間。Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子の増幅が成功したかを確認するために、前記ＰＣＲ生産物を１．２％Ｅ−ゲル上で分析した。
次に、前記ＰＣＲ生産物を、ＴＯＰＯ ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニング・キットを用いて生産者のプロトコールに従いクローンニングした：１μｌ ＰＣＲ反応液、１μｌ塩溶液、１μｌ ＴＯＰＯ ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター及び３μｌ水、全反応容量６μｌ。前記反応液を５分間室温でインキュベートした。ＴＯＰＯ反応液の１マイクロリットルを、化学的に形質転換可能なＴＯＰ１０大腸菌細胞に形質転換した。前記形質転換体を、ＬＡ及び５０μｇ／ｍｌカナマイシン・プレート上で選択した。いくつかのコロニーを選び、各々をＬＢ及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５ｍｌチューブに植菌し、培養液を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。プラスミドを生産者のプロトコールに従いＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン・インク）を用いて一晩培養したチューブから単離した。いくつかのプラスミドについて、ＤＮＡ配列が適正であることを確認するためにシークエンスをした。
Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子をコードする単一のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯプラスミドを、自作のｐＴｒｅｘ３ｇベクターへのゲートウェイ・クローニング（Ｇａｔｅｗａｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ）に用いた。ｐＴｒｅｘ３ｇの構築は、ＷＯ２００５／００１０３６Ａ２で記載される。前記反応を、ゲートウェイＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ酵素ミックス・キット（インビトロジェン）の生産者のプロトコールに従い行った：１μｌ Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯドナー・ベクター、１μｌ ｐＴｒｅｘ３ｇデスティネーション・ベクター、６μｌ ＴＥバッファー、ｐＨ８．０、全反応容量８μｌ。前記反応液を１時間室温でインキュベートし、次に、１μｌプロテイナーゼＫ溶液を添加した後、インキュベーションを１０分間３７℃で継続した。次に、反応液の１μｌを化学的に形質転換可能なＴＯＰ１０大腸菌細胞に形質転換した。前記形質転換体を、ＬＡ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン・プレート上で選択した。いくつかのコロニーを選び、各々を、ＬＢ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む５ｍｌチューブに植菌した。また、培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖した。プラスミドを生産者のプロトコールに従いＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン・インク）を用いて一晩培養したチューブから単離した。いくつかのプラスミドについて、ＤＮＡ配列が適正であることを確認するためにシークエンスをした。
Ｙ．リポリティカ・コドン最適化クズ・イソプレン・シンターゼｐＴｒｅｘ３ｇプラスミド（図１４）のクワッド・デリート（ｑｕａｄ ｄｅｌｅｔｅ）トリコデルマ・リーセイ株へのバイオリスティック形質転換（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）をバイオリスティックＰＤＳ−１０００／ＨＥ粒子伝達系（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／ＨＥ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＷＯ２００５／００１０３６Ａ２を参照されたい）を用いて行った。安定した形質転換体の単離及び振盪フラスコの評価を、特許公報ＷＯ２００５／００１０３６Ａ２の実施例１１に列記されたプロトコールを用いて行った。
ＩＩ．Ｔ．リーセイの組み換え株内のイソプレンの生産
１５及び３６時間培養した上述のイソプレン・シンターゼ形質転換体の培養物の１ｍｌを、ヘッドスペース・バイアルに移した。前記バイアルをシールし、３０℃で５時間インキュベートした。ヘッドスペース・ガスを測定し、イソプレンを実施例１に記載の方法で同定した。二個の形質転換体が、イソプレンの形跡を示した。前記イソプレンの量を、１４時間のインキュベーションで増加することが出来た。前記二個の陽性サンプルは、１４時間のインキュベーション後、約０．５μｇ／Ｌの値のイソプレンを示した。前記非形質転換体のコントロールは、イソプレンの検知出来る値を示さなかった。この実験は、Ｔ．リーセイが外因性のイソプレン・シンターゼが供給された場合に内因性の前駆体からイソプレンを生産可能なことを示す。
実施例６：ヤロウィア内のイソプレンの生産
Ｉ．ヤロウィア・リポリティカでのクズ・イソプレン・シンターゼの発現のためのベクターの構築
ヤロウィア・リポリティカでのクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子の発現のためのベクターの構築を、ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）から始めた。このベクターの完全な配列（配列番号１１）は、図１５で示す。
以下の断片を、テンプレートとしてのＹ．リポリティカ株ＧＩＣＣ１２０２８５の染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲで増幅した：ＵＲＡ３遺伝子のプロモーターがない形態、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の断片、Ｙ．リポリティカＸＰＲ２遺伝子の転写ターミネーター、及びＸＰＲ２のプロモーター及びＩＣＬ１遺伝子を含む二個のＤＮＡ断片。以下のＰＣＲプライマーを用いた：

ＩＣＬ１ ３
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣ（配列番号６９）

ＩＣＬ１ ５
５’−ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号７０）

ＸＰＲ ３
５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号７１）

ＸＰＲ ５
５’−ＧＧＴＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号７２）

ＸＰＲＴ３
５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号７３）

ＸＰＲＴ ５
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧ（配列番号７４）

Ｙ１８Ｓ３
５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＧ（配列番号７５）

Ｙ１８Ｓ ５
５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧ（配列番号７６）

ＹＵＲＡ３
５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号７７）

ＹＵＲＡ ５０
５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧ（配列番号７８）

ＹＵＲＡ ５１
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号７９）

ＰＣＲ増幅のために、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩポリメラーゼ（ストラタジェン）、付属のバッファー及びｄＮＴＰｓ、２．５μＭプライマー及び指定の鋳型ＤＮＡを、メーカーの指示に従って用いた。前記増幅は、以下のサイクルを用いて行った：９５℃１分間、３４×（９５℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃３分間）及び７２℃１０分間、その後４℃のインキュベーション。
ヤロウィアでの発現のためにコドン最適化された、クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子をコードする合成ＤＮＡ分子をＤＮＡ２．０から得た（図１６、配列番号１２）。図１８で、それぞれＸＰＲ２及びＩＣＬ１のプロモーター制御下で合成クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を有するプラスミドｐＹＬＡ（ＫＺ１）及びｐＹＬＩ（ＫＺ１）の構築構成の全詳細を提示する。交配因子遺伝子（ＭＡＰ２９）がイソプレン・シンターゼ遺伝子の位置に挿入されたコントロール・プラスミドも構築した（図１８Ｅ及び１８Ｆ）。
同様のクローニング手順をポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレン・シンターゼ遺伝子の発現のために使用することが出来る。ポプラ・イソプレンの配列は、Ｍｉｌｌｅｒ Ｂ．他、（２００１年）、Ｐｌａｎｔａ、第２１３巻、４８３−４８７ページで記載され、図１７で示す（配列番号１３）。図１８Ａ及びＢで、それぞれＸＰＲ２及びＩＣＬ１のプロモーター制御下で合成ポプラ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を有するプラスミドｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）及びｐＹＬＩ（ＰＯＰ１）の生成の構築構成を提示する。
ＩＩ．Ｙ．リポリティカの組み換え株によるイソプレンの生成
ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）及びｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）を、ＳａｃＩＩで消化し、標準的酢酸リチウム／ポリエチレングリコール手順により株Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＬＩＢ １２２をウリジン原栄養性（ｕｒｉｄｉｎｅ ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）へ形質転換するために用いた。簡潔に、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）で一晩増殖した酵母菌を、遠心沈澱法（４０００ｒｐｍ、１０分間）で集め、滅菌水で一度洗浄し、０．１Ｍ酢酸リチウム、ｐＨ６．０に懸濁した。細胞懸濁液の２００μ１分割量を線状化プラスミドＤＮＡ溶液（１０−２０μｇ）に混合し、室温で１０分間インキュベートした後、同じバッファー中で１ｍｌの５０％ ＰＥＧ４０００と混合した。前記懸濁液を室温で１時間さらにインキュベーした後、４２℃で２分間熱ショックを与えた。次に、細胞をＳＣ ｈｉｓ ｌｅｕプレート上にプレートした（０．６７％酵母窒素原基礎培地、２％グルコース、各１００ｍｇ／Ｌのロイシン及びヒスチジン）。形質転換体が３０℃で３−４日間のインキュベーション後に見えた。
ｐＹＬＡ（ＫＺ１）形質転換からの３単離株、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）形質転換からの３単離株、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２単離株及びｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２単離株を、振盪しながら３０℃のＹＥＰ７培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、ｐＨ７．０）内で２４時間増殖させた。１０ｍｌの培養物からの細胞を、遠心沈澱法で集め、３ｍｌの新しいＹＥＰ７に再懸濁し、１５ｍｌのねじ蓋バイアルに入れた。前記バイアルを、緩やかに（６０ｒｐｍ）振盪しながら室温で一晩インキュベートした。これらのバイアルのヘッドスペースでのイソプレン含有量を、実施例１で記載するように質量分析検出器を用いてガスクロマトグラフィーで分析した。ｐＹＬＡ（ＫＺ１）及びｐＹＬＩ（ＫＺ１）で得られた形質転換体は全て、容易に検出可能な量のイソプレン（０．５μｇ／Ｌから１μｇ／Ｌ、図２０）を生産した。イソプレンは、イソプレン・シンターゼ遺伝子の代わりにフィターゼ遺伝子を有するコントロール株のヘッドスペースでは検出されなかった。
実施例７：クズ・イソプレン・シンターゼ及びｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉ及びｄｘｓを発現する大腸菌でのイソプレンの生産
Ｉ．大腸菌でのイソプレンの生産のためのクズ・イソプレン・シンターゼ及びｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉ及びｄｘｓをコードするベクターの構築
ｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（実施例１で記載）のｂｌａ遺伝子を、カナマイシン耐性を与える遺伝子と置き換えた。ｂｌａ遺伝子を取り除くために、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕをＢｓｐＨＩで消化し、エビ・アルカリフォスファターゼ（ＳＡＰ）で処理し、６５℃で熱不活性化させ、次に、クレノーフラグメント及びｄＮＴＰｓで末端を満たした。５ｋｂｐの大きい断片をアガロースゲルから精製し、プライマーＭＣＭ２２ ５’−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧ（配列番号１４）及びＭＣＭ２３ ５’−ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号１５）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯからＰＣＲ増幅したｋａｎｒ遺伝子にライゲートした後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｖｕＩで消化し、末端を満たした。カナマイシン耐性（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎ）を与えるプラスミドを有する形質転換体を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡ上で選択した。
ｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ Ｋａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎを、ＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活性化後、ゲル精製した。それを、合成ＲＢＳと共にＳ．セルビシエ由来のｉｄｉをコードするＰＣＲ生産物にライゲートした。ＰＣＲのためのプライマーは、ＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ １ Ｆ ５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ（配列番号１６）及びＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ １ Ｒ ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ（配列番号１７）であった。また、テンプレートはＳ．セルビシエ・ゲノムＤＮＡであった。前記ＰＣＲ生産物を、ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩで消化し、ライゲーション前にゲル精製した。前記ライゲーション混合物を、化学的に形質転換可能なＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列決定した。得られたプラスミドはｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）（図３４及び３５）と呼ばれた。
ｉｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ Ｋａｎの構築
プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎをＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活性化後にゲル精製した。それを、合成ＲＢＳと共に大腸菌由来のｄｘｓをコードするＰＣＲ生産物にライゲートした。ＰＣＲのプライマーを、ＭＣＭ １３ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号１８）及びＭＣＭ１４ ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号１９）とし、テンプレートを大腸菌ゲノムＤＮＡとした。前記ＰＣＲ生産物をＮｓｉＩ及びＰｓｔＩで消化し、ライゲーション前にゲル精製した。前記得られた形質転換反応物を、ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列決定した。得られたプラスミドはｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（ｋａｎ）（図３６及び３７）と呼ばれた。
ｉｖ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）の構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）をＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活性化後、ゲル精製した。それを、合成ＲＢＳと共に大腸菌ｄｘｓをコードするＰＣＲ生産物にライゲートした（プライマー：ＭＣＭ１３ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号１８）及びＭＣＭ１４ ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号１９）、テンプレート：ＴＯＰ１０細胞）。それを、ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩで消化し、ゲル精製した。最終プラスミドはｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）（図２１及び２２）と呼ばれた。
ｖ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕの構築
プロモーター、構造遺伝子及び上記の実施例１のターミネーターを含むＤＮＡ断片を、ＳｓｐＩを用いてｐＴｒｃＫｕｄｚｕから消化し、ゲル精製した。それを、ＰｖｕＩＩで消化され、ＳＡＰで処理され、熱不活性化されたｐＣＬ１９２０にライゲートした。前記得られたライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡで選択した。いくつかのクローンを単離し、配列決定後、二個を選択した。ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ及びｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）は反対の方向で挿入断片を有する（図３８−４１）。
ｖｉ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩで消化され、ゲル精製された、上記（ｉｉ）からのＩＤＩ ＰＣＲ単位複製配列を、ＰｓｔＩで消化され、ＳＡＰで処理され、熱不活性化されたｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕにライゲートした。前記ライゲーション混合物を、ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡで選択した。いくつかのクローンを単離し、配列決定した。得られたプラスミドはｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ（図４２及び４３）と呼ばれる。
ｖｉｉ）ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩで消化され、ゲル精製された、上記（ｉｉｉ）からのＤＸＳ ＰＣＲ単位複製配列を、ＰｓｔＩで消化され、ＳＡＰで処理され、熱不活性化されたｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）にライゲートした。前記ライゲーション混合物を、ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＡで選択した。いくつかのクローンを単離し、配列決定した。得られたプラスミドはｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ（図４４及び４５）と呼ばれる。
ＩＩ．クズ・イソプレン・シンターゼ、ｉｄｉ、及び／またはｄｘｓを異なるコピー数で発現する培養物のヘッドスペース中のイソプレンの測定
事前に、プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）（Ａ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ ｋａｎ（Ｂ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ ｋａｎ（Ｃ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ＤＸＳ ｋａｎ（Ｄ）で形質転換された、大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）の培養物を、ＬＢカナマイシン５０μｇ／ｍＬで増殖した。ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ｅ）、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ、ｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（Ｆ）及びｐＣＬ ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（Ｇ）の培養物を、ＬＢスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬで増殖した。培養物を、０時間（ＯＤ６００はおよそ０．５）に４００μＭ ＩＰＴＧで誘導し、サンプルをヘッドスペースのイソプレンの測定のために採取した（実施例１を参照されたい）。その結果を図２３Ａ−２３Ｇに示す。
プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）を、形質転換により大腸菌株ＢＬ２１に導入した。得られた株ＢＬ２１／ｐＴｒｃ Ｋｕｄｚｕ ＩＤＩ ＤＸＳを、２０℃でカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢで一晩増殖し、１％グルコースを含むＴＭ３（（１３．６ｇのＫ２ＰＯ４、１３．６ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ）、２．０ｇのクエン酸一水和物、０．３ｇのクエン酸鉄アンモニウム、３．２ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇの酵母抽出物、１．０ｍｌの１０００×修飾微量金属溶液、適量のＨ２Ｏ、ｐＨ６．８で調節し、ろ過滅菌されている）の振盪フラスコを植菌するために用いた。ＯＤ６００が０．８になるまでフラスコを３０℃でインキュベートし、次に、４００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。誘導後にサンプルを多様な時間で採取し、ヘッドスペースでのイソプレンの量を実施例１で記載するように測定した。その結果を図２３Ｈに示す。
ＩＩＩ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ中のバイオマスからのイソプレンの生産
株ＢＬ２１ ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳを、３タイプのバイオマス（バガス、トウモロコシ茎葉及び軟材パルプ、コントロールとしてのグルコース）からイソプレンを生産する能力について試験した。バイオマスの加水分解産物を、酵素加水分解（Ｂｒｏｗｎ，Ｌ及びＴｏｒｇｅｔ，Ｒ．、１９９６年、ＮＲＥＬ標準的アッセイ法Ｌａｐ−００９（ＮＲＥＬ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ Ｌａｐ−００９）「リグノセルロースのバイオマスの酵素糖化法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓ）」）により調製し、グルコース当量に基づく希釈に用いた。この実施例において、グルコース当量は、１％グルコースと等しい。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）の新たな形質転換細胞のプレートからの単一コロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた５ｍｌのＬＢを植菌するために使用した。前記培養物を、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。次の日に、一晩培養した培養物を、２５ｍｌのＴＭ３及び０．２％ＹＥならびに１％供給材料でＯＤ６００が０．０５になるように希釈した。前記供給材料は、トウモロコシ茎葉、バガスまたは針葉樹パルプであった。グルコースをポジティブコントロールとして用い、グルコースはネガティブ・コントロールとしては用いなかった。培養物を、１８０ｒｐｍで振盪しながら３０℃でインキュベートした。前記培養物を、ＯＤ６００でモニタリングし、ＯＤ６００が〜０．８に達した時に、培養物を実施例１で記載するようにイソプレン生産について１及び３時間後に分析した。培養物は誘導されなかった。追加の供給材料を含む全ての培養物は、グルコース・ポジティブコントロールと等量のイソプレンを生産する。実験を重複して行い、その結果を図４６に示す。
ＩＶ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳでの転化糖からのイソプレンの生産
ＢＬ２１（λＤＥ３）／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）の新たな形質転換細胞のプレートからの単一コロニーを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を加えた５ｍｌのＬＢを植菌するために使用した。前記培養物を、振盪しながら２５℃で一晩インキュベートした。次の日に、一晩培養した培養物を、２５ｍｌのＴＭ３及び０．２％ＹＥならびに１％供給材料でＯＤ６００が０．０５になるように希釈した。供給材料は、グルコース、転化したグルコースまたはトウモロコシ茎葉であった。前記転化糖供給材料（ダニスコ転化糖）を、酵素的にショ糖シロップを処理することにより調製した。下記（パーツＶ）で記載するように、ＡＦＥＸトウモロコシ茎葉を調製した。前記細胞を３０℃で増殖し、培養物がＯＤ６００ 〜０．８−１．０（０時間）に達した時に、最初のサンプルを測定した。前記培養物を、ＯＤ６００で測定することにより増殖について分析し、実施例１のように０、１及び３時間でのイソプレン生産について分析した。その結果を、図４７に示す。
Ｖ．ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉からの加水分解産物の調製
ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉を、ミシガン・バイオテクノロジー研究所（Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から得た。前処理条件は、６０％湿気、１：１アンモニア充填及び３０分間９０℃の後、風乾した。ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉中の含水率は、２１．２７％であった。ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉中のグルカン及びキシランの含有量は、それぞれ３１．７％及び１９．１％（乾燥量基準）であった。糖化過程は次のようであった：２０ｇのＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉を、５ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ４．８、２．２５ｍｌのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ １０００及び０．１ｍｌのＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ１２１（パン製造産業のためのアスペルギルスニガーからのダニスコ・キシラナーゼ生産物）及び７２．６５ｍｌのＤＩ水を含む５００ｍｌのフラスコに添加した。前記フラスコを旋回振盪機に入れ、９６時間５０℃でインキュベートした。一のサンプルを振盪機から採取し、ＨＰＬＣを用いて分析した。前記加水分解産物は、３８．５ｇ／ｌのグルコース、２１．８ｇ／ｌのキシロース及び１０．３ｇ／ｌのグルコース及び／またはキシロースのオリゴマーを含んだ。
ＶＩ．流加回分培養で増殖された大腸菌でのイソプレン生産における酵母抽出物の効果
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳプラスミドを含む大腸菌細胞で上述したように発酵は１４Ｌスケールで行った。酵母抽出物（バイオ・スプリンガー（Ｂｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、モントリオール、ケベック、カナダ）を指数関数的速度で供給した。発酵槽に加えられる酵母抽出物の総量は、４０時間の発酵中、７０−８３０ｇの間で変化した。発酵培養液の光学密度を、５５０ｎｍの波長で測定した。発酵槽内の最終光学密度は、加えられた酵母抽出物の量に比例した（図４８Ａ）。上述のように、発酵槽からのオフガス中のイソプレン値を測定した。イソプレン力価は、発酵の進行にかけて増加した（図４８Ｂ）。生産されたイソプレンの量は、供給された酵母抽出物の量に直線的に比例した（図４８Ｃ）。
ＶＩＩ．ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ＤＸＳ ｙＩＤＩの５００Ｌ発酵槽でのイソプレンの生産
クズ・イソプレン・シンターゼ、Ｓ．セルビシエＩＤＩ及び大腸菌ＤＸＳ核酸（大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃ Ｋｕｄｚｕ ｄｘｓ ｙｉｄｉ）を含む大腸菌細胞の５００リットル発酵槽を、イソプレンを生産するために使用した。１５時間にかけて前記イソプレンの値は、５０から３００μｇ／Ｌの間で変化した。平均イソプレン濃度、装置を通る平均流量及びイソプレン貫流の程度に基づいて、収集されたイソプレンの量は、およそ１７ｇであると計算された。
ＶＩＩＩ．流加回分培養で増殖された大腸菌の５００Ｌ発酵槽でのイソプレンの生産
培地処方（発酵培地のリットル当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊ ７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、１０００Ｘ修飾微量金属溶液１ｍｌ。前記成分の全てを一度に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。この溶液をオートクレーブ滅菌した。ｐＨをアンモニウム・ガス（ＮＨ３）で７．０に調節し、容量を適量にした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ ０．１ｇ及び抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
１０００×修飾微量金属溶液：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ。各成分を、一個ずつＤＩ Ｈ２Ｏに溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、容量を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
発酵は、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳプラスミドを含む大腸菌細胞が入った５００Ｌバイオリアクターで行った。この実験を、ｐＨ７．０及び３０℃の所望の発酵でグルコース及び酵母抽出物からのイソプレン生成をモニターするために行った。冷凍のバイアルから採取された大腸菌株の植菌物を、ソイトーン−酵母抽出物−グルコース培地で調製した。５５０ｎｍで測定し、植菌物がＯＤ ０．１５に増殖した後、その２０ｍｌを、２．５Ｌのソイトーン−酵母抽出物−グルコース培地を含むバイオリアクターを植菌するために用いた。２．５Ｌバイオリアクターを、３０℃でＯＤ １．０まで増殖させ、２．０Ｌを、５００Ｌバイオリアクターに移した。
酵母抽出物（バイオ・スプリンガー、モントリオール、ケベック、カナダ）及びグルコースを、指数関数的速度で供給した。５０時間の発酵中、バイオリアクターに加えられたグルコース及び酵母抽出物の総量は、それぞれ１８１．２ｋｇ及び１７．６ｋｇであった。時間にわたるバイオリアクター内の光学密度を、図４９Ａで示す。上述のように、バイオリアクターからのオフガス中のイソプレン値を測定した。イソプレン力価は、発酵の進行にわたり増加した（図４９Ｂ）。５０時間の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、５５．１ｇであった。その生産のタイムコースを図４９Ｃで示す。
実施例８：クズ・イソプレン・シンターゼ及び組み換えメバロン酸経路遺伝子を発現する大腸菌でのイソプレンの生産
Ｉ．下流ＭＶＡ経路のクローンニング
下流メバロン酸経路をクローンニングための戦略は以下のとおりであった。メバロン酸生合成経路の４遺伝子：メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子を、Ｓ．セルビシエ染色体ＤＮＡからのＰＣＲで増幅し、ｐＣＲ ＢｌｕｎｔＩＩ ＴＯＰＯプラスミド（インビトロジェン）に個々にクローンニングした。いくつかの場合において、ｉｄｉ遺伝子を大腸菌染色体ＤＮＡから増幅した。大腸菌コンセンサスＲＢＳ（ＡＧＧＡＧＧＴ（配列番号８０）またはＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号８１））が５’末端の開始コドンの８ｂｐ上流で挿入され、ＰｓｔＩ部位が３’末端に加えられるように、前記プライマーを設計した。次に、全経路が組み立てられるまで、前記遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターに一個ずつクローンニングした。
Ｓ．セルビシエＳ２８８Ｃからの染色体ＤＮＡを、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ２０４５０８Ｄ）から得た。前記ＭＶＫ遺伝子を、製造者の指示のようにＰｆｕＴｕｒｂｏを用いてプライマーＭＶＫＦ（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＣ、配列番号２１）及びＭＶＫ−ＰｓｔＩ−Ｒ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＧＴＧ、配列番号２２）を用いてＳ．セルビシエの染色体から増幅した。適正なサイズのＰＣＲ生産物（１３７０ｂｐ）を、１．２％Ｅ−ゲル（インビトロジェン）を通して電気泳動で同定し、ｐＺｅｒｏＢＬＵＮＴ ＴＯＰＯにクローンニングした。得られたプラスミドはｐＭＶＫ１と指定された。プラスミドｐＭＶＫ１を、ＳａｃＩ及びＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、その断片をゲル精製した後、ＳａｃＩ及びＢｓｔＢＩで消化されたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂにライゲートした。得られたプラスミドはｐＴｒｃＭＶＫ１と命名された。
メバロン酸生合成経路の第２遺伝子、ＰＭＫを、プライマーを用いてＰＣＲで増幅した：ＰｓｔＩ−ＰＭＫ１ Ｒ（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＣ、配列番号２３）及びＢｓｉＨＫＡ Ｉ−ＰＭＫ１ Ｆ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧ、配列番号２４）。前記ＰＣＲ反応を、製造者の指示に従い、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（ストラタジェン）を用いて行った。適正なサイズの生産物（１３８７ｂｐ）を、ＰｓｔＩ及びＢｓｉＨＫＩで消化し、ＰｓｔＩで消化されたｐＴｒｃＭＶＫ１にライゲートした。得られたプラスミドはｐＴｒｃＫＫと命名された。前記ＭＶＤ及びｉｄｉ遺伝子を同じ方法でクローンニングした。ＰＣＲはプライマーペアを用いて行った。すなわち、ＭＶＤ遺伝子を増幅するためＰｓｔＩ−ＭＶＤ １ Ｒ（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣ、配列番号２５）及びＮｓｉＩ−ＭＶＤ １ Ｆ（５’−ＧＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧ、配列番号２６）、ｙＩＤＩ遺伝子を増幅するためのＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ １ Ｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ、配列番号２７）及びＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ １Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ、配列番号２８）である。いくつかの場合において、ＩＰＰイソメラーゼ遺伝子、大腸菌由来のｉｄｉを用いた。大腸菌染色体ＤＮＡ由来のｉｄｉを増幅するために、以下のプライマーセットを用いた：ＰｓｔＩ−ＣＩＤＩ １ Ｒ（５’−ＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧ、配列番号２９）及びＮｓｉＩ−ＣＩＤＩ １ Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧ、配列番号３０）。鋳型ＤＮＡは、大腸菌ＦＭ５から標準的方法で単離された染色体ＤＮＡであった（ＷＯ９６／３５７９６及びＷＯ２００４／０３３６４６を参照されたい。これらは、特に、核酸の単離に関して、参照によりその全体が組み込まれる）。最終プラスミドは、酵母ｉｄｉ遺伝子をコードする構築物についてｐＫＫＤＩｙまたは大腸菌ｉｄｉ遺伝子をコードする構築物についてｐＫＫＤＩｃと命名された。前記プラスミドを、後の分析のために大腸菌宿主ＢＬ２１に
形質転換した。いくつかの場合において、クズ由来のイソプレン・シンターゼを、ｐＫＫＤＩｙにクローンニングし、プラスミドｐＫＫＤＩｙＩＳを得た。
下流ＭＶＡ経路もまた、カナマイシン抗生物質耐性マーカーを含むｐＴｒｃにクローンニングした。プラスミドｐＴｒｃＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩ及びＰｓｔＩで消化し、５９３０ｂｐの断片を１．２％アガロースＥ−ゲル上で単離し、また製造者の指示に従いキアゲン・ゲル精製キットを用いて精製した。実施例７で記載の前記プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎを制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩ及びＰｓｔＩで消化し、ベクターを含む３３３８ｂｐの断片をキアゲン・ゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。前記３３３８ｂｐのベクター断片及び５９３０ｂｐの下流ＭＶＡ経路断片を、ロッシュ・クイック・ライゲーション・キットを用いてライゲートした。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択しながら３７℃で一晩増殖させた。前記形質転換体を制限酵素消化で確認し、一個をストックとして冷凍した。前記プラスミドはｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙと指定された。
ＩＩ．ｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙへのクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子のクローンニング
前記クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を、プライマーＭＣＭ５０ ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴ（配列番号３１）及びＭＣＭ５３ ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号３２）を用いて実施例１で記載のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ断片を、ｐＣＲ２．１にクローンニングし、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。この断片は、クズ・イソプレン・シンターゼのコーディング配列及び大腸菌からのＲＢＳを含む上流領域を含む。形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択しながら３７℃で一晩インキュベートした。前記断片が適正に挿入されたことをシークエンスで確認した。この株はＭＣＭ９３と指定された。
ＲＢＳ及びクズ・イソプレン・シンターゼを含む１７２４ｂｐの挿入断片を遊離するために、株ＭＣＭ９３からの前記プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩ及びＰｓｔＩで消化した。前記１７２４ｂｐの断片を、１．２％アガロースＥ−ゲル上で単離し、製造者の指示に従いキアゲン・ゲル精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、３７℃で３０分間ＳＡＰで処理した後、キアゲンＰＣＲクリーンアップ・キットを用いて精製した。前記プラスミド及びクズ・イソプレン・シンターゼをコードするＤＮＡ断片を、ロッシュ・クイック・ライゲーション・キットを用いてライゲートした。前記ライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を５０μｇ／ｍｌでカナマイシンを含むＬＡ上で選択しながら３７℃で一晩増殖させた。前記適正な形質転換体を制限酵素による消化で確認した。プラスミドはｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎ（図２４及び２５）と指定された。このプラスミドを、ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞（インビトロジェン）に形質転換した。
ＩＩＩ．組み換え下流メバロン酸経路及びクズ由来のイソプレン・シンターゼを発現する大腸菌内のメバロン酸塩からのイソプレン生産
株ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎを、ｐＨ７．１に調節され、０．５％グルコース及び０．５％メバロン酸で補給されたＭＯＰＳ培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ他（１９７４年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１１９巻、７３６−７４７ページ）内で培養した。また、コントロール培養は、同一条件を用いるが、０．５％メバロン酸を添加せずに作製した。前記培養を１％植菌物を含む一晩の種培養から始め、培養が０．３から０．５のＯＤ６００に達した時に、５００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。前記培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で増殖させた。前記イソプレンの生産を、実施例１で記載のヘッドスペース・アッセイを用いて誘導の３時間後に分析した。イソプレンの最大生産量は、６．６７×１０４ｎｍｏｌ／Ｌ培養液／ＯＤ６００／時間であった。ここで、Ｌ培養液は培養液の容量であり、細胞培地の容量及び細胞の容量の両方を含む。メバロン酸が補給されていない前記コントロール培養は、測定可能なイソプレンを生産しなかった。
ＩＶ．上流ＭＶＡ経路のクローンニング
三個の酵素活性をコードする二種類の遺伝子を含む上流メバロン酸塩生合成経路を、エンテロコッカス・フェカーリスからクローニングした。ｍｖａＥ遺伝子は、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ及び３−ヒドロキシ−３−メチル・グルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素の両方の酵素活性を含むタンパク質、及び前記経路における第１及び第３タンパク質をコードする。また、ｍｖａＳ遺伝子は、前記経路における第２酵素及びＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする。前記ｍｖａＥ遺伝子を、以下のプライマーを用いて前方の大腸菌リボソーム結合部位及びスペーサーを有するＥ．フェカーリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８０２Ｄ−５）から増幅した：
ＣＦ０７−６０（＋） ＲＢＳ＋ＡＴＧ開始コドンを含むｍｖａＥの開始 ＳａｃＩ
５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号３４）
ＣＦ０７−６２（−） 間にＲＢＳを含むｍｖａＥのｍｖａＳへの融合
５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号３５）
前記ｍｖａＳ遺伝子を、以下のプライマーを用いて前方のＲＢＳ及び大腸菌由来のスペーサーを有するＥ．フェカーリス・ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ７００８０２Ｄ−５）から増幅した：
ＣＦ０７−６１（＋） 間にＲＢＳを含むｍｖａＥのｍｖａＳへの融合
５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号３６）
ＣＦ０７−１０２（−） ｍｖａＳ遺伝子の末端 ＢｇｌＩＩ
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号３７）

