CN102131935A - 来自可再生资源的异戊二烯的聚合物 - Google Patents

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Abstract

已经发现培养中的某些细胞可以将细胞培养基中可获得的碳转化成异戊二烯。这些细胞具有与启动子有效连接并编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在这种培养基中产生的异戊二烯随后可以被回收并聚合成合成橡胶和其他有用的高分子材料。在衍生自不基于石油化学的资源方面，含有合成性异戊二烯的本发明聚合物提供了可验证的益处。它们也可以通过分析区别来自天然源的橡胶。本发明更具体地公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。这种类型的聚异戊二烯可以是αs-1A-聚异戊二烯均聚物橡胶。

Description

来自可再生资源的异戊二烯的聚合物
本申请要求2008年6月30日提交的美国临时专利申请系列号61/133,521的权益。美国临时专利申请系列号61/133,521的教导内容在此通过引用的方式完整并入。
发明背景
异戊二烯(2-甲基-丁-1，3-二烯)是在广泛类型的应用中使用的一种极重要的有机化合物。例如，异戊二烯用作众多化学组合物和聚合物合成中的中间体或原材料。异戊二烯也是由许多植物和动物(包括人类)天然合成的重要生物材料。异戊二烯在室温下是无色液体并且是高度可燃的。异戊二烯的结构式是：
Figure BDA0000047889120000011
当异戊二烯的立体调节聚合在20世纪60年代早期变得商业可行时，它变成用于顺-1，4-聚丁二烯合成中的重要单体。通过此类立体调节聚合所产生的顺-1，4-聚异戊二烯在结构和特性上与天然橡胶相似。即使它不与天然橡胶完全相同，但是它可以在许多应用中用作天然橡胶的替代物。例如，合成的顺-1，4-聚异戊二烯橡胶广泛地用于制造轮胎和其他橡胶产品中。这种对合成的顺-1，4-聚异戊二烯橡胶的需求消费了大部分在世界市场中可获得的异戊二烯。其余异戊二烯用于制造其他合成橡胶、嵌段共聚物和其他化学产品中。例如，异戊二烯用于制造丁二烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯共聚物橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物和苯乙烯-异戊二烯嵌段共聚物。
多年来，已经研究了用于产生异戊二烯的许多合成途径。例如，通过异丁烯与甲醛在催化剂存在下反应来合成异戊二烯在美国专利3,146,278、美国专利3,437,711、美国专利3,621,072、美国专利3,662,016、美国专利3,972,955、美国专利4,000,209、美国专利4,014,952、美国专利4,067,923和美国专利4,511,751中描述。美国专利3,574,780公开了用于通过将甲基叔丁醚与空气的混合物穿过混合氧化物催化剂而制造异戊二烯的另一种方法。甲基叔丁醚随后在该催化剂上被裂化成异丁烯和甲醇。产生的甲醇氧化成甲醛，后者随后与异丁烯在相同催化剂上反应以产生异戊二烯。美国专利5,177,290公开了用于产生二烯类(包括异戊二烯)的方法，其涉及使叔烷基醚和氧源的反应混合物在功能上不同的两种催化剂上在足以导致以所述醚的最少回收产生高产率所述二烯类的反应条件下反应。
工业应用中所用的异戊二烯一般作为热裂化石油或石脑油的副产物产生或另外自石油化学流提取。这是相对昂贵的能量密集方法。随着世界范围对基于石油化学的产品的需求持续增长，异戊二烯的成本预计在长期上升至高得多的水平并且它的可获得性在任何情况下是有限的。换而言之，存在以下顾虑：来自基于石油化学源的未来异戊二烯供应将不足以满足预计需求并且价格将上升至空前的水平。因此，当前存在对从环境友好的低成本可再生来源获得异戊二烯源的需求。
发明简述
已经发现培养中的某些细胞可以将细胞培养基中可获得的多于约0.002％的碳转化成异戊二烯。这些细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽并(ii)与启动子有效连接的异源核酸。在一些情况下，这些细胞在包含碳源的培养基中培养，所述碳源例如是，但不限于糖类、甘油、甘油、二羟基丙酮、一碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油酯类、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述二者或多者的任意组合。在这种培养基中产生的异戊二烯随后可以被回收并聚合成合成橡胶和其他有用的聚合材料。
预计对使用这种类型异戊二烯合成的合成橡胶和其他含异戊二烯的聚合物将存在明显需求，其中所述的异戊二烯从可再生的不基于石油化学的资源产生。实际上，据信相对于用衍生自石油化学工艺的异戊二烯制成的那些聚合物，工业用户和消费者将希望购买衍生自此类环境友好来源的含有异戊二烯的聚合物。还相信用户会愿意为采用可再生资源制成的此类环境友好产品支付额外价格。然而，重要的是能够验证此类含有异戊二烯的聚合物实际上由不基于石油化学的资源制成。在衍生自不基于石油化学的资源方面，含有合成性异戊二烯的本发明聚合物提供了可验证的益处。它们也可以通过分析区别来自天然来源的橡胶。
本发明更具体地公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。这种类型的聚异戊二烯可以是聚异戊二烯均聚物。
本发明还披露了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。这种类型的聚异戊二烯也可以是聚异戊二烯均聚物。
本发明也公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物不含有蛋白质，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明还披露了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的顺-1，4-微结构含量，其中该聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的反-1，4-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明也公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于2％的3，4-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明还披露了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于2％的1，2-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明也公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元和至少一种额外单体组成的聚合物，其中该聚合物包括衍生自异戊二烯的重复单元嵌段，并且其中衍生自异戊二烯的重复单元嵌段具有大于-22‰的δ13C值。
本发明还披露了由衍生自异戊二烯单体的重复单元和至少一种额外单体组成的聚合物，其中该聚合物包括衍生自异戊二烯的重复单元嵌段，并且其中衍生自异戊二烯的重复单元嵌段具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明也公开了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的液体聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重量平均分子量，并且其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明还披露了由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的液体聚异戊二烯聚合物，其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重量平均分子量，并且其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
本发明也公开了用于验证聚异戊二烯均聚物来自可持续的可再生非石油衍生来源的方法，其包括：(I)确定该聚异戊二烯均聚物的δ13C值；(II)如果该聚异戊二烯均聚物具有在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值，则额外地分析该聚异戊二烯均聚物以确定(1)其顺-微结构含量、(2)其3，4-微结构含量、(3)其1，2-微结构含量、(4)其重量平均分子量或(5)存在或不存在作为天然橡胶指示物的残余蛋白质、皂类、脂类、树脂或糖类；并且(III)如果该聚异戊二烯均聚物具有(i)大于-22‰的δ13C值、(ii)在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值或者(iii)在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值并且它(a)具有小于100％的顺-微结构含量、(b)含有3，4-微结构、(c)含有1，2-微结构、(d)具有小于100,000的重量平均分子量或(e)不含有作为天然橡胶指示物的残余蛋白质、皂类、脂类、树脂或糖类，则验证该聚异戊二烯均聚物来自可持续的可再生的非石油衍生来源。
本发明还披露了用于验证具有衍生自异戊二烯的重复单元的共聚物含有来自可持续性的可再生非石油衍生来源的异戊二烯的方法，所述方法包括：(I)确定该共聚物中至少一个聚异戊二烯嵌段的δ13C值；和(II)如果该聚异戊二烯嵌段具有(i)大于-22‰的δ13C值或(ii)在-34‰至-28.5范围内的δ13C值，则验证该共聚物中的异戊二烯来自可持续的可再生非石油衍生来源。
附图简述
图1是为大肠杆菌(E.coli)中表达而密码子优化的葛异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。atg起始密码子以斜体字表示，终止密码子以粗体字表示并且添加的PstI位点加下划线标出。
图2是pTrcKudzu的图。
图3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。RBS加下划线标出，葛异戊二烯合酶起始密码子以粗体大写字母表示并且终止密码子以粗体大写斜体字母表示。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图。
图5是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图。
图7是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图8A是显示在没有载体的大肠杆菌BL21细胞中产生异戊二烯的曲线图。
图8B是显示在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的曲线图。
图8C是显示在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的曲线图。
图8D是显示在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯产生的曲线图。
图9A是显示大肠杆菌BL21/pTrcKudzu在14升补料分批发酵中发酵的时间内OD的曲线图。
图9B是显示大肠杆菌BL21/pTrcKudzu在14升补料分批发酵中发酵的时间内异戊二烯产生的曲线图。
图10A是显示柠檬泛菌(Panteoa citrea)中异戊二烯产生的曲线图。对照细胞不含重组葛异戊二烯合酶。灰色菱形代表异戊二烯合成，黑色正方形代表OD600。
图10B是显示表达pCL-lac Kudzu的柠檬泛菌中异戊二烯产生的曲线图。灰色菱形代表异戊二烯合成，黑色正方形代表OD600。
图10C是显示表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯产生的曲线图。灰色菱形代表异戊二烯合成，黑色正方形代表OD600。
图11是显示表达重组异戊二烯合酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中异戊二烯产生的曲线图。BG3594comK是不含质粒的枯草芽孢杆菌菌株(天然的异戊二烯生产力)。CF443-BG3594comK是含有pBSKudzu的枯草芽孢杆菌菌株(重组的异戊二烯生产力)。y轴上的IS表示异戊二烯。
图12是pBS Kudzu#2的核苷酸序列(SEQ ID NO：57)。
图13是为耶氏酵母(Yarrowia)中表达而密码子优化的葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图14是包含为耶氏酵母中表达而密码子优化的葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g的图。
图15是载体pSPZl(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图16是为耶氏酵母中表达而密码子优化的合成葛(葛麻姆(Puerariamontana))异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。
图17是合成的杂种杨(银白杨x欧洲山杨(Populus alba x Populustremula))异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。ATG起始密码子以粗体字表示并且终止密码子加下划线标出。
图18A显示概述载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建的示意图。
图18B显示概述载体pYLA(POP1)的构建的示意图。
图18C显示概述载体pYLA(KZ1)的构建的示意图。
图18D显示概述载体pYLI(KZ1)的构建的示意图。
图18E显示概述载体pYLI(MAP29)的构建的示意图。
图18F显示概述载体pYLA(MAP29)的构建的示意图。
图19显示异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(基于F.Bouvier等人，Progress in Lipid Res.44：357-429，2005)。以下描述包括所述途径中每种多肽的备选名称和公开了测量所述多肽活性的测定法的参考文献(这些参考文献的每一篇因而分别通过引用的方式完整并入，尤其是在测定MVA和DXP途径中多肽的多肽活性方面)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰-CoA乙酰转移酶，MvaE，EC 2.3.1.9，测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟甲基戊二酰-CoA合酶，MvaS，EC 2.3.3.10，测定法：J.Bacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶，MvaE，EC 1.1.1.34，测定法：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC 2.7.1.36，测定法：Curr Genet 19：9-14，1991；PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC 2.7.4.2，测定法：Mol Cell Biol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，EC 4.1.1.33，测定法：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯二磷酸Δ-异构酶，IDI1，EC 5.3.3.2，测定法：J.Biol.Chem.264：19169-19175，1989。DXP途径：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，EC 2.2.1.7，测定法：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶，dxr，EC 2.2.1.7，测定法：Eur.J.Biochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶，IspD，EC 2.7.7.60，测定法：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶，IspE，EC 2.7.1.148，测定法：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，EC 4.6.1.12，测定法：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合酶，ispG，EC 1.17.4.3，测定法：J.Org.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶，IspH，EC 1.17.1.2，测定法：JACS，126：12847-12855，2004。
图20显示这样的曲线图，它们代表GC-MS分析具有(左)或没有(右)葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母菌株的异戊二烯生产力生产量的结果。箭头表权威性异戊二烯标准物的洗脱时间。
图21是pTrcKudzu yJDI DXS Kan的图。
图22是pTrcKudzu yIDI DXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。
图23A是显示BL21/pTrcKudzukan中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23B是显示BL21/pTrcKudzu yIDI kan中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23C是显示BL21/pTrcKudzu DXS kan中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23D是显示BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23E是显示BL21/pCL PtrcKudzu中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23F是显示BL21/pCL PtrcKudzu yIDI中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23G是显示BL21/pCL PtrcKudzu DXS中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。时间0是用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形代表OD600，圆圈代表总异戊二烯生产力(μg/L)并且正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23H是显示BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中从葡萄糖产生异戊二烯的曲线图。箭头表示用IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。黑色菱形代表OD600，黑色三角代表异戊二烯生产力(μg/L)并且白色正方形代表异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图24是pTrcKKDyIkIS kan的图。
图25是pTrcKKDyIkIS kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)。
图26是pCL PtrcUpperPathway的图。
图27是pCL PtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。
图28显示了含有用于在nprE基因座处整合入枯草芽孢杆菌染色体中的下游MVA途径和酵母idi的表达盒的图。nprE上游/下游表示用于整合的来自nprE基因座的各1kb序列。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35、-10、+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示带有该起始位点上游的芽孢杆菌RBS的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示带有该起始位点上游的芽孢杆菌RBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示带有该起始位点上游的芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标记。“用于扩增的nprE上游重复序列”表示用于扩增的上游区的直接重复序列。
图29是含有用于在nprE基因座处整合入枯草芽孢杆菌染色体中的下游MVA途径和酵母idi的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。
图30是p9796-杨的图。
图31是p9796-杨的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。
图32是pTrcPoplar的图。
图33是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。