ＰＣＲ断片を、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで相互に融合した：
ＣＦ０７−６０（＋） ＲＢＳ＋ＡＴＧ開始コドンを含むｍｖａＥの開始 ＳａｃＩ
５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号３４）
ＣＦ０７−１０２（−） ｍｖａＳ遺伝子の末端 ＢｇｌＩＩ
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号３７）

前記融合ＰＣＲ断片をキアゲン・キットを用いて精製し、制限酵素ＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで消化した。この消化されたＤＮＡ断片を、キアゲン・キットを用いてゲル精製し、ＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで消化され、ゲル精製された市販のベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ａにライゲートした。
前記ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン・プレート上で選択した。合計６個のコロニーを選び、ＬＢ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で一晩増殖した後、プラスミドをキアゲン・キットを用いて単離した。前記プラスミドを挿入断片の確認のためにＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、一の適正なプラスミドを以下のプライマーで配列決定した：
ＣＦ０７−５８（＋） ｍｖａＥ遺伝子の開始
５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号３８）
ＣＦ０７−５９（−） ｍｖａＥ遺伝子の末端
５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号３９）
ＣＦ０７−８２（＋） ｍｖａＳ遺伝子の開始
５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号−４０）
ＣＦ０７−８３（−） ｍｖａＳ遺伝子の末端
５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号４１）
ＣＦ０７−８６（＋） ｍｖａＥでの配列決定
５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号４２）
ＣＦ０７−８７（＋） ｍｖａＥでの配列決定
５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号４３）
ＣＦ０７−８８（＋） ｍｖａＥでの配列決定
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号４４）
ＣＦ０７−８９（＋） ｍｖａＳでの配列決定
５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号４５）

ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１と呼ばれる前記プラスミドを、シークエンスで適正であることを確認し、市販の大腸菌株ＢＬ２１に形質転換した。選択をＬＡ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン上で行った。二個の形質転換体を選び、ＯＤ６００が１．５に達するまでＬＢ及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で増殖させた。両方の株を、グリセロールが存在する状態で−８０℃でバイアル中に冷凍した。株は、ＢＬ２１でのｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１のＣＦ４４９を単離＃１、ＢＬ２１でのｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１のＣＦ４５０を単離＃２と指定された。分析した後、両方のクローンは、同一に機能することが分かった。
Ｖ．ｐＣＬ１９２０への上流ＭＶＡ経路のクローニング
ｐＴｒｃ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳ−（Ｈｉｓタグ）−ターミネーターを含む断片を遊離するために、前記プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩで消化した。この断片では、Ｈｉｓタグは翻訳されなかった。この平滑末端の４．５ｋｂｐ断片を、キアゲン・ゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。ｐＣＬ１９２０由来の脱リン酸化された、平滑末端の４．２ｋｂｐ断片を、制限エンドヌクレアーゼｐｖｕＩＩでベクターを消化することで調製し、ＳＡＰで処理後、キアゲン・ゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルからゲル精製した。二個の断片を、ロッシュ・クイック・ライゲーション・キットを用いてライゲートし、化学的に形質転換可能なＴＯＰ１０細胞に形質転換した。形質転換体を、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択した。適正なコロニーを、ＰＣＲで挿入断片の存在をスクリーニングすることで同定した。前記プラスミドはｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（図２６及び２７）と指定された。
ＶＩ．組み合わせた上流及び下流メバロン酸経路を発現する株
完全なメバロン酸経路及びクズ・イソプレン・シンターゼを有する株を得るため、プラスミドｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳｋａｎ及びｐＣＬｐＴｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを両方ともＢＬ２１（λＤＥ３）コンピテント細胞（インビトロジェン）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択した。両方のプラスミドが宿主内で保持されたことを確認するため、前記形質転換体をプラスミド・プレップ（ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ）で確認した。前記株はＭＣＭ１２７と指定された。
ＶＩＩ．大腸菌／ｐＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ内のグルコース由来のメバロン酸の生産
ＢＬ２１／ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳまたはＦＭ５／ｐ ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳの単一コロニーを、ＬＢ及びカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）に植菌し、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖した。これらの培養を、ＯＤ６００が０．１になるまで２５０ｍｌバッフル・フラスコ内の５０ｍｌ培地に希釈した。前記培地は、ＴＭ３、１％または２％グルコース、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３、１％グルコース、加水分解された大豆油、及びカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３及びバイオマス（調製されたバガス、トウモロコシ茎葉またはスイッチグラス）である。培養物を、ＯＤ６００が０．４に到達するまで、およそ２−３時間、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で増殖させた。ここで、ｍｖａＥ ｍｖａＳ構築物からの発現をＩＰＴＧ（４００μＭ）の追加で誘導した。培養物は、誘導後６時間まで２時間の間隔、その後は必要な場合に２４、３６及び４８時間でサンプルを採取しながら、さらに２０時間または４０時間インキュベートした。１ｍｌの培養物を採取し、ＯＤ６００を測定し、ミクロ遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）内で細胞をペレットにし、上清を除去した後、それをメバロン酸について分析することで、サンプリングを行った。
エンテロコッカス・フェカーリスＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドをコードする核酸を有する大腸菌細胞の１４リットルの発酵は、細胞培地としてのＴＭ３培地及び２％グルコースで２２グラムのメバロン酸を生産した。これらの細胞の振盪フラスコは、細胞培養培地としてのＬＢ培地及び１％グルコースでリットル当たり２−４グラムのメバロン酸を生産した。これらの株内でのメバロン酸の前記生産は、ＭＶＡ経路が大腸菌中で機能的であることを示した。
ＶＩＩＩ．上流及び下流ＭＶＡ経路及びクズ・イソプレン・シンターゼを含む大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの生産
以下の株を、上述の上流及び下流ＭＶＡ経路及びクズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を含むプラスミド及び実施例７で記載のｉｄｉ、ｄｘｓ及びｄｘｒ及びイソプレン・シンターゼ遺伝子を含むプラスミドの多様な組み合わせで形質転換することで作製した。用いた宿主細胞は、化学的に形質転換可能なＢＬ２１（λＤＥ３）であり、形質転換は標準的方法で行った。形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン及びスペクチノマイシン（両方とも５０μｇ／ｍｌの濃度）を含むＬ寒天上で選択した。プレートを３７℃で増殖した。得られた株は次のように指定された：

カナマイシン及びスペクチノマイシン（各々５０μｇ／ｍｌ）上で増殖
ＭＣＭ１２７−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ及びｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）
ＭＣＭ１３１−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＣＬ１９２０及びｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）
ＭＣＭ１２５−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ及びｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（ｋａｎ）

カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上で増殖
ＭＣＭ６４−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ（ｋａｎ）
ＭＣＭ５０−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）
ＭＣＭ１２３−ＢＬ２１（λＤＥ３）内のｐＴｒｃＫｕｄｚｕ ｙＩＤＩ ＤＸＳ ＤＸＲ（ｋａｎ）

上記の株を、冷凍庫ストックからＬＡ及び適切な抗生物質にストリーキングし、３７℃で一晩増殖した。各プレートからの単一コロニーを、振盪フラスコ（２５ｍｌ ＬＢ及び適切な抗生物質）に植菌するために使用した。前記フラスコを、２００ｒｐｍで振盪しながら２２℃で一晩インキュベートした。次の朝に、フラスコを３７℃のインキュベーターに移し、２００ｒｐｍで振盪しながらさらに４．５時間増殖した。前記２５ｍｌの培養物を遠心分離機にかけ、細胞をペレットにした後、その細胞を５ｍｌのＬＢ及び適切な抗生物質で再懸濁した。次に、前記培養物を、ＯＤ６００が０．１になるように、２５ｍｌのＬＢ、％グルコース及び適切な抗生物質に希釈した。各株の二個のフラスコを用意し、第１セットをＩＰＴＧ（８００μＭ）で誘導し、第２セットは誘導しなかった。前記培養物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。培養物の第１セットを、１．５０時間後（サンプリング時点１の直後）に誘導した。各サンプリング時点で、ＯＤ６００を測定し、実施例１で記載するようにイソプレンの量を測定した。その結果を表３で示す。作られたイソプレンの量は、特定の株のピーク生産時での量として示される。
表３．大腸菌株でのイソプレンの生産
Figure 0005624980
ＮＤ：測定値なし
Ｔｒａｃｅ：ピークは現れるが積分可能ではない。
ＩＸ．メバロン酸の分析
メバロノラクトン（Ｍｅｖａｌｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）（１．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ＃５０３−４８−０）は、水（７．７ｍＬ）に溶解されたシロップとして、シグマ−アルドリッチ（ウィスコンシン州、米国）から供給され、メバロン酸のカリウム塩を生産するために水酸化カリウム（７．７ｍｍｏｌ）で処理した。メバロン酸への転換は、１Ｈ ＮＭＲ分析で確認した。細胞を除去するために５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心沈澱し、その後、上清の３００μｌ分割量をＨ２Ｏの９００μｌに加えることで、ＨＰＬＣ解析のサンプルを調製した。次に、過塩素酸（３６μｌの７０％溶液）を加え、混合した後、５分間氷上で冷やした。次に、前記サンプルを再び遠心分離機（５分間１４，０００ｒｐｍ）にかけ、上清をＨＰＬＣに移した。メバロン酸基準値（２０、１０、５、１及び０．５ｇ／Ｌ）を、同じ方法で調製した。メバロン酸の分析（２０μＬ注入量）を、屈折率（ＲＩ）検出と共に、０．６ｍＬ／分間で５ｍＭ硫酸で溶出された、バイオラッドＡｍｉｎｅｘ８７−Ｈ＋カラム（３００ｍｍ×７．０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣで行った。これらの条件下で、メバロン酸は、１８．５分後にラクトン型として溶出した。
実施例９：バチルス・ズブチリスへの統合のための上流及び下流ＭＶＡ経路の構築
Ｉ．バチルス・ズブチリス内の上流ＭＶＡ経路の構築
エンテロコッカス・フェカーリスからの前記上流経路を、ａｐｒＥプロモーターの制御下でＢ．ズブチリスに統合した。前記上流経路は、二種類の遺伝子から成る：ＡＡＣＴ及びＨＭＧＲをコードするｍｖａＥ、及びＨＭＧＳをコードするｍｖａＳである。この二種類の遺伝子を、間の終止コドン、ｍｖａＳの前のＲＢＳ部位と共に相互に融合させ、ａｐｒＥプロモーターの制御下に置いた。ターミネーターはｍｖａＥ遺伝子の後に位置した。ホモロジーのフランキング領域を用いた二重交差により、ａｐｒＥ遺伝子座でｍｖａＥ遺伝子及び前記構築物を統合した後、前記クロラムフェニコール耐性マーカーをクローニングした。
ＰＣＲ反応で相互に融合することを可能にする突出部を含むように、４個のＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ増幅は、製造者の指示に従いＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いて行った。
１：ＰａｐｒＥ
ＣＦ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始 ＰｓｔＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号８２）

ＣＦ０７−９４（−） ＰａｐｒＥのｍｖａＥへの融合
５’−ＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡ（配列番号８３）
テンプレート：バチルス・ズブチリス染色体ＤＮＡ

２：ｍｖａＥ
ＣＦ０７−９３（＋） ｍｖａＥのａｐｒＥプロモーターへの融合（ＧＴＧ開始コドン）
５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡ ＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡ ＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号８４）

ＣＦ０７−６２（−） 間にＲＢＳを含むｍｖａＥのｍｖａＳへの融合
５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号３５）
テンプレート：（ＡＴＣＣからの）エンテロコッカス・フェカーリス染色体ＤＮＡ

３：ｍｖａＳ
ＣＦ０７−６２（＋） 間にＲＢＳを含むｍｖａＥのｍｖａＳへの融合
５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号３６）

ＣＦ０７−１２４（−） ｍｖａＳ末端のターミネーターへの融合
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号８５）
テンプレート：エンテロコッカス・フェカーリス染色体ＤＮＡ

４：Ｂ．アミロリケファシエンス・アルカリ性セリン・プロテアーゼ・ターミネーター

ＣＦ０７−１２３（＋） ｍｖａＳ末端のターミネーターへの融合
５’−ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ（配列番号８６）

ＣＦ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンス・ターミネーターの末端 ＢａｍＨＩ
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号６３）
テンプレート：バチルス・アミロリケファシエンス染色体ＤＮＡ

ＰＣＲ融合反応

５：ｍｖａＥのｍｖａＳへの融合
ＣＦ０７−９３（＋） ｍｖａＥのａｐｒＥプロモーターへの融合（ＧＴＧ開始コドン）
５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号８４）

ＣＦ０７−１２４（−） ｍｖａＳ末端のターミネーターへの融合
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号８５）

テンプレート：上から＃２及び３

６：ｍｖａＥ−ｍｖａＳのａｐｒＥプロモーターへの融合

ＣＦ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始 ＰｓｔＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号８２）

ＣＦ０７−１２４（−） ｍｖａＳ末端のターミネーターへの融合
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号：８５）

テンプレート：上から＃１及び＃４

７：ＰａｐｒＥ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳのターミネーターへの融合

ＣＦ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始 ＰｓｔＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号８２）

ＣＦ０７−４６（−） Ｂ．アミロリケファシエンス・ターミネーターの末端 ＢａｍＨＩ
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号６３）

テンプレート：＃４及び＃６

前記生産物を制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＪＭ１０２（Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ及びＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編集、バチルス・ズブチリス及び他のグラム陽性細菌：生化学、生理学及び分子遺伝学（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．内のＰｅｒｅｇｏ，Ｍ．、１９９３年、バチルス・ズブチリス内の遺伝子操作のための統合ベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、６１５−６２４ページ）にライゲートした。前記ライゲーション混合物を、化学的に形質転換可能な大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で選択した。適正なプラスミドを、シークエンスで同定し、ｐＪＭＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２（図５０及び５１）と指定した。精製プラスミドＤＮＡをバチルス・ズブチリスａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫに形質転換し、形質転換体を、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天上で選択した。適正なコロニーを選択し、上流経路を含むカセットのコピー数を増幅するため、クロラムフェニコール１０、１５及び２５μｇ／ｍｌを含むＬ寒天上に連続的にプレートした。
得られた株を、１％グルコース及び１％を含むＬＢ中で増殖させることで、メバロン酸生産について試験した。メバロン酸の生産性についてＧＣにより培養物を分析した。
この株を、下流メバロン酸経路の統合のための宿主として続いて用いた。
以下のプライマーを、上記の種々の構築物の配列決定ために使用した。

シークエンス用プライマー：

ＣＦ０７−１３４（＋） ａｐｒＥプロモーターの開始 ＰｓｔＩ
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号８２）

ＣＦ０７−５８（＋） ｍｖａＥ遺伝子の開始
５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号３８）

ＣＦ０７−５９（−） ｍｖａＥ遺伝子の末端
５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号３９）

ＣＦ０７−８２（＋） ｍｖａＳ遺伝子の開始
５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号４０）

ＣＦ０７−８３（−） ｍｖａＳ遺伝子の末端
５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号４１）

ＣＦ０７−８６（＋） ｍｖａＥのシークエンス
５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号４２）

ＣＦ０７−８７（＋） ｍｖａＥのシークエンス
５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号４３）

ＣＦ０７−８８（＋） ｍｖａＥのシークエンス
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号４４）

ＣＦ０７−８９（＋） ｍｖａＳのシークエンス
５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号４５）

形質転換体を、５μｇ／ｍｌの濃度でクロラムフェニコールを含むＬＡ上で選択した。一のコロニーが適正な統合を有することをシークエンスにより確認し、２５μｇ／ｍｌの最終値までの増加濃度のクロラムフェニコールを含むＬＡ上に数日間プレートした。これは、目的の遺伝子を含むカセットの増幅をもたらす。得られた株は、ＣＦ４５５：ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ＃１ Ｘ バチルス・ズブチリスａｐｒＥｎｐｒＥ Ｐｘｙｌ ｃｏｍＫ（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含むＬＡ上で増殖するために増幅された）と指定された。
ＩＩ．バチルス・ズブチリス内の下流ＭＶＡ経路の構築
遺伝子ｍｖｋ１、ｐｍｋ、ｍｐｄ及びｉｄｉから成る下流ＭＶＡ経路を、Ｂ．ズブチリス染色体（統合の部位）のｎｐｒＥ領域からの隣接するＤＮＡ領域、ａｐｒＥプロモーター及びスペクチノマイシン耐性マーカー（図２８及び２９を参照されたい）から成るカセットと組み合わせた。このカセットをＤＮＡ２．０により合成し、ａｐｒＥ遺伝子座で統合された上流ＭＶＡ経路を含むＢ．ズブチリスの染色体に統合した。クズ・イソプレン・シンターゼ遺伝子を実施例４で記載の複製プラスミドから発現させ、統合された上流及び下流経路の両方を有する株に形質転換した。
実施例１０：Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ及びＰ．アルバ・イソプレン・シンターゼを発現する大腸菌でのイソプレンの生産
Ｉ．Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）及びＰ．アルバ・イソプレン・シンターゼをコードするベクター及び株の構築
（ｉ）株ＥＷＬ２０１（ＢＬ２１、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の構築
大腸菌ＢＬ２１（ノバジェンブランド、ＥＭＤバイオサイエンシス・インク）は、ＭＣＭ３３１ Ｐ１溶解物で形質導入された受容株であった（溶解物は、Ａｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学の最新プロトコール、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版で記載される方法に従い調製した）。形質導入体を、Ｌ寒天及び２０μｇ／μｌクロラムフェニコール上の伸展細胞により選択した。前記プレートを、３０℃で一晩インキュベートした。形質導入体の分析は、コントロールプレート上のコロニーを示さなかった（復帰体のための水＋細胞コントロールプレート、及び溶解物汚染のための水及びＰ１溶解物コントロールプレート）。
４個の形質導入体を選び、５ｍＬ Ｌ培養液及び２０μｇ／μｌクロラムフェニコールを植菌するために用いた。前記培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖した。ＰＣＲ分析のための各形質導入体のゲノムＤＮＡプレップを作るため、一晩培養した細胞培養物の１．５ｍＬを遠心分離機にかけた。細胞ペレットを４００μｌ再懸濁バッファー（２０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で再懸濁し、４μｌ ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅフリー（ロッシュ）を加えた。前記チューブを、３０分間、３７℃でインキュベートし、続けて、４μｌの１０％ＳＤＳ及び４μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫストック溶液（シグマ・アルドリッチ）を加えた。前記チューブを、１時間、３７℃でインキュベートした。前記細胞溶解物を、２ｍｌフェーズ・ロック・ライト・ゲル・チューブ（エッペンドルフ）に移し、飽和フェノールｐＨ７．９（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社）及びクロロホルムの各々２００μｌを加えた。前記チューブをよく混合し、５分間、ミクロ遠心した。第２の抽出を４００μｌクロロホルムで行い、水層を新しいエッペンドルフチューブに移した。前記ゲノムＤＮＡを１ｍｌの１００％エタノールの添加及び５分間の遠心沈澱により沈殿させた。前記ゲノムＤＮＡペレットを、１ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。前記エタノールを除去し、ゲノムＤＮＡペレットを軽く風乾させた。前記ゲノムＤＮＡペレットを２００μｌ ＴＥで再懸濁した。
Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジェン）及び２００ｎｇ／μｌのテンプレートとしてのゲノムＤＮＡを用いて、異なる２セットのＰＣＲ反応チューブを製造者のプロトコールに従い調製した。セット１について、プライマーＭＣＭ１３０及びＧＢ Ｃｍ−Ｒｅｖ（表４）を、形質導入体がａｔｔＴｎ７遺伝子座にうまく統合されたことを確認するために用いた。セット１のＰＣＲパラメーターは、９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２５秒間、５５℃２５秒間、７２℃２５秒間（２−４工程を２８サイクル繰り返す）、７２℃１分間であった。セット２について、プライマーＭＶＤ Ｆｏｒ及びＭＶＤ Ｒｅｖ（表４）を、ｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロンが適切に統合されたことを確認するために用いた。セット２のＰＣＲパラメーターは、９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２５秒間、５５℃２５秒間、７２℃１０秒間（２−４工程を２８サイクル繰り返す）、７２℃１分間であった。１．２％Ｅ−ゲル（インビトロジェン社）上のＰＣＲ単位複製配列の分析は、４個の形質導入体クローンの全てが適正であったことを示した（１個を選び、株ＥＷＬ２０１として指定した）。
ｉｉ）株ＥＷＬ２０４（ＢＬ２１、ｌｏｏｐｏｕｔ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）の構築
前記クロラムフェニコール・マーカーを、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００年）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、第９７巻、６６４０−６６４５ページ、２０００年）で記載されるようにプラスミドｐＣＰ２０を用いて株ＥＷＬ２０１からループアウト（ｌｏｏｐｅｄ ｏｕｔ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＥＷＬ２０１）した。ＰＣＲ生産物を用いた大腸菌Ｋ１２の染色体遺伝子のワンステップ不活性化（Ｄａｔｓｅｎｋｏ他、ＰＮＡＳ、第９７巻、６６４０−６６４５ページ、２０００年）。ＥＷＬ２０１細胞を、中間対数増殖期までＬ培養液で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で三回洗浄した。細胞懸濁液の５０μｌの分割量を、ｐＣＰ２０の１μｌで混合し、細胞懸濁液混合物をジーン・パルサー・エレクトロポレーター（バイオ・ラッド社）を用いて２．５ボルト及び２５ｕＦｄで、２ｍｍキュベット（インビトロジェン社）内でエレクトロポレーションした。直ちに細胞に１ｍｌのＬＢを加え、次に、金属キャップがある１４ｍｌポリプロピレン・チューブ（サーステット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ））に移した。
３０℃で１時間増殖することで細胞は採取された。形質転換体をＬ寒天及び２０μｇ／μ１クロラムフェニコール及び５０μｇ／μ１カルベニシリン上で選択し、３０℃で一晩インキュベートした。次の日に、単一クローンを１０ｍｌのＬ培養液及び５０μｇ／μｌカルベニシリンで初期対数増殖期まで３０℃で増殖させた。次に、増殖している培養の温度を２時間、４２℃に移した。系列希釈を作り、次に、細胞を（抗生物質選択のない）ＬＡプレート上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。次の日、２０のコロニーを選び、Ｌ寒天（抗生物質はない）及びＬＡ及び２０μｇ／μｌクロラムフェニコール・プレート上にパッチした（ｐａｔｃｈｅｄ）。次に、プレートを３０℃で一晩インキュベートした。ＬＡ及び２０μｇ／μｌクロラムフェニコール・プレートではなく、ＬＡプレート上で増殖することが出来る細胞は、クロラムフェニコール・マーカーをループアウトしたと考えられた（そのうちの１個を選び、株ＥＷＬ２０４として指定した）。
ｉｉｉ）プラスミドｐＥＷＬ２３０の構築（ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ）
ウラジロハコヤナギ（ポプラ・アルバ）・イソプレン・シンターゼ（Ｐ．アルバ ＨＧＳ）をコードする合成遺伝子の生成は、委託先の大腸菌発現のためのコドン最適化手法に基づきＤＮＡ２．０社（メンローパーク、カリフォルニア州）に外部委託した。前記合成遺伝子は、プラスミドｐＥＴ２４ａ（ノバジェンブランド、ＥＭＤバイオサイエンシス社）にカスタムクローニングされ、凍結乾燥されて提供された（図５４、５５Ａ及び５５Ｂ）。
テンプレートとしてのｐＥＴ２４ Ｐ．アルバＨＧＳ、プライマーＭＣＭ１８２及びＭＣＭ１９２及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジェン）を用いてＰ．アルバ・イソプレン・シンターゼ（Ｐ．アルバＨＧＳ）遺伝子を製造者のプロトコールに従って増幅するためにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は以下であった：９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２５秒間、５５℃２０秒間、７２℃１分間を２５サイクル、最後の伸長は７２℃３分間であった。前記Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼＰＣＲ生産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。
次に、Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼＰＣＲ生産物を、２μｌ １０× ＮＥＢバッファー４と共に１μｌ ＢｓｐＨＩエンドヌクレアーゼ（ニューイングランド・バイオラボズ）を含む２０μｌの反応液中で消化した。その反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。第２の制限消化を、２μｌの１０×バッファーＨと共に１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（ロッシュ）を含む２０μｌの反応液中で行った。その反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（インヴィトロゲン社）を、１μｌのＮｃｏＩエンドヌクレアーゼ（ロッシュ）、１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ及び２μｌの１０×バッファーＨを含む２０μｌの反応液中で消化した。その反応液を３７℃で２時間インキュベートした。消化されたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターを、１．２％Ｅ−ゲル（インビトロジェン社）を用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン）を用いて抽出した（図５６）。ＢｓｐＨＩ及びＮｃｏＩ部位の適合する粘着末端を用いて、５μｌのＰ．アルバ・イソプレン・シンターゼ挿入断片、２μｌのｐＴｒｃベクター、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボズ）、２μｌの１０×リガーゼ・バッファー及び１０μｌのｄｄＨ２Ｏを含むように２０μｌのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を４０分間室温でインキュベートした。そのライゲーション混合物を、ｄｄＨ２Ｏのペトリ皿内で０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルター（ミリポア）を浮かせ、室温で３０分間ニトロセルロース膜フィルター上にライゲーション混合物を静かに適用することで脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞（ＩＩの項を参照されたい）を中間対数増殖期までＬＢ中で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液の５０μｌの分割量を、脱塩されたｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ ＨＧＳライゲーション混合物の５μｌで混合した。前記細胞懸濁液混合物を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて、２．５ボルト及び２５ｕＦｄで２ｍｍキュベット内でエレクトロポレーションした。直ちに細胞に１ｍｌのＬＢを加え、次に、金属キャップがある１４ｍｌポリプロピレン・チューブ（サーステット）に移した。
３０℃で２時間増殖することで細胞は採取された。形質転換体を、Ｌ寒天及び５０μｇ／μｌカルベニシリン及び１０ｍＭメバロン酸上で選択し、３０℃でインキュベートした。次の日に、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬ培養液及び５０μｇ／μｌカルベニシリンのチューブ中で、一晩３０℃で増殖した。プラスミド・プレップを、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピン・ミニプレップ・キット（キアゲン）を用いて一晩培養した培養物に行った。プラスミドの増殖のためのＢＬ２１細胞を使用するため、ＰＢバッファー５×及びＰＥバッファー３×を含むスピン・カラムの洗浄の修飾を、高品質プラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造者のプロトコールに組み込んだ。適正なサイズの直鎖断片であることを確実にするため、プラスミドを２０μｌの反応液中、ＰｓｔＩで消化した。６個のプラスミドの全てが適正なサイズであり、プライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００（表４）で配列決定するためにクインタラ・バイオサイエンシス（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（バークレー、カリフォルニア州）に送った。ＤＮＡシークエンスの結果は、６個のプラスミドが全て適正であったことを示した。そのうちの１個を選び、ＥＷＬ２３０（図５７、５８Ａ及び５８Ｂ）としてプラスミドを指定した。
ｉｖ）プラスミドｐＥＷＬ２４４の構築（ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）
テンプレートとしてのＭＣＭ３７６（ｖの項を参照されたい）、プライマーＭＣＭ１６５及びＭＣＭ１７７（表４を参照されたい）及びＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジェン）を用いてメタノサルシーナ・マゼイ（Ｍ．マゼイ）ＭＶＫ遺伝子を増幅するために、製造者のプロトコールに従いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は次であった：９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２５秒間、５５℃２５秒間、７２℃１８秒間を２８サイクル、最後の伸長は７２℃１分間であった。Ｍ．マゼイＭＶＫ ＰＣＲ生産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。
次に、前記Ｍ．マゼイＭＶＫ ＰＣＲ生産物を、８μｌのＰＣＲ生産物、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ（ニューイングランド・バイオラボズ）、４μｌの１０× ＮＥＢバッファー４、４μｌの１０× ＮＥＢ ＢＳＡ及び２２μｌのｄｄＨ２Ｏを含む４０μｌの反応液中で消化した。前記反応液を、３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。第２の制限消化を、４．７μｌの１０×バッファーＨ及び４０μｌのＰｍｅＩで消化されたＭ．マゼイＭＶＫ断片と共に２μｌのＮｓｉＩエンドヌクレアーゼ（ロッシュ）を含む４７μｌの反応液中で行った。前記反応液を、３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出した。プラスミドＥＷＬ２３０を、１０μｌのプラスミド、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ、４μｌの１０× ＮＥＢバッファー４、４μｌの１０× ＮＥＢ ＢＳＡ及び２０μｌのｄｄＨ２Ｏを含む４０μｌの反応液中で消化した。前記反応液を、３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。第２の制限消化を、４．７μｌの１０×バッファーＨ及び４０μｌのＰｍｅＩで消化されたＥＷＬ２３０直鎖断片と共に２μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼを含む４７μｌの反応液中で行った。前記反応液を、３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化されたＰＣＲ断片を、１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出した（図５９）。ＮｓｉＩ及びＰｓｔＩ部位の適合する粘着末端を用いて、８μｌのＭ．マゼイＭＶＫ挿入断片、３μｌのＥＷＬ２３０プラスミド、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、２μｌの１０×リガーゼ・バッファー及び６μｌのｄｄＨ２Ｏを含むように２０μｌのライゲーション反応液を調製した。ライゲーション混合物を、１６℃で一晩インキュベートした。次の日に、そのライゲーション混合物を、ｄｄＨ２Ｏのペトリ皿内で０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルター（ミリポア）を浮かせ、室温で３０分間ニトロセルロース膜フィルター上にライゲーション混合物を静かに適用することで脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を中間対数増殖期までＬＢ中で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液の５０μｌの分割量を、脱塩されたｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫライゲーション混合物の５μｌで混合した。前記細胞懸濁液混合物を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて、２．５ボルト及び２５ｕＦｄで２ｍｍキュベット内でエレクトロポレーションした。直ちに細胞に１ｍｌのＬＢを加え、次に、金属キャップがある１４ｍｌポリプロピレン・チューブに移した。３０℃で２時間増殖することで細胞は採取された。形質転換体を、ＬＡ及び５０μｇ／μｌカルベニシリン及び５ｍＭメバロン酸プレート上で選択し、３０℃でインキュベートした。次の日に、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬＢ及び５０μｇ／μｌカルベニシリンのチューブ中で、一晩３０℃で増殖した。プラスミド・プレップを、ＱＩＡｑｕｉｃｋスピン・ミニプレップ・キットを用いて一晩培養した培養物に行った。プラスミドの増殖のためのＢＬ２１細胞を使用するため、ＰＢバッファー５×及びＰＥバッファー３×を含むスピン・カラムの洗浄の修飾を、高品質プラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造者のプロトコールに組み込んだ。適正なサイズの直鎖断片であることを確実にするため、プラスミドを２０μｌの反応液中、ＰｓｔＩで消化した。６個のプラスミドのうち３個が適正なサイズであり、プライマーＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００、ＥＬ１００３及びＥＬ１００６（表４）で配列決定するためにクインタラ・バイオサイエンシスに送った。ＤＮＡシークエンス結果は、３個のプラスミドが全て適正であったことを示した。そのうちの１個を選び、ＥＷＬ２４４（図６０及び６１Ａ−Ｂ）としてプラスミドを指定した。
ｖ）ｐＥＴ２００Ｄの下流Ｍ．マゼイ・アーチャエアル由来のプラスミドＭＣＭ３７６−ＭＶＫの構築
Ｍ．マゼイ・アーチャエアル下流経路オペロン（図７３Ａ−Ｃ）由来のＭＶＫ ＯＲＦを、インビトロジェン・プラチナＨｉＦｉ ＰＣＲミックスを用いて、プライマーＭＣＭ１６１及びＭＣＭ１６２（表４）でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ混合物の４５μＬを、１μＬのテンプレート、各１μＬの１０μＭプライマー及び２μＬの水で組み合わせた。前記反応を以下のように循環させた：９４℃２分間（最初のサイクルのみ）、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、６８℃１分１５秒間を３０サイクル、次に、７２℃７分間後、冷却するまで４℃。このＰＣＲ反応液の３μＬを、製造者のプロトコールに従いインビトロジェンｐＥＴ２００Ｄプラスミドにライゲートした。このライゲーション混合物の３μＬをインビトロジェンＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体からのプラスミドを単離し、挿入断片を配列決定した後、ＭＣＭ３７６（図７４Ａ−Ｃ）がもたらされた。
ｖｉ）株ＥＷＬ２５１（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
ＭＣＭ３３１細胞（これは、Ｓ．セルビシエ・メバロン酸キナーゼ、リン酸メバロン酸塩キナーゼ、メバロン酸塩ピロリン酸塩デカルボキシラーゼ及びＩＰＰイソメラーゼをコードする染色体構築物ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含む）を中間対数増殖期までＬＢ中で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液の５０μｌをプラスミドＥＷＬ２４４の１μｌと混合した。前記細胞懸濁液混合物を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて、２．５ボルト及び２５ｕＦｄで２ｍｍキュベット内でエレクトロポレーションした。直ちに細胞に１ｍｌのＬＢを加え、次に、金属キャップがある１４ｍｌポリプロピレン・チューブに移した。３７℃で２時間増殖することで細胞は採取された。形質転換体を、ＬＡ及び５０μｇ／μｌカルベニシリン及び５ｍＭメバロン酸プレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。そのうちの１コロニーを選び、株ＥＷＬ２５１として指定した。
ｖｉｉ）株ＥＷＬ２５６（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＣＬ Ｕｐｐｅｒ ＭＶＡ）の構築
ＥＷＬ２５１細胞を中間対数増殖期までＬＢ中で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液の５０μｌを、プラスミドＭＣＭ８２（これは、Ｅ．フェカーリスｍｖａＥ及びｍｖａＳをコードするｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙである）の１μｌと混合した。前記細胞懸濁液混合物を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて、２．５ボルト及び２５ｕＦｄで２ｍｍキュベット内でエレクトロポレーションした。直ちに細胞に１ｍｌのＬＢを加え、次に、金属キャップがある１４ｍｌポリプロピレン・チューブに移した。３０℃で２時間増殖することで細胞は採取された。形質転換体を、ＬＡ及び５０μｇ／μｌカルベニシリン及び５０μｇ／μｌスペクチノマイシン・プレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。そのうちの１コロニーを選び、株ＥＷＬ２５６として指定した。
表４：プライマー配列
Figure 0005624980
ＩＩ．ＭＣＭ４４２−４４９の構築：ＢＬ２１及びＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ−ｇｉ１．ｘ−ｍＫＫＤｙＩを含むＢＬ２１（ＤＥ３）
ｉ）組み換えのためのテンプレートの構築
ＦＲＴベースの組み換えカセット、及びＲｅｄ／ＥＴ介在統合のためのプラスミド及び抗生物質マーカー・ループアウトを、ジーン・ブリッジＧｍｂＨ（ドイツ）から得た。これらの材料を用いた手順は、ジーン・ブリッジ・プロトコールに従って行った。プライマーＭＣＭ１９３及びＭＣＭ１９５を、ストラタジェンＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キットを用いたＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートからの耐性カセットを増幅するために製造者のプロトコールに従い用いた。５０μＬの反応液を次のように循環させた：９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２０秒間、５５℃２０秒間、７２℃１分間を５サイクル、９５℃２０秒間、６０℃２０秒間、７２℃１分間を２５サイクル、次に、７２℃３分間後、冷却するまで４℃。前記単位複製配列を製造者のプロトコールに従いキアゲンＰＣＲカラムで精製し、３０μＬ ＥＢ（溶出バッファー）中で溶出した。ＤＮＡは、１×ロッシュＨバッファー及び０．５μＬ ＢＳＡを含む２０μＬ反応液中でＮｄｅＩ及びＰｃｉＩで消化した。プラスミドＭＣＭ３７６を、各々１μＬのＮｄｅＩ、ＮｃｏＩ及びロッシュＨバッファーを含む１０μＬ反応液中で消化した。反応を３７℃で一晩進行させ、次に、切断されたＤＮＡをキアゲンＰＣＲカラム上で精製し、３０μＬ ＥＢ中で溶出した。前記ＰＣＲ生産物を１μＬのベクター、３μＬのＰＣＲ生産物、１μＬのロッシュ・クイック・リガーゼ・バッファー２、５μＬのバッファー１及び１μＬのリガーゼを含む反応液中でＭＣＭ３７６にライゲートした。前記反応を３時間室温で進行させ、次に、５μＬを製造者のプロトコールに従いインビトロジェンＴＯＰ１０細胞に形質転換した。Ｌ寒天（ＬＡ）及びクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬＯ）上で、一晩３７℃で培養し、形質転換体を選択した。
保存のためにクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＡ上で形質転換体コロニーをパッチし、配列決定のためにクインタラ（バークレー、カリフォルニア州）に送った。プライマーＭＣＭ１９５の「Ｎ」で４個の異なるヌクレオチドを各々有する４個のクローンは、挿入プロモーターの適正なシークエンスを有することが分かった。クローンをクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬのＬＢ中で増殖させ、プラスミドＤＮＡの調製に用いた。このプラスミドを以下のようにＴＯＰ１０細胞に再形質転換し、以下のように株を凍結させた。
表５：ＭＣＭ４８４−４８７
Figure 0005624980
ｉｉ）組み換え標的株ＭＣＭ３４９及びＭＣＭ４４１の作製
製造者の指示に従いプラスミドｐＧＢ７０６（ジーンブリッジーズ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ））を用いて、前記クロラムフェニコール耐性（ｃｍＲ）マーカーを株ＭＣＭ３３１からループアウトした。ＭＣＭ３３１細胞を中間対数増殖期までＬＢ中で増殖させ、次に、氷冷した滅菌水で３回洗浄した。ｐＧＢ７０６ ＤＮＡの１μＬの分割量を５０μＬの細胞懸濁液に加えた。また、この混合物を、ジーン・パルサー・エレクトロポレーターを用いて、２．５ボルト及び２５ｕＦｄで２ｍｍキュベット内でエレクトロポレーションした。直後に、３０℃で１時間５００μＬのＬＢ中で回復させた。形質転換体を３０℃でテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ上で選択した。次の日に、目に見えて濁るまで（ＯＤ６００〜０．５−０．８）、クローンを、３０℃でテトラサイクリン（５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ中で増殖させた。この培養物をＬＢ上でストリーキングし、３７℃で一晩培養させた。クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢまたはテトラサイクリン（５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ上で増殖できないクローンを、ＭＣＭ３４８として凍結した。プラスミドＭＣＭ３５６（ｐＲｅｄＥＴ ｃａｒｂｅｎｃｉｌｌｉｎ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）を上述のようにエレクトロポレーションし、形質転換体を３０℃でカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ上で選択した。クローンを３０℃でＬＢカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）中で増殖させ、ＭＣＭ３４９として凍結した。
株ＭＣＭ４４１を、上記のようにＥＷＬ２０４にプラスミドＭＣＭ３５６を電気形質転換することで作製した。
ｉｉｉ）ＭＣＭ３４９及びＭＣＭ４４１へのＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ−ｇｉ１．ｘ−ｍＭＶＫの組み換え
プラスミドＭＣＭ４８４−４８７を、プライマーＭＣＭ１２０及びＭＣＭ１９６及び製造者のプロトコールに従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キットを用いたＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。０、１または３μＬ ＤＭＳＯを用いた１個のテンプレート当たり３反応を行った。５０μＬの反応液を次のように循環させた：９５℃２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃２０秒間、５５℃２０秒間、７２℃１．５分間を５サイクル、９５℃２０秒間、６０℃２０秒間、７２℃１．５分間を２５サイクル、次に、７２℃３分間後、４℃で一晩。前記所与のテンプレートからの３反応液を集め、キアゲンＰＣＲカラム上で精製し、６０℃で３０μＬ ＥＢで溶出した。５μＬのＤＮＡを、３７℃で３時間、１×ロッシュ・バッファーＡ中で１μＬのＤｐｎＩを用いて消化した。次に、このＤＮＡを３０分間、過剰水に対してミクロ透析した。
株をＯＤ６００が〜０．５になるまで新しい画線から３０℃でカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含む５ｍＬのＬＢ中で増殖させた。４０ｍＭ Ｌ−アラビノースを加え、培養物を１．５時間、３７℃でインキュベートした。細胞を採取し、上述の透析された３μＬの単位複製配列を用いてエレクトロポレーションし、次に、３７℃で１．５−３時間、５００μＬ ＳＯＣ中で回復させた。形質転換体を３７℃でクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬＡプレート上で選択した。
カナマイシン感受性クローンを単位複製配列の挿入のためＰＣＲでスクリーニングした。陽性クローンからのＰＣＲ生産物を、挿入ＤＮＡの配列を確認するために配列決定した。単位複製配列は、ＦＲＴ−ｃｍＲ−ＦＲＴ−ｇｉ１．ｘ−ｍＫＫＤｙＩと置き換わったＭＣＭ４４１及び３４８中のａｔｔＴｎ７でＦＲＴ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩと一致していた（前記ｙＫ及びｍＫの記号は、サッカロミセス・セレヴィシエからのメバロン酸キナーゼ及びメタノサルシーナ・マゼイをそれぞれ指す）。
表６Ａ：以下の株をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ中で増殖させ、凍結させた。
Figure 0005624980
表６Ｂ：プライマー
Figure 0005624980
ＩＩＩ．メバロン酸経路由来の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールの流加回分培養中で増殖された大腸菌でのイソプレン生産に関する酵母抽出物の効果
培地処方（発酵培地のリットル当たり）
Ｋ２ＨＰＯ４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、１０００×修飾微量金属溶液１ｍｌ。前記成分の全てを一度に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。この溶液をオートクレーブ滅菌した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で７．０に調節し、容量を適量にした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ ０．１ｇ及び抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
１０００×修飾微量金属溶液：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ。各成分を、一個ずつＤＩ Ｈ２Ｏに溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、容量を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
発酵は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ上流）、統合された下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）、及びＭ．マゼイからのメバロン酸キナーゼ及びＰ．アルバからのイソプレン・シンターゼの高発現（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）を含むＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を伴う１５Ｌバイオリアクターで行った。この実験は、ｐＨ７．０及び３０℃の所望の発酵でグルコースからのイソプレン生成をモニターするために行った。大腸菌株の冷凍のバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地に植菌した。５５０ｎｍで測定し、植菌物がＯＤ １．０に増殖した後、その５００ｍｌを１５Ｌバイオリアクターに植菌するために用い、初期容量を５Ｌにした。
ｉ）酵母抽出物が供給されていない流加回分培養で増殖された大腸菌細胞（ＥＬ２５６）におけるイソプレンの生産
細胞が静止期に達するまで、グルコースを指数関数的速度で供給した。この時間後、グルコースの供給を代謝要求を満たすために減少した。６７時間の発酵中にバイオリアクターに加えられたグルコースの総量は、３．９ｋｇであった。誘導を、イソプロピル−ベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ＩＰＴＧ）を加えることで達成した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度が９の値に達した時に、ＩＰＴＧ濃度を１０２μＭにした。ＯＤ５５０が１４０に達した時に、前記ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上げた。時間にわたるバイオリアクター内のＯＤ５５０プロファイルを、図６７Ａで示す。バイオリアクターからのオフ・ガス中のイソプレン値を、Ｈｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。前記イソプレン力価は、３５．６ｇ／Ｌの終価まで発酵の進行にかけて増加した（図６７Ｂ）。６７時間の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、３２０．６ｇであった。また、生産のタイムコースを図６７Ｃで示す。ＴＣＥＲで測定された代謝活性プロファイルを、図６７Ｄで示す。発酵中のイソプレンの生産に利用された炭素のモル収率は１７．９％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は８．１％であった。
酵母抽出物の供給と共に流加回分培養で増殖された大腸菌細胞（ＥＬ２５６）におけるイソプレンの生産
細胞が静止期に達するまで、グルコースを指数関数的速度で供給した。この時間後、グルコースの供給を代謝要求を満たすために減少した。６８時間の発酵中にバイオリアクターに加えられたグルコースの総量は、７．１ｋｇであった。また、合計で１．０６ｋｇの酵母抽出物が、発酵中に供給された。ＩＰＴＧを加えることにより誘導は達成された。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度が７の値に達した時に、ＩＰＴＧ濃度を２０８μＭにした。ＯＤ５５０が１８０に達した時に、前記ＩＰＴＧ濃度を１９３μＭに上げた。時間にわたるバイオリアクター内のＯＤ５５０プロファイルを、図６８Ａで示す。バイオリアクターからのオフ・ガス中のイソプレン値を、Ｈｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。前記イソプレン力価は、３２．２ｇ／Ｌの最大値まで発酵の進行にかけて増加した（図６８Ｂ）。６８時間の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、３９５．５ｇであった。また、生産のタイムコースを図６８Ｃで示す。容積測定生産性のタイムコースを図６８Ｄで示す。図６８Ｄは、１．１ｇ／Ｌ／時間の平均比率が２３及び６３時間の間で維持されたことを示す。ＣＥＲで測定された代謝活性プロファイルを、図６８Ｅで示す。発酵中のイソプレンの生産に利用された炭素のモル収率は１０．３％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は５．２％であった。
ＩＶ．メバロン酸（ＭＶＡ）経路及びイソプレン・シンターゼ（ＥＷＬ２５６）を包括する大腸菌での異なる炭素源からのイソプレンの生産
培地処方（発酵培地のリットル当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４ １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３．２ｇ、酵母抽出物０．２ｇ、１０００×修飾微量金属溶液１ｍｌ。前記成分の全てを連続してｄｉＨ２Ｏに溶解した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で６．８に調節し、容量を適量にした。培地を、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。炭素源を１％の最終濃度に加えた。必要な抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
１０００×微量金属溶液（発酵培地のリットル当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ。各成分を、一個ずつｄｉＨ２Ｏに溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、容量を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
ｉ）ＡＦＥＸバイオマス加水分解産物の調製
ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉を加水分解し、キシロース、グルコース及び酢酸の両方を含むバイオマス加水分解産物を調製した。
ミシガン・バイオテクノロジー研究所から受け取った、ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉を用いた。前処理条件は、６０％湿気、１：１アンモニア充填及び３０分間９０℃の後、風乾した。ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉中の含水率は、２１．２７％であった。ＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉中のグルカン及びキシランの含有量は、それぞれ３１．７％及び１９．１％（乾燥量基準）であった。用いた酵素は、ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ１２１（パン製造産業のためのアスペルギルス・ニガーからのダニスコ・キシラナーゼ生産物）であった。
糖化のため、２０ｇのＡＦＥＸ前処理トウモロコシ茎葉を、５ｍｌの１Ｍ ｐＨ４．８クエン酸ナトリウム緩衝剤、２．２５ｍｌのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１０００及び０．１ｍｌのＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ１２１及び７２．６５ｍｌのＤＩ水を共に含む５００ｍｌフラスコに加えた。前記フラスコを旋回振盪機に入れ、９６時間５０℃でインキュベートした。
分析のため、一のサンプルを振盪機から採取し、ＨＰＬＣを用いて分析した。前記加水分解産物は、３７．２ｇ／ｌのグルコース、２４．３ｇ／ｌのキシロース及び７．６ｇ／ｌのグルコース及び／またはキシロースのオリゴマーを含んだ。加えて、加水分解産物はまた、１．１７ｇ／Ｌの酢酸を含んだ。
ｉｉ）実験手順
ＭＶＡ経路及びイソプレン・シンターゼを含む大腸菌株ＥＷＬ２５６の植菌物を、冷凍のバイアルから採取し、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培養液寒天プレート上にストリーキングし、３０℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを、唯一の炭素源としてのグルコース、キシロース、グリセロール、酢酸またはバイオマスを含むＴＭ３培地に植菌し、３０℃で一晩増殖した。酢酸上で増殖する細胞は、有意により低い光学密度に達した。グルコース、グリセロール、バイオマス加水分解産物または酢酸上で増殖された細胞を、６００ｎＭで測定して０．１の間の光学密度に達するそれぞれの炭素源を含む２０ｍＬのＴＭ３培地に希釈した。いずれの炭素源も含まないネガティブ・コントロールを、一晩培養したグルコース培養物から調製した。培養物が０．０５の光学密度まで希釈された時に、単離実験をグルコース及びキシロースを用いて行った。全ての培養条件（酢酸及びグリセロールを除き）は重複して試験し、得られた結果をこれらの培養物間で平均化した。イソプレンの生産を、実験の始めから２００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。前記フラスコを旋回振盪機（２００ｒｐｍ）中３０℃でインキュベートし、光学密度の測定で増殖を追跡した。グルコースが供給された培養物がおよそ０．４の光学密度に達した後、全ての試験した炭素源からのイソプレン生産についてサンプルを３時間の間、毎時間分析した。１００μＬのサンプルを、重複して２ｍＬグラス・バイアルに移し、密閉した後、３０℃で３０分間インキュベートした。次に、前記細菌を８分間８０℃でインキュベーションし、熱不活性化した。生産されたイソプレンの量をＧＣ−ＭＳを用いて測定し、比生産性（μｇ／Ｌ＊ｈｒ）を計算した。
ｉｉｉ）結果
全ての試験した炭素源について増殖間のイソプレンの有意な生産を実証することができた。これらの炭素源は、一般のアルコール、有機酸、５または６の炭素原子単位（Ｃ５またはＣ６）を含む糖質、及びバイオマス加水分解産物の例である。
バイオマス加水分解産物での初期の増殖速度は、グルコースでの増殖速度に匹敵した（図６９Ａ）。バイオマス加水分解産物での増殖間の初期比生産性は、グルコースでの増殖間の比生産性より有意に高かった。これは、イソプレンの生産のための効率的な炭素源としてバイオマス加水分解産物を用いることが出来ることを実証する。比生産性は、バイオマス加水分解産物での増殖の２５５分間後に減少した（図６９Ｂ）。グルコースと比べた場合、唯一の炭素源としてのキシロースでは、前記細菌はより遅い増殖速度を有した（図６９Ｃ）。しかし、有意なイソプレンの比生産性が測定された（図６９Ｄ）。これは、メバロン酸経路経由でのイソプレンの生産にＣ５及びＣ６の両方の糖類を利用出来ることを示す。
驚くべきことに、唯一の炭素源としての酢酸上で増殖された細菌は、グルコースでの増殖よりおよそ２倍高いイソプレンの比生産性を有していた（図６９Ａ）。グルコースと比べた場合、前記細菌は酢酸上でより遅く増殖した（図６９Ｂ）。しかし、行った実験は、イソプレンの生産のための炭素源として酢酸も用いることが出来ることを実証する。また、酢酸はＨＰＬＣで測定されるようにバイオマス加水分解産物中で存在した。
唯一の炭素源としてのグリセロールでは、前記細菌はよく増殖した（図６９Ａ）。また、イソプレンの有意な生産が実証された（図６９Ｂ）。これは、一般のアルコールもメバロン酸経路経由でのイソプレンの生産に炭素源として用いられ得ることを示す。
実施例１１：ストレプトミセス属での植物由来のイソプレン・シンターゼの発現
イソプレン・シンターゼ・クズの遺伝子を、プラスミドｐＪ２０１：１９８１３から得た。プラスミドｐＪ２０１：１９８１３は、プエライア・ロバタ（クズ植物）由来のイソプレン・シンターゼをコードし、蛍光菌、シュードモナス・プチダ、ロドシュードモナス・パルストリス及びコリネバクテリウムにコドン最適化される（図７９Ａ−７９Ｃ（配列番号１２３））。プラスミドｐＪ２０１：１９８１３の制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化は、ストレプトミセス大腸菌シャトルベクターｐＵＷＬ２０１ＰＷ（Ｄｏｕｍｉｔｈ他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２６４巻、４７７−４８５ページ、２０００年、図７１）にライゲートされた遺伝子ｉｓｏ１９８１３を遊離し、ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを生産した。クローニングが成功したかを、ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏの限定解析で確認した。イソプレン・シンターゼｉｓｏ１９８１３の発現は、大腸菌での発現のためではなくストレプトミセス種での構成的発現を可能にするｅｒｍプロモーターの管理下に置いた。
ＰＵＷＬ２０１ＰＷ（挿入断片はない）及びｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを、ストレプトミセス・アルブスＪ１０７４（Ｓａｎｃｈｅｚ他、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第９巻、５１９−５３１ページ、２００２年）内にＨｏｐｗｏｏｄ他、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ ｉｎｎｅｓ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ノーウィッチ、１９８５年で記載されるようなプロトプラストの形質転換で導入した。
プロトプラスト懸濁液の２００μ１分割量を、１．９μｇのｐＵＷＬ２０１ＰＷまたは２．９μｇのｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏで形質転換した。非選択的Ｒ５寒天プレート上で２８℃で一晩インキュベートした後、陽性の形質転換体を、チオストレプトン（２５０μｇ／ｍｌ）を含むＲ３オーバーレイ寒天中で４日間さらにインキュベートし、選択した。チオストレプトン耐性の形質転換体を、プラスミド・ミニ・キット（キアゲン）を用いたプラスミド調製でｐＵＷＬ−プラスミドの存在について試験した。限定解析で分析するための十分な量のプラスミドＤＮＡを生産するために、調製されたプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α内に再導入した。陽性の形質転換体を、アンピシリン含有Ｌ寒天プレート上で選択し、挿入断片分析をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩのエンドヌクレアーゼを用いたプラスミドＤＮＡの消化で行った。イソプレン・シンターゼを、陽性のｐＵＷＬ２０１ ｉｓｏクローン中の１．７ｋｂ断片として同定した。一方、コントロール株（ｐＵＷＬ２０１ＰＷ）では、このような断片は観察されなかった。
コントロール・プラスミドｐＵＷＬ２０１ＰＷまたはイソプレン・シンターゼをコードするｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを含むＳ．アルブス（ａｌｂｕｓ）の野生型株及び形質転換体を、イソプレン生成について分析した。チオストレプトン（２００μｇ／ｍｌ）が存在する状態または存在しない状態での固形培地（トリプシン作用性大豆培養液寒天、ＴＳＢ、２．５ｍｌ）上で株を重複して培養し、密封したヘッドスペース・バイアル（全容量２０ｍｌ）中、２８℃で４日間インキュベートした。５００μｌのヘッドスペース・サンプル（エンドポイント測定値）をＳＩＭモードのＧＣ−ＭＳで分析し、イソプレンを基準保持時間及び分子量（６７ｍ／ｚ）に従い同定した。ヘッドスペース・サンプル中に存在するイソプレンを、事前に作製された検量線で数量化した。野生型Ｓ．アルブス及びｐＵＷＬ２０１ＰＷを包括するコントロール株が、検出限界（０．０４−０．０７ｐｐｍ）よりわずかに高い濃度でイソプレンを生産した一方、ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを包括するＳ．アルブスは、コントロールと比べ、少なくとも１０倍の過剰量のイソプレンを生産した（０．７５ｐｐｍ、図７２）。この結果は、放線菌群の原核生物中で植物由来のイソプレン・シンターゼの発現が成功したことを実証する。
実施例１２：上流メバロン酸経路、または上流及び下流メバロン酸経路とクズ・イソプレン・シンターゼを含む大腸菌ｆａｄＲ ａｔｏＣ ＬＳ５２１８での脂肪酸またはヤシ油からのイソプレンまたはメバロン酸の生産
大腸菌ｆａｄＲ ａｔｏＣ株ＬＳ５２１８（＃６９６６）は大腸菌遺伝学ストックセンター（ｔｈｅ Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）から得た。ＦａｄＲは、脂肪酸分解酵素（Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８３巻、５９８２−５９９０ページ、２００１年）をコードする遺伝子の発現を負に制御する転写リプレッサーをコードする。ＡｔｏＣは、ＡｔｏＳがアセト乳酸代謝を制御する、二構成要素調節系の応答レギュレーターである。前記ｆａｄＲ ａｔｏＣ株は、脂肪酸分解遺伝子の構成的発現を可能にし、長鎖長（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ）ポリヒドロキシアルカノエートに長鎖脂肪酸を組み込む。ヤシ油をメバロン酸またはイソプレン生産のいずれかの炭素源として用いる場合、ヤシ油をグリセロールと脂肪酸に転換した。このための方法は当該技術分野でよく知られ、それは、リパーゼ（例えば、豚膵臓リパーゼ、カンディダ・ルゴサ（ｒｕｇｏｓａ）リパーゼまたは他の同様のリパーゼ）を用いたインキュベーションによる酵素的な方法、または水酸化ナトリウムのような基部を用いたけん化による化学的な方法のいずれかにより行われることが出来る。
ｉ）上流メバロン酸経路を発現する大腸菌ｆａｄＲ ａｔｏＣ株
株ＷＷ４は、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：ラボマニュアル、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年）を用いてＬＳ５２１８にｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙをエレクトロポレーションすることで作製した。プラスミドの組み込みは、細胞を炭素源としてのＣ１２脂肪酸（ＦＡ）またはヤシ油のいずれかで補給されたＴＭ３培地で培養した時に、メバロン酸（ＭＶＡ）が生産されるかで確認した。脂肪酸からのＷＷ４によるＭＶＡの生産を実証するために、一晩培養した培養物からの細胞を、０．２５％のＣ１２ ＦＡ（シグマカタログ＃Ｌ９７５５）で補給された、５ｍＬの修飾ＴＭ３培地（酵母抽出物を含まないＴＭ３）に１対１００で希釈した。ＭＶＡ生産（２４ｍｇ／Ｌ）の最初の兆候は、ＩＰＴＧで誘導した培養物を３０℃で一晩インキュベートした後に明白であった。生産は、１９４ｍｇ／Ｌの生産されたＭＶＡの最終値で３日間増加した。油からのＷＷ４によるＭＶＡの生産を実証するため、一晩培養した培養物からの細胞を、ＴＭ３培地の５ｍＬ当たり２００ｍｇの消化されたヤシ油で補給された、修飾ＴＭ３培地に１対１００で希釈した。ＭＶＡ生産（５０ｍｇ／Ｌ）の最初の兆候は、ＩＰＴＧで誘導した培養物を３０℃で一晩インキュベートした後に明白であった。生産は、５００ｍｇ／Ｌの生産されたＭＶＡの最終値で３日間増加した。
ｉｉ）クズ・イソプレン・シンターゼと上流ＭＶＡ経路及び下流ＭＶＡ経路を発現する大腸菌ｆａｄＲ ａｔｏＣ株
大腸菌株ＷＷ４（ＬＳ５２１８ ｆａｄＲ ａｔｏＣ ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）を、ＷＷ１０を得るためにｐＭＣＭ１１８［ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ］で形質転換した。前記プラスミドの組み込みは、前記株をＴＭ３及びグルコース中で培養し、ＩＰＴＧ（１００、３００または９００μＭ）で誘導した時に、イソプレンが生産されたことの証明により確認した。前記株は、ＩＰＴＧに比較的感受的で、１００μＭ ＩＰＴＧにでさえ有意な増殖欠陥を示した。これらの結果は図７０Ａで示す。
ドデカン酸からのイソプレン生産を試験するため、２００ｒｐｍで振盪しながらスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ培養液中でＷＷ１０を３７℃で一晩培養した。前記細胞を、遠心沈澱及び元の培養物容量の修飾ＴＭ３培地との再懸濁により修飾ＴＭ３培地で洗浄した。この開始培養物からの前記洗浄及び再懸濁された細胞を、０．１２５％ Ｃ１２脂肪酸（シグマカタログ＃Ｌ９７５５）を含む、５ｍＬの修飾されたＴＭ３培地に１対１００及び１対１０で希釈した。
ヤシ油からのメバロン酸の生産を実証するため、油をリパーゼで数日間３７℃及び２５０ｒｐｍであらかじめ消化し、脂肪酸を遊離した（加水分解の証明はチューブの振とう時に形成された泡で判断した）。
加えて、洗浄された細胞をヤシ油と共に試験管に含される修飾ＴＭ３培地で１対１０に希釈し、培養物を用意した。別のチューブを、それ以上希釈されていない洗浄細胞の残査（２．５ｍＬ）に０．１２５％ Ｃ１２ＦＡを追加し用意した（バイオコン・バージョン）。２５０ｒｐｍでの振盪を伴う３０℃での３．７５時間の増殖の後、全ての培養物を５０μＭ ＩＰＴＧの追加により誘導した。インキュベーションを４時間継続し、その後、修飾されたヘッドスペース・アッセイ（５００ｒｐｍでの振盪を伴う３０℃での１時間の蓄積）と共に、イソプレンの蓄積について培養物の各々２００μＬを分析した。追加のイソプレン・アッセイを、ＧＣＭＳ分析の前に、アッセイ・ガラスブロックの１２時間のインキュベーションにより行った。誘導された培養物のインキュベーションを一晩継続し、翌朝イソプレン生産（１時間、３０℃、５００ｒｐｍ Ｓｈｅｌ−Ｌａｂ振盪機）について２００μＬの分割量を再度分析した。これらの培養物の分析は、イソプレンの有意値の生産を示した。前記イソプレンの最高値は、開始培養物が一晩インキュベートされ、誘導された後、それの１／１０の希釈度で接種された培養物で観察された。この結果は、この培養物は増殖し続け細胞密度で増加することを示唆する。これらの結果を図７０Ｂで示す。脂肪酸懸濁液に濁っている様子があったため、細胞密度を直接測定することができなかった。従って、この培養物の細胞密度は、培養物の分割量をプレートして測定し、８×１０７コロニー形成単位を示した。これはおよそ０．１のＯＤ６００に対応する。しかしながら、この培養物は有意なイソプレン生産を提供した。この実施例で記載する経路を有さない同様の株では、イソプレンは観察されなかった。
実施例１３：大腸菌でのｙｂｈＥの構成的発現によるイソプレン生産の改善
この実施例は、コントロール株を含む野生型ｙｂｈＥと比べ、構成的にｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する株中のイソプレンの生産を示す。前記遺伝子ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）は、異種発現タンパク質の翻訳後のグルコニル化（ｇｌｕｃｏｎｙｌａｔｉｏｎ）を抑える６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ）をコードし、生産物の可溶性及び収量を改善する一方、ペントースリン酸経路（Ａｏｎ他、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７４巻（４）、９５０−９５８ページ、２００８年）を通るバイオマス収量及び流出（ｆｌｕｘ）も改善する。
イソプレンを生産する大腸菌のＢＬ２１株（ＥＷＬ２５６）を、複製プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）（Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ博士、ルイジアナ州立大学から得た）上のｙｂｈＥ遺伝子の構成的発現で構築した。
ＦＲＴベース組み換えカセット、及びＲｅｄ／ＥＴ介在統合及び抗生物質マーカーのループアウトのためのプラスミドを、ジーン・ブリッジーズＧｍｂＨ（ドイツ）から得た。これらの材料を用いた手順を、ジーン・ブリッジーズのプロトコールに従い行った。ストラタジェンＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合キットを用いたＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレート由来の耐性カセットを増幅するため、プライマーＰｇｌ−Ｆ及びＰｇｌＧＩ１．５−Ｒを製造者のプロトコールに従い使用した。前記ＰＣＲ反応液（５０μＬ最終容量）は、５μＬのバッファー、１μＬの鋳型ＤＮＡ（ジーン・ブリッジーズからのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−Ｆ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー及び１．５μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰミックスを含み、５０μＬにｄＨ２Ｏで作られる。前記反応液を次のように循環させた：９５℃１×２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃３０秒間、６３℃３０秒間、７２℃３分間を３０サイクル。
得られたＰＣＲ生産物を、ＱｉａＱｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製し、次のようにプラスミドを含むｐＲｅｄ−ＥＴレコンビナーゼを包括する電気的に形質転換可能なＭＧ１６５５細胞にエレクトロポレーションした。細胞を、ＯＤ６００〜０．６に３０℃で５ｍＬのＬ培養液中で増殖させることで調製した。前記細胞を４％アラビノースの追加によりレコンビナーゼ発現のために誘導し、３０℃で３０分間増殖させた後、３７℃で３０分間増殖させた。細胞の１．５ｍＬの分割量を、氷冷したｄＨ２Ｏ中で３−４回洗浄した。前記終末細胞ペレットを４０μＬの氷冷したｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、２−５μＬのＰＣＲ生産物を加えた。エレクトロポレーションは、ジーン・パルサー・エレクトロポレーター（バイオ・ラッド・インク）の１．３ｋＶで１ｍｍギャップ・キュベット内で行った。細胞を３０℃で１−２時間回復し、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬ寒天上にプレートした。５個の形質転換体をＰＣＲ及び統合部位に隣接するプライマーを用いたシークエンスで分析した（２プライマーセット：ｐｇｌ及び４９ｒｅｖ及び３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ、Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｇｂ２及びＴｏｐ ＧＢ’ｓ ＣＭＰ（９４６））。適正な形質転換体を選択し、この株はＭＧ１６５５ ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰと指定された。
ＦＲＴ−ＣＭＰ−ＦＲＴ−ＧＩ１．５−ｙｂｈＥ構築物を含むＰＣＲ断片を作製するために、ＭＧ１６５５ ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰの前記染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いた。この構築物を、次のようにｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）にクローニングした。以下ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌとする前記断片を、５’プライマーＰｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ及び３’プライマー３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐを用いて増幅した。得られた断片を、インビトロジェンＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニング・キットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯに製造者から推奨されるようにクローニングした。ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ断片を包括するＮｓｉＩ断片を、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）のＰｓｔＩ部位にクローニングした。２０μｌのライゲーション反応を、５μｌのＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ挿入断片、２μｌのｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）ベクター、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド・バイオラボズ）、２μｌの１０×リガーゼ・バッファー及び１０μｌのｄｄＨ２Ｏを含むように調製した。前記ライゲーション混合物を４０分間室温でインキュベートし、次に、その２−４μＬを、上述のパラメーターを用いて電気的に形質転換可能なＴｏｐ１０細胞（インビトロジェン）にエレクトロポレーションした。形質転換体を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール及び５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＬ寒天上で選択した。選択されたクローンの配列を、シークエテック（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ）、カリフォルニア州で提供される組織内Ｔ３プライマー及びリバースプライマーと同様に上述の多くのプライマーを用いて測定した。このプラスミドはｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌと指定された（図７７Ａ−Ｂ及び配列番号１２２）。
プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌを、上述の実施例１０で記載するようにＥＷＬ２５６にエレクトロポレーションし、形質転換体を、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬ寒天上にプレートした。１個の形質転換体が選択され、ＲＭ１１６０８−２と指定された。