图34是pTrcKudzu yIDI Kan的图。
图35是pTrcKudzu yIDI Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)。
图36是pTrcKudzuDXS Kan的图。
图37是pTrcKudzuDXS Kan的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。
图38是pCL PtrcKudzu的图。
图39是pCL PtrcKudzu的核苷酸序列(SEQ ID NO：52)。
图40是pCL PtrcKudzu A3的图。
图41是pCL PtrcKudzu A3的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。
图42是pCL PtrcKudzu yIDI的图。
图43是pCL PtrcKudzu yIDI的核苷酸序列(SEQ ID NO：54)。
图44是pCL PtrcKudzu DXS的图。
图45是pCL PtrcKudzu DXS的核苷酸序列(SEQ ID NO：55)。
图46显示了代表来自生物量原料的异戊二烯产生的曲线图。分图A显示来自玉米秸秆的异戊二烯生产力，分图B显示来自甘蔗渣的异戊二烯生产力，分图C显示来自软木浆的异戊二烯生产力，分图D显示来自葡萄糖的异戊二烯生产力，并且分图E显示来自没有额外原料的细胞的异戊二烯生产力。灰色正方形代表培养物在接种后所示时间处的OD600量值并且黑色三角形代表在接种后所示时间处的异戊二烯生产力。
图47A显示了代表在不添加葡萄糖的培养物中BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的异戊二烯生产的曲线图。正方形代表OD600，并且三角形代表产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47B显示了代表BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的从1％葡萄糖原料转化糖产生异戊二烯的曲线图。正方形代表OD600，并且三角形代表产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47C显示了代表BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％转化糖原料产生异戊二烯的曲线图。正方形代表OD600，并且三角形代表产生的异戊二烯(μg/ml)。
图47D显示了代表BL21(λDE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)从1％AFEX玉米秸秆产生异戊二烯的曲线图。正方形代表OD600，并且三角形代表产生的异戊二烯(μg/ml)。
图48显示了展示酵母提取物影响异戊二烯产生的曲线图。分图A显示在以不同量的酵母提取物补料的发酵罐内部光密度的时程。分图B显示异在以不同量的酵母提取物补料的发酵罐内部戊二烯滴度的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。分图C显示酵母提取物对补料分批培养中所培育大肠杆菌中的异戊二烯生产的影响。
图49显示了曲线图，其展示用大肠杆菌细胞从500L生物反应器的异戊二烯生产力生产量，所述的大肠杆菌细胞含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒。分图A显示在葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器内部光密度的时程。分图B显示在葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器内部异戊二烯滴度的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。分图C显示从葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。
图50是pJMupperpathway2的图。
图51是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQ ID NO：56)。
图52是pBS Kudzu#2的图。
图53A是曲线图，其显示在14升补料分批发酵中表达重组葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间期间的生长。黑色菱形代表没有重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产力)和灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢杆菌(重组的异戊二烯生产力)。
图53B是曲线图，其显示在14升补料分批发酵中表达重组葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌的发酵时间期间的异戊二烯生产力。黑色菱形代表没有重组异戊二烯合酶的对照菌株(BG3594comK)(天然的异戊二烯生产力)和灰色三角形代表具有pBSKudzu的芽孢杆菌(重组的异戊二烯生产力)。
图54是质粒pET24P.alba HGS的图。
图55A和55B是质粒pET24P.alba HGS的核苷酸序列(SEQ IDNO：87)。
图56是示意图，其显示用于核酸内切酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点和BspHI与Ncol位点之间的相容性粘性末端。
图57是质粒EWL230的图。
图58A和58B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQ ID NO：88)。
图59是示意图，其显示用于核酸内切酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点和NsiI与PstI位点之间的相容性粘性末端。
图60是EWL244的图。
图61A和61B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQ ID NO：89)。
图62是质粒MCM484-487的图。
图63A-63C是质粒MCM484的核苷酸序列(SEQ ID NO：90)。
图64A-64C是质粒MCM485的核苷酸序列(SEQ ID NO：91)。
图65A-65C是质粒MCM486的核苷酸序列(SEQ ID NO：92)。
图66A-66C是质粒MCM487的核苷酸序列(SEQ ID NO：93)。
图67A-67D是大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯产生的曲线图，其中所述的大肠杆菌菌株表达来自MVA途径的基因并且在补料分批培养中以15升规模在没有酵母提取物补料的情况下培育。图67A显示光密度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。图67B显示异戊二烯滴度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图67C显示从葡萄糖补料的15升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。图67D显示葡萄糖补料的15升生物反应器内部的总二氧化碳释放速率(TCER)或代谢活性曲线。
图68A-68E是大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯产生的曲线图，其中所述的大肠杆菌菌株表达来自MVA途径的基因并且在补料分批培养中以15升规模在酵母提取物补料的情况下培育。图68A显示光密度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。图68B显示异戊二烯滴度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图68C显示从葡萄糖补料的15升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。图68D显示葡萄糖补料的15升生物反应器内部的容积生产力。在酵母提取物补料的情况下，平均值1.1g/L/小时维持40小时时间(23-63小时)。图68E显示葡萄糖补料的15升生物反应器内部的二氧化碳释放速率(CER)或代谢活性曲线。
图69A-69D显示通过MVA(途径)来自不同碳源的异戊二烯的生产力。图69A显示了以葡萄糖、生物量水解物、甘油或乙酸盐作为唯一碳源，含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256的生长。添加不同的碳源至培养基中1％的浓度。包括不添加碳源的阴性对照。将生长测量为600nm处的光密度。图69B显示了以葡萄糖、生物量水解物、甘油或乙酸盐作为唯一碳源被培育时，来自含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256的异戊二烯的比生产力。添加不同的碳源至培养基中的1％浓度。包括不添加碳源的阴性对照。在接种190分钟、255分钟和317分钟后取得样品并且使用GC-MS测量由细菌产生的异戊二烯。图69C显示以葡萄糖或木糖作为唯一碳源的大肠杆菌EWL256的生长。添加不同的碳源至培养基中的1％浓度。包括不添加碳源的阴性对照。将生长测量为600nm处的光密度。图69D显示了以葡萄糖或木糖作为唯一碳源培育时，来自大肠杆菌EWL256的异戊二烯的比生产力。添加所述碳源至培养基中的1％浓度。包括不添加碳源的阴性对照。在接种260分钟、322分钟和383分钟后取得样品并且使用GC-MS测量由细菌产生的异戊二烯。
图70A和70B显示由大肠杆菌菌株分别从葡萄糖和来自脂肪酸产生异戊二烯。对于图70A，挑取来自用pMCM118(携带下游甲羟戊酸途径的质粒)转化WW4的11个菌落以验证该下游途径的存在。来自所述菌落的细胞在含有0.1％酵母提取物和2％葡萄糖的TM3培养基中培养。在诱导4小时后，对等分试样的诱导的培养物测定异戊二烯产生。全部菌落显示产生异戊二烯。诱导剂IPTG具有强烈生长抑制作用，如从该诱导剂由50μM到达900μM浓度时细胞密度降低3至4.6倍显而易见(数据未显示)。曲线图表明更高的诱导作用产生更高的异戊二烯比滴度。对于图70B，生产培养物以稀释度1至10从洗涤的过夜培养物接种。将该培养物培育几小时并用50μMIPTG诱导。左侧柱图显示诱导4小时后，随后进行1小时异戊二烯积累测定法的异戊二烯分析结果。中间柱图显示在相同的诱导时间下，但通过12小时异戊二烯积累测定法所分析的相同培养物的1小时归一化值。右侧柱图显示被诱导13小时的培养物的1小时异戊二烯积累测定法的值。
图71是用于克隆来自葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUWL201PW(6400bp)的图。Tsr，硫链丝菌素抗性基因。图片取自Takaiwa等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000。
图72显示白色链霉菌(Streptomyces albus)野生型菌株(″wt″)和携带质粒pUWL201PW(阴性对照)或pUWL201_iso(编码来自葛的异戊二烯合酶)的菌株的异戊二烯形成。
图73A是马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)古菌下游途径操纵子的图。
图73B和73C是马氏甲烷八叠球菌古菌下游途径操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO：113)。
图74A是来自马氏甲烷八叠球菌古菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的图。
图74B和74C是来自马氏甲烷八叠球菌古菌Lowerin pET200D的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQ ID NO：114)。
图75A-75D显示与RM11608-2相比，EWL256的生长和异戊二烯产生的比生产力。生长(OD550)由白色菱形代表；异戊二烯的比生产力由实心条形代表。x轴是用200μM(图75A和75B)或400μM(图75C和75D)IPTG诱导后的时间(小时)。Y-1轴是异戊二烯的生产力(μg/L/OD/小时)并且Y-2是任意单位的在波长550处的光密度。OD550的这些值必须乘以6.66以获得培养物的实际OD。
图76是质粒pBBRCMPGI1.5-pg1的图。
图77A和77B是质粒pBBRCMPGI1.5-pg1的核苷酸序列(SEQ IDNO：122)。
图78A-78F是大肠杆菌菌株的异戊二烯产生的曲线图，其中所述的大肠杆菌菌株表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和pg1(RHM111608-2)并且在补料分批培养中以15升规模培育。图78A显示光密度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。图78B显示异戊二烯滴度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。用于计算异戊二烯的方法：59小时内产生的累积性异戊二烯，在59小时的g/发酵罐容积，L [＝]g/L培养液。图78C也显示异戊二烯滴度在葡萄糖补料的15升生物反应器内部的时程。用于计算异戊二烯的方法：∫(瞬时的异戊二烯产生速率，g/L/小时)dt从t＝0至59小时[＝]g/L培养液。图78D显示从葡萄糖补料的15升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。图78E显示葡萄糖补料的15升生物反应器内部的容积生产力。图78F显示葡萄糖补料的15升生物反应器内部的二氧化碳释放速率(CER)或代谢活性曲线。
图79A是质粒pJ201：19813的图。
图79B和79C是质粒pJ201：19813的核苷酸序列(SEQ ID NO：123)。
图80显示在葡萄糖补料的15升生物反应器内部光密度的时程。
图81显示在葡萄糖补料的15升生物反应器内部异戊二烯滴度的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图82显示从葡萄糖补料的15升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。
图83是曲线图，其显示在葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器内部光密度的时程。
图84是曲线图，其显示在葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器内部异戊二烯滴度的时程。该滴度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。
图85是曲线图，其显示从葡萄糖和酵母提取物补料的500升生物反应器中产生的总异戊二烯的时程。
发明详述
用于在产生异戊二烯的细胞的培养物中产生异戊二烯的技术在2007年12月13日提交的美国临时专利申请系列号61/013,574中和2007年12月13日提交的美国临时专利申请系列号61/013,386及在美国专利申请系列号12/335,071中描述。为了教导通过这种方法产生和回收异戊二烯的技术，美国临时专利申请系列号61/013,574、美国临时专利申请系列号61/013,386和美国专利申请系列号12/335,071的教导内容在此通过引用的方式并入。在任何情况下，美国临时专利申请系列号61/013,574、美国临时专利申请系列号61/013,386和美国专利申请系列号12/335,071教导了用于在细胞培养中产生增加量的异戊二烯的组合物和方法。特别地，这些组合物和方法提高异戊二烯产生的速率并增加所产生异戊二烯的总量。例如，已经产生了生成4.8×104nmole/gwcm/小时的异戊二烯的细胞培养系统(表1)。这些系统的效率由的细胞从培养基消费的碳转变成异戊二烯(％碳产率)的约23.6摩尔％产率(10.7重量％产率)展示。如实施例和表2中所示，每升培养液生成大约60.5g异戊二烯。异戊二烯以峰比速率1.88×105纳摩尔/OD/小时(1.88×105纳摩尔/gWCm/小时)产生。根据需要，使用其他条件，如本文中所述的那些条件，可以获得甚至更大的量的异戊二烯。在一些实施方案中，可再生碳源用于异戊二烯的产生。本发明的组合物和方法是受欢迎的，因为它们允许每细胞的高异戊二烯产率、高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产力、低能量消耗、低的生产成本及投资和最少的副反应。这种用于异戊二烯生产的高效大规模生物合成方法为基于异戊二烯的合成橡胶提供了异戊二烯来源并且为使用天然橡胶提供了受欢迎的低成本备选。
如下文进一步讨论，可以通过将编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸导入细胞而大大增加由所述细胞产生的异戊二烯的量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。如实施例中所示，异源性葛麻姆(葛(kudzu))或银白杨(杨(Poplar))异戊二烯合酶多肽在多种宿主细胞如大肠杆菌(EschericHIa coli)、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和里氏木霉(Yarrowia lipolytica)中表达。还如实施例中所示，异源性马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)(M.mazei)甲羟戊酸激酶(MVK)在宿主细胞如大肠杆菌中表达以增加异戊二烯产生。全部这些细胞比没有异源异戊二烯合酶多肽的相应细胞产生更多的异戊二烯。如表1和表2中所示，使用本文中所述的方法，产生了大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞在14升发酵罐中比相应的没有该异源核酸的对照枯草芽孢杆菌细胞产生大约10倍更多的异戊二烯(表2)。发酵罐中大肠杆菌产生每升培养液60.5g异戊二烯(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)和枯草芽孢杆菌产生30mg/L异戊二烯表明可以产生显著量的异戊二烯(表2)。根据需要，可以在甚至更大的规模上产生异戊二烯或者本文中所述的其他条件可以用来进一步增加异戊二烯的量。表1和表2中列出的载体和实验条件在下文和实施例部分中进一步详细描述。表1：使用本发明的细胞培养物和方法，来自摇瓶的异戊二烯的示例性产率。用于测量异戊二烯生产力的测定法在实施例I，第II部分中描述。对于该测定法，在一个或多个时间点从摇瓶取得样品并将其培养30分钟。随后测量该样品中产生的异戊二烯的量。异戊二烯产生的顶空浓度和比速率在表1中列出并在本文中进一步描述。
Figure BDA0000047889120000171
Figure BDA0000047889120000181
＊针对具有液体对顶空体积比1∶19的密封顶空小瓶中培养1小时的1mL的1OD600归一化。
表2：使用本发明的细胞培养物和方法，发酵罐中的异戊二烯的示例性产率。用于测量异戊二烯生产力的测定法在实施例I，第II.部分中描述。对于该测定法，取得发酵罐废气的样品并分析异戊二烯的量。峰顶空浓度(其是发酵期间的最高顶空浓度)、滴度(其是每升培养液所产生异戊二烯的累积总量)和异戊二烯产生的峰比速率(其是发酵期间的最高比速率)在表2中列出并在本文中进一步描述。
Figure BDA0000047889120000191
Figure BDA0000047889120000201
＊＊针对废气流速1vvm(1体积废气每1L培养液每分钟)归一化。
另外，由含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产可以通过增加由所述细胞表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽和/或异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)多肽的量来增强。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入所述细胞。该DXS核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。类似地，该IDI核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。在一些实施方案中，通过内源DXS和/或IDI启动子或调节区替换为导致DXS和/或IDI核酸更多转录的其他启动子和/或调节区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方案中，所述细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
编码的DXS和IDI多肽是生物合成异戊二烯的DXP途径的组成部分(图19A)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。尽管不意图受任何具体理论限制，然而认为增加DXS多肽的量增加经过DXP途径的碳通量，从而导致更大的异戊二烯生产。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)互变。尽管不意图受任何具体理论限制，然而认为增加细胞中IDI多肽的量增加了被转化成DMAPP的IPP的量，所述DMAPP又被转化成异戊二烯。