プライマー：

Ｐｇｌ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１１５）

ＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ
５’−ＧＣＴＧＧＣＧＡＴＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＡＡＡＣＧＣＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧＣＴＣＧＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号１１６）

３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ：
５’−ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＴＧＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ（配列番号１１７）

ｐｇｌ ＋４９ ｒｅｖ：
ＣＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号１１８）

Ｂｏｔｔｏｍ Ｐｇｂ２：
ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号１１９）

Ｔｏｐ ＧＢ’ｓ ＣＭＰ（９４６）：
ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣ（配列番号１２０）

Ｐｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ
５’−ＡＣＣＧＣＣＡＡＡＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＴＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号１２１）
ｉ）小規模分析
培地処方（発酵培地のリットル当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４ １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ３．２ｇ、酵母抽出物１ｇ、１０００×微量金属溶液１ｍｌ。前記成分の全てを一度に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で６．８に調節し、容量を適量にした。培地を０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。グルコース５．０ｇ及び抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
１０００×微量金属溶液（発酵培地のリットル当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ。各成分を、一個ずつｄｉＨ２Ｏに溶解した。ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に、溶液を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
ａ）実験手順
イソプレン生産を、ミクロリアクター・テクノロジーズ・インク（ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）からのＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）内で株を増殖することで分析した。２４ウェルの各々の装填量は４．５ｍＬであった。前記温度を３０℃で維持し、ｐＨ整定値は７．０、酸素流量整定値は２０ｓｃｃｍ、また撹拌速度は８００ｒｐｍであった。冷凍バイアルから採取された大腸菌株の植菌物を、（抗生物質と共に）ＬＢ培養液寒天プレート上にストリーキングし、３０℃でインキュベートした。単一コロニーを抗生物質を含む培地に植菌し、一晩増殖させた。５５０ｎｍで測定し、０．０５の光学密度に達するように、前記細菌を抗生物質を含む４．５ｍＬの培地に希釈した。
イソプレンのオフガス分析を、ガスクロマトグラフ−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）（アジレント）ヘッドスペース・アッセイを用いて行った。サンプル調製を次のように行った：全培養液の１００μＬを、密封したＧＣバイアルに入れ、３０分間の一定期間、３０℃でインキュベートした。５分間７０℃でのインキュベーションから成る熱不活化工程後、サンプルをＧＣに載せた。
５５０ｎｍの波長の光学密度（ＯＤ）を、実行中、マイクロプレート・リーダー（スペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ））を用いて得た。イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をＯＤ読取値及び時間（時間）で割ることで、比生産性を得た。
二個の株ＥＷＬ２５６及びＲＭ１１６０８−２を、２００及び４００μＭ ＩＰＴＧ誘導値で評価した。サンプルを、誘導後の１、２．５、４．７５及び８時間でのイソプレン生産及び細胞増殖（ＯＤ５５０）について分析した。重複してサンプルの分析を行った。
ｂ）結果
前記実験は、ＩＰＴＧの二の異なる濃度で、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する株がコントロール株と比較して、イソプレンの比生産性で劇的に２−３倍増加したことを実証した。
ｉｉ）Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ、Ｐ．アルバ・イソプレン・シンターゼ及びｐｇｌ過剰発現（ＲＨＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケール流加回分培養槽中で増殖された大腸菌からのイソプレン発酵
培地処方（発酵培地のリットル当たり）
Ｋ２ＨＰＯ４ ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、１０００×修飾微量金属溶液１ｍｌ。前記成分の全てを一度に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。この溶液をオートクレーブ滅菌した。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で７．０に調節し、容量を適量にした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ ０．１ｇ及び抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
１０００×修飾微量金属溶液：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ３０ｇ、ＮａＣｌ １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３ １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ １００ｍｇ。各成分を、一個ずつＤＩ Ｈ２Ｏに溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、容量を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
発酵は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ上流）、統合された下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）、Ｍ．マゼイからのメバロン酸キナーゼ及びＰ．アルバからのイソプレン・シンターゼの高発現（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）及びｐｇｌの高発現（ｐＢＢＲ−ｐｇｌ）を含むＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を伴う１５Ｌバイオリアクターで行った。この実験は、ｐＨ７．０及び３４℃の所望の発酵でのグルコースからのイソプレン生成をモニターするために行った。大腸菌株の冷凍バイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地に植菌した。５５０ｎｍで測定し、植菌物がＯＤ １．０に増殖した後、その５００ｍｌを１５Ｌバイオリアクターを植菌するために用い、初期容量を５Ｌにした。
細胞が静止期に達するまで、グルコースを指数関数的速度で供給した。この時間後、グルコースの供給を代謝要求を満たすために減少した。４０時間（５９時間）の発酵中にバイオリアクターに加えられたグルコースの総量は、３．１ｋｇ（５９時間で４．２ｋｇ）であった。誘発を、ＩＰＴＧを加えることで達成した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度が４の値に達した時に、ＩＰＴＧ濃度を１１０μＭにした。ＯＤ５５０が１５０に達した時に、前記ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上げた。時間にわたるバイオリアクター内のＯＤ５５０プロファイルを、図７８Ａで示す。バイオリアクターからのオフ・ガス中のイソプレン値を、Ｈｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は、４０時間で３３．２ｇ／Ｌ（５９時間で４８．６ｇ／Ｌ）の最大価まで発酵の進行にかけて増加した（図７８Ｂ）。イソプレン力価は、４０時間で４０．０ｇ／Ｌ（５９時間で６０．５ｇ／Ｌ）の最大価まで発酵の進行にかけて増加した（図７８Ｃ）。４０時間（５９時間）の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、２８１．３ｇ（５９時間で４５１．０ｇ）であった。また、生産のタイムコースを図７８Ｄで示す。容積測定生産性のタイムコースを図７８Ｅで示す。図７８Ｅは、１．０ｇ／Ｌ／時間の平均比率が０及び４０時間の間（１９及び５９時間の間で１．４ｇ／Ｌ／時間）で維持されたことを示す。ＣＥＲで測定された代謝活性プロファイルを、図７８Ｆで示す。発酵中のイソプレンの生産に利用された炭素のモル収率は、４０時間で１９．６％（５９時間で２３．６％）であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は、４０時間で８．９％（５９時間で１０．７％）であった。
重合のためのイソプレン・サンプルの調製
（ａ）１０００×修飾微量金属溶液の調製：
下記の各成分を、一個ずつＤｉ Ｈ２Ｏに溶解した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調節し、次に、容量を適量にした後、０．２２ミクロンのフィルターでろ過滅菌した。
（ｂ）発酵培地の調製：
発酵培地は、リットル当たりＫ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母抽出物（０．５ｇ）、１０００×修飾微量金属溶液（１ｍｌ）を含んだ。前記成分の全てを一度に加え、ｄｉＨ２Ｏに溶解した。この溶液をオートクレーブ滅菌した。ｐＨをアンモニウム・ガス（ＮＨ３）で７．０に調節し、容量を適量にした。グルコース（１０ｇ）、チアミン＊ＨＣｌ（０．１ｇ）及び抗生物質を、滅菌及びｐＨ調整後に加えた。
（ｃ）精製及び重合のためのイソプレン・サンプルの収集：
排気マニホルド上に平行して整列された活性炭のキャニスターを横断するように発酵排気を通すことで、活性炭上に吸着させてイソプレンを収集した。
（ｄ）大腸菌を用いたグルコースからのイソプレン重合サンプルＡの調製
発酵は、ｐＣＬ ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ及びｐＴｒｃ ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含むＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を伴う１５Ｌバイオリアクター中、ｐＨ７．０及び３０℃で行った。冷凍バイアルから採取された大腸菌株の植菌物を、（抗生物質を含む）ＬＢ培養液寒天プレート上にストリーキングし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーを、トリプトン−酵母エキス培地に植菌した。５５０ｎｍで測定し、植菌物がＯＤ １．０に増殖した後、その５００ｍｌを、５Ｌバイオリアクターを植菌するために用いた。
細胞が静止期に達するまで、グルコースを指数関数的速度で供給した。この時間後、グルコースの供給を代謝要求を満たすために減少した。５４時間の発酵中にバイオリアクターに加えられたグルコースの総量は、３．７ｋｇであった。誘導を、イソプロピル−ベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることで達成した。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度が１０の値に達した時に、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１９０に達した時に、前記ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上げた。ＩＰＴＧ濃度を、発酵の３８時間後に１００μＭに上げた。時間にわたるバイオリアクター内のＯＤ５５０プロファイルを、図１で示す。イソプレン力価は、２．２ｇ／Ｌの終価まで発酵の進行にかけて増加した（図２）。５４時間の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、１５．９ｇであった。また、生産のタイムコースを図３で示す。発酵中のイソプレンの生産に利用された炭素のモル収率は１．５３％であった（図８０、８１及び８２を参照されたい）。
（ｅ）大腸菌を用いた、グルコース及び酵母抽出物からのイソプレン重合サンプルＢの調製
グルコース及び酵母抽出物からのイソプレン生成を、ｐＨ７．０及び３０℃で、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含む大腸菌細胞を伴う５００Ｌバイオリアクター内で行った。冷凍バイアルから採取された大腸菌株の植菌物を、ソイトーン−酵母抽出物−グルコース培地中で調製した。５５０ｎｍで測定し、植菌物がＯＤ ０．１５に増殖した後、その２０ｍｌを、２．５Ｌのトリプトン−酵母抽出物培地を含むバイオリアクターを植菌するために用いた。前記２．５Ｌバイオリアクターを３０℃でＯＤ １．０に増殖し、そのうちの２．０Ｌを５００Ｌバイオリアクターに移した。酵母抽出物（バイオ・スプリンガー、モントリオール、ケベック、カナダ）及びグルコースを、指数関数的速度で供給した。５０時間の発酵中にバイオリアクターに加えられたグルコース及び酵母抽出物の総量は、それぞれ１８１．２ｋｇ及び１７．６ｋｇであった。時間にわたるバイオリアクター内の光学密度を図４で示す。前記イソプレン力価は、発酵の進行にかけて増加した（図５）。５０時間の発酵中に生産されたイソプレンの総量は、５５．１ｇであった。また、生産のタイムコースを図６で示す。
活性炭からのイソプレンの脱着（方法Ａ）
発酵槽のオフガスのストリームにさらされた活性炭（１３０ｇ）を、撹拌棒と共に１０００ｍＬのフラスコに入れた。シクロヘキサン（５６３ｍＬ）をフラスコに加え、スラリーを２時間撹拌した。真空装置を、インライン低温捕捉器（ｉｎ−ｌｉｎｅ ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｐ）（３０ｍＬの容量、液体窒素に浸漬）を介して適用した（１００ｍｂａｒ）。４個の画分を収集し、イソプレン／シクロヘキサン溶液（２．１ｗｔ％イソプレン、全容積＝５３．１ｇ）を得るために組み合わせた。この溶液を１００ｍｂａｒで真空蒸留し、新しいイソプレン／シクロヘキサン溶液を収集した（収率＝１０．１ｇ）後、それを３Ａモレキュラーシーブ上で乾かした。この溶液のＧＣ分析は、７．７重量％のイソプレン含有量を示した。
活性炭からのイソプレンの脱着（方法Ｂ）
発酵槽のオフガスのストリームにさらされた活性炭（６５ｇ）を、撹拌棒と共に５００ｍＬのフラスコに入れた。ジャリーサーム（Ｊａｒｙｔｈｅｒｍ）ＤＢＴ（２５０ｇ）を炭に加え、スラリーを２時間撹拌した。真空装置を、インライン低温捕捉器（３０ｍＬの容量、液体窒素に浸漬）を介して適用した（５ｍｂａｒ）。１時間後、捕捉器を周囲温度に暖めた。捕捉器中に二相の液相が見られた（総重量１．８２ｇ）。そのうちの有機相をシクロヘキサン（３．２６ｇ）で希釈し、デカントした後、３Ａモレキュラーシーブ上で乾かした。この溶液のＧＣ分析は、２７．３重量％または１．２２ｇのイソプレン含有量を示した。
ネオジム触媒の調製
ネオジムｖｅｒｓａｔａｔｅ（２．６８ｍＬ、ヘキサン中０．５１Ｍ）、トリイソブチルアルミニウム（５４ｍＬ、ヘキサン中１．０Ｍ）及び塩化ジエチルアルミニウム（３．４０ｍＬ、ヘキサン中１．０Ｍ）を、鋼カニューレが取り付けられたプラスチック・シリンジに引き上げた。初めの二成分を、ヘキサン内の１，３−ブタジエン溶液（隔膜トップを有する１００ｍＬガラス容器に置かれ、周囲温度で０．５時間撹拌した、２２．４ｍＬ、１５重量％の１，３−ブタジエン）に加えた。最後の成分を、６５℃で０．５時間熱老化された（ｈｅａｔ−ａｇｅｄ）後の溶液に加えた。最終溶液は澄んだ黄色であった。ネオジムに基づいた溶液の濃度は、０．０１６４Ｍであった。
チタン触媒の調製
注入口に隔膜を有し、また磁気撹拌棒を含む１００ｍＬグラス反応容器を、０℃の氷浴に置き、激しい撹拌の下、ｎヘキサン（５．０７ｍＬ、無水）及び純粋なＴｉＣｌ４（１．５ｍＬ、１３．７ｍｍｏｌ）を満たした。別途、ジフェニルエーテル（１．２ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）及びトリイソブチルアルミニウム（１４．６ｍＬ、１２．６ｍｍｏｌ、ヘキサン中２５重量％の溶液）から成るように溶液を作製した。前記溶液を５分間かけて反応容器に加えた。この添加に従い、茶色の沈殿が形成された。前記懸濁液を１０分間撹拌し、次に、後の使用のために−４０℃で保存した。
重合
主にグルコースに由来するポリイソプレンのサンプルを、ネオジム触媒及びｎ−ＢｕＬｉを含むイソプレン重合サンプルＡの重合で生産した。グルコース及び酵母抽出物の共発酵に由来するポリイソプレンのサンプルを、ネオジム触媒、チタン触媒、ｎ−ＢｕＬｉ触媒を含むイソプレン重合サンプルＢの重合及び乳化遊離基重合で生産した。代表的な重合条件を下記に記載する。
ネオジム触媒を伴うイソプレンの溶液重合
テフロンでコートされた撹拌棒を含む４ｍＬねじ蓋グラス・バイアルを、１５０℃で３時間、オーブン中で緩冷（ａｎｎｅａｌｅｄ）した。前記バイアルにテフロン表面のシリコーン隔膜かつオープントップのキャップを取り付けた。次に、シリンジを用いて、前記バイアルにイソプレン溶液（１．５ｇ、シクロヘキサン中７．７重量％、無水）を満たした。ネオジム触媒溶液（６０μＬ）を、ミクロシリンジでバイアルに注入した。前記バイアルを、５００ｒｐｍで回る撹拌棒と共に６５℃に制御された撹拌機／ホットプレート上に置いた。１５分間後に、前記溶液は顕著により多くのビスコースに変わった。１．５時間の反応時間後、前記反応をイソプロパノール及びブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、（３０μＬ、１０重量％ＢＨＴ）の溶液で止めた。１００ｍｇのセメントのサンプルを、ＧＰＣ分析のために採取した。残渣重合体セメントを、周囲条件下で乾かした。前記単離された重合体は重さ１１０ｍｇであり、（ＧＰＣにより）９３５，０００の重量平均分子量及び（１３Ｃ−ＮＭＲにより）９０％より高いシス−ミクロ構造の含有量を有することが測定された。
Ｔｉ触媒を伴うイソプレンの溶液重合
４ｍＬねじ蓋グラス・バイアル及びテフロンでコートされた撹拌棒を、１５０℃で３時間、オーブン中で緩冷した。前記バイアルにあらかじめ計量されたテフロン表面のシリコーン隔膜かつオープントップのキャップを取り付けた。次に、シリンジを用いて、前記バイアルにイソプレン溶液（１．５ｇ、シクロヘキサン中７．７重量％、無水）を満たした。前記チタン触媒懸濁液を磁気的に撹拌し、サンプルを使い捨てのチップのピペットで採取し（７０μＬ）、次に、あらかじめ計量された隔膜を通して反応バイアルに加えた。前記反応バイアル隔膜を固形キャップに置き換え、前記バイアルを、５００ｒｐｍで回る撹拌棒と共に６５℃に制御された撹拌機／ホットプレート上に置いた。５分間後に、前記溶液は顕著により多くのビスコースに変わった。１．５時間の反応時間後、前記反応をイソプロパノール及びブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、（３０μＬ、１０重量％ＢＨＴ）の溶液で止めた。１００ｍｇのセメントのサンプルを、ＧＰＣ分析のために採取した。残渣重合体セメントを、周囲条件下で乾かした。前記単離された重合体は重さ１０８ｍｇであり、（ＧＰＣにより）２２１，０００の重量平均分子量を有し、（１３Ｃ−ＮＭＲにより）９４％より高いシス−ミクロ構造の含有量を有する。
イソプレンの乳化重合
２０ｍＬバイアルを重合容器として用いた。前記金属キャップを大針で２度貫き、厚紙ライナーをゴムガスケット及びテフロンライナーに置き換えた。前記バイアルを脱イオン水で濯ぎ、窒素下で乾かした。
バイアルに、７．０５ｇの脱イオン水、１．１４ｇの１０％石鹸（混合脂肪酸のカリウム塩）、１７４ｍｇの１０％過硫酸アンモニウム溶液及び２４ｍｇのｎ−ドデカン・チオールを加えた。前記フラスコを窒素で３０秒間浄化し、蓋を閉めた。ゴム／テフロン・ガスケットを通してバイアルに、３ｍＬのバイオＨＧ（ｂｉｏ−ＨＧ）（２．０３３グラムのイソプレン）を満たした。前記バイアルを、標準的なボトル重合浴槽（別の空のバイアルを用いて前記バイアルを４ｏｚボトル保持具にはめることが出来る）に置いた。前記混合物を６５℃（＋／−０．２℃）で２５．５時間転がした。
精密検査：
前記ラテックスを５０ｍＬナシ形フラスコに移し、１０ｍＬの水で希釈した。反応させていない揮発性有機物を、真空（５４ｍｍＨｇ、４０−５０℃）下で２ｍＬの水を蒸発させることで採取した。ラテックスに、酸化防止剤分散液、１４０ｍｇの５０％活性ポリフェノールＡＯ（ボステックス（Ｂｏｓｔｅｘ）２４）を加えた。前記ラテックスを、希酸溶液（１５０ｍＬのＲＯ水中１２ｍＬの１８％硫酸）に加えることで凝結させた。前記重合体を単一の大きい１片に凝結させ、圧縮した後、ＲＯ水で洗浄した。前記サンプルは、オフホワイト色の柔軟な弾性のある固まりになった。前記収率は１．２４グラムの湿ったかけらであった。
最終総計固形分（ＴＳＣ＝１００＊乾燥重量／湿重量）は、１８．９ｗｔ％または８４％の近似転換であった。
ブチルリチウムを伴うイソプレンの重合
ブチルリチウム（ヘキサン中１，６Ｍ）を、１：１０の比率にｎヘキサン（無水）で希釈した。前記溶液を、ＴＨＦ中の標準Ｎ−ピバロイル−ｏ−ベンジルアニリンに滴定した。シクロヘキサン（４ｍＬ）中のイソプレン溶液を、熱処理されたシリカゲルを含む小さなカラムを通して乾かした。
（１５０℃のオーブンで乾かした）４ｍＬグラス・バイアルを、テフロンでコートされた小さな磁気撹拌棒及びシクロヘキサン（１．３５ｇ、２１．５ｗｔ％）中のイソプレン溶液で満たした。ブチルリチウム（０．１４Ｍ、ヘキサン）を、シリンジを介して加え、前記バイアルを、撹拌機／ホットプレート上で６５℃に３時間加熱した。前記重合体反応を、ＢＨＴ／イソ・プロパノール溶液（イソ・プロパノール中１０ｗｔ％ＢＨＴ）で止めた。全ての揮発物を真空下で採取した。この処置により、約１００％の理論収率を表わす２９０ｍｇの重合体を得た。この重合体は、１７，８８０の重量平均分子量（Ｍｗ）を有することがＧＰＣ分析で測定され、６７％のシス−ミクロ構造の含有量、２５％のトランス−ミクロ構造の含有量及び８％の３，４−ミクロ構造の含有量を有することが１３Ｃ ＮＭＲで測定された。
重合体のＧＰＣ分析
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、重合体分子量及び多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定するためのよく確立した技術である。連続した二個の重合体ラボラトリーズＣミクロゲル・カラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃ ｍｉｃｒｏｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎｓ）を、０．７ｍｌ／分間の流量及び４０℃のカラム温度でキャリア溶媒としてのテトラヒドロフランと共に利用した。ＳＥＣを、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）１０４７Ａ屈折率検出器と連結されたワイアット・テクノロジーズ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｍｉｎｉＤａｗｎ光散乱検出器を用いて行った。ポリスチレン基準値を、計器を較正するために使用した。
重合体のＮＭＲ分析
重合体のミクロ構造をクロロホルム−ｄ１溶媒中のＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ−Ｐｌｕｓ ４００ＭＨｚ分光計で１３Ｃ−ＮＭＲ分析により測定した。
１３Ｃ／１２Ｃアイソトープ分析データ
Figure 0005624980

Figure 0005624980
別途記載のない限り、本明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語の意味は、本発明が関係する技術分野の当業者に一般に理解されるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、微生物学及び分子生物学辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ出版、ニューヨーク州（１９９４年）、及びＨａｌｅ及びＭａｒｈａｍ、ハーパーコリンズ生物学辞典（Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ出版、ニューヨーク州（１９９１年）は、本明細書に用いられる多くの用語の一般的な定義を提供する。
本明細書で提供する見出しは、多様な本発明の側面または実施態様を制限するものではない。これらは、明細書を全体として参照することにより理解されることが出来る。別途記載のない限り、本明細書で使用する単数を表わす「ａ」、「ａｎ」等の語は、その複数形をも含む。本明細書の値やパラメーターについての「約」の言及は、それ自体がその値やパラメーターに導かれる実施態様を含む（及び記述する）。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は範囲を定義する数を包括する。本明細書に記載の本発明の側面及び実施態様は、側面及び実施態様「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及び「から実質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」ことを含むことが理解される。
一定の代表的な実施態様及び詳細が本発明を説明する目的で示される一方、本発明の範囲から逸脱せずに、種々の変更及び修飾が行われ得ることは当業者に明らかである。本発明は、記載される特定の方法、プロトコール及び試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書に記載の方法及び材料に類似または同等の任意の方法及び材料がまた、本発明の実施または試験に使用出来ることを当業者は理解する。

別表１
例示的な１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ核酸およびポリペプチド
ＡＴＨ：ＡＴ３Ｇ２１５００（ＤＸＰＳ１） ＡＴ４Ｇ１５５６０（ＣＬＡ１） ＡＴ５Ｇ１１３８０（ＤＸＰＳ３）
ＯＳＡ：４３３８７６８ ４３４００９０ ４３４２６１４
ＣＭＥ：ＣＭＦ０８９Ｃ
ＰＦＡ：ＭＡＬ１３Ｐ１．１８６
ＴＡＮ：ＴＡ２０４７０
ＴＰＶ：ＴＰ０１＿０５１６
ＥＣＯ：ｂ０４２０（ｄｘｓ）
ＥＣＪ：ＪＷ０４１０（ｄｘｓ）
ＥＣＥ：Ｚ０５２３（ｄｘｓ）
ＥＣＳ：ＥＣｓ０４７４
ＥＣＣ：ｃ０５３１（ｄｘｓ）
ＥＣＩ：ＵＴＩ８９＿Ｃ０４４３（ｄｘｓ）
ＥＣＰ：ＥＣＰ＿０４７９
ＥＣＶ：ＡＰＥＣＯ１＿１５９０（ｄｘｓ）
ＥＣＷ：ＥｃＥ２４３７７Ａ＿０４５１（ｄｘｓ）
ＥＣＸ：ＥｃＨＳ＿Ａ０４９１
ＳＴＹ：ＳＴＹ０４６１（ｄｘｓ）
ＳＴＴ：ｔ２４４１（ｄｘｓ）
ＳＰＴ：ＳＰＡ２３０１（ｄｘｓ）
ＳＥＣ：ＳＣ０４６３（ｄｘｓ）
ＳＴＭ：ＳＴＭ０４２２（ｄｘｓ）
ＹＰＥ：ＹＰＯ３１７７（ｄｘｓ）
ＹＰＫ：ｙ１００８（ｄｘｓ）
ＹＰＭ：ＹＰ＿０７５４（ｄｘｓ）
ＹＰＡ：ＹＰＡ＿２６７１
ＹＰＮ：ＹＰＮ ０９１１
ＹＰＰ：ＹＰＤＳＦ＿２８１２
ＹＰＳ：ＹＰＴＢ０９３９（ｄｘｓ）
ＹＰＩ：ＹｐｓＩＰ３１７５８＿３１１２（ｄｘｓ）
ＳＦＬ：ＳＦ０３５７（ｄｘｓ）
ＳＦＸ：Ｓ０３６５（ｄｘｓ）
ＳＦＶ：ＳＦＶ＿０３８５（ｄｘｓ）
ＳＳＮ：ＳＳＯＮ＿０３９７（ｄｘｓ）
ＳＢＯ：ＳＢＯ＿０３１４（ｄｘｓ）
ＳＤＹ：ＳＤＹ＿０３１０（ｄｘｓ）
ＥＣＡ：ＥＣＡ１１３１（ｄｘｓ）
ＰＬＵ：ｐ１ｕ３８８７（ｄｘｓ）
ＢＵＣ：ＢＵ４６４（ｄｘｓ）
ＢＡＳ：ＢＵｓｇ４４８（ｄｘｓ）
ＷＢＲ：ＷＧＬｐ１４４（ｄｘｓ）
ＳＧＬ：ＳＧ０６５６
ＫＰＮ：ＫＰＮ＿００３７２（ｄｘｓ）
ＢＦＬ：Ｂｆｌ２３８（ｄｘｓ）
ＢＰＮ：ＢＰＥＮ＿２４４（ｄｘｓ）
ＨＩＮ：ＨＩ１４３９（ｄｘｓ）
ＨＩＴ：ＮＴＨＩ１６９１（ｄｘｓ）
ＨＩＰ：ＣＧＳＨｉＥＥ＿０４７９５
ＨＩＱ：ＣＧＳＨｉＧＧ＿０１０８０
ＨＤＵ：ＨＤ０４４１（ｄｘｓ）
ＨＳＯ：ＨＳ＿０９０５（ｄｘｓ）
ＰＭＵ：ＰＭ０５３２（ｄｘｓ）
ＭＳＵ：ＭＳ１０５９（ｄｘｓ）
ＡＰＬ：ＡＰＬ＿０２０７（ｄｘｓ）
ＸＦＡ：ＸＦ２２４９
ＸＦＴ：ＰＤ１２９３（ｄｘｓ）
ＸＣＣ：ＸＣＣ２４３４（ｄｘｓ）
ＸＣＢ：ＸＣ＿１６７８
ＸＣＶ：ＸＣＶ２７６４（ｄｘｓ）
ＸＡＣ：ＸＡＣ２５６５（ｄｘｓ）
ＸＯＯ：ＸＯＯ２０１７（ｄｘｓ）
ＸＯＭ：ＸＯＯ＿１９００（ＸＯＯ１９００）
ＶＣＨ：ＶＣ０８８９
ＶＶＵ：ＶＶ１＿０３１５
ＶＶＹ：ＶＶ０８６８
ＶＰＡ：ＶＰ０６８６
ＶＦＩ：ＶＦ０７１１
ＰＰＲ：ＰＢＰＲＡ０８０５
ＰＡＥ：ＰＡ４０４４（ｄｘｓ）
ＰＡＵ：ＰＡ１４＿１１５５０（ｄｘｓ）
ＰＡＰ：ＰＳＰＡ７＿１０５７（ｄｘｓ）
ＰＰＵ：ＰＰ＿０５２７（ｄｘｓ）
ＰＳＴ：ＰＳＰＴＯ＿０６９８（ｄｘｓ）
ＰＳＢ：Ｐｓｙｒ＿０６０４
ＰＳＰ：ＰＳＰＰＨ＿０５９９（ｄｘｓ）
ＰＦＬ：ＰＦＬ＿５５１０（ｄｘｓ）
ＰＦＯ：Ｐｆｌ＿５００７
ＰＥＮ：ＰＳＥＥＮ０６００（ｄｘｓ）
ＰＭＹ：Ｐｍｅｎ＿３８４４
ＰＡＲ：Ｐｓｙｃ＿０２２１（ｄｘｓ）
ＰＣＲ：Ｐｃｒｙｏ＿０２４５
ＡＣＩ：ＡＣＩＡＤ３２４７（ｄｘｓ）
ＳＯＮ：ＳＯ＿１５２５（ｄｘｓ）
ＳＤＮ：Ｓｄｅｎ＿２５７１
ＳＦＲ：Ｓｆｒｉ＿２７９０
ＳＡＺ：Ｓａｍａ＿２４３６
ＳＢＬ：Ｓｂａｌ＿１３５７
ＳＬＯ：Ｓｈｅｗ＿２７７１
ＳＨＥ：Ｓｈｅｗｍｒ４＿２７３１
ＳＨＭ：Ｓｈｅｗｍｒ７＿２８０４
ＳＨＮ：Ｓｈｅｗａｎａ３＿２９０１
ＳＨＷ：Ｓｐｕｔｗ３１８１＿２８３１
ＩＬＯ：ＩＬ２１３８（ｄｘｓ）
ＣＰＳ：ＣＰＳ＿１０８８（ｄｘｓ）
ＰＨＡ：ＰＳＨＡａ２３６６（ｄｘｓ）
ＰＡＴ：Ｐａｔｌ＿１３１９
ＳＤＥ：Ｓｄｅ＿３３８１
ＰＩＮ：Ｐｉｎｇ＿２２４０
ＭＡＱ：Ｍａｑｕ＿２４３８
ＭＣＡ：ＭＣＡ０８１７（ｄｘｓ）
ＦＴＵ：ＦＴＴ１０１８ｃ（ｄｘｓ）
ＦＴＦ：ＦＴＦ１０１８ｃ（ｄｘｓ）
ＦＴＷ：ＦＴＷ＿０９２５（ｄｘｓ）
ＦＴＬ：ＦＴＬ＿１０７２
ＦＴＨ：ＦＴＨ＿１０４７（ｄｘｓ）
ＦＴＡ：ＦＴＡ＿１１３１（ｄｘｓ）
ＦＴＮ：ＦＴＮ＿０８９６（ｄｘｓ）
ＮＯＣ：Ｎｏｃ＿１７４３
ＡＥＨ：Ｍｌｇ＿１３８１
ＨＣＨ：ＨＣＨ＿０５８６６（ｄｘｓ）
ＣＳＡ：Ｃｓａｌ＿００９９
ＡＢＯ：ＡＢＯ＿２１６６（ｄｘｓ）
ＡＨＡ：ＡＨＡ＿３３２１（ｄｘｓ）
ＢＣＩ：ＢＣＩ＿０２７５（ｄｘｓ）
ＲＭＡ：Ｒｍａｇ＿０３８６
ＶＯＫ：ＣＯＳＹ＿０３６０（ｄｘｓ）
ＮＭＥ：ＮＭＢ１８６７
ＮＭＡ：ＮＭＡ０５８９（ｄｘｓ）
ＮＭＣ：ＮＭＣ０３５２（ｄｘｓ）
ＮＧＯ：ＮＧＯ００３６
ＣＶＩ：ＣＶ＿２６９２（ｄｘｓ）
ＲＳＯ：ＲＳｃ２２２１（ｄｘｓ）
ＲＥＵ：Ｒｅｕｔ＿Ａ０８８２
ＲＥＨ：Ｈ１６＿Ａ２７３２（ｄｘｓ）
ＲＭＥ：Ｒｍｅｔ＿２６１５
ＢＭＡ：ＢＭＡＡ０３３０（ｄｘｓ）
ＢＭＶ：ＢＭＡＳＡＶＰ１＿１５１２（ｄｘｓ）
ＢＭＬ：ＢＭＡ１０２９９＿１７０６（ｄｘｓ）
ＢＭＮ：ＢＭＡ１０２４７＿Ａ０３６４（ｄｘｓ）
ＢＸＥ：Ｂｘｅ＿Ｂ２８２７
ＢＵＲ：Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｂ２２１１
ＢＣＮ：Ｂｃｅｎ＿４４８６
ＢＣＨ：Ｂｃｅｎ２４２４＿３８７９
ＢＡＭ：Ｂａｍｂ＿３２５０
ＢＰＳ：ＢＰＳＳ１７６２（ｄｘｓ）
ＢＰＭ：ＢＵＲＰＳ１７１０ｂ＿Ａ０８４２（ｄｘｓ）
ＢＰＬ：ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿Ａ２３９２（ｄｘｓ）
ＢＰＤ：ＢＵＲＰＳ６６８＿Ａ２５３４（ｄｘｓ）
ＢＴＥ：ＢＴＨ＿ＩＩ０６１４（ｄｘｓ）
ＢＰＥ：ＢＰ２７９８（ｄｘｓ）
ＢＰＡ：ＢＰＰ２４６４（ｄｘｓ）
ＢＢＲ：ＢＢ１９１２（ｄｘｓ）
ＲＦＲ：Ｒｆｅｒ＿２８７５
ＰＯＬ：Ｂｐｒｏ＿１７４７
ＰＮＡ：Ｐｎａｐ＿１５０１
ＡＪＳ：Ａｊｓ＿１０３８
ＭＰＴ：Ｍｐｅ＿Ａ２６３１
ＨＡＲ：ＨＥＡＲ０２７９（ｄｘｓ）
ＭＭＳ：ｍｍａ＿０３３１
ＮＥＵ：ＮＥ１１６１（ｄｘｓ）
ＮＥＴ：Ｎｅｕｔ＿１５０１
ＮＭＵ：Ｎｍｕｌ＿Ａ０２３６
ＥＢＡ：ｅｂＡ４４３９（ｄｘｓ）
ＡＺＯ：ａｚｏ１１９８（ｄｘｓ）
ＤＡＲ：Ｄａｒｏ＿３０６１
ＴＢＤ：Ｔｂｄ＿０８７９
ＭＦＡ：Ｍｆｌａ＿２１３３
ＨＰＹ：ＨＰ０３５４（ｄｘｓ）
ＨＰＪ：ｊｈｐ０３２８（ｄｘｓ）
ＨＰＡ：ＨＰＡＧ１＿０３４９
ＨＨＥ：ＨＨ０６０８（ｄｘｓ）
ＨＡＣ：Ｈａｃ＿０９６８（ｄｘｓ）
ＷＳＵ：ＷＳ１９９６
ＴＤＮ：Ｔｍｄｅｎ＿０４７５
ＣＪＥ：Ｃｊ０３２１（ｄｘｓ）
ＣＪＲ：ＣＪＥ０３６６（ｄｘｓ）
ＣＪＪ：ＣＪＪ８１１７６＿０３４３（ｄｘｓ）
ＣＪＵ：Ｃ８Ｊ＿０２９８（ｄｘｓ）
ＣＪＤ：ＪＪＤ２６９９７＿１６４２（ｄｘｓ）
ＣＦＦ：ＣＦＦ８２４０＿０２６４（ｄｘｓ）
ＣＣＶ：ＣＣＶ５２５９２＿１６７１（ｄｘｓ） ＣＣＶ５２５９２＿１７２２
ＣＨＡ：ＣＨＡＢ３８１＿１２９７（ｄｘｓ）
ＣＣＯ：ＣＣＣ１３８２６＿１５９４（ｄｘｓ）
ＡＢＵ：Ａｂｕ＿２１３９（ｄｘｓ）
ＮＩＳ：ＮＩＳ＿０３９１（ｄｘｓ）
ＳＵＮ：ＳＵＮ＿２０５５（ｄｘｓ）
ＧＳＵ：ＧＳＵ０６８６（ｄｘｓ−１） ＧＳＵ１７６４（ｄｘｓ−２）
ＧＭＥ：Ｇｍｅｔ＿１９３４ Ｇｍｅｔ＿２８２２
ＰＣＡ：Ｐｃａｒ＿１６６７
ＰＰＤ：Ｐｐｒｏ＿１１９１ Ｐｐｒｏ＿２４０３
ＤＶＵ：ＤＶＵ１３５０（ｄｘｓ）
ＤＶＬ：Ｄｖｕｌ＿１７１８
ＤＤＥ：Ｄｄｅ＿２２００
ＬＩＰ：ＬＩ０４０８（ｄｓｘ）
ＤＰＳ：ＤＰ２７００
ＡＤＥ：Ａｄｅｈ＿１０９７
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿４６４３（ｄｘｓ）
ＳＡＴ：ＳＹＮ＿０２４５６
ＳＦＵ：Ｓｆｕｍ＿１４１８
ＰＵＢ：ＳＡＲ１１＿０６１１（ｄｘｓ）
ＭＬＯ：ｍｌｒ７４７４
ＭＥＳ：Ｍｅｓｏ＿０７３５
ＳＭＥ：ＳＭｃ００９７２（ｄｘｓ）
ＡＴＵ：Ａｔｕ０７４５（ｄｘｓ）
ＡＴＣ：ＡＧＲ＿Ｃ＿１３５１
ＲＥＴ：ＲＨＥ＿ＣＨ００９１３（ｄｘｓ）
ＲＬＥ：ＲＬ０９７３（ｄｘｓ）
ＢＭＥ：ＢＭＥＩ１４９８
ＢＭＦ：ＢＡＢ１＿０４６２（ｄｘｓ）
ＢＭＳ：ＢＲ０４３６（ｄｘｓ）
ＢＭＢ：ＢｒｕＡｂ１＿０４５８（ｄｘｓ）
ＢＯＶ：ＢＯＶ＿０４４３（ｄｘｓ）
ＢＪＡ：ｂｌｌ２６５１（ｄｘｓ）
ＢＲＡ：ＢＲＡＤＯ２１６１（ｄｘｓ）
ＢＢＴ：ＢＢｔａ＿２４７９（ｄｘｓ）
ＲＰＡ：ＲＰＡ０９５２（ｄｘｓ）
ＲＰＢ：ＲＰＢ＿４４６０
ＲＰＣ：ＲＰＣ＿１１４９
ＲＰＤ：ＲＰＤ＿４３０５
ＲＰＥ：ＲＰＥ＿１０６７
ＮＷＩ：Ｎｗｉ＿０６３３
ＮＨＡ：Ｎｈａｍ＿０７７８
ＢＨＥ：ＢＨ０４３５０（ｄｘｓ）
ＢＱＵ：ＢＱ０３５４０（ｄｘｓ）
ＢＢＫ：ＢＡＲＢＡＫＣ５８３＿０４００（ｄｘｓ）
ＣＣＲ：ＣＣ＿２０６８
ＳＩＬ：ＳＰＯ０２４７（ｄｘｓ）
ＳＩＴ：ＴＭ１０４０＿２９２０
ＲＳＰ：ＲＳＰ＿０２５４（ｄｘｓＡ） ＲＳＰ＿１１３４（ｄｘｓ）
ＪＡＮ：Ｊａｎｎ＿００８８ Ｊａｎｎ＿０１７０
ＲＤＥ：ＲＤ１＿０１０１（ｄｘｓ） ＲＤ１＿０５４８（ｄｘｓ）
ＭＭＲ：Ｍｍａｒ１０＿０８４９
ＨＮＥ：ＨＮＥ＿１８３８（ｄｘｓ）
ＺＭＯ：ＺＭＯ１２３４（ｄｘｓ） ＺＭＯ１５９８（ｄｘｓ）
ＮＡＲ：Ｓａｒｏ＿０１６１
ＳＡＬ：Ｓａｌａ＿２３５４
ＥＬＩ：ＥＬＩ＿１２５２０
ＧＯＸ：ＧＯＸ０２５２
ＧＢＥ：ＧｂＣＧＤＮＩＨ１＿０２２１ ＧｂＣＧＤＮＩＨ１＿２４０４
ＲＲＵ：Ｒｒｕ＿Ａ００５４ Ｒｒｕ＿Ａ２６１９
ＭＡＧ：ａｍｂ２９０４
ＭＧＭ：Ｍｍｃ１＿１０４８
ＳＵＳ：Ａｃｉｄ＿１７８３
ＢＳＵ：ＢＧ１１７１５（ｄｘｓ）
ＢＨＡ：ＢＨ２７７９
ＢＡＮ：ＢＡ４４００（ｄｘｓ）
ＢＡＲ：ＧＢＡＡ４４００（ｄｘｓ）
ＢＡＡ：ＢＡ＿４８５３
ＢＡＴ：ＢＡＳ４０８１
ＢＣＥ：ＢＣ４１７６（ｄｘｓ）
ＢＣＡ：ＢＣＥ＿４２４９（ｄｘｓ）
ＢＣＺ：ＢＣＺＫ３９３０（ｄｘｓ）
ＢＴＫ：ＢＴ９７２７＿３９１９（ｄｘｓ）
ＢＴＬ：ＢＡＬＨ＿３７８５（ｄｘｓ）
ＢＬＩ：ＢＬ０１５２３（ｄｘｓ）
ＢＬＤ：ＢＬｉ０２５９８（ｄｘｓ）
ＢＣＬ：ＡＢＣ２４６２（ｄｘｓ）
ＢＡＹ：ＲＢＡＭ＿０２２６００
ＢＰＵ：ＢＰＵＭ＿２１５９
ＧＫＡ：ＧＫ２３９２
ＧＴＮ：ＧＴＮＧ＿２３２２
ＬＭＯ：ｌｍｏ１３６５（ｔｋｔＢ）
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿１３８２（ｄｘｓ）
ＬＩＮ：ｌｉｎ１４０２（ｔｋｔＢ）
ＬＷＥ：ｌｗｅ１３８０（ｔｋｔＢ）
ＬＬＡ：Ｌ１０８９１１（ｄｘｓＡ） Ｌ１２３３６５（ｄｘｓＢ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿１５７２ ＬＡＣＲ＿１８４３
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０７４９（ｄｘｓＢ）
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿０２６３
ＬＰＬ：ｌｐ＿２６１０（ｄｘｓ）
ＬＪＯ：ＬＪ０４０６
ＬＡＣ：ＬＢＡ０３５６
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０２０９（ｄｘｓ）
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿０３５０
ＳＴＨ：ＳＴＨｌ８４２
ＣＡＣ：ＣＡＣ２０７７ ＣＡ＿Ｐ０１０６（ｄｘｓ）
ＣＰＥ：ＣＰＥｌ８１９
ＣＰＦ：ＣＰＦ＿２０７３（ｄｘｓ）
ＣＰＲ：ＣＰＲ＿１７８７（ｄｘｓ）
ＣＴＣ：ＣＴＣ０１５７５
ＣＮＯ：ＮＴ０１ＣＸ＿１９８３
ＣＴＨ：Ｃｔｈｅ＿０８２８
ＣＤＦ：ＣＤ１２０７（ｄｘｓ）
ＣＢＯ：ＣＢＯ１８８１（ｄｘｓ）
ＣＢＡ：ＣＬＢ＿１８１８（ｄｘｓ）
ＣＢＨ：ＣＬＣ＿１８２５（ｄｘｓ）
ＣＢＦ：ＣＬＩ＿１９４５（ｄｘｓ）
ＣＫＬ：ＣＫＬ＿１２３１（ｄｘｓ）
ＣＨＹ：ＣＨＹ＿１９８５（ｄｘｓ）
ＤＳＹ：ＤＳＹ２３４８
ＤＲＭ：Ｄｒｅｄ＿１０７８
ＰＴＨ：ＰＴＨ＿１１９６（ｄｘｓ）
ＳＷＯ：Ｓｗｏｌ＿０５８２
ＣＳＣ：Ｃｓａｃ＿１８５３
ＴＴＥ：ＴＴＥ１２９８（ｄｘｓ）
ＭＴＡ：Ｍｏｔｈ＿１５１１
ＭＰＥ：ＭＹＰＥ７３０
ＭＧＡ：ＭＧＡ＿１２６８（ｄｘｓ）
ＭＴＵ：Ｒｖ２６８２ｃ（ｄｘｓ１） Ｒｖ３３７９ｃ（ｄｘｓ２）
ＭＴＣ：ＭＴ２７５６（ｄｘｓ）
ＭＢＯ：Ｍｂ２７０１ｃ（ｄｘｓ１） Ｍｂ３４１３ｃ（ｄｘｓ２）
ＭＬＥ：ＭＬ１０３８（ｄｘｓ）
ＭＰＡ：ＭＡＰ２８０３ｃ（ｄｘｓ）
ＭＡＶ：ＭＡＶ＿３５７７（ｄｘｓ）
ＭＳＭ：ＭＳＭＥＧ＿２７７６（ｄｘｓ）
ＭＭＣ：Ｍｍｃｓ＿２２０８
ＣＧＬ：ＮＣｇｌ１８２７（ｃｇｌ１９０２）
ＣＧＢ：ｃｇ２０８３（ｄｘｓ）
ＣＥＦ：ＣＥ１７９６
ＣＤＩ：ＤＩＰ１３９７（ｄｘｓ）
ＣＪＫ：ｊｋ１０７８（ｄｘｓ）
ＮＦＡ：ｎｆａ３７４１０（ｄｘｓ）
ＲＨＡ：ＲＨＡ１＿ｒｏ０６８４３
ＳＣＯ：ＳＣＯ６０１３（ＳＣ１Ｃ３．０１） ＳＣＯ６７６８（ＳＣ６Ａ５．１７）
ＳＭＡ：ＳＡＶ１６４６（ｄｘｓ１） ＳＡＶ２２４４（ｄｘｓ２）
ＴＷＨ：ＴＷＴ４８４
ＴＷＳ：ＴＷ２８０（Ｄｘｓ）
ＬＸＸ：Ｌｘｘ１０４５０（ｄｘｓ）
ＣＭＩ：ＣＭＭ＿１６６０（ｄｘｓＡ）
ＡＡＵ：ＡＡｕｒ＿１７９０（ｄｘｓ）
ＰＡＣ：ＰＰＡ１０６２
ＴＦＵ：Ｔｆｕ＿１９１７
ＦＲＡ：Ｆｒａｎｃｃｉ３＿１３２６
ＦＡＬ：ＦＲＡＡＬ２０８８（ｄｘｓ）
ＡＣＥ：Ａｃｅｌ＿１３９３
ＳＥＮ：ＳＡＣＥ＿１８１５（ｄｘｓ） ＳＡＣＥ＿４３５１
ＢＬＯ：ＢＬ１１３２（ｄｘｓ）
ＢＡＤ：ＢＡＤ＿０５１３（ｄｘｓ）
ＦＮＵ：ＦＮ１２０８ ＦＮ１４６４
ＲＢＡ：ＲＢ２１４３（ｄｘｓ）
ＣＴＲ：ＣＴ３３１（ｄｘｓ）
ＣＴＡ：ＣＴＡ＿０３５９（ｄｘｓ）
ＣＭＵ：ＴＣ０６０８
ＣＰＮ：ＣＰｎ１０６０（ｔｋｔＢ＿２）
ＣＰＡ：ＣＰ０７９０
ＣＰＪ：ＣＰｊ１０６０（ｔｋｔＢ＿２）
ＣＰＴ：ＣｐＢ１１０２
ＣＣＡ：ＣＣＡ００３０４（ｄｘｓ）
ＣＡＢ：ＣＡＢ３０１（ｄｘｓ）
ＣＦＥ：ＣＦ０６９９（ｄｘｓ）
ＰＣＵ：ｐｃ０６１９（ｄｘｓ）
ＴＰＡ：ＴＰ０８２４
ＴＤＥ：ＴＤＥ１９１０（ｄｘｓ）
ＬＩＬ：ＬＡ３２８５（ｄｘｓ）
ＬＩＣ：ＬＩＣ１０８６３（ｄｘｓ）
ＬＢＪ：ＬＢＪ＿０９１７（ｄｘｓ）
ＬＢＬ：ＬＢＬ＿０９３２（ｄｘｓ）
ＳＹＮ：ｓｌｌ１９４５（ｄｘｓ）
ＳＹＷ：ＳＹＮＷ１２９２（Ｄｘｓ）
ＳＹＣ：ｓｙｃ１０８７＿ｃ（ｄｘｓ）
ＳＹＦ：Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿０４３０
ＳＹＤ：Ｓｙｎｃｃ９６０５＿１４３０
ＳＹＥ：Ｓｙｎｃｃ９９０２＿１０６９
ＳＹＧ：ｓｙｎｃ＿１４１０（ｄｘｓ）
ＳＹＲ：ＳｙｎＲＣＣ３０７＿１３９０（ｄｘｓ）
ＳＹＸ：ＳｙｎＷＨ７８０３＿１２２３（ｄｘｓ）
ＣＹＡ：ＣＹＡ＿１７０１（ｄｘｓ）
ＣＹＢ：ＣＹＢ＿１９８３（ｄｘｓ）
ＴＥＬ：ｔｌｌ０６２３
ＧＶＩ：ｇｌｌ０１９４
ＡＮＡ：ａｌｒ０５９９
ＡＶＡ：Ａｖａ＿４５３２
ＰＭＡ：Ｐｒｏ０９２８（ｄｘｓ）
ＰＭＭ：ＰＭＭ０９０７（Ｄｘｓ）
ＰＭＴ：ＰＭＴ０６８５（ｄｘｓ）
ＰＭＮ：ＰＭＮ２Ａ＿０３００
ＰＭＩ：ＰＭＴ９３１２＿０８９３
ＰＭＢ：Ａ９６０１＿０９５４１（ｄｘｓ）
ＰＭＣ：Ｐ９５１５＿０９９０１（ｄｘｓ）
ＰＭＦ：Ｐ９３０３＿１５３７１（ｄｘｓ）
ＰＭＧ：Ｐ９３０１＿０９５２１（ｄｘｓ）
ＰＭＨ：Ｐ９２１５＿０９８５１
ＰＭＪ：Ｐ９２１１＿０８５２１
ＰＭＥ：ＮＡＴＬｌ＿０９７２１（ｄｘｓ）
ＴＥＲ：Ｔｅｒｙ＿３０４２
ＢＴＨ：ＢＴ＿１４０３ ＢＴ＿４０９９
ＢＦＲ：ＢＦ０８７３ ＢＦ４３０６
ＢＦＳ：ＢＦ０７９６（ｄｘｓ） ＢＦ４１１４
ＰＧＩ：ＰＧ２２１７（ｄｘｓ）
ＣＨＵ：ＣＨＵ＿３６４３（ｄｘｓ）
ＧＦＯ：ＧＦＯ＿３４７０（ｄｘｓ）
ＦＰＳ：ＦＰ０２７９（ｄｘｓ）
ＣＴＥ：ＣＴ０３３７（ｄｘｓ）
ＣＰＨ：Ｃｐｈａ２６６＿０６７１
ＰＶＩ：Ｃｖｉｂ＿０４９８
ＰＬＴ：Ｐｌｕｔ＿０４５０
ＤＥＴ：ＤＥＴ０７４５（ｄｘｓ）
ＤＥＨ：ｃｂｄｂ＿Ａ７２０（ｄｘｓ）
ＤＲＡ：ＤＲ＿１４７５
ＤＧＥ：Ｄｇｅｏ＿０９９４
ＴＴＨ：ＴＴＣ １６１４
ＴＴＪ：ＴＴＨＡ０００６
ＡＡＥ：ａｑ＿８８１
ＴＭＡ：ＴＭ１７７０
ＰＭＯ：Ｐｍｏｂ＿１００１