例如，具有葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母(S.cerevisia)IDI核酸和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞的发酵用来产生异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间期间从50μg/L变动至300μg/L(实施例7，第VII部分)。作为另一个实例，具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、上游MVA途径和整合的下游MVA途径的大肠杆菌的发酵用来产生异戊二烯。异戊二烯的水平在67小时的时间期间从32g/L变动至35.6g/L(实施例10，第III部分)。
在另一个实例中，具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、pg1过量表达(RHM111608-2)、上游MVA途径和整合的下游MVA途径的大肠杆菌的发酵用来产生异戊二烯。异戊二烯的水平在40小时的时间期间从33.2g/L变动至40.0g/L或在59小时的时间期间从48.6g/L变动至60.5g/L(实施例13，第(ii)部分)。
在一些实施方案中，异源或额外的内源异戊二烯合酶核酸、IDI核酸和DXS核酸的存在引起细胞与仅具有这些异源或额外的内源核酸中一种或两种的相应细胞相比更可重现地生长或更长地保持活力。例如，含有异源异戊二烯合酶核酸、IDI核酸和DXS核酸的细胞比仅具有异源异戊二烯合酶核酸和DXS核酸或仅具有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。另外，异源异戊二烯合酶核酸、IDI核酸和DXS核酸成功地与由大肠杆菌细胞维持的高拷贝质粒上的强启动子有效连接，提示可能在所述细胞中表达大量的这些多肽，而不对细胞造成过多量的毒性。尽管不意图受具体理论限制，据信异源或额外的内源异戊二烯合酶核酸和IDI核酸的存在可以减少一种或多种潜在有毒的中间体的量，其中仅在异源或额外的内源DXS核酸在细胞中存在时，所述的中间体将积累。
在一些实施方案中，由含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞所致的异戊二烯生产通过增加由所述细胞表达的MVA多肽的量来强化(图19A和图19B)。示例性MVA途径多肽包括任意的以下多肽：乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。例如，一种或多种MVA途径核酸可以导入所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞含有上游MVA途径，该途径包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸和HMG-CoA还原酶核酸。在一些实施方案中，所述细胞含有下游MVA途径，该途径包括MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸和IDI核酸。在一些实施方案中，所述细胞含有完整MVA途径，该途径包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、HMG-CoA还原酶核酸、MVK核酸、PMK核酸、MVD核酸和IDI核酸。在一些实施方案中，所述细胞含有完整MVA途径，该途径包括AA-CoA硫解酶核酸、HMG-CoA合酶核酸、HMG-CoA还原酶核酸、MVK核酸、PMDC核酸、IPK核酸和IDI核酸。MVA途径核酸可以是异源核酸或是内源核酸的重复拷贝。在一些实施方案中，通过MVA途径核酸的内源启动子或调节区替换为导致所述MVA途径核酸更多转录的其他启动子和/或调节区来增加一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方案中，所述细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如，植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的重复拷贝。
例如，含有编码葛异戊二烯合酶多肽的核酸和编码酿酒酵母MVK多肽、PMK多肽、MVD多肽和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67×104纳摩尔/L培养液/OD600/小时的速率产生异戊二烯(见实施例8)。此外，具有编码粪肠球菌AA-CoA硫解酶多肽、HMG-CoA合酶多肽和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠杆菌细胞的14升发酵产生了22克甲羟戊酸(MVA途径的一种中间体)。一个摇瓶的这些细胞产生每升2-4克甲羟戊酸。这些结果表明异源MVA途径核酸在大肠杆菌中有活性。与仅具有下游MVA途径和葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 131)相比，含有上游MVA途径和下游MVA途径以及葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM 127)产生明显更多的异戊二烯(874μg/L培养液/小时/OD)(见表3)，具有异戊二烯合酶多肽和编码马氏甲烷八叠球菌MVK多肽的核酸的大肠杆菌细胞在酵母提取物补料不存在下的67小时发酵期间(以9.54×104纳摩尔/L培养液/OD600/小时的峰比速率(即9.5×105mol/L培养液/OD600/小时))产生320.6g异戊二烯或在酵母提取物补料存在下的68小时发酵期间(以8.66×104纳摩尔/L培养液/OD600/小时的峰比速率)产生395.5g异戊二烯(见实施例10)。
在一些实施方案中，至少一部分细胞在连续培养物(如无稀释的连续培养)中维持异源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途径核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300次或更多次细胞分裂。在本发明任意方面的一些实施方案中，包含内源异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和/或MVA途径核酸之异源或重复拷贝的核酸也包含选择标记如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄西林、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素抗生素抗性核酸。
如实施例7第VI部分中所示，使用具有葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母IDI核酸和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞来产生异戊二烯，可以通过添加酵母提取物至细胞培养基进一步增加产生的异戊二烯的量。尤其，对于测试的浓度，产生的异戊二烯的量与细胞培养基中酵母提取物的量成线性比例(图48C)。另外，从含有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基中产生每升培养液大约0.11克异戊二烯(实施例7，第VIII部分)。与在酵母提取物存在下增加葡萄糖的量相比，在葡萄糖存在下增加酵母提取物的量导致更多的异戊二烯产生。另外，增加酵母提取物的量允许细胞产生高水平的异戊二烯持续更长的时间长度并改善细胞的健康。
使用三种类型的水解生物量(甘蔗渣、玉米秸秆和软木浆)作为碳源，也展示了异戊二烯产生(图46A-C和图69A和图69B)。具有葛异戊二烯合酶核酸、酿酒酵母IDI核酸和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物量碳源产生与从等同量的葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)一样多的异戊二烯。表达银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞以比等同量的葡萄糖更高的初始生长速率从氨纤维膨胀法(AFEX)预处理的玉米秸秆产生异戊二烯。(图69A和图69B)。根据需要，任何其他生物量碳源可以用于本发明的组合物和方法中。生物量碳源是受欢迎的，因为它们比许多常规的细胞培养基更便宜，因而有利于经济地产生异戊二烯。
另外，显示转化糖充当了用于产生异戊二烯的碳源(图47D)。
另外，也显示木糖、乙酸盐和甘油充当了用于产生异戊二烯的碳源(图69A-69D)。例如，以乙酸盐作为唯一碳源所培育的具有银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞具有如在葡萄糖上的生长期间约两倍高的异戊二烯比生产力(实施例10，第IV部分；图69A和69B)。
在一些实施方案中，细胞培养基中包含油。例如，在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，含有葛异戊二烯合酶核酸的枯草芽孢杆菌细胞产生异戊二烯(实施例4，第III部分)。作为另一个实例，在含有棕榈油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，含有上游和下游MVA途径外加葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC突变细胞产生异戊二烯(实施例12，第II部分)。在一些实施方案中，细胞培养基中包含多于一种油((如2、3、4、5种或更多种油)。尽管不意图受任何具体理论限制，据信(i)油可以增加细胞中可用于转化成异戊二烯的碳的量，(ii)油可以增加细胞中乙酰-CoA的量，因而通过MVA途径增加碳通量，和/或(ii)油可以对细胞提供额外的养分，这是受欢迎的，因为细胞中的许多碳被转化成异戊二烯而非其他产物。在一些实施方案中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然地使用MVA途径来产生异戊二烯或被遗传修饰以含有完整MVA途径的核酸。在一些实施方案中，在添加至细胞培养基之前，油被部分或彻底水解以有利于宿主细胞利用它。
示例性多肽和核酸
多种异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸可以用于本发明的组合物和方法中。
如本文中所用，“多肽”包括下述多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽，它们包含第一多肽(例如，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽)的部分或全部和第二多肽(例如，辅助纯化或检测融合多肽的肽，如His标记)的部分或全部。在一些实施方案中，融合多肽具有两种或多种MVA途径多肽(如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶多肽)的活性。在一些实施方案中，该多肽是具有两种或多种MVA途径多肽活性的天然存在多肽(如粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。
在多种实施方案中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，多肽片段含有来自全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300个或更多个连续氨基酸并具有相应全长多肽的至少或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，或100％活性。在特定的实施方案中，所述多肽包括任意的天然存在的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的区段或其完整氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的序列(即，自然界中存在的序列)相比，该多肽具有一个或多个突变。
在一些实施方案中，该多肽是分离的多肽。如本文中所用，“分离的多肽”不是多肽文库(如具有2、5、10、20、50种或更多种不同多肽的文库)的部分并且同自然界中与之共存的至少一种组分分开。分离的多肽可以例如通过表达编码该多肽的重组核酸获得。
在一些实施方案中，该多肽是异源多肽。“异源多肽”意指一种多肽，其氨基酸序列与相同宿主细胞中天然表达的另一种多肽的氨基酸序列不相同。
如本文中所用，“核酸”指单链或双链形式的两个或多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。在一些实施方案中，该核酸是重组核酸。“重组核酸”意指不含下述一种或多种核酸(例如，基因)的目的核酸，其中所述的一种或多种核酸在自然界中存在的衍生该目的核酸的生物的基因组中分布于该目的核酸的侧翼。该术语因而包括例如不依赖于其他序列而掺入载体、掺入自主复制型质粒或病毒或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA或作为独立分子存在(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA、基因组DNA片段或cDNA片段)的重组DNA。在一些实施方案中，一种异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途径核酸与编码另一种多肽的全部或部分的另一种核酸有效连接，从而该重组核酸编码一种融合多肽，其包括异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和另一种多肽(例如，辅助纯化或检测该融合多肽的肽，如His标记)的全部或部分。在一些实施方案中，化学合成重组核酸的部分或全部。
在一些实施方案中，该核酸是异源核酸。“异源核酸”意指一种核酸，其核酸序列与相同宿主细胞天然发现的另一种核酸的核酸序列不同。在特定的实施方案中，该核酸包括任意的天然存在的异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途径核酸的区段或其完整核酸序列。在一些实施方案中，该核酸包括来自天然存在的异戊二烯合酶核酸DXS、IDI或MVA途径核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，与异戊二烯合酶、DXS、IDI，或MVA途径核酸的野生型序列(即，自然界中存在的序列)相比，该核酸具有一个或多个突变。在一些实施方案中，该核酸具有增加异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸或MVA途径核酸转录或翻译的一个或多个突变(例如，沉默突变)。在一些实施方案中，该核酸是编码异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的任意核酸的简并变体。
“密码子简并性”指遗传密码中的趋异性，其允许核苷酸序列变异而不影响所编码多肽的氨基酸序列。技术人员非常熟悉特定宿主细胞在指示给定氨基酸的核苷酸密码子选择上所表现的“密码子偏倚”。因而，当合成用于改善在宿主细胞中表达的核酸时，在一些实施方案中想要的是如此设计该核酸，使得它的密码子选择频率接近于该宿主细胞的优选密码子选择频率。
示例性异戊二烯合酶DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸的检索号列于附录1中(附录1的检索号和它们的相应序列通过引用方式完整并入本文，尤其是异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列方面)。Kegg数据库也含有众多示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(见，例如，在互联网“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”处及其中序列，所述网址和序列各自因而通过引用的方式完整并入，特别是异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸的氨基酸序列和核酸序列方面)。在一些实施方案中，一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和/或核酸与2007年12月12日或2007年12月11日公众可获得的序列(如与附件1中的任意检索号相对应的任意序列或存在于Kegg数据库中的任意序列)具有序列同一性。下文进一步描述额外的示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽和核酸。
示例性异戊二烯合酶多肽和核酸
如上文所述，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法可以用来通过测量某多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化成异戊二烯的能力而确定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性测定法，细胞提取物通过在如实施例1中描述的摇瓶方法培育菌株(例如，本文中所述的大肠杆菌/pTrcKudzu菌株)来制备。在诱导结束后，大约10mL的细胞通过以7000x g离心10分钟进行沉淀并重悬于无甘油的5ml PEB中。使用弗氏压碎器，使用标准流程裂解细胞。备选地，在-80℃冻融后，细胞用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理。
细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性例如可以如Silver等人，J.Biol.Chem.270：13010-13016，1995和参考文献中所述那样测量，所述文献在此各自通过引用的方式完整并入、特别是用于异戊二烯合酶多肽活性的测定法方面。DMAPP(Sigma)在氮气流下蒸发至干燥并在100mM磷酸钾缓冲液pH 8.2中再水化至浓度100mM并贮存于-20℃。为开展该测定法，将含有5μl 1M MgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μl植物提取缓冲液(PEB)(50mM Tris-HCl、pH 8.0、20mM MgCl2、5％丙三醇和2mM DTT)的溶液添加到带有金属螺旋盖和特氟龙涂层硅隔片的20ml顶空小瓶(Agilent Technologies)中的25μl细胞提取物并在37℃振摇下培育15分钟。如实施例1，第II部分中所述，反应通过添加200μl的250mM EDTA终止并且通过GC/MS定量。
示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽的核酸。示例性异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自本文中所述任意来源生物的天然存在多肽和核酸以及从本文中所述任意来源生物衍生的突变多肽和核酸。
在一些实施方案中，该异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae)，如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些实施方案中，该异戊二烯合酶多肽或核酸是来自葛麻姆(葛)(Sharkey等人，Plant Physiology 137：700-712，2005)、野葛(Pueraria lobata)、杨(如银白杨、黑杨(Populus nigra)、毛果杨(Populus trichocarpa)、银白杨x欧洲山杨(CAC35696)或银白杨(Sasaki等人，FEBSLetters 579(11)：2514-2518，2005；Miller等人，Planta 213：483-487，2001)、杨(如美洲山杨(Populus tremuloides))(Silver等人，JBC 270(22)：13010-1316，1995)或欧洲栎(夏栎(Quercus robur))(Zimmer等人，WO 98/02550)的多肽或核酸，所述文献在此各自通过引用的方式完整并入，特别是异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达方面。合适的异戊二烯合酶包括，但不限于由GenBank检索号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所鉴定的那些戊二烯合酶，所述的检索号在此各自通过引用的方式完整并入，特别是异戊二烯合酶核酸和多肽的序列方面。在一些实施方案中，该异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自夏栎的天然存在的多肽或核酸(即，该异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然存在多肽或核酸之外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方案中，该异戊二烯合酶核酸或多肽是来自杨的天然存在多肽或核酸。在一些实施方案中，该异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨的天然存在多肽或核酸。
示例性DXS多肽和核酸
如上所指出，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包括多肽、多肽片段、肽和具有DXS多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXS多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性IDI多肽和核酸
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯二磷酸δ异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转变(例如将IPP转变成DMAPP和/或将DMAPP转变成IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内对IPP和DMAPP相互转变的能力而用来测定该多肽是否具有IDI多肽活性。示例性IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性MVA途径多肽和核酸