例示的なアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：３８（ＡＣＡＴ１） ３９（ＡＣＡＴ２）
ＰＴＲ：４５１５２８（ＡＣＡＴ１）
ＭＣＣ：７０７６５３（ＡＣＡＴ１） ７０８７５０（ＡＣＡＴ２）
ＭＭＵ：１１０４４６（Ａｃａｔ１） １１０４６０（Ａｃａｔ２）
ＲＮＯ：２５０１４（Ａｃａｔ１）
ＣＦＡ：４８４０６３（ＡＣＡＴ２） ４８９４２１（ＡＣＡＴ１）
ＧＧＡ：４１８９６８（ＡＣＡＴ１） ４２１５８７（ＲＣＪＭＢ０４＿３４ｉ５）
ＸＬＡ：３７９５６９（ＭＧＣ６９０９８） ４１４６２２（ＭＧＣ８１４０３） ４１４６３９（ＭＧＣ８１２５６） ４４４４５７（ＭＧＣ８３６６４）
ＸＴＲ：３９４５６２（ａｃａｔ２）
ＤＲＥ：３０６４３（ａｃａｔ２）
ＳＰＵ：７５９５０２（ＬＯＣ７５９５０２）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ１０９３２ Ｄｍｅｌ＿ＣＧ９１４９
ＣＥＬ：Ｔ０２Ｇ５．４ Ｔ０２Ｇ５．７ Ｔ０２Ｇ５．８（ｋａｔ−１）
ＡＴＨ：ＡＴ５Ｇ４８２３０（ＡＣＡＴ２／ＥＭＢ１２７６）
ＯＳＡ：４３２６１３６ ４３４６５２０
ＣＭＥ：ＣＭＡ０４２Ｃ ＣＭＥ０８７Ｃ
ＳＣＥ：ＹＰＬ０２８Ｗ（ＥＲＧ１０）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＤＲ１６５Ｃ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿３１７０７（ＥＲＧ１０）
ＣＡＬ：ＣａＯ１９．１５９１（ｅｒｇ１０）
ＣＧＲ：ＣＡＧＬＯＬ１２３６４ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＢＣ２１５．０９ｃ
ＭＧＲ：ＭＧＧ＿０１７５５ ＭＧＧ＿１３４９９
ＡＮＩ：ＡＮ１４０９．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿６Ｇ１４２００ ＡＦＵＡ＿８Ｇ０４０００
ＡＯＲ：ＡＯ０９０１０３００００１２ ＡＯ０９０１０３０００４０６
ＣＮＥ：ＣＮＣ０５２８０
ＵＭＡ：ＵＭ０３５７１．１
ＤＤＩ：ＤＤＢ＿０２３１６２１
ＰＦＡ：ＰＦ１４＿０４８４
ＴＥＴ：ＴＴＨＥＲＭ＿０００９１５９０ ＴＴＨＥＲＭ＿００２７７４７０ ＴＴＨＥＲＭ＿００９２６９８０
ＴＣＲ：５１１００３．６０
ＥＣＯ：ｂ２２２４（ａｔｏＢ）
ＥＣＪ：ＪＷ２２１８（ａｔｏＢ） ＪＷ５４５３（ｙｑｅＦ）
ＥＣＥ：Ｚ４１６４（ｙｑｅＦ）
ＥＣＳ：ＥＣｓ３７０１
ＥＣＣ：ｃ２７６７（ａｔｏＢ） ｃ３４４１（ｙｑｅＦ）
ＥＣＩ：ＵＴＩ８９＿Ｃ２５０６（ａｔｏＢ） ＵＴＩ８９＿Ｃ３２４７（ｙｑｅＦ）
ＥＣＰ：ＥＣＰ＿２２６８ ＥＣＰ＿２８５７
ＥＣＶ：ＡＰＥＣＯ１＿３６６２（ｙｑｅＦ） ＡＰＥＣＯ１＿４３３５（ａｔｏＢ） ＡＰＥＣＯ１＿４３３５２（ａｔｏＢ）
ＥＣＸ：ＥｃＨＳ＿Ａ２３６５
ＳＴＹ：ＳＴＹ３１６４（ｙｑｅＦ）
ＳＴＴ：ｔ２９２９（ｙｑｅＦ）
ＳＰＴ：ＳＰＡ２８８６（ｙｑｅＦ）
ＳＥＣ：ＳＣ２９５８（ｙｑｅＦ）
ＳＴＭ：ＳＴＭ３０１９（ｙｑｅＦ）
ＳＦＬ：ＳＦ２８５４（ｙｑｅＦ）
ＳＦＸ：Ｓ３０５２（ｙｑｅＦ）
ＳＦＶ：ＳＦＶ＿２９２２（ｙｑｅＦ）
ＳＳＮ：ＳＳＯＮ＿２２８３（ａｔｏＢ） ＳＳＯＮ＿３００４（ｙｑｅＦ）
ＳＢＯ：ＳＢＯ＿２７３６（ｙｑｅＦ）
ＥＣＡ：ＥＣＡ１２８２（ａｔｏＢ）
ＥＮＴ：Ｅｎｔ６３８＿３２９９
ＳＰＥ：Ｓｐｒｏ＿０５９２
ＨＩＴ：ＮＴＨＩ０９３２（ａｔｏＢ）
ＸＣＣ：ＸＣＣ１２９７（ａｔｏＢ）
ＸＣＢ：ＸＣ＿２９４３
ＸＣＶ：ＸＣＶ１４０１（ｔｈｌＡ）
ＸＡＣ：ＸＡＣ１３４８（ａｔｏＢ）
ＸＯＯ：ＸＯＯ１８８１（ａｔｏＢ）
ＸＯＭ：ＸＯＯ＿１７７８（ＸＯＯ１７７８）
ＶＣＨ：ＶＣＡ０６９０
ＶＣＯ：ＶＣ０３９５＿０６３０
ＶＶＵ：ＶＶ２＿０４９４ ＶＶ２＿０７４１
ＶＶＹ：ＶＶＡ１０４３ ＶＶＡ１２１０
ＶＰＡ：ＶＰＡ０６２０ ＶＰＡ１１２３ ＶＰＡ１２０４
ＰＰＲ：ＰＢＰＲＢ１１１２ ＰＢＰＲＢ１８４０
ＰＡＥ：ＰＡ２００１（ａｔｏＢ） ＰＡ２５５３ ＰＡ３４５４ ＰＡ３５８９ ＰＡ３９２５
ＰＡＵ：ＰＡ１４＿３８６３０（ａｔｏＢ）
ＰＰＵ：ＰＰ＿２０５１（ａｔｏＢ） ＰＰ＿２２１５（ｆａｄＡｘ） ＰＰ＿３７５４ ＰＰ＿４６３６
ＰＰＦ：Ｐｐｕｔ＿２００９ Ｐｐｕｔ＿２４０３ Ｐｐｕｔ＿３５２３ Ｐｐｕｔ＿４４９８
ＰＳＴ：ＰＳＰＴＯ＿０９５７（ｐｈｂＡ−１） ＰＳＰＴＯ＿３１６４（ｐｈｂＡ−２）
ＰＳＢ：Ｐｓｙｒ＿０８２４ Ｐｓｙｒ＿３０３１
ＰＳＰ：ＰＳＰＰＨ＿０８５０（ｐｈｂＡ１） ＰＳＰＰＨ＿２２０９（ｐｈｂＡ２）
ＰＦＬ：ＰＦＬ＿１４７８（ａｔｏＢ−２） ＰＦＬ＿２３２１ ＰＦＬ＿３０６６ ＰＦＬ＿４３３０（ａｔｏＢ−２） ＰＦＬ＿５２８３
ＰＦＯ：Ｐｆｌ＿１２６９ Ｐｆｌ＿１７３９ Ｐｆｌ＿２０７４ Ｐｆｌ＿２８６８
ＰＥＮ：ＰＳＥＥＮ３１９７ ＰＳＥＥＮ３５４７（ｆａｄＡｘ） ＰＳＥＥＮ４６３５（ｐｈｂＡ）
ＰＭＹ：Ｐｍｅｎ＿１１３８ Ｐｍｅｎ＿２０３６ Ｐｍｅｎ＿３５９７ Ｐｍｅｎ＿３６６２ Ｐｍｅｎ＿３８２０
ＰＡＲ：Ｐｓｙｃ＿０２５２ Ｐｓｙｃ＿１１６９
ＰＣＲ：Ｐｃｒｙｏ＿０２７８ Ｐｃｒｙｏ＿１２３６ Ｐｃｒｙｏ＿１２６０
ＰＲＷ：ＰｓｙｃＰＲｗｆ＿２０１１
ＡＣＩ：ＡＣＩＡＤ０６９４ ＡＣＩＡＤ１６１２ ＡＣＩＡＤ２５１６（ａｔｏＢ）
ＳＯＮ：ＳＯ＿１６７７（ａｔｏＢ）
ＳＤＮ：Ｓｄｅｎ＿１９４３
ＳＦＲ：Ｓｆｒｉ＿１３３８ Ｓｆｒｉ＿２０６３
ＳＡＺ：Ｓａｍａ＿１３７５
ＳＢＬ：Ｓｂａｌ＿１４９５
ＳＢＭ：Ｓｈｅｗ１８５＿１４８９
ＳＢＮ：Ｓｂａｌ１９５＿１５２５
ＳＬＯ：Ｓｈｅｗ＿１６６７ Ｓｈｅｗ＿２８５８
ＳＰＣ：Ｓｐｕｔｃｎ３２＿１３９７
ＳＳＥ：Ｓｓｅｄ＿１４７３ Ｓｓｅｄ＿３５３３
ＳＰＬ：Ｓｐｅａ＿２７８３
ＳＨＥ：Ｓｈｅｗｍｒ４＿２５９７
ＳＨＭ：Ｓｈｅｗｍｒ７＿２６６４
ＳＨＮ：Ｓｈｅｗａｎａ３＿２７７１
ＳＨＷ：Ｓｐｕｔｗ３１８１＿２７０４
ＩＬＯ：ＩＬ０８７２
ＣＰＳ：ＣＰＳ＿１６０５ ＣＰＳ＿２６２６
ＰＨＡ：ＰＳＨＡａ０９０８ ＰＳＨＡａ１４５４（ａｔｏＢ） ＰＳＨＡａ１５８６（ａｔｏＢ）
ＰＡＴ：Ｐａｔｌ＿２９２３
ＳＤＥ：Ｓｄｅ＿３１４９
ＰＩＮ：Ｐｉｎｇ＿０６５９ Ｐｉｎｇ＿２４０１
ＭＡＱ：Ｍａｑｕ＿２１１７ Ｍａｑｕ＿２４８９ Ｍａｑｕ＿２６９６ Ｍａｑｕ＿３１６２
ＣＢＵ：ＣＢＵ＿０９７４
ＬＰＮ：ｌｐｇ１８２５（ａｔｏＢ）
ＬＰＦ：ｌｐｌ１７８９
ＬＰＰ：ｌｐｐ１７８８
ＮＯＣ：Ｎｏｃ＿１８９１
ＡＥＨ：Ｍｌｇ＿０６８８ Ｍｌｇ＿２７０６
ＨＨＡ：Ｈｈａｌ＿１６８５
ＨＣＨ：ＨＣＨ＿０５２９９
ＣＳＡ：Ｃｓａｌ＿０３０１ Ｃｓａｌ＿３０６８
ＡＢＯ：ＡＢＯ＿０６４８（ｆａｄＡｘ）
ＭＭＷ：Ｍｍｗｙｌｌ＿００７３ Ｍｍｗｙｌｌ＿３０２１ Ｍｍｗｙｌｌ＿３０５３ Ｍｍｗｙｌｌ＿３０９７ Ｍｍｗｙｌｌ＿４１８２
ＡＨＡ：ＡＨＡ＿２１４３（ａｔｏＢ）
ＣＶＩ：ＣＶ＿２０８８（ａｔｏＢ） ＣＶ＿２７９０（ｐｈａＡ）
ＲＳＯ：ＲＳｃ０２７６（ａｔｏＢ） ＲＳｃ１６３２（ｐｈｂＡ） ＲＳｃ１６３７（ｂｋｔＢ） ＲＳｃ１７６１（ＲＳ０２９４８）
ＲＥＵ：Ｒｅｕｔ＿Ａ０１３８ Ｒｅｕｔ＿Ａ１３４８ Ｒｅｕｔ＿Ａ１３５３ Ｒｅｕｔ＿Ｂ４５６１ Ｒｅｕｔ＿Ｂ４７３８ Ｒｅｕｔ＿Ｂ５５８７ Ｒｅｕｔ＿Ｃ５９４３ Ｒｅｕｔ＿Ｃ６０６２
ＲＥＨ：Ｈ１６＿Ａ０１７０ Ｈ１６＿Ａ０８６７ Ｈ１６＿Ａ０８６８ Ｈ１６＿Ａ０８７２ Ｈ１６＿Ａ１２９７ Ｈ１６＿Ａ１４３８（ｐｈａＡ） Ｈ１６＿Ａ１４４５（ｂｋｔＢ） Ｈ１６＿Ａ１５２８ Ｈ１６＿Ａ１７１３ Ｈ１６＿Ａ１７２０ Ｈ１６＿Ａ１８８７ Ｈ１６＿Ａ２１４８ Ｈ１６＿Ｂ０３８０ Ｈ１６＿Ｂ０３８１ Ｈ１６＿Ｂ０４０６ Ｈ１６＿Ｂ０６６２ Ｈ１６＿Ｂ０６６８ Ｈ１６＿Ｂ０７５９ Ｈ１６＿Ｂ１３６９ Ｈ１６＿Ｂ１７７１
ＲＭＥ：Ｒｍｅｔ＿０１０６ Ｒｍｅｔ＿１３５７ Ｒｍｅｔ＿１３６２ Ｒｍｅｔ＿５１５６
ＢＭＡ：ＢＭＡ１３１６ ＢＭＡ１３２１（ｐｈｂＡ） ＢＭＡ１４３６
ＢＭＶ：ＢＭＡＳＡＶＰ１＿Ａ１８０５（ｂｋｔＢ） ＢＭＡＳＡＶＰ１＿Ａ１８１０（ｐｈｂＡ）
ＢＭＬ：ＢＭＡ１０２９９＿Ａ００８６（ｐｈｂＡ） ＢＭＡ１０２９９＿Ａ００９１
ＢＭＮ：ＢＭＡ１０２４７＿１０７６（ｂｋｔＢ） ＢＭＡ１０２４７＿１０８１（ｐｈｂＡ）
ＢＸＥ：Ｂｘｅ＿Ａ２２７３ Ｂｘｅ＿Ａ２３３５ Ｂｘｅ＿Ａ２３４２ Ｂｘｅ＿Ａ４２５５ Ｂｘｅ＿Ｂ０３７７ Ｂｘｅ＿Ｂ０７３９ Ｂｘｅ＿Ｃ０３３２ Ｂｘｅ＿Ｃ０５７４ Ｂｘｅ＿Ｃ０９１５
ＢＶＩ：Ｂｃｅｐ１８０８＿０５１９ Ｂｃｅｐ１８０８＿１７１７ Ｂｃｅｐ１８０８＿２８７７ Ｂｃｅｐ１８０８＿３５９４ Ｂｃｅｐ１８０８＿４０１５ Ｂｃｅｐ１８０８＿５５０７ Ｂｃｅｐ１８０８＿５６４４
ＢＵＲ：Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ａ３６２９ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ａ５０８０ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ａ５０９１ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ａ６１０２ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｂ０２６３ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｂ１４３９ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ６６５２ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ６８０２ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ６８７４ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ７１１８ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ７１５１ Ｂｃｅｐ１８１９４＿Ｃ７３３２
ＢＣＮ：Ｂｃｅｎ＿１５５３ Ｂｃｅｎ＿１５９９ Ｂｃｅｎ＿２１５８ Ｂｃｅｎ＿２５６３ Ｂｃｅｎ＿２９９８ Ｂｃｅｎ＿６２８９
ＢＣＨ：Ｂｃｅｎ２４２４＿０５４２ Ｂｃｅｎ２４２４＿１７９０ Ｂｃｅｎ２４２４＿２７７２ Ｂｃｅｎ２４２４＿５３６８ Ｂｃｅｎ２４２４＿６２３２ Ｂｃｅｎ２４２４＿６２７６
ＢＡＭ：Ｂａｍｂ＿０４４７ Ｂａｍｂ＿１７２８ Ｂａｍｂ＿２８２４ Ｂａｍｂ＿４７１７ Ｂａｍｂ＿５７７１ Ｂａｍｂ＿５９６９
ＢＰＳ：ＢＰＳＬ１４２６ ＢＰＳＬ１５３５（ｐｈｂＡ） ＢＰＳＬ１５４０
ＢＰＭ：ＢＵＲＰＳ１７１０ｂ＿２３２５（ｂｋｔＢ） ＢＵＲＰＳ１７１０ｂ＿２３３０（ｐｈｂＡ） ＢＵＲＰＳ１７１０ｂ＿２４５３（ａｔｏＢ−２）
ＢＰＬ：ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿２１９７（ｂｋｔＢ） ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿２２０２（ｐｈｂＡ）
ＢＰＤ：ＢＵＲＰＳ６６８＿２１６０（ｂｋｔＢ） ＢＵＲＰＳ６６８＿２１６５（ｐｈｂＡ）
ＢＴＥ：ＢＴＨ＿Ｉ２１４４ ＢＴＨ＿Ｉ２２５６ ＢＴＨ＿Ｉ２２６１
ＰＮＵ：Ｐｎｕｃ＿０９２７
ＢＰＥ：ＢＰ０４４７ ＢＰ０６６８ ＢＰ２０５９
ＢＰＡ：ＢＰＰ０６０８ ＢＰＰ１７４４ ＢＰＰ３８０５ ＢＰＰ４２１６ ＢＰＰ４３６１
ＢＢＲ：ＢＢ０６１４ ＢＢ３３６４ ＢＢ４２５０ ＢＢ４８０４ ＢＢ４９４７
ＲＦＲ：Ｒｆｅｒ＿０２７２ Ｒｆｅｒ＿１０００ Ｒｆｅｒ＿１８７１ Ｒｆｅｒ＿２２７３ Ｒｆｅｒ＿２５６１ Ｒｆｅｒ＿２５９４ Ｒｆｅｒ＿３８３９
ＰＯＬ：Ｂｐｒｏ＿１５７７ Ｂｐｒｏ＿２１４０ Ｂｐｒｏ＿３１１３ Ｂｐｒｏ＿４１８７
ＰＮＡ：Ｐｎａｐ＿００６０ Ｐｎａｐ＿０４５８ Ｐｎａｐ＿０８６７ Ｐｎａｐ＿１１５９ Ｐｎａｐ＿２１３６ Ｐｎａｐ＿２８０４
ＡＡＶ：Ａａｖｅ＿００３１ Ａａｖｅ＿２４７８ Ａａｖｅ＿３９４４ Ａａｖｅ＿４３６８
ＡＪＳ：Ａｊｓ＿００１４ Ａｊｓ＿０１２４ Ａｊｓ＿１９３１ Ａｊｓ＿２０７３ Ａｊｓ＿２３１７ Ａｊｓ＿３５４８ Ａｊｓ＿３７３８ Ａｊｓ＿３７７６
ＶＥＩ：Ｖｅｉｓ＿１３３１ Ｖｅｉｓ＿３８１８ Ｖｅｉｓ＿４１９３
ＤＡＣ：Ｄａｃｉ＿００２５ Ｄａｃｉ＿０１９２ Ｄａｃｉ＿３６０１ Ｄａｃｉ＿５９８８
ＭＰＴ：Ｍｐｅ＿Ａ１５３６ Ｍｐｅ＿Ａ１７７６ Ｍｐｅ＿Ａ１８６９ Ｍｐｅ＿Ａ３３６７
ＨＡＲ：ＨＥＡＲ０５７７（ｐｈｂＡ）
ＭＭＳ：ｍｍａ＿０５５５
ＮＥＵ：ＮＥ２２６２（ｂｋｔＢ）
ＮＥＴ：Ｎｅｕｔ＿０６１０
ＥＢＡ：ｅｂＡ５２０２ ｐ２Ａ４０９（ｔｉｏＬ）
ＡＺＯ：ａｚｏ０４６４（ｆａｄＡ１） ａｚｏ０４６９（ｆａｄＡ２） ａｚｏ２１７２（ｔｈｌＡ）
ＤＡＲ：Ｄａｒｏ＿００９８ Ｄａｒｏ＿３０２２
ＨＰＡ：ＨＰＡＧ１＿０６７５
ＨＡＣ：Ｈａｃ＿０９５８（ａｔｏＢ）
ＧＭＥ：Ｇｍｅｔ＿１７１９ Ｇｍｅｔ＿２０７４ Ｇｍｅｔ＿２２１３ Ｇｍｅｔ＿２２６８ Ｇｍｅｔ＿３３０２
ＧＵＲ：Ｇｕｒａ＿３０４３
ＢＢＡ：Ｂｄ０４０４（ａｔｏＢ） Ｂｄ２０９５
ＤＯＬ：Ｄｏｌｅ＿０６７１ Ｄｏｌｅ＿１７７８ Ｄｏｌｅ＿２１６０ Ｄｏｌｅ＿２１８７
ＡＤＥ：Ａｄｅｈ＿００６２ Ａｄｅｈ＿２３６５
ＡＦＷ：Ａｎａｅ１０９＿００６４ Ａｎａｅ１０９＿１５０４
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿３７９１
ＳＡＴ：ＳＹＮ＿０２６４２
ＳＦＵ：Ｓｆｕｍ＿２２８０ Ｓｆｕｍ＿３５８２
ＲＰＲ：ＲＰ７３７
ＲＣＯ：ＲＣ１１３４ ＲＣ１１３５
ＲＦＥ：ＲＦ＿０１６３（ｐａａＪ）
ＲＢＥ：ＲＢＥ＿０１３９（ｐａａＪ）
ＲＡＫ：Ａ１Ｃ＿０５８２０
ＲＢＯ：Ａ１Ｉ＿０７２１５
ＲＣＭ：Ａ１Ｅ＿０４７６０
ＰＵＢ：ＳＡＲ１１＿０４２８（ｔｈｌＡ）
ＭＬＯ：ｍｌｒ３８４７
ＭＥＳ：Ｍｅｓｏ＿３３７４
ＰＬＡ：Ｐｌａｖ＿１５７３ Ｐｌａｖ＿２７８３
ＳＭＥ：ＳＭａ１４５０ ＳＭｃ０３８７９（ｐｈｂＡ）
ＳＭＤ：Ｓｍｅｄ＿０４９９ Ｓｍｅｄ＿３１１７ Ｓｍｅｄ＿５０９４ Ｓｍｅｄ＿５０９６
ＡＴＵ：Ａｔｕ２７６９（ａｔｏＢ） Ａｔｕ３４７５
ＡＴＣ：ＡＧＲ＿Ｃ＿５０２２（ｐｈｂＡ） ＡＧＲ＿Ｌ＿２７１３
ＲＥＴ：ＲＨＥ＿ＣＨ０４０１８（ｐｈｂＡｃｈ） ＲＨＥ＿ＰＣ０００６８（ｙｐｃ０００４０） ＲＨＥ＿ＰＦ０００１４（ｐｈｂＡｆ）
ＲＬＥ：ＲＬ４６２１（ｐｈａＡ） ｐＲＬ１００３０１ ｐＲＬ１２０３６９
ＢＭＥ：ＢＭＥＩ０２７４ ＢＭＥＩＩ０８１７
ＢＭＦ：ＢＡＢ１＿１７８３（ｐｈｂＡ−１） ＢＡＢ２＿０７９０（ｐｈｂＡ−２）
ＢＭＳ：ＢＲ１７７２（ｐｈｂＡ−１） ＢＲＡ０４４８（ｐｈｂＡ−２）
ＢＭＢ：ＢｒｕＡｂ１＿１７５６（ｐｈｂＡ−１） ＢｒｕＡｂ２＿０７７４（ｐｈｂＡ−２）
ＢＯＶ：ＢＯＶ＿１７０７（ｐｈｂＡ−１）
ＯＡＮ：Ｏａｎｔ＿１１３０ Ｏａｎｔ＿３１０７ Ｏａｎｔ＿３７１８ Ｏａｎｔ＿４０２０
ＢＪＡ：ｂｌｌ０２２６（ａｔｏＢ） ｂｌｌ３９４９ ｂｌｌ７４００ ｂｌｌ７８１９ ｂｌｒ３７２４（ｐｈｂＡ）
ＢＲＡ：ＢＲＡＤＯ０５６２（ｐｈｂＡ） ＢＲＡＤＯ０９８３（ｐｉｍＢ） ＢＲＡＤＯ３１１０ ＢＲＡＤＯ３１３４（ａｔｏＢ）
ＢＢＴ：ＢＢｔａ＿３５５８ ＢＢｔａ＿３５７５（ａｔｏＢ） ＢＢｔａ＿５１４７（ｐｉｍＢ） ＢＢｔａ＿７０７２（ｐｉｍＢ）ＢＢｔａ＿７６１４（ｐｈｂＡ）
ＲＰＡ：ＲＰＡ０５１３（ｐｃａＦ） ＲＰＡ０５３１ ＲＰＡ３７１５（ｐｉｍＢ）
ＲＰＢ：ＲＰＢ＿０５０９ ＲＰＢ＿０５２５ ＲＰＢ＿１７４８
ＲＰＣ：ＲＰＣ＿０５０４ ＲＰＣ＿０６３６ ＲＰＣ＿０６４１ ＲＰＣ＿０８３２ ＲＰＣ＿１０５０ ＲＰＣ＿２００５ ＲＰＣ＿２１９４ ＲＰＣ＿２２２８
ＲＰＤ：ＲＰＤ＿０３０６ ＲＰＤ＿０３２０ ＲＰＤ＿３１０５ ＲＰＤ＿３３０６
ＲＰＥ：ＲＰＥ＿０１６８ ＲＰＥ＿０２４８ ＲＰＥ＿３８２７
ＮＷＩ：Ｎｗｉ＿３０６０
ＸＡＵ：Ｘａｕｔ＿３１０８ Ｘａｕｔ＿４６６５
ＣＣＲ：ＣＣ＿０５１０ ＣＣ＿０８９４ ＣＣ＿３４６２
ＳＩＬ：ＳＰＯ０１４２（ｂｋｔＢ） ＳＰＯ０３２６（ｐｈｂＡ） ＳＰＯ０７７３ ＳＰＯ３４０８
ＳＩＴ：ＴＭ１０４０＿００６７ ＴＭ１０４０＿２７９０ ＴＭ１０４０＿３０２６ ＴＭ１０４０＿３７３５
ＲＳＰ：ＲＳＰ＿０７４５ ＲＳＰ＿１３５４ ＲＳＰ＿３１８４
ＲＳＨ：Ｒｓｐｈ１７０２９＿００２２ Ｒｓｐｈ１７０２９＿２４０１ Ｒｓｐｈ１７０２９＿３１７９ Ｒｓｐｈ１７０２９＿３９２１
ＲＳＱ：Ｒｓｐｈ１７０２５＿００１２ Ｒｓｐｈ１７０２５＿２４６６ Ｒｓｐｈ１７０２５＿２８３３
ＪＡＮ：Ｊａｎｎ＿０２６２ Ｊａｎｎ＿０４９３ Ｊａｎｎ＿４０５０
ＲＤＥ：ＲＤ１＿００２５ ＲＤ１＿０２０１（ｂｋｔＢ） ＲＤ１＿３３９４（ｐｈｂＡ）
ＰＤＥ：Ｐｄｅｎ＿２０２６ Ｐｄｅｎ＿２６６３ Ｐｄｅｎ＿２８７０ Ｐｄｅｎ＿２９０７ Ｐｄｅｎ＿４８１１ Ｐｄｅｎ＿５０２２
ＤＳＨ：Ｄｓｈｉ＿００７４ Ｄｓｈｉ＿３０６６ Ｄｓｈｉ＿３３３１
ＭＭＲ：Ｍｍａｒ１０＿０６９７
ＨＮＥ：ＨＮＥ＿２７０６ ＨＮＥ＿３０６５ ＨＮＥ＿３１３３
ＮＡＲ：Ｓａｒｏ＿０８０９ Ｓａｒｏ＿１０６９ Ｓａｒｏ＿１２２２ Ｓａｒｏ＿２３０６ Ｓａｒｏ＿２３４９
ＳＡＬ：Ｓａｌａ＿０７８１ Ｓａｌａ＿１２４４ Ｓａｌａ＿２８９６ Ｓａｌａ＿３１５８
ＳＷＩ：Ｓｗｉｔ＿０６３２ Ｓｗｉｔ＿０７５２ Ｓｗｉｔ＿２８９３ Ｓｗｉｔ＿３６０２ Ｓｗｉｔ＿４８８７ Ｓｗｉｔ＿５０１９ Ｓｗｉｔ＿５３０９
ＥＬＩ：ＥＬＩ＿０１４７５ ＥＬＩ＿０６７０５ ＥＬＩ＿１２０３５
ＧＢＥ：ＧｂＣＧＤＮＩＨ１＿０４４７
ＡＣＲ：Ａｃｒｙ＿１８４７ Ａｃｒｙ＿２２５６
ＲＲＵ：Ｒｒｕ＿Ａ０２７４ Ｒｒｕ＿Ａ１３８０ Ｒｒｕ＿Ａ１４６９ Ｒｒｕ＿Ａ１９４６ Ｒｒｕ＿Ａ３３８７
ＭＡＧ：ａｍｂ０８４２
ＭＧＭ：Ｍｍｃ１＿１１６５
ＡＢＡ：Ａｃｉｄ３４５＿３２３９
ＢＳＵ：ＢＧ１１３１９（ｍｍｇＡ） ＢＧ１３０６３（ｙｈｆＳ）
ＢＨＡ：ＢＨ１９９７ ＢＨ２０２９ ＢＨ３８０１（ｍｍｇＡ）
ＢＡＮ：ＢＡ３６８７ ＢＡ４２４０ ＢＡ５５８９
ＢＡＲ：ＧＢＡＡ３６８７ ＧＢＡＡ４２４０ ＧＢＡＡ５５８９
ＢＡＡ：ＢＡ＿０４４５ ＢＡ＿４１７２ ＢＡ＿４７００
ＢＡＴ：ＢＡＳ３４１８ ＢＡＳ３９３２ ＢＡＳ５１９３
ＢＣＥ：ＢＣ３６２７ ＢＣ４０２３ ＢＣ５３４４
ＢＣＡ：ＢＣＥ＿３６４６ ＢＣＥ＿４０７６ ＢＣＥ＿５４７５
ＢＣＺ：ＢＣＺＫ３３２９（ｍｍｇＡ） ＢＣＺＫ３７８０（ｔｈｌ） ＢＣＺＫ５０４４（ａｔｏＢ）
ＢＣＹ：Ｂｃｅｒ９８＿２７２２ Ｂｃｅｒ９８＿３８６５
ＢＴＫ：ＢＴ９７２７＿３３７９（ｍｍｇＡ） ＢＴ９７２７＿３７６５（ｔｈｌ） ＢＴ９７２７＿５０２８（ａｔｏＢ）
ＢＴＬ：ＢＡＬＨ＿３２６２（ｍｍｇＡ） ＢＡＬＨ＿３６４２（ｆａｄＡ） ＢＡＬＨ＿４８４３（ａｔｏＢ）
ＢＬＩ：ＢＬ０３９２５（ｍｍｇＡ）
ＢＬＤ：ＢＬｉ０３９６８（ｍｍｇＡ）
ＢＣＬ：ＡＢＣ０３４５ ＡＢＣ２９８９ ＡＢＣ３６１７ ＡＢＣ３８９１（ｍｍｇＡ）
ＢＡＹ：ＲＢＡＭ＿０２２４５０
ＢＰＵ：ＢＰＵＭ＿２３７４（ｙｈｆＳ） ＢＰＵＭ＿２９４１ ＢＰＵＭ＿３３７３
ＯＩＨ：ＯＢ０６７６ ＯＢ０６８９ ＯＢ２６３２ ＯＢ３０１３
ＧＫＡ：ＧＫ１６５８ ＧＫ３３９７
ＳＡＵ：ＳＡ０３４２ ＳＡ０５３４（ｖｒａＢ）
ＳＡＶ：ＳＡＶ０３５４ ＳＡＶ０５７６（ｖｒａＢ）
ＳＡＭ：ＭＷ０３３０ ＭＷ０５３１（ｖｒａＢ）
ＳＡＲ：ＳＡＲ０３５１（ｔｈｌ） ＳＡＲ０５８１
ＳＡＳ：ＳＡＳ０３３０ ＳＡＳ０５３４
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ０４２６ ＳＡＣＯＬ０６２２（ａｔｏＢ）
ＳＡＢ：ＳＡＢ０３０４（ｔｈｌ） ＳＡＢ０５２６
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿０３５５ ＳＡＵＳＡ３００＿０５６０（ｖｒａＢ）
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿００３３６ ＳＡＯＵＨＳＣ＿００５５８
ＳＡＪ：ＳａｕｒＪＨ９＿０４０２
ＳＡＨ：ＳａｕｒＪＨ１＿０４１２
ＳＥＰ：ＳＥ０３４６ ＳＥ２３８４
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ００３２ ＳＥＲＰ０２２０
ＳＨＡ：ＳＨ０５１０（ｍｖａＣ） ＳＨ２４１７
ＳＳＰ：ＳＳＰ０３２５ ＳＳＰ２１４５
ＬＭＯ：ｌｍｏ１４１４
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿１４３３
ＬＩＮ：ｌｉｎ１４５３
ＬＷＥ：ｌｗｅ１４３１
ＬＬＡ：Ｌ１１７４５（ｔｈｉＬ） Ｌ２５９４６（ｆａｄＡ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿１６６５ ＬＡＣＲ＿１９５６
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０９３０（ｔｈｉＬ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０１４０ ＳＰｙ＿１６３７（ａｔｏＢ）
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０１１９ Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０４３２ Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿１３４４（ａｔｏＢ）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０１３６ ｓｐｙＭ１８＿１６４５（ａｔｏＢ）
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０１０８ ＳｐｙＭ３＿１３７８（ａｔｏＢ）
ＳＰＳ：ＳＰｓ０１１０ ＳＰｓ０４８４
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０１２１ ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０４３３ ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ１４６１（ａｔｏＢ）
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０１２４ ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０４５２ ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ１４５３（ａｔｏＢ）
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０１２３ ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０４５１ ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ１３６５（ａｔｏＢ）
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０１２１ ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０４３１ ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ１３３９（ａｔｏＢ）
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５０４４７（ａｔｏＢ２）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０１６６ Ｍ６＿Ｓｐｙ０４６６ Ｍ６＿Ｓｐｙ１３９０
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０１１７ Ｍ２８＿Ｓｐｙ０４２０ Ｍ２８＿Ｓｐｙ１３８５（ａｔｏＢ）
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿０５６８
ＬＪＯ：ＬＪ１６０９
ＬＡＣ：ＬＢＡ０６２６（ｔｈｉＬ）
ＬＳＡ：ＬＳＡ１４８６
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０８７９
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０８０４
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿２２１８
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１７８７
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１３７４
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿００５２
ＥＦＡ：ＥＦ１３６４
ＯＯＥ：ＯＥＯＥ＿０５２９
ＳＴＨ：ＳＴＨ２９１３ ＳＴＨ７２５ ＳＴＨ８０４
ＣＡＣ：ＣＡＣ２８７３ ＣＡ＿Ｐ００７８（ｔｈｉＬ）
ＣＰＥ：ＣＰＥ２１９５（ａｔｏＢ）
ＣＰＦ：ＣＰＦ＿２４６０
ＣＰＲ：ＣＰＲ＿２１７０
ＣＴＣ：ＣＴＣ００３１２
ＣＮＯ：ＮＴ０１ＣＸ＿０５３８ ＮＴ０１ＣＸ＿０６０３
ＣＤＦ：ＣＤ１０５９（ｔｈｌＡ１） ＣＤ２６７６（ｔｈｌＡ２）
ＣＢＯ：ＣＢＯ３２００（ｔｈｌ）
ＣＢＥ：Ｃｂｅｉ＿０４１１ Ｃｂｅｉ＿３６３０
ＣＫＬ：ＣＫＬ＿３６９６（ｔｈｌＡ１） ＣＫＬ＿３６９７（ｔｈｌＡ２） ＣＫＬ＿３６９８（ｔｈｌＡ３）
ＡＭＴ：Ａｍｅｔ＿４６３０
ＡＯＥ：Ｃｌｏｓ＿００８４ Ｃｌｏｓ＿０２５８
ＣＨＹ：ＣＨＹ＿１２８８ ＣＨＹ＿１３５５（ａｔｏＢ） ＣＨＹ＿１６０４ ＣＨＹ＿１７３８
ＤＳＹ：ＤＳＹ０６３２ ＤＳＹ０６３９ ＤＳＹ１５６７ ＤＳＹ１７１０ ＤＳＹ２４０２ ＤＳＹ３３０２
ＤＲＭ：Ｄｒｅｄ＿０４００ Ｄｒｅｄ＿１４９１ Ｄｒｅｄ＿１７８４ Ｄｒｅｄ＿１８９２
ＳＷＯ：Ｓｗｏｌ＿０３０８ Ｓｗｏｌ＿０６７５ Ｓｗｏｌ＿０７８９ Ｓｗｏｌ＿１４８６ Ｓｗｏｌ＿１９３４ Ｓｗｏｌ＿２０５１
ＴＴＥ：ＴＴＥ０５４９（ｐａａＪ）
ＭＴＡ：Ｍｏｔｈ＿１２６０
ＭＴＵ：Ｒｖ１１３５Ａ Ｒｖ１３２３（ｆａｄＡ４） Ｒｖ３５４６（ｆａｄＡ５）
ＭＴＣ：ＭＴ１３６５（ｐｈｂＡ）
ＭＢＯ：Ｍｂ１１６７ Ｍｂ１３５８（ｆａｄＡ４） Ｍｂ３５７６（ｆａｄＡ５） Ｍｂ３５８６ｃ（ｆａｄＡ６）
ＭＢＢ：ＢＣＧ＿１１９７ ＢＣＧ＿１３８５（ｆａｄＡ４） ＢＣＧ＿３６１０（ｆａｄＡ５） ＢＣＧ＿３６２０ｃ（ｆａｄＡ６）
ＭＬＥ：ＭＬ１１５８（ｆａｄＡ４）
ＭＰＡ：ＭＡＰ２４０７ｃ（ｆａｄＡ３） ＭＡＰ２４３６ｃ（ｆａｄＡ４）
ＭＡＶ：ＭＡＶ＿１５４４ ＭＡＶ＿１５７３ ＭＡＶ＿１８６３ ＭＡＶ＿５０８１
ＭＳＭ：ＭＳＭＥＧ＿２２２４ ＭＳＭＥＧ＿４９２０
ＭＵＬ：ＭＵＬ＿０３５７
ＭＶＡ：Ｍｖａｎ＿１９７６ Ｍｖａｎ＿１９８８ Ｍｖａｎ＿４３０５ Ｍｖａｎ＿４６７７ Ｍｖａｎ＿４８９１
ＭＧＩ：Ｍｆｌｖ＿１３４７ Ｍｆｌｖ＿１４８４ Ｍｆｌｖ＿２０４０ Ｍｆｌｖ＿２３４０ Ｍｆｌｖ＿４３５６ Ｍｆｌｖ＿４３６８
ＭＭＣ：Ｍｍｃｓ＿１７５８ Ｍｍｃｓ＿１７６９ Ｍｍｃｓ＿３７９６ Ｍｍｃｓ＿３８６４
ＭＫＭ：Ｍｋｍｓ＿０２５１ Ｍｋｍｓ＿１５４０ Ｍｋｍｓ＿１８０５ Ｍｋｍｓ＿１８１６ Ｍｋｍｓ＿２８３６ Ｍｋｍｓ＿３１５９ Ｍｋｍｓ＿３２８６ Ｍｋｍｓ＿３８６９ Ｍｋｍｓ＿３９３８ Ｍｋｍｓ＿４２２７ Ｍｋｍｓ＿４４１１ Ｍｋｍｓ＿４５８０ Ｍｋｍｓ＿４７２４ Ｍｋｍｓ＿４７６４ Ｍｋｍｓ＿４７７６
ＭＪＬ：Ｍｊｌｓ＿０２３１ Ｍｊｌｓ＿１７３９ Ｍｊｌｓ＿１７５０ Ｍｊｌｓ＿２８１９ Ｍｊｌｓ＿３１１９ Ｍｊｌｓ＿３２３５ Ｍｊｌｓ＿３８００ Ｍｊｌｓ＿３８５０ Ｍｊｌｓ＿４１１０ Ｍｊｌｓ＿４３８３ Ｍｊｌｓ＿４７０５ Ｍｊｌｓ＿４８７６ Ｍｊｌｓ＿５０１８ Ｍｊｌｓ＿５０６３ Ｍｊｌｓ＿５０７５
ＣＧＬ：ＮＣｇｌ２３０９（ｃｇｌ２３９２）
ＣＧＢ：ｃｇ２６２５（ｐｃａＦ）
ＣＥＦ：ＣＥ０７３１ ＣＥ２２９５
ＣＪＫ：ｊｋ１５４３（ｆａｄＡ３）
ＮＦＡ：ｎｆａ１０７５０（ｆａｄＡ４）
ＲＨＡ：ＲＨＡ１＿ｒｏ０１４５５ ＲＨＡ１＿ｒｏ０１６２３ ＲＨＡ１＿ｒｏ０１８７６ ＲＨＡ１＿ｒｏ０２５１７（ｃａｔＦ） ＲＨＡ１＿ｒｏ０３０２２ ＲＨＡ１＿ｒｏ０３０２４ ＲＨＡ１＿ｒｏ０３３９１ ＲＨＡ１＿ｒｏ０３８９２ ＲＨＡ１＿ｒｏ０４５９９ ＲＨＡ１＿ｒｏ０５２５７ ＲＨＡ１＿ｒｏ０８８７１
ＳＣＯ：ＳＣＯ５３９９（ＳＣ８Ｆ４．０３）
ＳＭＡ：ＳＡＶ１３８４（ｆａｄＡ５） ＳＡＶ２８５６（ｆａｄＡ１）
ＡＲＴ：Ａｒｔｈ＿１１６０ Ａｒｔｈ＿２９８６ Ａｒｔｈ＿３２６８ Ａｒｔｈ＿４０７３
ＮＣＡ：Ｎｏｃａ＿１３７１ Ｎｏｃａ＿１７９７ Ｎｏｃａ＿１８２８ Ｎｏｃａ＿２７６４ Ｎｏｃａ＿４１４２
ＴＦＵ：Ｔｆｕ＿１５２０ Ｔｆｕ＿２３９４
ＦＲＡ：Ｆｒａｎｃｃｉ３＿３６８７
ＦＲＥ：Ｆｒａｎｅａｎ１＿１０４４ Ｆｒａｎｅａｎ１＿２７１１ Ｆｒａｎｅａｎ１＿２７２６ Ｆｒａｎｅａｎ１＿３９２９ Ｆｒａｎｅａｎ１＿４０３７ Ｆｒａｎｅａｎ１＿４５７７
ＦＡＬ：ＦＲＡＡＬ２５１４ ＦＲＡＡＬ２６１８ ＦＲＡＡＬ５９１０（ａｔｏＢ）
ＡＣＥ：Ａｃｅｌ＿０６２６ Ａｃｅｌ＿０６７２
ＳＥＮ：ＳＡＣＥ＿１１９２（ｍｍｇＡ） ＳＡＣＥ＿２７３６（ｆａｄＡ６） ＳＡＣＥ＿４０１１（ｃａｔＦ） ＳＡＣＥ＿６２３６（ｆａｄＡ４）
ＳＴＰ：Ｓｔｒｏｐ＿３６１０
ＳＡＱ：Ｓａｒｅ＿１３１６ Ｓａｒｅ＿３９９１
ＲＸＹ：Ｒｘｙｌ＿１５８２ Ｒｘｙｌ＿１８４２ Ｒｘｙｌ＿２３８９ Ｒｘｙｌ＿２５３０
ＦＮＵ：ＦＮ０４９５
ＢＧＡ：ＢＧ０１１０（ｆａｄＡ）
ＢＡＦ：ＢＡＰＫＯ＿０１１０（ｆａｄＡ）
ＬＩＬ：ＬＡ０４５７（ｔｈｉＬ１） ＬＡ０８２８（ｔｈｉＬ２） ＬＡ４１３９（ｆａｄＡ）
ＬＩＣ：ＬＩＣ１０３９６（ｐｈｂＡ）
ＬＢＪ：ＬＢＪ＿２８６２（ｐａａＪ−４）
ＬＢＬ：ＬＢＬ＿０２０９（ｐａａＪ−４）
ＳＹＮ：ｓｌｒ１９９３（ｐｈａＡ）
ＳＲＵ：ＳＲＵ＿１２１１（ａｔｏＢ） ＳＲＵ＿１５４７
ＣＨＵ：ＣＨＵ＿１９１０（ａｔｏＢ）
ＧＦＯ：ＧＦＯ＿１５０７（ａｔｏＢ）
ＦＪＯ：Ｆｊｏｈ＿４６１２
ＦＰＳ：ＦＰ０７７０ ＦＰ１５８６ ＦＰ１７２５
ＲＲＳ：ＲｏｓｅＲＳ＿３９１１ ＲｏｓｅＲＳ＿４３４８
ＲＣＡ：Ｒｃａｓ＿０７０２ Ｒｃａｓ＿３２０６
ＨＡＵ：Ｈａｕｒ＿０５２２
ＤＲＡ：ＤＲ＿１０７２ ＤＲ＿１４２８ ＤＲ＿１９６０ ＤＲ＿２４８０ ＤＲ＿Ａ００５３
ＤＧＥ：Ｄｇｅｏ＿０７５５ Ｄｇｅｏ＿１３０５ Ｄｇｅｏ＿１４４１ Ｄｇｅｏ＿１８８３
ＴＴＨ：ＴＴＣ０１９１ ＴＴＣ０３３０
ＴＴＪ：ＴＴＨＡ０５５９
ＴＭＥ：Ｔｍｅｌ＿１１３４
ＦＮＯ：Ｆｎｏｄ＿０３１４
ＰＭＯ：Ｐｍｏｂ＿０５１５
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ０８９６（ａｃａＢ３） ｒｒｎＡＣ２８１５（ａｃａ２） ｒｒｎＡＣ３４９７（ｙｑｅＦ） ｒｒｎＢ０２４０（ａｃａ１） ｒｒｎＢ０２４２（ａｃａＢ２） ｒｒｎＢ０３０９（ａｃａＢ１）
ＴＡＣ：Ｔａ０５８２
ＴＶＯ：ＴＶＮ０６４９
ＰＴＯ：ＰＴＯ１５０５
ＡＰＥ：ＡＰＥ＿２１０８
ＳＳＯ：ＳＳＯ２３７７（ａｃａＢ−４）
ＳＴＯ：ＳＴ０５１４
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿０９６３ Ｓａｃｉ＿１３６１（ａｃａＢ１）
ＭＳＥ：Ｍｓｅｄ＿０６５６
ＰＡＩ：ＰＡＥ１２２０
ＰＩＳ：Ｐｉｓｌ＿００２９ Ｐｉｓｌ＿１３０１
ＰＣＬ：Ｐｃａｌ＿０７８１
ＰＡＳ：Ｐａｒｓ＿０３０９ Ｐａｒｓ＿１０７１
ＣＭＡ：Ｃｍａｑ＿１９４１

例示的なＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：３１５７（ＨＭＧＣＳ１） ３１５８（ＨＭＧＣＳ２）
ＰＴＲ：４５７１６９（ＨＭＧＣＳ２） ４６１８９２（ＨＭＧＣＳ１）
ＭＣＣ：７０２５５３（ＨＭＧＣＳ１） ７１３５４１（ＨＭＧＣＳ２）
ＭＭＵ：１５３６０（Ｈｍｇｃｓ２） ２０８７１５（Ｈｍｇｃｓ１）
ＲＮＯ：２４４５０（Ｈｍｇｃｓ２） ２９６３７（Ｈｍｇｃｓ１）
ＣＦＡ：４７９３４４（ＨＭＧＣＳ１） ６０７９２３（ＨＭＧＣＳ２）
ＢＴＡ：４０７７６７（ＨＭＧＣＳ１）
ＳＳＣ：３９７６７３（ＣＨ２４２−３８Ｂ５．１）
ＧＧＡ：３９６３７９（ＨＭＧＣＳ１）
ＸＬＡ：３８００９１（ｈｍｇｃｓ１） ４４７２０４（ＭＧＣ８０８１６）
ＤＲＥ：３９４０６０（ｈｍｇｃｓ１）
ＳＰＵ：５７８２５９（ＬＯＣ５７８２５９）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ４３１１ （Ｈｍｇｓ）
ＣＥＬ：Ｆ２５Ｂ４．６
ＡＴＨ：ＡＴ４Ｇ１１８２０（ＢＡＰ１）
ＯＳＡ：４３３１４１８ ４３４７６１４
ＣＭＥ：ＣＭＭ１８９Ｃ
ＳＣＥ：ＹＭＬ１２６Ｃ（ＥＲＧ１３）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＤＬ３５６Ｃ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿８３０２０
ＣＡＬ：ＣａＯ１９＿７３１２（ＣａＯ１９．７３１２）
ＣＧＲ：ＣＡＧＬ０Ｈ０４０８１ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＡＣ４Ｆ８．１４ｃ（ｈｃｓ）
ＭＧＲ：ＭＧＧ＿０１０２６
ＡＮＩ：ＡＮ４９２３．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿３Ｇ１０６６０ ＡＦＵＡ＿８Ｇ０７２１０
ＡＯＲ：ＡＯ０９０００３０００６１１ ＡＯ０９００１００００４８７
ＣＮＥ：ＣＮＣ０５０８０ ＣＮＧ０２６７０
ＵＭＡ：ＵＭ０５３６２．１
ＥＣＵ：ＥＣＵ１０＿０５１０
ＤＤＩ：ＤＤＢＤＲＡＦＴ＿０２１７５２２ ＤＤＢ＿０２１９９２４（ｈｇｓＡ）
ＴＥＴ：ＴＴＨＥＲＭ＿００６９１１９０
ＴＢＲ：Ｔｂ９２７．８．６１１０
ＹＰＥ：ＹＰＯ１４５７
ＹＰＫ：ｙ２７１２（ｐｋｓＧ）
ＹＰＭ：ＹＰ＿１３４９（ｐｋｓＧ）
ＹＰＡ：ＹＰＡ＿０７５０
ＹＰＮ：ＹＰＮ＿２５２１
ＹＰＰ：ＹＰＤＳＦ＿１５１７
ＹＰＳ：ＹＰＴＢ１４７５
ＣＢＤ：ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿１９３１
ＴＣＸ：Ｔｃｒ＿１７１９
ＤＮＯ：ＤＮＯ＿０７９９
ＢＭＡ：ＢＭＡＡ１２１２
ＢＰＳ：ＢＰＳＳ１００２
ＢＰＭ：ＢＵＲＰＳ１７１０ｂ＿Ａ２６１３
ＢＰＬ：ＢＵＲＰＳ１１０６Ａ＿Ａ１３８４
ＢＰＤ：ＢＵＲＰＳ６６８＿Ａ１４７０
ＢＴＥ：ＢＴＨ＿ＩＩ１６７０
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿３９４８（ｔａｃ） ＭＸＡＮ＿４２６７（ｍｖａＳ）
ＢＳＵ：ＢＧ１０９２６（ｐｋｓＧ）
ＯＩＨ：ＯＢ２２４８
ＳＡＵ：ＳＡ２３３４（ｍｖａＳ）
ＳＡＶ：ＳＡＶ２５４６（ｍｖａＳ）
ＳＡＭ：ＭＷ２４６７（ｍｖａＳ）
ＳＡＲ：ＳＡＲ２６２６（ｍｖａＳ）
ＳＡＳ：ＳＡＳ２４３２
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ２５６１
ＳＡＢ：ＳＡＢ２４２０（ｍｖａＳ）
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿２４８４
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿０２８６０
ＳＡＪ：ＳａｕｒＪＨ９＿２５６９
ＳＡＨ：ＳａｕｒＪＨ１＿２６２２
ＳＥＰ：ＳＥ２１１０
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ２１２２
ＳＨＡ：ＳＨ０５０８（ｍｖａＳ）
ＳＳＰ：ＳＳＰ０３２４
ＬＭＯ：ｌｍｏ１４１５
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿１４３４（ｍｖａＳ）
ＬＩＮ：ｌｉｎ１４５４
ＬＷＥ：ｌｗｅ１４３２（ｍｖａＳ）
ＬＬＡ：Ｌ１３１８７（ｈｍｃＭ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿１６６６
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０９２９（ｈｍｃＭ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８８１（ｍｖａＳ．２）
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０６８７（ｍｖａＳ．１）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９４２（ｍｖａＳ２）
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０６００（ｍｖａＳ．２）
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５３
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４５（ｍｖａＳ１）
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７９（ｍｖａＳ１）
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５９（ｍｖａＳ１）
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７４３（ｍｖａＳ１）
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５１１２１（ｍｖａＳ）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０７０４
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０６６７（ｍｖａＳ．１）
ＳＰＮ：ＳＰ＿１７２７
ＳＰＲ：ｓｐｒ１５７１（ｍｖａＳ）
ＳＰＤ：ＳＰＤ＿１５３７（ｍｖａＳ）
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３１６
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３８６
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿１３４７
ＳＭＵ：ＳＭＵ．９４３ｃ
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５７７（ｍｖａＳ）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５７７（ｍｖａＳ）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０６２１
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３８（ｍｖａＳ）
ＳＳＵ：ＳＳＵ０５＿１６４１
ＳＳＶ：ＳＳＵ９８＿１６５２
ＳＧＯ：ＳＧＯ＿０２４４
ＬＰＬ：ｌｐ＿２０６７（ｍｖａＳ）
ＬＪＯ：ＬＪ１６０７
ＬＡＣ：ＬＢＡ０６２８（ｈｍｃＳ）
ＬＳＡ：ＬＳＡ１４８４（ｍｖａＳ）
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０５２６
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０８８１（ｍｖａＳ）
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０８０６
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿１３６３
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１７８５
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１３７２
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿０６７６
ＰＰＥ：ＰＥＰＥ＿０８６８
ＥＦＡ：ＥＦ１３６３
ＯＯＥ：ＯＥＯＥ＿０９６８
ＬＭＥ：ＬＥＵＭ＿１１８４
ＮＦＡ：ｎｆａ２２１２０
ＳＥＮ：ＳＡＣＥ＿４５７０（ｐｋｓＧ）
ＢＢＵ：ＢＢ０６８３
ＢＧＡ：ＢＧ０７０６
ＢＡＦ：ＢＡＰＫＯ＿０７２７
ＦＪＯ：Ｆｊｏｈ＿０６７８
ＨＡＬ：ＶＮＧ１６１５Ｇ（ｍｖａＢ）
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ１７４０（ｍｖａＳ）
ＨＷＡ：ＨＱ２８６８Ａ（ｍｖａＢ）
ＮＰＨ：ＮＰ２６０８Ａ（ｍｖａＢ＿１） ＮＰ４８３６Ａ（ｍｖａＢ＿２）

例示的なヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：３１５６（ＨＭＧＣＲ）
ＰＴＲ：４７１５１６（ＨＭＧＣＲ）
ＭＣＣ：７０５４７９（ＨＭＧＣＲ）
ＭＭＵ：１５３５７（Ｈｍｇｃｒ）
ＲＮＯ：２５６７５（Ｈｍｇｃｒ）
ＣＦＡ：４７９１８２（ＨＭＧＣＲ）
ＢＴＡ：４０７１５９（ＨＭＧＣＲ）
ＧＧＡ：３９５１４５（ＲＣＪＭＢ０４＿１４ｍ２４）
ＳＰＵ：３７３３５５（ＬＯＣ３７３３５５）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ１０３６７（Ｈｍｇｃｒ）
ＣＥＬ：Ｆ０８Ｆ８．２
ＯＳＡ：４３４７４４３
ＳＣＥ：ＹＬＲ４５０Ｗ（ＨＭＧ２） ＹＭＬ０７５Ｃ（ＨＭＧ１）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＥＲ１５２Ｗ
ＣＧＲ：ＣＡＧＬＯＬ１１５０６ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＣＣ１６２．０９ｃ（ｈｍｇ１）
ＡＮＩ：ＡＮ３８１７．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿１Ｇ１１２３０ ＡＦＵＡ＿２Ｇ０３７００
ＡＯＲ：ＡＯ０９０１０３０００３１１ ＡＯ０９０１２００００２１７
ＣＮＥ：ＣＮＦ０４８３０
ＵＭＡ：ＵＭ０３０１４．１
ＥＣＵ：ＥＣＵ１０＿１７２０
ＤＤＩ：ＤＤＢ＿０１９１１２５（ｈｍｇＡ） ＤＤＢ＿０２１５３５７（ｈｍｇＢ）
ＴＢＲ：Ｔｂ９２７．６．４５４０
ＴＣＲ：５０６８３１．４０ ５０９１６７．２０
ＬＭＡ：ＬｍｊＦ３０．３１９０
ＶＣＨ：ＶＣＡ０７２３
ＶＣＯ：ＶＣ０３９５＿０６６２
ＶＶＵ：ＶＶ２＿０１１７
ＶＶＹ：ＶＶＡ０６２５
ＶＰＡ：ＶＰＡ０９６８
ＶＦＩ：ＶＦＡ０８４１
ＰＡＴ：Ｐａｔｌ＿０４２７
ＣＢＵ：ＣＢＵ＿００３０ ＣＢＵ＿０６１０
ＣＢＤ：ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿０１５１ ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿０６２２（ｈｍｇＡ）
ＴＣＸ：Ｔｃｒ＿１７１７
ＤＮＯ：ＤＮＯ＿０７９７
ＣＶＩ：ＣＶ＿１８０６
ＳＵＳ：Ａｃｉｄ＿５７２８ Ａｃｉｄ＿６１３２
ＳＡＵ：ＳＡ２３３３（ｍｖａＡ）
ＳＡＶ：ＳＡＶ２５４５（ｍｖａＡ）
ＳＡＭ：ＭＷ２４６６（ｍｖａＡ）
ＳＡＢ：ＳＡＢ２４１９ｃ（ｍｖａＡ）
ＳＥＰ：ＳＥ２１０９
ＬＷＥ：ｌｗｅ０８１９（ｍｖａＡ）
ＬＬＡ：Ｌ１０４３３（ｍｖａＡ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿１６６４
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０９３１（ｍｖａＡ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８８０（ｍｖａＳ．１）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９４１（ｍｖａＳ１）
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０５９９（ｍｖａＳ．１）
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５４
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４４
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７８
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５８
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７４２
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０７０３
ＳＰＮ：ＳＰ＿１７２６
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３１７
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３８７
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５７６（ｍｖａＡ）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５７６（ｍｖａＡ）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０６２０
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３７（ｍｖａＡ）
ＬＰＬ：ｌｐ＿０４４７（ｍｖａＡ）
ＬＪＯ：ＬＪ１６０８
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０２２４
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿０４５０
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１３７３
ＥＦＡ：ＥＦ１３６４
ＮＦＡ：ｎｆａ２２１１０
ＢＧＡ：ＢＧ０７０８（ｍｖａＡ）
ＳＲＵ：ＳＲＵ＿２４２２
ＦＰＳ：ＦＰ２３４１
ＭＭＰ：ＭＭＰ００８７（ｈｍｇＡ）
ＭＭＱ：ＭｍａｒＣ５＿１５８９
ＭＡＣ：ＭＡ３０７３（ｈｍｇＡ）
ＭＢＡ：Ｍｂａｒ＿Ａ１９７２
ＭＭＡ：ＭＭ＿０３３５
ＭＢＵ：Ｍｂｕｒ＿１０９８
ＭＨＵ：Ｍｈｕｎ＿３００４
ＭＥＭ：Ｍｅｍａｒ＿２３６５
ＭＢＮ：Ｍｂｏｏ＿０１３７
ＭＴＨ：ＭＴＨ５６２
ＭＳＴ：Ｍｓｐ＿０５８４（ｈｍｇＡ）
ＭＳＩ：Ｍｓｍ＿０２２７
ＭＫＡ：ＭＫ０３５５（ＨＭＧ１）
ＡＦＵ：ＡＦ１７３６（ｍｖａＡ）
ＨＡＬ：ＶＮＧ１８７５Ｇ（ｍｖａＡ）
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ３４１２（ｍｖａＡ）
ＨＷＡ：ＨＱ３２１５Ａ（ｈｍｇＲ）
ＮＰＨ：ＮＰ０３６８Ａ（ｍｖａＡ＿２） ＮＰ２４２２Ａ（ｍｖａＡ＿１）
ＴＡＣ：Ｔａ０４０６ｍ
ＴＶＯ：ＴＶＮ１１６８
ＰＴＯ：ＰＴＯ１１４３
ＰＡＢ：ＰＡＢ２１０６（ｍｖａＡ）
ＰＦＵ：ＰＦ１８４８
ＴＫＯ：ＴＫ０９１４
ＲＣＩ：ＲＣＩＸ１０２７（ｈｍｇＡ） ＲＣＩＸ３７６（ｈｍｇＡ）
ＡＰＥ：ＡＰＥ＿１８６９
ＩＨＯ：Ｉｇｎｉ＿０４７６
ＨＢＵ：Ｈｂｕｔ＿１５３１
ＳＳＯ：ＳＳＯ０５３１
ＳＴＯ：ＳＴ１３５２
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿１３５９
ＰＡＩ：ＰＡＥ２１８２
ＰＩＳ：Ｐｉｓｌ＿０８１４
ＰＣＬ：Ｐｃａｌ＿１０８５
ＰＡＳ：Ｐａｒｓ＿０７９６

例示的なメバロン酸キナーゼ核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：４５９８（ＭＶＫ）
ＭＣＣ：７０７６４５（ＭＶＫ）
ＭＭＵ：１７８５５（Ｍｖｋ）
ＲＮＯ：８１７２７（Ｍｖｋ）
ＣＦＡ：４８６３０９（ＭＶＫ）
ＢＴＡ：５０５７９２（ＭＶＫ） ＾
ＧＧＡ：７６８５５５（ＭＶＫ）
ＤＲＥ：４９２４７７（ｚｇｃ：１０３４７３）
ＳＰＵ：５８５７８５（ＬＯＣ５８５７８５）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ３３６７１
ＯＳＡ：４３４８３３１
ＳＣＥ：ＹＭＲ２０８Ｗ（ＥＲＧ１２）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＥＲ３３５Ｗ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿４０７４２（ＥＲＧ１２）
ＣＧＲ：ＣＡＧＬ０Ｆ０３８６１ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＡＣ１３Ｇ６．１１ｃ
ＭＧＲ：ＭＧＧ＿０６９４６
ＡＮＩ：ＡＮ３８６９．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿４Ｇ０７７８０
ＡＯＲ：ＡＯ０９００２３０００７９３
ＣＮＥ：ＣＮＫ０１７４０
ＥＣＵ：ＥＣＵ０９＿１７８０
ＤＤＩ：ＤＤＢＤＲＡＦＴ＿０１６８６２１
ＴＥＴ：ＴＴＨＥＲＭ＿００６３７６８０
ＴＢＲ：Ｔｂ９２７．４．４０７０
ＴＣＲ：４３６５２１．９ ５０９２３７．１０
ＬＭＡ：ＬｍｊＦ３１．０５６０
ＣＢＵ：ＣＢＵ＿０６０８ ＣＢＵ＿０６０９
ＣＢＤ：ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿０６２０（ｍｖｋ）
ＬＰＮ：ｌｐｇ２０３９
ＬＰＦ：ｌｐｌ２０１７
ＬＰＰ：ｌｐｐ２０２２
ＢＢＡ：Ｂｄ１０２７（ｌｍｂＰ） Ｂｄ１６３０（ｍｖｋ）
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿５０１９（ｍｖｋ）
ＯＩＨ：ＯＢ０２２５
ＳＡＵ：ＳＡ０５４７（ｍｖａＫ１）
ＳＡＶ：ＳＡＶ０５９０（ｍｖａＫ１）
ＳＡＭ：ＭＷ０５４５（ｍｖａＫ１）
ＳＡＲ：ＳＡＲ０５９６（ｍｖａＫ１）
ＳＡＳ：ＳＡＳ０５４９
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ０６３６（ｍｖｋ）
ＳＡＢ：ＳＡＢ０５４０（ｍｖａＫ１）
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿０５７２（ｍｖｋ）
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿００５７７
ＳＥＰ：ＳＥ０３６１
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ０２３８（ｍｖｋ）
ＳＨＡ：ＳＨ２４０２（ｍｖａＫ１）
ＳＳＰ：ＳＳＰ２１２２
ＬＭＯ：ｌｍｏ００１０
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿００１１
ＬＩＮ：ｌｉｎ００１０
ＬＷＥ：ｌｗｅ００１１（ｍｖｋ）
ＬＬＡ：Ｌ７８６６（ｙｅａＧ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿０４５４
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０４２５（ｍｖｋ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８７６（ｍｖａＫ１）
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０６８２（ｍｖａＫ１）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９３７（ｍｖａＫ１）
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０５９５（ｍｖａＫ１）
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５８
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４０（ｍｖａＫ１）
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７４（ｍｖａＫ１）
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５３（ｍｖａＫ１）
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７３７（ｍｖａＫ１）
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５１１２６（ｍｖａＫ１）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０６９９
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０６６２（ｍｖａＫ１）
ＳＰＮ：ＳＰ＿０３８１
ＳＰＲ：ｓｐｒ０３３８（ｍｖｋ）
ＳＰＤ：ＳＰＤ＿０３４６（ｍｖｋ）
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３２６
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３９６
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿１３５７（ｍｖｋ）
ＳＭＵ：ＳＭＵ．１８１
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５５９（ｍｖａＫ１）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５５９（ｍｖａＫ１）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０５９８
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３３（ｍｖａＫ１）
ＳＳＵ：ＳＳＵ０５＿０２８９
ＳＳＶ：ＳＳＵ９８＿０２８５
ＳＧＯ：ＳＧＯ＿０２３９（ｍｖｋ）
ＬＰＬ：ｌｐ＿１７３５（ｍｖａＫ１）
ＬＪＯ：ＬＪ１２０５
ＬＡＣ：ＬＢＡ１１６７（ｍｖａＫ）
ＬＳＡ：ＬＳＡ０９０８（ｍｖａＫ１）
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０６８５（ｅＲＧ）
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０９９９（ｍｖｋ）
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０９０６
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿０８５８
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１４９１
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１０３３
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿０９１５
ＰＰＥ：ＰＥＰＥ＿０９２７
ＥＦＡ：ＥＦ０９０４（ｍｖｋ）
ＯＯＥ：ＯＥＯＥ＿１１００
ＬＭＥ：ＬＥＵＭ＿１３８５
ＮＦＡ：ｎｆａ２２０７０
ＢＧＡ：ＢＧ０７１１
ＢＡＦ：ＢＡＰＫＯ＿０７３２
ＦＰＳ：ＦＰ０３１３
ＭＭＰ：ＭＭＰ１３３５
ＭＡＥ：Ｍａｅｏ＿０７７５
ＭＡＣ：ＭＡ０６０２（ｍｖｋ）
ＭＢＡ：Ｍｂａｒ＿Ａ１４２１
ＭＭＡ：ＭＭ＿１７６２
ＭＢＵ：Ｍｂｕｒ＿２３９５
ＭＨＵ：Ｍｈｕｎ＿２８９０
ＭＥＭ：Ｍｅｍａｒ＿１８１２
ＭＢＮ：Ｍｂｏｏ＿２２１３
ＭＳＴ：Ｍｓｐ＿０８５８（ｍｖｋ）
ＭＳＩ：Ｍｓｍ＿１４３９
ＭＫＡ：ＭＫ０９９３（ＥＲＧ１２）
ＨＡＬ：ＶＮＧ１１４５Ｇ（ｍｖｋ）
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ００７７（ｍｖｋ）
ＨＷＡ：ＨＱ２９２５Ａ（ｍｖｋ）
ＮＰＨ：ＮＰ２８５０Ａ（ｍｖｋ）
ＰＴＯ：ＰＴＯ１３５２
ＰＨＯ：ＰＨ１６２５
ＰＡＢ：ＰＡＢ０３７２（ｍｖｋ）
ＰＦＵ：ＰＦ１６３７（ｍｖｋ）
ＴＫＯ：ＴＫ１４７４
ＲＣＩ：ＬＲＣ３９９（ｍｖｋ）
ＡＰＥ：ＡＰＥ＿２４３９
ＨＢＵ：Ｈｂｕｔ＿０８７７
ＳＳＯ：ＳＳＯ０３８３
ＳＴＯ：ＳＴ２１８５
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿２３６５（ｍｖｋ）
ＭＳＥ：Ｍｓｅｄ＿１６０２
ＰＡＩ：ＰＡＥ３１０８
ＰＩＳ：Ｐｉｓｌ＿０４６７
ＰＣＬ：Ｐｃａｌ＿１８３５

例示的なホスホメバロン酸キナーゼ核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：１０６５４（ＰＭＶＫ）
ＰＴＲ：４５７３５０（ＰＭＶＫ）
ＭＣＣ：７１７０１４（ＰＭＶＫ）
ＭＭＵ：６８６０３（Ｐｍｖｋ）
ＣＦＡ：６１２２５１（ＰＭＶＫ）
ＢＴＡ：５１３５３３（ＰＭＶＫ）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ１０２６８
ＡＴＨ：ＡＴ１Ｇ３１９１０
ＯＳＡ：４３３２２７５
ＳＣＥ：ＹＭＲ２２０Ｗ（ＥＲＧ８）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＥＲ３５４Ｗ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿５２２５７（ＥＲＧ８）
ＣＧＲ：ＣＡＧＬ０Ｆ０３９９３ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＡＣ３４３．０１ｃ
ＭＧＲ：ＭＧＧ＿０５８１２
ＡＮＩ：ＡＮ２３１１．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿５Ｇ１０６８０
ＡＯＲ：ＡＯ０９００１００００４７１
ＣＮＥ：ＣＮＭ００１００
ＵＭＡ：ＵＭ００７６０．１
ＤＤＩ：ＤＤＢＤＲＡＦＴ＿０１８４５１２
ＴＢＲ：Ｔｂ０９．１６０．３６９０
ＴＣＲ：５０７９１３．２０ ５０８２７７．１４０
ＬＭＡ：ＬｍｊＦ１５．１４６０
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿５０１７
ＯＩＨ：ＯＢ０２２７
ＳＡＵ：ＳＡ０５４９（ｍｖａＫ２）
ＳＡＶ：ＳＡＶ０５９２（ｍｖａＫ２）
ＳＡＭ：ＭＷ０５４７（ｍｖａＫ２）
ＳＡＲ：ＳＡＲ０５９８（ｍｖａＫ２）
ＳＡＳ：ＳＡＳ０５５１
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ０６３８
ＳＡＢ：ＳＡＢ０５４２（ｍｖａＫ２）
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿０５７４
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿００５７９
ＳＡＪ：ＳａｕｒＪＨ９＿０６１５
ＳＥＰ：ＳＥ０３６３
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ０２４０
ＳＨＡ：ＳＨ２４００（ｍｖａＫ２）
ＳＳＰ：ＳＳＰ２１２０
ＬＭＯ：ｌｍｏ００１２
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿００１３
ＬＩＮ：ｌｉｎ００１２
ＬＷＥ：ｌｗｅ００１３
ＬＬＡ：Ｌ１００１４（ｙｅｂＡ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿０４５６
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０４２７
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８７８（ｍｖａＫ２）
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０６８４（ｍｖａＫ２）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９３９
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０５９７（ｍｖａＫ２）
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５６
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４２（ｍｖａＫ２）
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７６（ｍｖａＫ２）
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５５（ｍｖａＫ２）
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７３９（ｍｖａＫ２）
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５１１２４（ｍｖａＫ２）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０７０１
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０６６４（ｍｖａＫ２）
ＳＰＮ：ＳＰ＿０３８３
ＳＰＲ：ｓｐｒ０３４０（ｍｖａＫ２）
ＳＰＤ：ＳＰＤ＿０３４８（ｍｖａＫ２）
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３２４
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３９４
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿１３５５
ＳＭＵ：ＳＭＵ．９３８
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５６１（ｍｖａＫ２）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５６１（ｍｖａＫ２）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０６００
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３５（ｍｖａＫ２）
ＳＳＵ：ＳＳＵ０５＿０２９１
ＳＳＶ：ＳＳＵ９８＿０２８７
ＳＧＯ：ＳＧＯ＿０２４１
ＬＰＬ：ｌｐ＿１７３３（ｍｖａＫ２）
ＬＪＯ：ＬＪ１２０７
ＬＡＣ：ＬＢＡ１１６９
ＬＳＡ：ＬＳＡ０９０６（ｍｖａＫ２）
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０６８３
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０９９７（ｍｖａＫ）
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０９０４
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿０８６０
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１０９２
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１０３５
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿０９１３
ＰＰＥ：ＰＥＰＥ＿０９２５
ＥＦＡ：ＥＦ０９０２
ＮＦＡ：ｎｆａ２２０９０
ＢＧＡ：ＢＧ０７１０
ＢＡＦ：ＢＡＰＫＯ＿０７３１
ＮＰＨ：ＮＰ２８５２Ａ
ＳＳＯ：ＳＳＯ２９８８
ＳＴＯ：ＳＴ０９７８
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿１２４４