示例性MVA途径多肽包括乙酰基-CoA乙酰转移酶(AACoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。特别地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
特别地，乙酰基-CoA乙酰转移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将两分子乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有AA-CoA硫解酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA还原酶多肽活性。
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽使甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸转变成甲羟戊酸-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有MVK多肽活性。
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽使甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成甲羟戊酸-5-二磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有PMK多肽活性。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成异戊烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成IPP的能力而用来测定该多肽是否具有MVD多肽活性。
磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转变成异戊烯磷酸(IP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成IP的能力而用来测定该多肽是否具有PMDC多肽活性。
异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽使异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将IP转变成IPP的能力而用来测定该多肽是否具有IPK多肽活性。
示例性IDI多肽和核酸如上所述。
分离核酸的示例性方法
可以使用标准方法来分离异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。从目的源生物(例如细菌基因组)获得想要的核酸的方法是常规的并且是分子生物学领域公知的(参见，例如WO 2004/033646及其中引用的文献，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于目的核酸的分离)。例如，如果核酸序列是已知的(例如任何在此所述的已知核酸)，那么可通过限制性内切核酸酶消化来产生适当的基因组文库并且可用与想要的核酸序列互补的探针筛选该文库。一旦分离了序列，可使用标准引物导向扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)来扩增DNA(美国专利号4,683,202，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于PCR方法)来获得适于使用适当的载体来转化的DNA量。
或者，可以使用标准方法来化学合成异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸，例如具有已知核酸序列的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。
可以使用标准方法来鉴定可适合用于在此所述组合物和方法的其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径的多肽。例如，可以在诸如大肠杆菌的生物中构建已知天然产生异戊二烯的生物的染色体DNA的黏粒文库，然后筛选异戊二烯生产。特别地，可产生黏粒文库，在该文库中，基因组DNA的大区段(35-45kb)包装到载体并用于转化适当的宿主。黏粒载体是独特的，因为能接纳大量DNA。通常，黏粒载体具有封装以及随后环化异源DNA所需的至少一个拷贝的cos DNA序列。除了cos序列，这些载体也含有诸如ColEI的复制起点以及药物抗性标记如对于氨苄青霉素或新霉素有抗性的核酸。使用黏粒载体来转化适当的细菌宿主的方法充分描述于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
通常对于克隆黏粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA并使用适当的连接酶将与其邻近黏粒载体的cos区连接。然后将含有线性异源DNA的黏粒载体与DNA包装载体如噬菌体反应。在包装过程期间，切割cos位点并将异源DNA包装到细菌病毒颗粒的头部。然后使用这些颗粒来转染适当的宿主细胞如大肠杆菌。一旦注入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下环化。以这一方式，可以将大区段异源DNA导入宿主细胞并表达。
其他获得异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的方法包括通过检测法(例如在此所述的顶空检测法)或通过使用针对于编码一段保守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物进行PCR来筛选宏基因组文库。可以通过比对已知异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的氨基酸序列来鉴定保守氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对序列鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以对发现能天然生产异戊二烯的生物进行标准蛋白纯化方法(这是本领域公知的)并且可以使用标准方法对得到的纯化多肽测序。文献中记载了其他方法(参见，例如Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，Appl Environ Microbiol.73(l9)：6277-83，2007，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于参与异戊二烯合成的核酸鉴定)。
此外，可以使用标准序列比对和/或结构预测程序来根据其他DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的一级和/或预测的多肽二级结构与已知DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的结构的相似性而鉴定它们。也可以使用标准数据库如swissprot-trembl数据库(网址在“expasy.org”，Swiss Institute ofBioinformatics Swiss-Prot group CMU-1rue Michel Servet CH-1211Geneva 4，Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸。可以使用标准结构预测程序(例如PredictProtein(630West，168Street，BB217，New York，N.Y.10032，USA))的默认设置来预测异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法来测定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的实际二级和/或三级结构。也可以通过与从已知异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸产生的探针杂交来鉴定其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。
示例性启动子和载体
任何在此所述的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸可以包括在一或多个载体中。因此，本发明也表征了具有编码在此所述的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的一种以上的核酸的载体。如在此使用，“载体”指能够递送，并期望地在宿主细胞中表达一种或多种目的核酸的构建体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体含有受表达控制序列所控的核酸。
如在此使用，“表达控制序列”指指导目的核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。表达控制序列有效地连接待转录的核酸区段。
在一些实施方式中，载体含有选择标记。术语“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸，该选择标记允许轻易选择那些含有导入的核酸或载体的宿主细胞。选择标记的实例包括但不限于抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素、)和/或赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的核酸。示例性营养选择标记包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pyr4。可用于转化木霉的载体系统中的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein，Biotechnology of filamentous Fungi，第6章，Finkelstein等人编，Butterworth-Heinemann，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，Applied Molecular Genetics of filamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，Chapman and Hall，London，1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，选择标记是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择标记的使用描述于Kelley等人，EMBO J.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene 61：155-164，1987(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸整合到没有选择标记的细胞的染色体中。
适当的载体是与所用宿主细胞兼容的那些。适当的载体可以源自，例如细菌、病毒(如噬菌体T7或源自M13的噬菌体)、黏粒、酵母或植物。获得和使用此种载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体的使用)。
启动子是本领域公知的。任何在宿主细胞中起作用的启动子可以用于在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。用于在多种宿主细胞中驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸表达的起始控制区或启动子很多并且是本领域技术人员所熟知的(参见，例如WO 2004/033646及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于表达目的核酸的载体)。事实上，任何能够驱动这些核酸的启动子都适于本发明，这些启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(用于在酵母菌中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于用于表达目的多肽的启动子和质粒系统)。可以使用报道的葡萄糖异构酶启动子突变体来改变由有效连接葡萄糖异构酶启动子的核酸所编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多种实施方式中，葡萄糖异构酶启动子含于低、中或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多种实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中(例如维持在每个细胞约1至约4拷贝的质粒)、中度拷贝质粒(例如维持在每个细胞约10至约15拷贝的质粒)或高拷贝质粒(例如维持在每个细胞约50或更高拷贝的质粒)。在一些实施方式中，异源或额外内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接T7启动子。在一些实施方式中，有效连接T7启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Trc启动子。在一些实施方式中，有效连接Trc启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Lac启动子。在一些实施方式中，有效连接Lac启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接内源启动子，如内源埃希氏菌、泛菌、芽孢杆菌、耶氏酵母、链霉菌、或木霉菌启动子或内源碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径启动子。在一些实施方式中，有效连接内源启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞染色体的复制质粒。在一些实施方式中，载体部分或全部整合到细胞染色体中。
在一些实施方式中，载体是任何在引入到真菌宿主细胞时，整合到该宿主细胞基因组中并复制的载体。载体列表参考Fungal Genetics Stock Center Catalogue of Strains(FGSC，网址为“fgsc.net”及其引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体)。其他适合的表达和/或整合载体的实例提供于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987，Supplement 30，section7.7.18)；van den Hondel等人，Bennett and Lasure(编)More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press pp.396-428，1991；以及美国专利号5,874,276，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC 100和pENTR/D。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适当的启动子。启动子可源自一种或多种编码宿主内源或异源的多肽的核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉宿主。启动子的适当的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1，和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbhl，它是诱导型启动子并且以检索号D86235保藏于GenBank，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞异源的启动子。有用的启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)基因的启动子(Nunberg等人，Mot Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln 1和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP 137280，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)。
在一些实施方式中，表达载体也包括终止序列。终止控制区也可源自宿主细胞天然的多种基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同来源。在另一实施方式中，终止序列是宿主细胞内源的。特别适合的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1。其他有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，Mot Cell Biol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBO J.3：1581-1585，1984；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌终止子)。任选地，可包括终止位点。对于多肽的有效表达，编码该多肽的DNA通过起始密码子而有效连接至选择的表达控制区以便表达导致适当信使RNA的形成。
在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子都源自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的编码区插入通用表达载体以便其处在表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分插入到强cbh1启动子的下游。
可以使用标准技术(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于适当DNA序列的筛选和载体的构建)将异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸插入载体，如表达载体。用于连接包含目的核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸)、启动子、终止子或其他序列的DNA构建体以及将它们插入适当载体的方法是本领域公知的。例如，可以使用限制性酶来切割异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸和载体。然后，可以将切割下的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的相容末端和切割下的载体相连。连接通常是在常规限制性位点处连接来完成。如果不存在此种位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989以及Bennett和Lasure，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，pp 70-76，1991，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于寡核苷酸接头)。此外，可以使用已知的重组技术(例如Invitrogen Life Technologies，Gateway Technology)来构建载体。
在一些实施方式中，可能想要以远高于目前在天然发生的细胞中发现的水平来过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。这一结果可通过将编码那些多肽的核酸选择性地克隆到多拷贝质粒或将那些核酸放在强诱导型或组成型启动子下而实现。过表达想要的多肽的方法是常见的并且是分子生物学领域公知的，并且实例可见于Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于克隆技术)。
下面的来源包括根据本发明有用的其他通用方法学的描述：Kreigler，Gene Transfer and Expression；A Laboratory Manual，1990和Ausubel等人编，Current Protocols in Molecular Biology，1994，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于分子生物学和克隆技术)。
示例性源生物
异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸(以及它们的编码多肽)可以获自任何天然含有异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的生物。如上所指出，通过多种生物，如细菌、酵母、植物和动物而天然形成异戊二烯。生物含有用于生产异戊二烯的MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者(图19)。因此，DXS核酸可以获自，例如任何含有DXP途径或含有MVA和DXP途径两者的生物。IDI和异戊二烯合酶核酸可以获自，例如任何含有MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者的生物。MVA途径核酸可以获自，例如任何含有MVA途径或MVA和DXP途径两者的生物。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的核酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的核酸序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的氨基酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的多肽序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸或多肽是源自在此所述的任何生物的突变核酸或多肽。如在此使用，“源自”指被导入一或多个突变的核酸或多肽来源。例如，“源自植物多肽”的多肽指通过向野生型植物多肽的序列(即，天然发生的序列)导入一或多个突变所产生的目的多肽。
在一些实施方式中，源生物是真菌，其实例是曲霉种如米曲霉和黑曲霉，酵母种如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)种如粟酒裂殖酵母(S.pombe)，和木霉种如里氏木霉。在一些实施方式中，源生物是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见，Alexopoulos，C.I.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌特征为营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其他复杂多糖所构成。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是菌丝延伸并且碳代谢是专性有氧的。丝状真菌的亲本细胞可为下述物种的细胞：木霉(如里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性形态，以前归类为T.longibrachiatum、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))(Sheir-Neirs等人，Appi.Microbiol.Biotechnol 20：46-53，1984；ATCCNo.56765和ATCC No.26921)；青霉属(Peniciliium sp.)，腐质霉属(Humicola sp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、疏毛腐质霉(H.lanuginose)或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢霉属(Chrysosporium sp.)(如C.iucknowense)、Gliociadium sp.、曲霉属(如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743、1993和Goedegebuur等人，Genet 41：89-98、2002)、镰孢(Fusarium sp.)、(如粉红镰孢(F.roseum)、赤禾镰孢(F.graminum)、F.cerealis、尖镰孢(F.oxysporuim)或F.venenatum)、脉孢菌(Neurospora sp.)、(如粗糙脉胞菌(N.crassa))、肉座菌(Hypocrea sp.)、毛霉菌(Mucor sp.)、(如米黑毛霉(M.miehei))、根霉菌(Rhizopus sp.)和Emericella sp.(也参见Innis等人，Sci.228：21-26，1985)，但不限于此。术语“Trichoderma”或“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.”指任何以前或目前被归类为木霉属的真菌属。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢或腐皮镰孢(F.solani)。曲霉菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，Curr Gene 41：89-98，2002，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌。在具体实施方式中，真菌是木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的并且非限制性实例包括ATCC No.13631，ATCC No.26921，ATCC No.56764，ATCC No.56765，ATCC No.56767和NRRL 15709，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53，1984，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。
在一些实施方式中，源生物是酵母，例如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomyces sp.)，毕氏酵母(Pichia sp.)或假丝酵母(Candida sp.)。
在一些实施方式中，源生物是细菌，例如芽孢杆菌菌株，如地衣芽孢杆菌或枯草杆菌，泛菌(Pantoea)菌株如柠檬泛菌(P.citrea)，假单胞菌(Pseudomonas)菌株如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，链霉菌(Streptomyces)菌株如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈赤链霉菌(S.rubiginosus)，或埃希氏菌菌株如大肠杆菌。
如在此所述，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有种，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经意识到该芽孢杆菌属持续经历分类学重组。因此，该属意在包括已经被重分类的种，包括但不限于如嗜热脂肪芽孢杆菌(现称作嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))的生物。认为在氧气存在下，抗性内孢子的生产是芽孢杆菌属的限定特征，但是这一特征也用于近来命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，源生物是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链霉菌(如，白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)和芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，源生物是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌或假单胞菌。
在一些实施方式中，源生物是植物，如来自豆科(Fabaceae)的植物，如蝶形花亚科。在一些实施方式中，源生物是葛，杨(如银白杨xtremulaCAC35696或银白杨)(Sasaki等人，FEBS Letters 579(11)：2514-2518，2005)，白杨(如Populus tremuloides)，或夏栎(Quercus robur)。
在一些实施方式中，源生物是藻类，如绿藻、红藻、灰绿藻(glaucophyte)、chlorarachniophyte、眼虫、chromista或沟鞭藻。
在一些实施方式中，源生物是蓝藻，如根据形态学而被分类为下述组的蓝藻：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
示例性宿主细胞
可以使用多种宿主细胞来表达异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽并按所要求保护的发明的方法来生产异戊二烯。示例性的宿主细胞包括来自在前面标题为“示例性源生物”部分所列出的任何生物的细胞。宿主细胞可为天然产生异戊二烯的细胞或不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸以增强使用这一途径的异戊二烯生产。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用MVA途径生产异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和/或一或多种MVA途径核酸以增强使用这一途径的异戊二烯生产。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二烯，并且加入一或多种MVA途径核酸来使用DXP途径以及MVA途径的部分或者全部来生产异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP和MVA两种途径生产异戊二烯，并且加入一或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸以增强使用这些途径中一种或两种的异戊二烯生产。
示例性转化方法
可以使用用于表达编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(例如，在此所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)。可以使用诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(如，脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、磷酸钙DNA沉淀孵育、DNA包被微粒的高速轰击以及原生质体融合这些技术进行DNA构建体或载体向宿主细胞的导入。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如，Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，Chapter 9，1987；Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。异源多肽在木霉菌中的表达描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO2005/001036；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，Bio Technol.7：596-603，1989；EP 244,234；EP 215,594；和Nevalainen等人，The Molecular Biology of Trich oderma and its Application to the Expression of Both Homologous and heterologous Genes，在Molecular Industrial Mycology，Leong和Berka编，Marcel Dekker Inc.，NY pp.129-148，1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化和表达方法)。对于曲霉菌株的转化也参考Cao等人，Sci.9：991-1001，2000；EP 238023；和Yelton等人，Proceedings.Nail.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，1984(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。所导入的核酸可整合到染色体DNA或者作为染色体外复制序列维持。
任何本领域已知的方法可用于筛选转化体。在一个非限制性实例中，包括amdS标记的稳定转化体与不稳定转化体的区别在于它们更快的生长速率以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成平滑而非齿状轮廓的圆形菌落。此外，在通过于固体非选择性培养基(例如缺乏乙酰胺的培养基)上生长转化体来进行稳定性的进一步检测的情形下，从这一培养基收获孢子，并测定随后在含有乙酰胺的选择培养基上萌发并生长的这些孢子的百分数。
在一些实施方式中，通过如下方法来转化真菌细胞，该方法涉及原生质体形成以及原生质体转化以及以已知方式再生细胞壁。在一个具体实施方式中，制备木霉菌用来转化包括从真菌菌丝体制备原生质体(参见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。在一些实施方式中，菌丝体获自萌发的营养孢子。用消化细胞壁的酶来处理菌丝体，得到原生质体。然后通过在悬浮培养基中渗透压稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。希望使用在悬浮培养基中约1.2M的山梨醇溶液。
DNA向宿主木霉菌菌株的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约10mM CaCl2到50mM CaCl2。除了摄取溶液中的钙离子，通常包括的其他化合物是缓冲系统，如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mMEDTA)或10mM MOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。尽管不希望受任何具体理论所限，但相信聚乙二醇用于融合细胞膜，从而允许培养基中的内容物被送到木霉菌菌株的细胞质中并且质粒DNA被转入核中。这一融合经常留下多拷贝的整合到宿主染色体的质粒DNA。
通常，在转化中使用含有木霉菌原生质体或细胞的悬浮液，这些原生质体或细胞以105至107/mL(如2×106/mL)的密度进行了通透性处理。在适当溶液(如1.2M山梨醇和50mM CaCl2)中100μL体积的这些原生质体或细胞与想要的DNA混合。通常，向摄取溶液中加入高浓度PEG。可将0.1至1体积的25％的PEG 4000加入原生质体悬浮液中。在一些实施方式中，约0.25体积加入原生质体悬浮液。也可将诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加剂加入摄取溶液，帮助转化。对于其他真菌宿主细胞可以用类似的方法(参见例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。
通常，然后在约0℃培养混合物10至30分钟的时间。然后向混合物加入另外的PEG以进一步增强想要的核酸序列的摄取。通常以转化混合物体积的5至15倍体积来添加25％的PEG 4000；然而，更大或更小的体积也可为适合的。希望25％的PEG 4000是转化混合物体积的约10倍。在加入PEG后，在室温或在冰上培养该转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后向熔化的生长培养基等份进一步加入原生质体悬浮液。当生长培养基包括生长选择(如乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体生长。
可根据常规方法进行细菌细胞的转化，如Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1982所述，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
示例性细胞培养基
本发明也包括产生异戊二烯的培养细胞或细胞群。“培养细胞”指在允许细胞经历一或多次细胞分裂的溶液(如细胞培养基)中的两种或更多种细胞。“培养细胞”不包括这样的植物细胞，其是含有已经分化成植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多种实施方式中，细胞培养物包括至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多的细胞。
任何碳源可以用于培养宿主细胞。术语“碳源”指能够被宿主细胞或生物所代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包括任何适于维持宿主细胞存活或生长的碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)、转化糖(例如，酶促处理的蔗糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生物柴油或制造肥皂工艺的甘油副产物)、二羟丙酮、单碳源、油(例如，植物油如玉米、棕榈或大豆油)、乙酸盐/酯、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物量碳源，如水解的生物量碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，聚合物，酸，醇，醛，酮，氨基酸，琥珀酸，乳酸，乙酸，乙醇、或者前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合合成的产物，包括但不限于葡萄糖。在一些实施方式中，碳水化合物是木糖或葡萄糖。
示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，而示例性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及碳水化合物之外的碳源(例如丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或酵母提取物的组分)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的多肽。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度为至少或约每升培养液5克(g/L，其中，培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度在约50和约400g/L之间，例如约100和约360g/L之间，约120和约360g/L之间，或约200和约300g/L之间。在一些实施方式中，碳水化合物的这一浓度包括在宿主细胞培养之前和/或培养期间，加入的碳水化合物的总量。
示例性脂类是任何含有一种或多种脂肪酸的物质，所述脂肪酸是饱和、不饱和或分支的C4以及以上的脂肪酸。
示例性油是室温为液态的脂类。在一些实施方式中，脂类含有一种或多种C4或更高的脂肪酸(例如，含有具有四个或更多个碳的一种或多种饱和、不饱和或分支脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻籽、产油微生物细胞、乌桕、或者是前述两种或更多种的任一组合。
示例性脂肪酸包括通式为RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、11-十八碳烯酸、亚油酸、棕榈油酸以及花生四烯酸。示例性多不饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”是饱和脂族基团。在一些实施方式中，碳源包括一或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的衍生物、或者脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)衍生物的盐。适当的盐包括但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是丙三醇的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是至少或约每升培养液1克(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是约10和约400g/L之间，例如约25和约300g/L之间，约60和约180g/L之间，或约75约150g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(i)脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯和(ii)碳水化合物，如葡萄糖。在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯与碳水化合物基于碳的比率是约1∶1(即每个碳水化合物碳对应脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。在具体实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的量为约60和约180g/L之间，而碳水化合物的量为约120和约360g/L之间。
示例性微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。示例性植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一或多种多肽。