例示的なジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：４５９７（ＭＶＤ）
ＰＴＲ：４６８０６９（ＭＶＤ）
ＭＣＣ：６９６８６５（ＭＶＤ）
ＭＭＵ：１９２１５６（Ｍｖｄ）
ＲＮＯ：８１７２６（Ｍｖｄ）
ＣＦＡ：４８９６６３（ＭＶＤ）
ＧＧＡ：４２５３５９（ＭＶＤ）
ＤＭＥ：Ｄｍｅｌ＿ＣＧ８２３９
ＳＣＥ：ＹＮＲ０４３Ｗ（ＭＶＤ１）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＧＬ２３２Ｃ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿９０７５２
ＣＧＲ：ＣＡＧＬ０Ｃ０３６３０ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＡＣ２４Ｃ９．０３
ＭＧＲ：ＭＧＧ＿０９７５０
ＡＮＩ：ＡＮ４４１４．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿４Ｇ０７１３０
ＡＯＲ：ＡＯ０９００２３０００８６２
ＣＮＥ：ＣＮＬ０４９５０
ＵＭＡ：ＵＭ０５１７９．１
ＤＤＩ：ＤＤＢＤＲＡＦＴ＿０２１８０５８
ＴＥＴ：ＴＴＨＥＲＭ＿００８４９２００
ＴＢＲ：Ｔｂ１０．０５．００１０ Ｔｂ１０．６１．２７４５
ＴＣＲ：５０７９９３．３３０ ５１１２８１．４０
ＬＭＡ：ＬｍｊＦ１８．００２０
ＣＢＵ：ＣＢＵ＿０６０７（ｍｖａＤ）
ＣＢＤ：ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿０６１９（ｍｖａＤ）
ＬＰＮ：ｌｐｇ２０４０
ＬＰＦ：ｌｐｌ２０１８
ＬＰＰ：ｌｐｐ２０２３
ＴＣＸ：Ｔｃｒ＿１７３４
ＤＮＯ：ＤＮＯ＿０５０４（ｍｖａＤ）
ＢＢＡ：Ｂｄ１６２９
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿５０１８（ｍｖａＤ）
ＯＩＨ：ＯＢ０２２６
ＳＡＵ：ＳＡ０５４８（ｍｖａＤ）
ＳＡＶ：ＳＡＶ０５９１（ｍｖａＤ）
ＳＡＭ：ＭＷ０５４６（ｍｖａＤ）
ＳＡＲ：ＳＡＲ０５９７（ｍｖａＤ）
ＳＡＳ：ＳＡＳ０５５０
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ０６３７（ｍｖａＤ）
ＳＡＢ：ＳＡＢ０５４１（ｍｖａＤ）
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿０５７３（ｍｖａＤ）
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿００５７８
ＳＡＪ：ＳａｕｒＪＨ９＿０６１４
ＳＡＨ：ＳａｕｒＪＨ１＿０６２９
ＳＥＰ：ＳＥ０３６２
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ０２３９（ｍｖａＤ）
ＳＨＡ：ＳＨ２４０１（ｍｖａＤ）
ＳＳＰ：ＳＳＰ２１２１
ＬＭＯ：ｌｍｏ００１１
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿００１２（ｍｖａＤ）
ＬＩＮ：ｌｉｎ００１１
ＬＷＥ：ｌｗｅ００１２（ｍｖａＤ）
ＬＬＡ：Ｌ９０８９（ｙｅａＨ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿０４５５
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０４２６（ｍｖａＤ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８７７（ｍｖａＤ）
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０６８３（ｍｖａＤ）
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９３８（ｍｖｄ）
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０５９６（ｍｖａＤ）
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５７
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４１（ｍｖａＤ）
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７５（ｍｖａＤ）
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５４（ｍｖａＤ）
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７３８（ｍｖａＤ）
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５１１２５（ｍｖａＤ）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０７００
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０６６３（ｍｖａＤ）
ＳＰＮ：ＳＰ＿０３８２
ＳＰＲ：ｓｐｒ０３３９（ｍｖｄ１）
ＳＰＤ：ＳＰＤ＿０３４７（ｍｖａＤ）
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３２５（ｍｖａＤ）
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３９５
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿１３５６（ｍｖａＤ）
ＳＭＵ：ＳＭＵ．９３７
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５６０（ｍｖａＤ）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５６０（ｍｖａＤ）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０５９９
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３４（ｍｖａＤ）
ＳＳＵ：ＳＳＵ０５＿０２９０
ＳＳＶ：ＳＳＵ９８＿０２８６
ＳＧＯ：ＳＧＯ＿０２４０（ｍｖａＤ）
ＬＰＬ：ｌｐ＿１７３４（ｍｖａＤ）
ＬＪＯ：ＬＪ１２０６
ＬＡＣ：ＬＢＡ１１６８（ｍｖａＤ）
ＬＳＡ：ＬＳＡ０９０７（ｍｖａＤ）
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０６８４
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０９９８（ｍｖａＤ）
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０９０５
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿０８５９
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１４９２
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１０３４
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿０９１４
ＰＰＥ：ＰＥＰＥ＿０９２６
ＥＦＡ：ＥＦ０９０３（ｍｖａＤ）
ＬＭＥ：ＬＥＵＭ＿１３８６
ＮＦＡ：ｎｆａ２２０８０
ＢＢＵ：ＢＢ０６８６
ＢＧＡ：ＢＧ０７０９
ＢＡＦ：ＢＡＰＫＯ＿０７３０
ＧＦＯ：ＧＦＯ＿３６３２
ＦＰＳ：ＦＰ０３１０（ｍｖａＤ）
ＨＡＵ：Ｈａｕｒ＿１６１２
ＨＡＬ：ＶＮＧ０５９３Ｇ（ｄｍｄ）
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ１４８９（ｄｍｄ）
ＨＷＡ：ＨＱ１５２５Ａ（ｍｖａＤ）
ＮＰＨ：ＮＰ１５８０Ａ（ｍｖａＤ）
ＰＴＯ：ＰＴＯ０４７８ ＰＴＯ１３５６
ＳＳＯ：ＳＳＯ２９８９
ＳＴＯ：ＳＴ０９７７
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿１２４５（ｍｖｄ）
ＭＳＥ：Ｍｓｅｄ＿１５７６

例示的なイソペンテニル・リン酸キナーゼ（ＩＰＫ）核酸およびポリペプチド
メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ） ｇｉ ２６２１０８２
メタノコックス・ジャンナスチイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ） ＤＳＭ ２６６１ ｇｉ １５９０８４２ ；
メタノカルドコックス・ジャンナスチイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ） ｇｉ １５９０８４２
メタノサーモバクター・サーマウトトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ） ｇｉ ２６２１０８２
ピクロフィラス・トリデュス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ ｔｏｒｒｉｄｕｓ） ＤＳＭ９７９０（ＩＧ−５７） ｇｉ ４８４７７５６９
ピロコックス・アビシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ） ｇｉ １４５２０７５８
ピロコックス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ） ＯＴ３ ｇｉ ３２５８０５２
アーケイオグロブス・ファルギデュス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ） ＤＳＭ４３０４ ｇｉ ２６４８２３１

例示的なイソペンテニル二リン酸デルタ・イソメラーゼ（ＩＤＩ）核酸およびポリペプチド
ＨＳＡ：３４２２（ＩＤＩ１） ９１７３４（ＩＤＩ２）
ＰＴＲ：４５０２６２（ＩＤＩ２） ４５０２６３（ＩＤＩ１）
ＭＣＣ：７１００５２（ＬＯＣ７１００５２） ７２１７３０（ＬＯＣ７２１７３０）
ＭＭＵ：３１９５５４（Ｉｄｉ１）
ＲＮＯ：８９７８４（Ｉｄｉ１）
ＧＧＡ：４２０４５９（ＩＤＩ１）
ＸＬＡ：４９４６７１（ＬＯＣ４９４６７１）
ＸＴＲ：４９６７８３（ｉｄｉ２）
ＳＰＵ：５８６１８４（ＬＯＣ５８６１８４）
ＣＥＬ：Ｋ０６Ｈ７．９（ｉｄｉ−１）
ＡＴＨ：ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＩＰＰ２）
ＯＳＡ：４３３８７９１ ４３４３５２３
ＣＭＥ：ＣＭＢ０６２Ｃ
ＳＣＥ：ＹＰＬ１１７Ｃ（ＩＤＩ１）
ＡＧＯ：ＡＧＯＳ＿ＡＤＬ２６８Ｃ
ＰＩＣ：ＰＩＣＳＴ＿６８９９０（ＩＤＩ１）
ＣＧＲ：ＣＡＧＬ０Ｊ０６９５２ｇ
ＳＰＯ：ＳＰＢＣ１０６．１５（ｉｄｉ１）
ＡＮＩ：ＡＮ０５７９．２
ＡＦＭ：ＡＦＵＡ＿６Ｇ１１１６０
ＡＯＲ：ＡＯ０９００２３０００５００
ＣＮＥ：ＣＮＡ０２５５０
ＵＭＡ：ＵＭ０４８３８．１
ＥＣＵ：ＥＣＵ０２＿０２３０
ＤＤＩ：ＤＤＢ＿０１９１３４２（ｉｐｉ）
ＴＥＴ：ＴＴＨＥＲＭ＿００２３７２８０ ＴＴＨＥＲＭ＿００４３８８６０
ＴＢＲ：ＴｂＯ９．２１１．０７００
ＴＣＲ：４０８７９９．１９ ５１０４３１．１０
ＬＭＡ：ＬｍｊＦ３５．５３３０
ＥＨＩ：４６．ｔ０００２５
ＥＣＯ：ｂ２８８９（ｉｄｉ）
ＥＣＪ：ＪＷ２８５７（ｉｄｉ）
ＥＣＥ：Ｚ４２２７
ＥＣＳ：ＥＣｓ３７６１
ＥＣＣ：ｃ３４６７
ＥＣＩ：ＵＴＩ８９＿Ｃ３２７４
ＥＣＰ：ＥＣＰ＿２８８２
ＥＣＶ：ＡＰＥＣＯ１＿３６３８
ＥＣＷ：ＥｃＥ２４３７７Ａ＿３２１５（ｉｄｉ）
ＥＣＸ：ＥｃＨＳ＿Ａ３０４８
ＳＴＹ：ＳＴＹ３１９５
ＳＴＴ：ｔ２９５７
ＳＰＴ：ＳＰＡ２９０７（ｉｄｉ）
ＳＥＣ：ＳＣ２９７９（ｉｄｉ）
ＳＴＭ：ＳＴＭ３０３９（ｉｄｉ）
ＳＦＬ：ＳＦ２８７５（ｉｄｉ）
ＳＦＸ：Ｓ３０７４
ＳＦＶ：ＳＦＶ＿２９３７
ＳＳＮ：ＳＳＯＮ＿３０４２ ＳＳＯＮ＿３４８９（ｙｈｆＫ）
ＳＢＯ：ＳＢＯ＿３１０３
ＳＤＹ：ＳＤＹ＿３１９３
ＥＣＡ：ＥＣＡ２７８９
ＰＬＵ：ｐｌｕ３９８７
ＥＮＴ：Ｅｎｔ６３８＿３３０７
ＳＰＥ：Ｓｐｒｏ＿２２０１
ＶＰＡ：ＶＰＡ０２７８
ＶＦＩ：ＶＦ０４０３
ＰＰＲ：ＰＢＰＲＡ０４６９（ｍｖａＤ）
ＰＥＮ：ＰＳＥＥＮ４８５０
ＣＢＵ：ＣＢＵ＿０６０７（ｍｖａＤ）
ＣＢＤ：ＣＯＸＢＵ７Ｅ９１２＿０６１９（ｍｖａＤ）
ＬＰＮ：ｌｐｇ２０５１
ＬＰＦ：ｌｐｌ２０２９
ＬＰＰ：ｌｐｐ２０３４
ＴＣＸ：Ｔｃｒ＿１７１８
ＨＨＡ：Ｈｈａｌ＿１６２３
ＤＮＯ：ＤＮＯ＿０７９８
ＥＢＡ：ｅｂＡ５６７８ ｐ２Ａ１４３
ＤＶＵ：ＤＶＵ１６７９（ｉｄｉ）
ＤＤＥ：Ｄｄｅ＿１９９１
ＬＩＰ：ＬＩ１１３４
ＢＢＡ：Ｂｄ１６２６
ＡＦＷ：Ａｎａｅ１０９＿４０８２
ＭＸＡ：ＭＸＡＮ＿５０２１（ｆｎｉ）
ＲＰＲ：ＲＰ４５２
ＲＴＹ：ＲＴ０４３９（ｉｄｉ）
ＲＣＯ：ＲＣ０７４４
ＲＦＥ：ＲＦ＿０７８５（ｆｎｉ）
ＲＢＥ：ＲＢＥ＿０７３１（ｆｎｉ）
ＲＡＫ：Ａ１Ｃ＿０４１９０
ＲＢＯ：Ａ１Ｉ＿０４７５５
ＲＣＭ：Ａ１Ｅ＿０２５５５
ＲＲＩ：Ａ１Ｇ＿０４１９５
ＭＬＯ：ｍｌｒ６３７１
ＲＥＴ：ＲＨＥ＿ＰＤ００２４５（ｙｐｄ０００４６）
ＸＡＵ：Ｘａｕｔ＿４１３４
ＳＩＬ：ＳＰＯ０１３１
ＳＩＴ：ＴＭ１０４０＿３４４２
ＲＳＰ：ＲＳＰ＿０２７６
ＲＳＨ：Ｒｓｐｈ１７０２９＿１９１９
ＲＳＱ：Ｒｓｐｈ１７０２５＿１０１９
ＪＡＮ：Ｊａｎｎ＿０１６８
ＲＤＥ：ＲＤ１＿０１４７（ｉｄｉ）
ＤＳＨ：Ｄｓｈｉ＿３５２７
ＢＳＵ：ＢＧ１１４４０（ｙｐｇＡ）
ＢＡＮ：ＢＡ１５２０
ＢＡＲ：ＧＢＡＡ１５２０
ＢＡＡ：ＢＡ＿２０４１
ＢＡＴ：ＢＡＳ１４０９
ＢＣＥ：ＢＣ１４９９
ＢＣＡ：ＢＣＥ＿１６２６
ＢＣＺ：ＢＣＺＫ１３８０（ｆｎｉ）
ＢＣＹ：Ｂｃｅｒ９８＿１２２２
ＢＴＫ：ＢＴ９７２７＿１３８１（ｆｎｉ）
ＢＴＬ：ＢＡＬＨ＿１３５４
ＢＬＩ：ＢＬ０２２１７（ｆｎｉ）
ＢＬＤ：ＢＬｉ０２４２６
ＢＡＹ：ＲＢＡＭ＿０２１０２０（ｆｎｉ）
ＢＰＵ：ＢＰＵＭ＿２０２０（ｆｎｉ）
ＯＩＨ：ＯＢ０５３７
ＳＡＵ：ＳＡ２１３６（ｆｎｉ）
ＳＡＶ：ＳＡＶ２３４６（ｆｎｉ）
ＳＡＭ：ＭＷ２２６７（ｆｎｉ）
ＳＡＲ：ＳＡＲ２４３１（ｆｎｉ）
ＳＡＳ：ＳＡＳ２２３７
ＳＡＣ：ＳＡＣＯＬ２３４１（ｆｎｉ）
ＳＡＢ：ＳＡＢ２２２５ｃ（ｆｎｉ）
ＳＡＡ：ＳＡＵＳＡ３００＿２２９２（ｆｎｉ）
ＳＡＯ：ＳＡＯＵＨＳＣ＿０２６２３
ＳＥＰ：ＳＥ１９２５
ＳＥＲ：ＳＥＲＰ１９３７（ｆｎｉ−２）
ＳＨＡ：ＳＨ０７１２（ｆｎｉ）
ＳＳＰ：ＳＳＰ０５５６
ＬＭＯ：ｌｍｏ１３８３
ＬＭＦ：ＬＭＯｆ２３６５＿１４０２（ｆｎｉ）
ＬＩＮ：ｌｉｎ１４２０
ＬＷＥ：ｌｗｅ１３９９（ｆｎｉ）
ＬＬＡ：Ｌ１１０８３（ｙｅｂＢ）
ＬＬＣ：ＬＡＣＲ＿０４５７
ＬＬＭ：ｌｌｍｇ＿０４２８（ｆｎｉ）
ＳＰＹ：ＳＰｙ＿０８７９
ＳＰＺ：Ｍ５００５＿Ｓｐｙ＿０６８５
ＳＰＭ：ｓｐｙＭ１８＿０９４０
ＳＰＧ：ＳｐｙＭ３＿０５９８
ＳＰＳ：ＳＰｓ１２５５
ＳＰＨ：ＭＧＡＳ１０２７０＿Ｓｐｙ０７４３
ＳＰＩ：ＭＧＡＳ１０７５０＿Ｓｐｙ０７７７
ＳＰＪ：ＭＧＡＳ２０９６＿Ｓｐｙ０７５６
ＳＰＫ：ＭＧＡＳ９４２９＿Ｓｐｙ０７４０
ＳＰＦ：ＳｐｙＭ５１１２３（ｆｎｉ）
ＳＰＡ：Ｍ６＿Ｓｐｙ０７０２
ＳＰＢ：Ｍ２８＿Ｓｐｙ０６６５
ＳＰＮ：ＳＰ＿０３８４
ＳＰＲ：ｓｐｒ０３４１（ｆｎｉ）
ＳＰＤ：ＳＰＤ＿０３４９（ｆｎｉ）
ＳＡＧ：ＳＡＧ１３２３
ＳＡＮ：ｇｂｓ１３９３
ＳＡＫ：ＳＡＫ＿１３５４（ｆｎｉ）
ＳＭＵ：ＳＭＵ．９３９
ＳＴＣ：ｓｔｒ０５６２（ｉｄｉ）
ＳＴＬ：ｓｔｕ０５６２（ｉｄｉ）
ＳＴＥ：ＳＴＥＲ＿０６０１
ＳＳＡ：ＳＳＡ＿０３３６
ＳＧＯ：ＳＧＯ＿０２４２
ＬＰＬ：ｌｐ＿１７３２（ｉｄｉ１）
ＬＪＯ：ＬＪ１２０８
ＬＡＣ：ＬＢＡ１１７１
ＬＳＡ：ＬＳＡ０９０５（ｉｄｉ）
ＬＳＬ：ＬＳＬ＿０６８２
ＬＤＢ：Ｌｄｂ０９９６（ｆｎｉ）
ＬＢＵ：ＬＢＵＬ＿０９０３
ＬＢＲ：ＬＶＩＳ＿０８６１
ＬＣＡ：ＬＳＥＩ＿１４９３
ＬＧＡ：ＬＧＡＳ＿１０３６
ＬＲＥ：Ｌｒｅｕ＿０９１２
ＥＦＡ：ＥＦ０９０１
ＯＯＥ：ＯＥＯＥ＿１１０３
ＳＴＨ：ＳＴＨ１６７４
ＣＢＥ：Ｃｂｅｉ＿３０８１
ＤＲＭ：Ｄｒｅｄ＿０４７４
ＳＷＯ：Ｓｗｏｌ＿１３４１
ＭＴＡ：Ｍｏｔｈ＿１３２８
ＭＴＵ：Ｒｖ１７４５ｃ（ｉｄｉ）
ＭＴＣ：ＭＴ１７８７（ｉｄｉ）
ＭＢＯ：Ｍｂ１７７４ｃ（ｉｄｉ）
ＭＢＢ：ＢＣＧ＿１７８４ｃ（ｉｄｉ）
ＭＰＡ：ＭＡＰ３０７９ｃ
ＭＡＶ：ＭＡＶ＿３８９４（ｆｎｉ）
ＭＳＭ：ＭＳＭＥＧ＿１０５７（ｆｎｉ） ＭＳＭＥＧ＿２３３７（ｆｎｉ）
ＭＵＬ：ＭＵＬ＿０３８０（ｉｄｉ２）
ＭＶＡ：Ｍｖａｎ＿１５８２ Ｍｖａｎ＿２１７６
ＭＧＩ：Ｍｆｌｖ＿１８４２ Ｍｆｌｖ＿４１８７
ＭＭＣ：Ｍｍｃｓ＿１９５４
ＭＫＭ：Ｍｋｍｓ＿２０００
ＭＪＬ：Ｍｊｌｓ＿１９３４
ＣＧＬ：ＮＣｇｌ２２２３（ｃｇｌ２３０５）
ＣＧＢ：ｃｇ２５３１（ｉｄｉ）
ＣＥＦ：ＣＥ２２０７
ＣＤＩ：ＤＩＰ１７３０（ｉｄｉ）
ＮＦＡ：ｎｆａ１９７９０ ｎｆａ２２１００
ＲＨＡ：ＲＨＡ１＿ｒｏ００２３９
ＳＣＯ：ＳＣＯ６７５０（ＳＣ５Ｆ２Ａ．３３ｃ）
ＳＭＡ：ＳＡＶ１６６３（ｉｄｉ）
ＬＸＸ：Ｌｘｘ２３８１０（ｉｄｉ）
ＣＭＩ：ＣＭＭ＿２８８９（ｉｄｉＡ）
ＡＡＵ：ＡＡｕｒ＿０３２１（ｉｄｉ）
ＰＡＣ：ＰＰＡ２１１５
ＦＲＡ：Ｆｒａｎｃｃｉ３＿４１８８
ＦＲＥ：Ｆｒａｎｅａｎ１＿５５７０
ＦＡＬ：ＦＲＡＡＬ６５０４（ｉｄｉ）
ＫＲＡ：Ｋｒａｄ＿３９９１
ＳＥＮ：ＳＡＣＥ＿２６２７（ｉｄｉＢ＿２） ＳＡＣＥ＿５２１０（ｉｄｉ）
ＳＴＰ：Ｓｔｒｏｐ＿４４３８
ＳＡＱ：Ｓａｒｅ＿４５６４ Ｓａｒｅ＿４９２８
ＲＸＹ：Ｒｘｙｌ＿０４００
ＢＢＵ：ＢＢ０６８４
ＢＧＡ：ＢＧ０７０７
ＳＹＮ：ｓｌｌ１５５６
ＳＹＣ：ｓｙｃ２１６１＿ｃ
ＳＹＦ：Ｓｙｎｐｃｃ７９４２＿１９３３
ＣＹＡ：ＣＹＡ＿２３９５（ｆｎｉ）
ＣＹＢ：ＣＹＢ＿２６９１（ｆｎｉ）
ＴＥＬ：ｔｌｌ１４０３
ＡＮＡ：ａｌｌ４５９１
ＡＶＡ：Ａｖａ＿２４６１ Ａｖａ＿Ｂ０３４６
ＴＥＲ：Ｔｅｒｙ＿１５８９
ＳＲＵ：ＳＲＵ＿１９００（ｉｄｉ）
ＣＨＵ：ＣＨＵ＿０６７４（ｉｄｉ）
ＧＦＯ：ＧＦＯ＿２３６３（ｉｄｉ）
ＦＪＯ：Ｆｊｏｈ＿０２６９
ＦＰＳ：ＦＰ１７９２（ｉｄｉ）
ＣＴＥ：ＣＴ０２５７
ＣＣＨ：Ｃａｇ＿１４４５
ＣＰＨ：Ｃｐｈａ２６６＿０３８５
ＰＶＩ：Ｃｖｉｂ＿１５４５
ＰＬＴ：Ｐｌｕｔ＿１７６４
ＲＲＳ：ＲｏｓｅＲＳ＿２４３７
ＲＣＡ：Ｒｃａｓ＿２２１５
ＨＡＵ：Ｈａｕｒ＿４６８７
ＤＲＡ：ＤＲ＿１０８７
ＤＧＥ：Ｄｇｅｏ＿１３８１
ＴＴＨ：ＴＴ＿Ｐ００６７
ＴＴＪ：ＴＴＨＢ１１０
ＭＪＡ：ＭＪ０８６２
ＭＭＰ：ＭＭＰ００４３
ＭＭＱ：ＭｍａｒＣ５＿１６３７
ＭＭＸ：ＭｍａｒＣ６＿０９０６
ＭＭＺ：ＭｍａｒＣ７＿１０４０
ＭＡＥ：Ｍａｅｏ＿１１８４
ＭＶＮ：Ｍｅｖａｎ＿１０５８
ＭＡＣ：ＭＡ０６０４（ｉｄｉ）
ＭＢＡ：Ｍｂａｒ＿Ａ１４１９
ＭＭＡ：ＭＭ＿１７６４
ＭＢＵ：Ｍｂｕｒ＿２３９７
ＭＴＰ：Ｍｔｈｅ＿０４７４
ＭＨＵ：Ｍｈｕｎ＿２８８８
ＭＬＡ：Ｍｌａｂ＿１６６５
ＭＥＭ：Ｍｅｍａｒ＿１８１４
ＭＢＮ：Ｍｂｏｏ＿２２１１
ＭＴＨ：ＭＴＨ４８
ＭＳＴ：Ｍｓｐ＿０８５６（ｆｎｉ）
ＭＳＩ：Ｍｓｍ＿１４４１
ＭＫＡ：ＭＫ０７７６（ｌｌｄＤ）
ＡＦＵ：ＡＦ２２８７
ＨＡＬ：ＶＮＧ１８１８Ｇ（ｉｄｉ） ＶＮＧ６０８１Ｇ（ｃｒｔ＿１） ＶＮＧ６４４５Ｇ（ｃｒｔ＿２） ＶＮＧ７０６０ ＶＮＧ７１４９
ＨＭＡ：ｒｒｎＡＣ３４８４（ｉｄｉ）
ＨＷＡ：ＨＱ２７７２Ａ（ｉｄｉＡ） ＨＱ２８４７Ａ（ｉｄｉＢ）
ＮＰＨ：ＮＰ０３６０Ａ（ｉｄｉＢ＿１） ＮＰ４８２６Ａ（ｉｄｉＡ） ＮＰ５１２４Ａ（ｉｄｉＢ＿２）
ＴＡＣ：Ｔａ０１０２
ＴＶＯ：ＴＶＮ０１７９
ＰＴＯ：ＰＴＯ０４９６
ＰＨＯ：ＰＨ１２０２
ＰＡＢ：ＰＡＢ１６６２
ＰＦＵ：ＰＦ０８５６
ＴＫＯ：ＴＫ１４７０
ＲＣＩ：ＬＲＣ３９７（ｆｎｉ）
ＡＰＥ：ＡＰＥ＿１７６５．１
ＳＭＲ：Ｓｍａｒ＿０８２２
ＩＨＯ：Ｉｇｎｉ＿０８０４
ＨＢＵ：Ｈｂｕｔ＿０５３９
ＳＳＯ：ＳＳＯ００６３
ＳＴＯ：ＳＴ２０５９
ＳＡＩ：Ｓａｃｉ＿００９１
ＭＳＥ：Ｍｓｅｄ＿２１３６
ＰＡＩ：ＰＡＥ０８０１
ＰＩＳ：Ｐｉｓｌ＿１０９３
ＰＣＬ：Ｐｃａｌ＿００１７
ＰＡＳ：Ｐａｒｓ＿００５１
ＴＰＥ：Ｔｐｅｎ＿０２７２

例示的なイソプレン・シンターゼ核酸およびポリペプチド
ジェンバンク登録番号
ＡＹ３４１４３１
ＡＹ３１６６９１
ＡＹ２７９３７９
ＡＪ４５７０７０
ＡＹ１８２２４１

Claims (15)

  1. イソプレンに由来する反復単位から成るポリイソプレン重合体であって、前記ポリイソプレン重合体が、
    （Ａ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有するか、または−３０‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することを特徴とするか、
    （Ｂ）−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、前記ポリイソプレン重合体には（ｉ）タンパク質がないか、または（ｉｉ）９９．９％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量及び９９．９％未満のトランス−１，４−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｉｉｉ）２％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｉｖ）２％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｖ）５，０００から１００，０００の範囲内の重量平均分子量を有することを特徴とするか、または
    （Ｃ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有するか、または−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、前記ポリイソプレン重合体がイソプレンに由来する反復単位の少なくとも一のブロックを含むことを特徴とする、前記ポリイソプレン重合体。
  2. 前記ポリイソプレン重合体が−２１‰〜−１２‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  3. 前記ポリイソプレン重合体が−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有するか、−３０‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、前記ポリイソプレン重合体がホモ重合体である、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  4. 前記ポリイソプレン重合体が、−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、前記ポリイソプレン重合体には（ｉ）タンパク質がないか、または（ｉｉ）９９．９％未満のシス−１，４−ミクロ構造の含有量及び９９．９％未満のトランス−１，４−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｉｉｉ）２％より高い３，４−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｉｖ）２％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有するか、または（ｖ）５，０００から１００，０００の範囲内の重量平均分子量を有する、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  5. 前記ポリイソプレン重合体が５％より高い１，２−ミクロ構造の含有量を有し、前記ポリイソプレン重合体が２．０未満の多分散性を有する、請求項４に記載のポリイソプレン重合体。
  6. 前記ポリイソプレン重合体が、（ｉ）−３３‰〜−２５‰の範囲内のδ１３Ｃ値、及び（ｉｉ）３０，０００から５０，０００の範囲内の重量平均分子量及び／又は１．８未満の多分散性を有する、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  7. イソプレンに由来する反復単位から成る重合体であって、前記イソプレンが、（ａ）イソプレンの生産に適した培養状態下でイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を培養する工程、（ｂ）イソプレンを生産する工程、及び（ｃ）前記培養物からイソプレンを回収する工程により生産される、前記重合体。
  8. 前記イソプレンが、（ａ）イソプレンの生産に適した培養状態下でイソプレン・シンターゼ・ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を培養する工程、（ｂ）イソプレンを生産する工程、及び（ｃ）前記培養物からイソプレンを回収する工程により生産される、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  9. 前記イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドが植物イソプレン・シンターゼ・ポリペプチドに由来する、請求項８に記載のポリイソプレン重合体。
  10. ポリイソプレン重合体中のイソプレンが持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する方法であって、前記方法が、
    （Ａ）ポリイソプレン・ホモ重合体の場合に、（Ｉ）ポリイソプレン・ホモ重合体のδ１３Ｃ値を測定する工程、（ＩＩ）ポリイソプレン・ホモ重合体が−３４‰〜−３０‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する場合、または−２８．５‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する場合に、（１）そのシス−ミクロ構造の含有量、（２）その３，４−ミクロ構造の含有量、（３）その１，２−ミクロ構造の含有量、（４）その重量平均分子量、または（５）残留タンパク質、石鹸、脂質、樹脂剤及び／または天然ゴムを示す糖質の存在または不在を測定するためにポリイソプレン・ホモ重合体をさらに分析する工程、及び（ＩＩＩ）ポリイソプレン・ホモ重合体が持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する工程であって、ポリイソプレン・ホモ重合体が（ｉ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値、（ｉｉ）−３０‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値、または（ｉｉｉ）−３４‰〜−３０‰の範囲内のδ１３Ｃ値または−２８．５‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有するかどうか、及びポリイソプレン・ホモ重合体が（ａ）１００％未満のシス−ミクロ構造の含有量を有するか、（ｂ）３，４−ミクロ構造を含むか、（ｃ）１，２−ミクロ構造を含むか、（ｄ）１００，０００未満の重量平均分子量を有するか、または（ｅ）残留タンパク質、石鹸、脂質、樹脂剤及び／または天然ゴムを示す糖質がないかどうかを確認する、前記工程を含み、また
    （Ｂ）イソプレン含有共重合体の場合に、（Ｉ）共重合体中の少なくとも一のポリイソプレン・ブロックのδ１３Ｃ値を測定する工程、及び（ＩＩ）共重合体中のイソプレンが持続可能で再生可能な非石油源に由来することを確認する工程であって、前記ポリイソプレン・ブロックが（ｉ）−２２‰より高いδ１３Ｃ値、または（ｉｉ）−３４‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することを確認する、前記工程を含む前記方法。
  11. 前記ポリイソプレン重合体が−２９．５‰〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  12. 前記ポリイソプレン重合体が−３０‰〜−２９‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  13. 前記ポリイソプレン重合体が−２２‰より高いδ１３Ｃ値を有するか、または−３４‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有し、前記ポリイソプレン重合体がイソプレンに由来する反復単位の少なくとも一のブロックを含み、前記ポリイソプレン重合体が、（ｉ）イソプレン及び１，３−ブタジエンの共重合体、（ｉｉ）イソプレン及びスチレンの共重合体、（ｉｉｉ）イソプレン、１，３−ブタジエン及びスチレンの共重合体、及び（ｉｖ）イソプレン及びα−メチルスチレンの共重合体から成る群から選ばれる共重合体である、請求項１に記載のポリイソプレン重合体。
  14. 前記重合体が工程（ｃ）で回収されたイソプレンの重合により合成される、請求項７に記載の重合体。
  15. 前記確認する工程が、ポリイソプレン・ホモ重合体が−３４‰〜−３０‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有することを示すことにより、またポリイソプレン・ホモ重合体が残留タンパク質、石鹸、脂質、樹脂剤および／または天然ゴムを示す糖質がないことを示すことにより行われる、請求項１０に記載の方法。
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