示例性的可再生碳源包括奶酪乳清渗透物(cheese whey permeate)、玉米浆、甜菜糖浆、大麦芽、和来自任何前述物质的组分。示例性可再生碳源也包括存在于生物量中的乙酸盐/酯、葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，生物量如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵工艺的细胞废物，以及来自大豆、玉米、或小麦碾磨的蛋白副产物。在一些实施方式中，生物量碳源是木质纤维素、半纤维素或纤维素物质，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木材木浆、玉米、玉米穗轴或外壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产品、或来自谷物(如玉米、高粱、黑麦、小黑麦(triticate)、大麦、小麦和/或酒糟)的湿或干碾磨的副产物。示例性纤维素物质包括木、纸和纸浆废物、草本植物和果浆。在一些实施方式中，碳源包括任何植物部分，例如茎、谷物、根或块茎。在一些实施方式中，将任何下述植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、小黑麦、水稻、粟、大麦、木薯、豆类例如豆和豌豆、马铃薯、甜薯、香蕉、甘蔗、和/或树薯粉。在一些实施方式中，碳源是生物量水解物，如包括木糖和葡萄糖或包括蔗糖和葡萄糖的生物量水解物。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如生物量)在添加到细胞培养基之前被预处理。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理两者的组合(参见，例如Farzaneh等人，BioresourceTechnology 96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于可再生碳源的预处理)。在一些实施方式中，可再生碳源在添加到细胞培养基之前被部分或完全水解。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如玉米秸秆)在添加到细胞培养基之前经历氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见例如，Farzaneh等人，Bioresource Technology 96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理期间，可再生碳源在中等温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250至约300psi)下受无水液态氨处理约5分钟。然后快速释放压力。在这一过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素解晶作用的组合的化学和物理效应，以及增加的表面积使得纤维素和半纤维素几乎完全酶促转化成可发酵糖。AFEX预处理具有可以回收几乎全部的氨并再利用，同时将剩余物用作下游过程中的微生物的氮源的优点。此外，AFEX预处理不需要冲洗流。因此，在AFEX处理后的干物质回收基本上为100％。AFEX基本上是干-干工艺。经处理的可再生碳源是长期稳定的并且可以在酶促水解或发酵工艺中以极高固体负载来供料。纤维素和半纤维素在AFEX工艺中得到很好地保留，只有很少或没有降解。不需要在经历AFEX预处理的可再生碳源酶促水解之前进行中和。AFEX处理的碳源的酶促水解产生清洁的糖流用于随后的发酵。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于至少或约0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、或50％的葡萄糖(w/v)。可以使用标准HPLC方法，用葡萄糖作为参考来测量由碳源产生的葡萄糖的量，从而确定葡萄糖的当量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于约0.1和约20％之间的葡萄糖，例如约0.1和约10％之间的葡萄糖，约0.5和约10％之间的葡萄糖，约1和约10％之间的葡萄糖，约1和约5％之间的葡萄糖，或约1和约2％之间的葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或者酵母提取物的一种或多种组分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度为至少每升培养液1克酵母提取物(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是约1和约300g/L之间，例如约1和约200g/L之间，约5和约200g/L之间，约5和约100g/L之间，或约5和约60g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一或多种组分)和另一碳源如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物和另一碳源的比率为约1∶5，约1∶10，或约1∶20(w/w)。
此外，碳源也可为单碳底物，如二氧化碳或甲醇。来自单碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸酯)的丙三醇生产已经报道于甲基营养酵母中(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)和细菌中(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。这些生物可以同化单碳化合物，氧化态从甲烷到甲酸酯改变，并产生丙三醇。碳同化的途径可以通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸或通过木酮糖单磷酸(Gottschalk，Bacterial Metabolism，第二版，Springer-Verlag：New York，1986，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。核酮糖单磷酸途径包括甲酸酯与核酮糖-5-磷酸缩合以形成六碳糖，该六碳糖变成果糖并最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样地，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将单碳化合物同化到糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，也已知甲基营养生物利用许多含有其他含碳的化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.，[mt.Symp.]，第7版，415-32.编者：Murrell等人，出版：Intercept，Andover，UK，1993，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。类似地，众多假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见例如，Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，Aubert等人编，Academic Press，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养基)。示例性的生长培养基是常规商业制备的培养基如Luria Bertani(LB)培养液，Sabouraud Dextrose(SD)培养液，或酵母培养基(YM)培养液。也可使用其他限定的或合成的生长培养基，并且用于特定宿主细胞生长的适当培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了适当的碳源，希望细胞培养基含有适当的矿物、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适于培养物生长或增强异戊二烯生产的其他组分(参见例如，WO 2004/033646以及其中引用的文献和WO 96/35796以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于各自细胞培养基和细胞培养条件)。在异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸处于诱导型启动子控制下的一些实施方式中，希望诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以对于诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽表达有效的浓度添加到培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基具有抗生素(例如卡那霉素)，其对应于具有一或多种DXS、IDI和/或MVA途径核酸的载体上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)。
示例性细胞培养条件
适于维持并生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的。示例性的技术可见于Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt等人编，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994)或Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养技术。在一些实施方式中，在允许表达由插入到宿主细胞的核酸所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽中一种或多种的条件下，在培养基中培养细胞。
可以使用标准细胞培养条件来培养细胞(参见例如WO 2004/033646以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件)。细胞在适当温度、气体混合物和pH(例如约20至约37℃，约6％至约84％CO2，以及约5至约9的pH)下生长并维持。在一些实施方式中，细胞在35℃下于适当的细胞培养基中生长。在一些实施方式中，例如，培养物在接近28℃下于适当培养基中在摇动培养或发酵罐中培养直到达到想要量的异戊二烯生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围为约pH 5.0至约pH 9.0之间(例如约pH 6.0至约pH 8.0之间或pH 6.5至约pH 7.0之间)。根据宿主细胞的要求，反应可在需氧、缺氧或厌氧的条件下进行。对于给定丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的并且可见于科学文献和/或来自真菌源如美国典型培养物保藏中心和真菌遗传种源中心(Fungal Genetics Stock Center)。
在多种实施方式中，使用任何已知的发酵模式，如分批、补料分批或连续发酵方法来培养细胞。在一些实施方式中，使用发酵的分批方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成并且该组成在发酵期间不进行人工改变。因此，在发酵开始时，用想要的宿主细胞接种细胞培养基并且允许发酵而不向系统添加任何物质。然而，通常，“分批”发酵是对于添加碳源而言的分批并且经常尝试控制诸如pH和氧浓度的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组成持续改变直到发酵停止时。在分批培养物中，细胞稳定地经过静态停滞期到高生长对数期并最终至生长率减小或停止的稳定期。在一些实施方式中，对数期的细胞负责大部分的异戊二烯生产。在一些实施方式中，稳定期的细胞生产异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准分批系统的变型，例如补料分批(Fed-Batch)系统。补料分批发酵方法包括典型的分批系统，只是随着发酵进展而以增量添加碳源。当分解代谢产物阻遏倾向于抑制细胞代谢，以及想要细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以有限量或过量的碳源(例如葡萄糖)来进行补料分批发酵。对补料分批系统中实际碳源浓度的测量很难，并且因此基于可测因子如pH、溶氧和废气(如CO2)分压的改变来进行估算。分批以及补料分批发酵是本领域普遍且公知的，并且实例可见于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(1989)Sinauer Associates，Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续添加限定的发酵培养基并且同时除去等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，而细胞主要处于对数期生长。
连续发酵允许调控影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任何数量的因素。例如，一种方法将限制营养物如碳源或氮水平维持在固定比率并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，可以连续改变影响生长的许多因素同时保持细胞浓度(如培养基浑浊度所测量的浓度)恒定。连续系统致力于维持稳态生长条件。因此由于被丢掉的培养基，在发酵中，细胞损失相对于细胞生长速率保持平衡。调控用于连续发酵工艺的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域领域公知的并且多种方法详述于Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，(1989)Sinauer Associates，Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，细胞固定在基质上作为完整细胞催化剂并经历用于异戊二烯生产的发酵条件。
在一些实施方式中，将多瓶液体培养物放置在摇床上以便将氧气引入液体并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用培养箱来控制培养物生长的温度、湿度、摇速和/或其他条件。最简单的培养箱是具有可调加热器的保温箱，其通常高达～65℃。更精细的培养箱也可以包括降低温度的能力(通过冷冻)，或控制湿度或CO2水平的能力。大多数培养箱包括计时器；一些也可以编程以通过不同的温度、湿度水平等来循环。培养箱可以从桌面的尺寸到小房间的尺寸来变化。
如果需要，可以改变一部分或者所有细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在的有害代谢副产物和死亡细胞。在悬浮培养的情形下，可以利用离心或过滤该悬浮培养物而从培养基分离细胞并且然后在新鲜培养基中重悬细胞。在贴壁培养的情形下，可以通过吸取和替代而直接除去培养基。在一些实施方式中，细胞培养基允许在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中至少一部分细胞分开用于至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，并且不添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。在一些实施方案中，添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。
示例性异戊二烯生产
在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下，于细胞培养基中培养细胞。“峰值绝对生产力”指在培养细胞特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，在废气中异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产力时间点”指细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当废气中的异戊二烯的绝对量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值绝对生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产力约为任何在此所公开的任一异戊二烯量。
“峰值比生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比生产力通过用总生产力除以细胞量来测定，如由在600nm处的光密度(OD600)来测定。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产力约为任何在此所公开的每细胞的异戊二烯量。
“峰值体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，每体积培养液生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，当每体积培养液生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和时间量来测定。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比体积生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值比体积生产力约为任何在此所公开的每体积每时间异戊二烯量。
“峰值浓度”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞所生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值浓度时间点处进行测量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度约为任何在此所公开的异戊二烯量。
“平均体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的平均量。平均体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和时间量来测定。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产力约为任何在此所公开的每体积每时间异戊二烯量。
“累积总生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，生产的异戊二烯的累积总量。在一些实施方式中，测量异戊二烯的累计总量。在一些实施方式中，细胞的累计总生产力约为任何在此所公开的异戊二烯量。
在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000、或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(纳摩尔/gwcm/hr)生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间，例如在约2至约100纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约500纳摩尔/gwcm/hr、约150至约500纳摩尔/gwcm/hr、约500至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约1,000至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约5,000至约10,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、约50,000至约100,000纳摩尔/gwcm/hr、约100,000至约150,000纳摩尔/gwcm/hr、或约150,000至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约300至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约400至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约1,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约20,000纳摩尔/gwcm/hr、约5,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约100,000纳摩尔/gwcm/hr、约20,000至约150,000纳摩尔/gwcm/hr、或约20,000至约200,000纳摩尔/gwcm/hr。
以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯的量可以按照美国专利号5,849,970所公开来测量，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯生产的测量。例如，使用标准气相色谱系统来分析2ml顶空(例如，来自培养物的顶空，该培养物如在32℃，在密封瓶中以200rpm摇动约3小时培养的2mL培养物)的异戊二烯，该系统为例如以正-辛烷/多孔硅胶C柱(Alitech Associates，Inc.，Deerfield，Ill.)等温操作并且连接RGD2氧化汞还原气体检测器的系统(Trace Analytical，Menlo Park，CA)(参见例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，Plant Physiol.97：1588-1591，1991，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯生产的测量)。气相色谱面积单位通过标准异戊二烯浓度校准曲线而转换成nmol异戊二烯。在一些实施方式中，以细胞湿重计，细胞克数值通过获得细胞培养物的样品的A600值，然后根据具有已知A600值的细胞培养物的湿重的校准曲线将A600值转换成细胞克数来计算。在一些实施方式中，通过假定1升具有A600值为1的培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿重细胞来估计细胞克数。该值也除以该培养物被孵育的小时数，如3小时。
在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如约2至约100ng/gwcm/h之间，约100至约500ng/gwcm/h、约500至约1,000ng/gwcm/h、约1,000至约2,000ng/gwcm/h、或约2,000至约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000ng/gwcm/h、约100至约5,000ng/gwcm/h、约200至约2,000ng/gwcm/h、约200至约1,000ng/gwcm/h、约300至约1,000ng/gwcm/h、或约400至约1,000ng/gwcm/h。以ng/gwcm/h计的异戊二烯的量可以通过将在上面讨论的以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯生产的值乘以68.1来计算(如下面等式5所述)。
在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的量包括细胞和细胞培养基的体积)来生产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000mg/L培养液之间，例如约2至约100mg/L培养液之间、约100至约500mg/L培养液、约500至约1,000mg/L培养液、约1,000至约2,000mg/L培养液、或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000mg/L培养液之间、约100至约5,000mg/L培养液、约200至约2,000mg/L培养液、约200至约1,000mg/L培养液、约300至约1,000mg/L培养液、或约400至约1,000mg/L培养液。
来自摇瓶顶空或类似培养物的以mg异戊二烯/L计的异戊二烯的比生产力可以这样测量：在OD600值为约1.0下，从细胞培养物取1ml样品，将其至于20mL瓶中，孵育30分钟，然后测量顶空中异戊二烯的量(如例如，实施例I，第II部分所述)。如果OD600值不是1.0，那么可以通过除以OD600值而将测量归一为OD600值。mg异戊二烯/L顶空的值可以通过乘以因数38而转换成培养液的mg/L培养液/hr/OD600。以mg/L培养液/hr/OD600为单位的值可以乘以小时数以及OD600值以获得以mg异戊二烯/L培养液为单位的累积滴定度。
在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积生产力为高于或约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1,200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更高mg异戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约0.1至约3,500mg/L培养液/hr之间，例如在约0.1至约100mg/L培养液/hr之间、约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、约1,000至约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000至约2,500mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、或约3,000至约3,500mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约10至约3,500mg/L培养液/hr之间、约100至约3,500mg/L培养液/hr、约200至约1,000mg/L培养液/hr、约200至约1,500mg/L培养液/hr、约1,000至约3,000mg/L培养液/hr、或约1,500至约3,000mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体积生产力高于或约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多mg异戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产力在约0.5至约15,000mg/L培养液/hr之间，例如约0.5至约10mg/L培养液/hr之间、约1.0至约100mg/L培养液/hr、约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、约1,000至约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000至约2,500mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、约3,000至约3,500mg/L培养液/hr、约3,500至约5,000mg/L培养液/hr、约5,000至约7,500mg/L培养液/hr、约7,500至约10,000mg/L培养液/hr、约10,000至约12,500mg/L培养液/h、或约12,500至约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产力在约10至约15,000mg/L培养液/hr之间、约100至约2,500mg/L培养液/hr、约1,000至约5,000mg/L培养液/hr、约2,500至约7,500mg/L培养液/hr、约5,000至约10,000mg/L培养液/hr、约7,500至约12,500mg/L培养液/hr、或约10,000至约15,000mg/L培养液/hr。
可以通过对发酵罐废气取样品，按所述，如在实施例I，第II部分所述分析它的异戊二烯量(以例如mg异戊二烯/L气体为单位)并将这一值乘以废气流经每升培养液的速率(例如，以1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)来测量发酵罐中以mg/L培养液/hr计的瞬间异戊二烯生产。因此，1mg/L气体的废气水平对应于在空气流速为1vvm时，60mg/L培养液/hr的瞬间生产力。如果需要，可以将以mg/L培养液/hr为单位的值除以OD600值以获得以mg/L培养液/hr/OD为单位的比速率。mg异戊二烯/L气体的平均值可以通过将这一平均废气异戊二烯浓度乘以发酵期间每升发酵培养液冒出的废气的总量而转换成总产物生产力(每升发酵培养液的异戊二烯克数，mg/L培养液)。因此，在1vvm时10小时内0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300mg异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养细胞将细胞培养基中的大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、或90.0摩尔％的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约90.0摩尔％之间，例如约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、约-.05至约0.15％，0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％、约1.0至约1.6％、约1.6至约3.0％、约3.0至约5.0％、约5.0至约8.0％、约8.0至约10.0％、约10.0至约15.0％、约15.0至约20.0％、约20.0至约25.0％、约25.0％至30.0％、约30.0％至35.0％、约35.0％至40.0％、约45.0％至50.0％、约50.0％至55.0％、约55.0％至60.0％、约60.0％至65.0％、约65.0％至70.0％、约75.0％至80.0％、约80.0％至85.0％、或约85.0％至90.0％。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约0.4摩尔％，0.002至约0.16摩尔％，0.04至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％、约0.05至约0.3摩尔％、约0.1至0.3摩尔％、约0.3至约1.0摩尔％、约1.0至约5.0摩尔％、约2至约5.0摩尔％、约5.0至约10.0摩尔％、约7至约10.0摩尔％、约10.0至约20.0摩尔％、约12至约20.0摩尔％、约16至约20.0摩尔％、约18至约20.0摩尔％、约18至23.2摩尔％、约18至23.6摩尔％、约18至约23.8摩尔％、约18至约24.0摩尔％、约18至约25.0摩尔％、约20至约30.0摩尔％、约30至约40.0摩尔％、约30至约50.0摩尔％、约30至约60.0摩尔％、约30至约70.0摩尔％、约30至约80.0摩尔％、或约30至约90.0摩尔％。
碳转化成异戊二烯的百分数(也称作％碳产量)可以通过将所生产的异戊二烯的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如在分批和补料葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)而测量。这一数字乘以100％得到百分数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产量＝(生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)＊100
对于这一计算，可以假定酵母提取物含有50％w/w碳。作为实例，对于实施例7，第III部分所述的500升，碳转化成异戊二烯的百分数可以按等式2所示来计算。
等式2
％碳产量＝(39.1g异戊二烯＊1/68.1mol/g＊5C/mol)/[(181221g葡萄糖＊1/180mol/g＊6C/mol)+(17780g酵母提取物＊0.5＊1/12mol/g)]＊100＝0.042％
对于在此所述的两个500升发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳转化成异戊二烯的百分数在0.04-0.06％之间。使用在此所述的14升系统实现了0.11-0.16％碳产量。
本领域熟练技术人员可以容易地将异戊二烯生产力或生产的异戊二烯的量转化成任何其它单位。示例性的等式列于下面用于在单位间的相互转换。
异戊二烯生产力(总的和比生产力)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重量)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(鉴于异戊二烯的分子量)
等式6
1mnol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(以O2流速为90L/hr每升培养液)
等式7
1ug异戊二烯/L气体废气中的异戊二烯＝60ug异戊二烯/L培养液/hr，流速为每L培养液60L气体(1vvm)
滴定度(总和比)单位
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的一升培养液具有约150mg的总细胞蛋白)(比生产力)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总滴定度)
如果需要，可以使用等式10将包括细胞湿重的任何单位转换成包括细胞干重的相应单位。
等式10
细胞干重＝细胞湿重/3.3
在本发明所包含的一些实施方式中，包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
在本发明所包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸以及编码DXS、IDI和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
示例性异戊二烯纯化方法
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如，可以使用标准技术来回收使用本发明组合物和方法所生产的异戊二烯。例如气提、分馏、吸附/解吸附、全蒸发、从固相热或真空解吸异戊二烯、或用溶剂提取固定化或吸附在固相上的异戊二烯(参见例如，美国专利号4,703,007和4,570,029，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯回收和纯化方法)。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及以液体形式分离异戊二烯(例如异戊二烯纯溶液或溶剂中的异戊二烯溶液)。气提涉及以连续方式从发酵废气流除去异戊二烯蒸汽。此种去除可以以多种不同方式实现，包括但不限于吸附至固相，分配到液相，或直接冷凝。在一些实施方式中，在蒸发露点以上，稀释异戊二烯蒸汽流的膜富集导致液体异戊二烯的冷凝。
异戊二烯的回收可包括一步或多步。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是同时进行的。例如，异戊二烯可以直接从废气流冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是顺序进行的。例如，可将异戊二烯吸附至固相然后用溶剂从固相提取。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法进一步包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术来纯化使用本发明组合物和方法所生产的异戊二烯。纯化指一种方法，通过该方法将异戊二烯与在生产异戊二烯时存在的一种或多种组分分离。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体来获得。纯化方法的实例包括(i)以液体提取物从溶液蒸馏和(ii)色谱。如在此使用，“纯化的异戊二烯”指已经与在生产异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是按重量计，至少约20％不含有在生产异戊二烯时存在的其它组分。在多种实施方式中，异戊二烯是按重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％纯的。纯度可以通过任何适当的方法来检测，例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括使异戊二烯聚合。例如，可以使用标准方法来聚合纯化的异戊二烯以形成顺式聚异戊二烯或使用标准方法形成其他下游产物。
额外的方法和组合物在2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,186、2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,189、2008年9月15日提交的美国临时专利申请号61/097,163，和美国临时专利申请序列号12/335,071，所述全部文献通过引用的方式完整并入，特别在用于产生异戊二烯组合物和方法的方面。
利用适用于从石油化学源衍生的异戊二烯的相同技术，本发明的异戊二烯可以聚合成有用的聚合物，包括合成橡胶。根据适用于二烯单体聚合过程的多种方法合适地实施聚合和回收此类含异戊二烯的聚合物。这包括在排除空气和其他大气杂质、尤其氧气和水汽的条件下的分批、半连续或连续操作。异戊二烯单体的聚合也可以在众多不同的聚合反应器系统中进行，包括但不限于本体聚合、气相聚合、溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合和沉淀聚合系统。商业优选的聚合方法一般是溶液聚合和乳液聚合。
聚合反应也可以使用种类繁多的不同聚合引发剂或催化剂系统引发。使用的引发剂或催化剂系统将取决于正在合成的含有异戊二烯的聚合物所需特征。例如，在正在制造顺-1，4-聚异戊二烯橡胶的情况下，可以利用四氯化钛和三乙基铝组成的齐格勒-纳塔催化剂系统。在合成其他类型含有异戊二烯的聚合物时，可能需要其他类型的引发剂系统。含有异戊二烯的聚合物可以使用自由基引发剂、氧化还原反应引发剂、阴离子引发剂或阳离子引发剂制备。优选的引发或催化剂系统将取决于聚合物微结构、分子量、分子量分布和想要的链支化(chain branching)。优选的引发剂也会取决于异戊二烯是否进行均聚或与额外单体共聚。在共聚物的情况下，使用的引发剂还将取决于是否希望正在制造的聚合物具有从特定单体衍生的重复单元的随机、非随机或锥形(tapered)分布。例如，阴离子引发剂或受控的自由基引发剂一般在合成具有异戊二烯嵌段的嵌段共聚物中使用。
重要的是使用的引发剂或催化剂系统与所用类型的聚合系统相容。例如，在乳液聚合中，一般使用自由基引发剂。在溶液聚合，一般使用阴离子引发剂，如烷基锂化合物来引发聚合。自由基聚合的有利之处是反应一般可以在比离子聚合更不严格的条件下实施。自由基引发系统也显示对痕量杂质的更大耐受性。
常规的乳液配方也可以用于聚合本发明的异戊二烯；但是，一些限制和修改可能源自包含额外的共单体或对聚合参数的限制。本领域已知的离子型表面活性剂，包括磺酸盐去垢剂和羧酸盐、硫酸盐和磷酸盐皂类在本发明中有用。离子型表面活性剂的水平基于有机组分总重量计算并且可以是每100重量份的有机组分从约2至30重量份离子型表面活性剂。
用于实施本发明的自由基引发剂的实例是称作″氧化还原″引发剂的那些自由基引发剂，如螯合铁盐、甲醛次硫酸钠和有机氢过氧化物的组合。有机氢过氧化物的代表是氢过氧化枯烯、氢过氧化对孟烷和叔丁基氢过氧化物。优选叔丁基氢过氧化物(t-BHP)、过乙酸叔丁酯(t-BPA)和″偶氮″引发剂如偶氮二异丁腈(AIBN)。
自由基聚合中所用的反应温度一般维持在0℃至150℃范围。约20℃和120℃之间的温度通常是优选的，并且60℃至100℃范围内的温度通常是最优选的。反应压力不是关键的。压力一般仅是足够高以维持液相反应条件；它可以是自生压力，其会根据反应混合物的组分和温度变化，或它可以更高的，例如，直至1000psi。
在分批操作中，聚合时间可以在需要时从短如几分钟变化至长如几日。当单体不再被吸附或根据需要更早时，例如，当反应混合物变得太黏时，可以终止分批过程中的聚合。在连续操作中，可以使聚合混合物穿过一个反应器或具有任意适合设计的一组反应器。在此类情况下通过改变在反应器系统中的停留时间适当地调节聚合反应。停留时间随反应器系统的类型变化并且范围从10至15分钟至24小时或更多小时。单体在反应混合物中的浓度可以根据所用的条件从5％重量的反应混合物向上变动；优选从20至80％重量的范围。
异戊二烯的聚合也可以在反应条件下为液体并呈相对惰性的适合有机溶剂中实施。该溶剂可以具有每分子与二烯反应物相同数目的碳原子或它可以处于不同的沸腾范围内。优选的有机溶剂通常是烷和环烷类。所述溶剂可以由一种或多种芳族、链烷或环链烷化合物组成。这些溶剂通常会含有每分子约4个碳原子至每分子约10个碳原子并且在聚合的条件会呈液态。适合的有机溶剂的一些代表性实例包括单独或处于混合的戊烷、异辛烷、环己烷、甲基环己烷、异己烷、正庚烷、正辛烷、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、乙苯、二乙苯、异丁苯、石油醚、煤油、石油溶剂油、石脑油等。也可以使用芳烃(如苯、甲苯、异丙基苯、二甲苯)或卤代芳族化合物(如氯苯、溴苯或邻二氯苯)，但是在大多数情况下不是优选的。其他有用的溶剂包括四氢呋喃和二
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烷。
在溶液聚合中，聚合介质中中将通常存在5至30重量百分数的单体。此类聚合介质当然由有机溶剂和单体组成。在大多数情况下，将优选该聚合介质含有10至25重量百分数的单体。一般更优选该聚合介质含有15至20重量百分数的单体。
一般实施该聚合以实现单体基本上完全转化成聚合物。可以利用逐步添加单体或链转移剂来避免过多凝胶形成。这种微小修改属于技术人员的能力范围内。在聚合完成后，从聚合物的浆液或溶液回收该聚合物。简单的过滤可能足以将聚合物与稀释剂分开。可以使用用于将聚合物与稀释剂分开的其他手段。该聚合物可以单独地或在反应混合物中混合时被处理以分离残留物。这种处理可以用醇如甲醇、乙醇或异丙醇、用酸化的醇或用其他的相似极性液体进行。在许多情况下，在烃溶液中获得聚合物，并且可以通过用酸化的醇(例如，快速搅拌的含有2％盐酸的甲醇或异丙醇)凝结来回收所述聚合物。在这个初步凝结后，可以用适宜的液体如甲醇洗涤所述聚合物。
如先前已经指出，异戊二烯也可以与一种或多种额外的共单体共聚合以产生有用的共聚物。根据所包含的异戊二烯和所涉及的其他单体的相对量，在聚合配方或反应条件上的一些调整可能是必需的，旨在获得满意的聚合物形成率。用于实施本发明的共单体的实例包括其他二烯单体，如1，3-丁二烯和己二烯。乙烯基芳香单体也可以与异戊二烯共聚合以产生有用的聚合物。此类乙烯基芳香单体包括苯乙烯、á-甲基苯乙烯、二乙烯基苯、氯乙烯、乙酸乙烯酯、1，1-二氯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、乙烯吡啶、丙烯腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸、衣康酸和丙烯酸。不同共单体的混合物也可以在不同的水平上使用。
异戊二烯单体也可以与一种或多种额外的共轭二烯属单体共聚合。通常优选含有4至8个碳原子的那些共轭二烯属单体用于商业目的。可以与异戊二烯共聚合的共轭二烯属单体的一些具体代表性实例包括单独或混合的1，3-丁二烯、2，3-二甲基-1，3-丁二烯、戊间二烯、3-丁基-1，3-辛二烯、2-苯基-1，3-丁二烯等。
可以与异戊二烯共聚合的烯键式不饱和单体的一些代表性实例包括丙烯酸烷基酯，如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸甲酯等；具有一个或多个CH2＝CH端基的亚乙烯基单体；乙烯基芳族化合物如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、溴苯乙烯、氯苯乙烯、氟苯乙烯等；α-烯烃如乙烯、丙烯、1-丁烯等；卤乙烯，如溴乙烯、氯乙烯、氟乙烯、碘乙烯、1，2-二溴乙烯、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯等；乙烯酯，如乙酸乙烯酯；α，β-烯属不饱和腈，如丙烯腈和甲基丙烯腈；α，β-烯属不饱和酰胺，如丙烯酰胺、N-甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等。官能化单体也可以任选地在产生有用橡胶状聚合物中与异戊二烯共聚合。这种类型的官能化单体和可以将这类单体掺入橡胶状聚合物的方法在美国专利6,627,721和美国专利6,936,669中描述。出于描述述此类官能化单体和它们掺入含有异戊二烯的聚合物的目的，在此通过引用的方式并入美国专利6,627,721和美国专利6,936,669教导的内容。
作为一种或多种二烯单体与一种或多种其他烯键不饱和单体的共聚物的橡胶状聚合物通常会含有从约50重量百分数至约99重量百分数共轭二烯烃单体(包括异戊二烯)和从约1重量百分数至约50重量百分数的除了所述共轭烯烃单体之外的其他烯键不饱和单体。例如，异戊二烯单体与乙烯基芳香单体的橡胶状共聚物如苯乙烯-异戊二烯橡胶通常会含有从50至95重量百分数的异戊二烯和从5至50重量百分数的乙烯基芳香单体。
乙烯基芳香单体可能是最重要类别的烯键不饱和单体，它们通常被掺入含有异戊二烯的橡胶。此类乙烯基芳香单体一般含有8至20个碳原子。通常，乙烯基芳香单体会含有8至14个碳原子。最广泛使用的乙烯基芳香单体是苯乙烯。可以使用的乙烯基芳香单体的一些实例包括苯乙烯、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘、α-甲基苯乙烯、4-苯基苯乙烯、3-甲基苯乙烯等。
含有异戊二烯的橡胶状聚合物的一些代表性实例包括顺-1，3-聚异戊二烯均聚物橡胶、3，4-聚异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯橡胶(SIR)、α-甲基苯乙烯-异戊二烯橡胶、苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶(SIBR)、苯乙烯-异戊二烯橡胶(SIR)、异戊二烯-丁二烯橡胶(IBR)、α-甲基苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶和α-甲基苯乙烯-苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶。在橡胶状聚合物由衍生自二种或多种单体的重复单元组成的情况下，衍生自不同单体(包括异戊二烯)的重复单元通常会以基本上随机的方式分布。衍生自所述单体的重复单元与该单体不同之处在于双键通常被聚合反应消耗掉。
橡胶状聚合物可以通过分批方法中的溶液聚合、通过连续方法、通过将异戊二烯单体和任选地额外单体连续充入聚合区来制备。该聚合区一般会是聚合反应器或一组聚合反应器。聚合区通常会提供搅拌以保持单体、聚合物、引发剂和改性剂在聚合区中的有机溶剂内充分分散。此类连续聚合一般在多反应器系统中进行。合成的橡胶状聚合物从聚合区连续撤出。该聚合区中得到的单体转化率通常将是至少约85％。优选单体转化率是至少约90％。
聚合可以用阴离子引发剂(如烷基锂化合物)引发。可以使用的烷基锂化合物一般会含有1至约8个碳原子，如正丁基锂。使用的锂引发剂的量将随正在聚合的单体和随正在合成的聚合物所希望的分子量变动。然而，作为一般原则，将使用0.01至1phm(每100重量份单体的份数)的锂引发剂。在大多数情况下，会使用0.01至0.1phm的锂引发剂，优选使用0.025至0.07phm的锂引发剂。
这类阴离子聚合任选地在极性改性剂(如烷基四氢糠基醚)存在下进行。可以使用的具体极性改性剂的一些代表性实例包括甲基四氢糠基醚、乙基四氢糠基醚、丙基四氢糠基醚、丁基四氢糠基醚、己基四氢糠基醚、辛基四氢糠基醚、十二烷基四氢糠基醚、二乙醚、二正丙基醚、二异丙基醚、二正丁基醚、四氢呋喃、二
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烷、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二甘醇二甲醚、二甘醇二乙醚、三甘醇二甲醚、三甲胺、三乙胺、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉或N-苯基吗啉。
极性改性剂一般会以这样的水平使用，其中极性改性剂对锂引发剂之摩尔比在约0.01∶1至约5∶1的范围内。极性改性剂对锂引发剂之摩尔比更一般会在约0.1∶1至约4∶1的范围内。极性改性剂对锂引发剂之摩尔比通常优选是在约0.25∶1至约3∶1的范围内。极性改性剂对锂引发剂之摩尔比通常最优选是在约0.5∶1至约3∶2的范围内。
此类阴离子聚合中使用的聚合温度可以在约-20℃至约180℃的大范围内变动。在大多数情况下，会使用在约30℃至约125℃范围内的聚合温度。一般优选聚合温度是在约45℃至约100℃的范围内。一般最优选聚合温度是在约60℃至约90℃的范围内。使用的压力通常足以在聚合反应条件下基本上维持液相。
异戊二烯的此类阴离子聚合通常进行足以允许存在的异戊二烯和任何额外单体基本上彻底聚合的时间长度。换而言之，通常实施该聚合至实现至少约85％的高转化率。聚合随后通常通过添加试剂如醇、终止剂或偶联剂终止。例如，卤化锡和/或卤化硅可以用作偶联剂。在希望非对称偶联的情况下，连续地添加卤化锡和/或卤化硅。锡偶联剂和/或硅偶联剂的这种连续添加通常在与正在发生本体聚合的区域分隔的反应区内进行。在希望程度的转化已经达到后，通常将偶联剂添加于独立的反应容器中。偶联剂可以在烃溶液中例如环己烷中添加至聚合混合物，伴以用于分布和反应的适合搅拌。换而言之，偶联剂一般仅会在高度转化已经达到后添加。例如，偶联剂通常仅会在已经实现大于约85％的单体转化率后添加。一般优选在添加偶联剂之前单体转化率达到至少约90％。
用作偶联剂的卤化锡通常会是四卤化锡，如四氯化锡、四溴化锡、四氟化锡或四碘化锡。然而，也可以任选地使用三卤化锡。聚合物与具有最多三条臂的三卤化锡偶联。这当然与具有最多四条臂的四卤化锡偶联的聚合物形成对比。为诱导更高水平的支化，通常优选四卤化锡。作为一般原则，最优选四氯化锡。
可以使用的硅偶联剂通常会是四卤化硅，如四氯化硅、四溴化硅、四氟化硅或四碘化硅。然而，也可以任选地使用三卤化硅。聚合物与具有最多三条臂的三卤化硅偶联。这当然与具有最多四条臂的四卤化硅偶联的聚合物形成对比。为诱导更高水平的支化，通常优选四卤化硅。作为一般原则，四卤化硅是最优选的硅偶联剂。
卤化锡和卤化硅的组合可以任选地用来偶联橡胶状聚合物。使用锡偶联剂和硅偶联剂的这种组合，可以实现轮胎橡胶的改善特性，如较低的滞后现象。特别希望的是在含有二氧化硅和炭黑的轮胎胎面复合物中利用锡偶联剂和硅偶联剂的组合。在这类情况下，偶联橡胶状聚合物中所用的卤化锡对卤化硅的摩尔比通常会在20∶80至95∶5的范围内。偶联橡胶状聚合物中所用的卤化锡对卤化硅的摩尔比更常见地会在40∶60至90∶10的范围内。偶联橡胶状聚合物中所用的卤化锡对卤化硅的摩尔比优选地会在60∶40至85∶15的范围内。偶联橡胶状聚合物中所用的卤化锡对卤化硅的摩尔比最优选地会在65∶35至80∶20的范围内。
广义地和示例地，每100克橡胶状聚合物使用约0.01至4.5毫当量范围的锡偶联剂(卤化锡和卤化硅)。通常优选每100克聚合物使用约0.01至约1.5毫当量的偶联剂以获得希望的门尼(Mooney)黏度。更大的量倾向于导致产生含有末端反应基团或不充分的偶联的聚合物。每当量锂1当量锡偶联剂视为最大支化的最适量。例如，如果使用四卤化锡和四卤化硅的混合物作为偶联剂，将使用每4摩尔有效锂末端1摩尔该偶联剂。在使用三卤化锡和三卤化硅的混合物作为偶联剂的情况下，将最佳地使用每3摩尔有效锂末端1摩尔该偶联剂。偶联剂可以在烃溶液中例如环己烷中添加至反应器中的聚合混合物，伴以用于分布和反应的适合搅拌。
在偶联已经完成后，可以任选地添加螯合性叔烷基1，2-乙二胺或环状醇的金属盐至聚合物胶状物以稳定化偶联的橡胶状聚合物。在大多数情况下，将添加约0.01phr(重量份每100重量份的干燥橡胶)至约2phr的螯合性烷基1，2-乙二胺或环状醇金属盐至聚合物胶泥以稳定化橡胶状聚合物。常见地，将添加约0.05phr至约1phr的螯合性烷基1，2-乙二胺或环状醇金属盐。更常见地，将添加约0.1phr至约0.6phr的螯合性烷基1，2-乙二胺或环状醇金属盐至聚合物胶泥以稳定化橡胶状聚合物。
可以用来停止聚合和″终止″活性橡胶状聚合物的终止剂包括单卤化锡、单卤化硅、N，N，N′，N′-四二烷基二氨基-二苯酮(如四甲基二氨基二苯酮等)、N，N-二烷基氨基-苯甲醛(如二甲基氨基苯甲醛等)、1，3-二烷基-2-咪唑啉酮(如1，3-二甲基-2-咪唑啉酮等)、1-烷基取代的吡咯烷酮；1-芳基取代的吡咯烷酮、含有约5至约20个碳原子的二烷基-二环烷基-碳二亚胺和含有约5至约20个碳原子的二环烷基-碳二亚胺。
在终止步骤和任选地稳定化步骤已经完成后，可以从有机溶剂回收橡胶状聚合物。偶联的橡胶状聚合物可以通过手段如化学(醇)凝结法、热去溶剂化或其他合适方法从有机溶剂和残余物中回收。例如，经常希望通过添加含有约1至约4个碳原子的低级醇至聚合物溶液从有机溶剂中沉淀橡胶状聚合物。用于从聚合物胶泥沉淀出橡胶的合适低级醇包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和叔丁醇。利用低级醇来从聚合物胶泥沉淀出橡胶状聚合物也通过失活锂末端基团″终止″了任何剩余的活性聚合物。在偶联的橡胶状聚合物从该溶液回收后，汽提法可以用来减少偶联的橡胶状聚合物中挥发性有机化合物的水平。另外，有机溶剂可以通过圆筒干燥、挤出机干燥、真空干燥等从橡胶状聚合物去除。
如先前已经解释，相似到足以允许自由替换天然橡胶的合成的顺-1，3-聚异戊二烯橡胶可以通过用齐格勒-纳塔催化剂系统使异戊二烯进行溶液聚合来产生，其中所述的齐格勒-纳塔催化剂系统由四氯化钛(TiCl4)和有机铝化合物如三乙基铝Al-(CH2-CH3)3组成。用这种齐格勒-纳塔催化剂系统产生的聚异戊二烯橡胶具有直至98％的高的顺-微结构含量，其中所述的顺-微结构含量极接近于具有几乎100％顺-微结构含量的来自巴西橡胶树(Hevea Brasiliensis)(普通橡胶树)的天然橡胶的顺-微结构含量。然而，聚合物微结构上的这种轻微差异导致物理特性在某些方面的劣于天然橡胶。例如，天然橡胶一般显示出优于合成的顺-1，4-聚异戊二烯橡胶的原始强度。另一方面，在某些其他方面，合成的顺-1，4-聚异戊二烯橡胶优于来自巴西橡胶树、银胶菊和蒲公英青橡胶草(Taraxacum kok-Saghyz)(俄国蒲公英)的天然橡胶。例如，因为天然橡胶来自植物，它含有残余蛋白质、皂类、树脂和糖类。这些残余杂质的存在可能在一些应用中极端有害。例如，残余蛋白质在橡胶产品中的存在可以在一些人中引起严重的变态反应并且是一些含橡胶产品如橡胶手套、避孕套、注射器柱塞等的制造商的主要顾虑。在任何情况下，本发明的合成的聚异戊二烯均聚物橡胶不含在天然橡胶(包括来自巴西橡胶树的天然橡胶)中存在的蛋白质、皂类、树脂和糖类。
美国专利3,931,136公开了用于产生高分子量顺-1，4-聚异戊二烯的方法。该方法中所用的催化剂是一种三组分混合物：(A)四氯化钛，(B)式AlR3的有机铝化合物，其中每个R代表烷基，优选地含有1至8个碳原子的烷基，芳基，优选地苯基，或环烷基，优选地环己基，和(C)下式的β-二酮：
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其中R′和R″可以相同或不同并且代表烷基或芳基。R′和R″将优选地代表含有1至5个碳原子的烷基或苯基。美国专利3,931,136的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成顺-1，4-聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
用于以催化剂系统合成顺-1，4-聚异戊二烯的溶液聚合技术由美国专利4,430,487公开，其中所述的催化剂系统由四氯化钛和三烷基铝化合物的混合物组成。在该方法中，用4，7-二氮杂-癸烷-1，10-二胺迅速停止聚合。美国专利4,430,487的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成顺-1，4-聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
通过使用由四卤化钛、三烷基铝化合物和二苯醚组成的催化剂系统聚合异戊二烯合成顺-1，4-聚异戊二烯可以导致不想要的凝胶形成。美国专利5,919,876公开了可以通过在二芳胺(如对-苯乙烯化二苯胺)存在下实施这种聚合来减少凝胶形成。美国专利5,919,876更具体地公开了用于合成具有低凝胶含量的顺-1，4-聚异戊二烯的方法，该方法包括在惰性有机溶剂中用预制催化剂系统聚合异戊二烯，所述的预制催化剂系统通过有机铝化合物与四卤化钛(如四氯化钛)在至少一种醚存在下反应而产生，其中所述的聚合在约0℃至约100℃范围内的温度下进行，并且其中所述的聚合在二芳胺存在下进行。美国专利5,919,867的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成顺-1，4-聚异戊二烯橡胶中使用的催化剂系统和溶液聚合技术。
顺-1，4-聚异戊二烯可以通过利用预制催化剂的气相聚合产生，其中所述的预制催化剂系统通过有机铝化合物与四氯化钛反应而产生。美国专利6,066,705公开了用于将异戊二烯在下述方法中气相聚合成顺-1，4-聚异戊二烯的方法，所述方法包括步骤：(1)将所述的异戊二烯和预制催化剂系统充入反应区，所述的预制催化剂系统通过有机铝化合物与四氯化钛反应，优选地在至少一种醚存在下反应而产生；其中在所述的反应区中通过温度和压力的合适组合维持异戊二烯处于气相；(2)允许所述的异戊二烯在约35℃至约70℃范围内的温度聚合成顺-1，4-聚异戊二烯；并且(3)从所述的反应区撤出所述的顺-1，4-聚异戊二烯。已经确定凝胶形成可以通过在二芳胺(如对-苯乙烯化二苯胺)存在下实施异戊二烯单体的这种聚合来减少凝胶形成。美国专利6,066,705的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成顺-1，4-聚异戊二烯橡胶中使用的催化剂系统和气相聚合技术。
澄清(透明)并且高纯度的聚异戊二烯橡胶可以利用钕催化剂系统合成。美国专利6,780,948涉及用于合成聚异戊二烯橡胶的这种方法，其包括在钕催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，其中所述的钕催化剂系统通过下述方式制备：(1)羧酸钕与有机铝化合物在异戊二烯存在下反应约10分钟至约30分钟时间以产生钕-铝催化剂组分，并(2)随后钕-铝催化剂组分与二烷基氯化铝反应至少30分钟时间以产生钕催化剂系统。美国专利5,919,867的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成高纯度顺-1，4-聚异戊二烯橡胶中使用的催化剂系统和聚合技术。
美国专利7,091,150和美国专利7,199,201公开了钕催化剂系统将异戊二烯单体聚合成具有极高顺-微结构含量和高立体规整性的合成聚异戊二烯橡胶的用途。这种聚异戊二烯橡胶会在应力下结晶并可以以类似于天然橡胶的方式复合入橡胶制剂中。该技术更具体地公开了用于合成聚异戊二烯橡胶的方法，其包括在钕催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，其中所述的钕催化剂系统通过下述方法制备，所述方法包括(1)羧酸钕与有机溶剂中的有机铝化合物反应以产生钕-铝催化剂组分，并(2)随后钕-铝催化剂组分与元素卤反应以产生钕催化剂系统。在实施该方法中，钕催化剂系统一般避开含镍化合物。
由该方法产生的合成聚异戊二烯橡胶由衍生自异戊二烯的重复单元组成，其中合成的聚异戊二烯橡胶具有在98.0％至99.5％范围内的顺-微结构含量，在0.5％至2.0％范围内的3，4-微结构含量和在0.0％至0.5％范围内的反-微结构含量。美国专利7,091,150和美国专利7,199,201的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成具有极高顺-微结构含量和高立体规整性的顺-1，4-聚异戊二烯橡胶中使用的钕催化剂系统和聚合技术。
也可以在合成具有极高顺-微结构含量的聚异戊二烯中使用单组分镧系元素催化剂，如二碘化镧系元素。例如，二碘化铥、二碘化镝和二碘化钕可以引发异戊二烯聚合成高顺-1，4-聚异戊二烯橡胶，无需任何额外的催化剂组分。二碘化镧系元素因此可以用来在溶液聚合条件下引发异戊二烯单体聚合成高顺-1，4-聚异戊二烯。
美国专利4,894,425公开了用于合成聚异戊二烯的方法，所述的聚异戊二烯可以拥有官能团并含有多于70％的1，2-和3，4-结构单元。该方法涉及异戊二烯在惰性烃溶剂中在作为催化剂的有机锂化合物和作为助催化剂的醚存在下的阴离子聚合，其中所用的助催化剂是式R1-O-CH2-CH2-O-R2的乙二醇二烷基醚，其中R1和R2是具有不同数目碳原子的烷基，选自由甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组，并且其中两个烷基R1和R2中的碳原子总数在5至7的范围内。美国专利4,894,425的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成具有高1，2-和3，4-微结构含量的聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
可结晶的3，4-聚异戊二烯可以在短聚合时间后通过利用美国专利5,082,906描述的催化剂系统在有机溶剂中合成至定量产率。利用这种催化剂系统产生的3，4-聚异戊二烯是应力可结晶的并且用于提供改善的牵引和改善的切口增长抗性的轮胎胎面中。美国专利5,082,906具体地公开了用于合成3，4-聚异戊二烯的方法，该方法包括在有机溶剂中在约-10℃至约100℃范围内的温度在催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，所述的催化剂系统由(a)有机铁化合物、(b)有机铝化合物、(c)螯合性芳香胺和(d)质子化合物组成；其中螯合胺对有机铁化合物的摩尔比在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物对有机体铁化合物的摩尔比在约5∶1至约200∶1范围内，并且其中质子化合物对有机铝化合物的摩尔比在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。美国专利5,082,906的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成具有高3，4-微结构含量和应力可结晶的聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
美国专利5,356,997也涉及用于合成应力可结晶的3，4-聚异戊二烯的方法。该3，4-聚异戊二烯具有在约65％至约85％范围内的3，4-微结构含量，在约15％至约35％范围内的顺-1，4-微结构含量并且基本上没有反-1，4-微结构或1，2-微结构。它可以在短聚合时间后在有机溶剂中合成至定量产率。美国专利5,356,997具体地公开了用于合成3，4-聚异戊二烯的方法，该方法包括在有机溶剂中在约-10℃至约100℃范围内的温度在催化剂系统存在下聚合异戊二烯单体，所述的催化剂系统由(a)可溶于该有机溶剂中的有机铁化合物，其中所述有机铁化合物中的铁处于+3氧化状态，(b)部分水解的有机铝化合物，其通过添加选自由水、醇和羧酸组成的组中的质子化合物至所述有机铝化合物制备，(c)螯合性芳香胺组成；其中螯合胺对有机铁化合物的摩尔比在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物至有机体铁化合物的摩尔比在约5∶1至约200∶1范围内，并且其中质子化合物对有机铝化合物的摩尔比在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。美国专利5,356,997的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成具有高3，4-微结构含量和应力可结晶的聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
美国专利5,677,402公开了用于制备3，4-聚异戊二烯橡胶的方法，该方法包括在约30℃至约100℃范围内的温度在醇钠和极性改性剂存在下用有机锂引发剂聚合异戊二烯单体，其中醇钠对有机锂引发剂的摩尔比在约0.05∶1至约3∶1范围内；并且其中极性改性剂对有机锂引发剂的摩尔比在约0.25∶1至约5∶1范围内。美国专利5,677,402的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导可以在合成3，4-聚异戊二烯中使用的催化剂系统和聚合技术。
美国专利7,351,768公开了具有在5,000至100,000范围内并且优选在20,000至80,000范围内的重量平均分子量的液体聚异戊二烯的合成。美国专利5,677,402的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明液体聚异戊二烯的合成。
美国专利6,576,728公开用于共聚合苯乙烯和异戊二烯以产生低级乙烯基苯乙烯-异戊二烯橡胶的方法，其中所述的橡胶具有衍生自苯乙烯的重复单元的随机分布。这些聚合中使用的引发剂系统由(a)锂引发剂和(b)选自(1)醇钠、(2)磺酸钠盐和(3)乙二醇醚钠盐的成员组成。重要的是这些聚合中使用的引发剂系统不含极性改性剂，如路易斯碱。美国专利6,576,728的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明苯乙烯-异戊二烯橡胶的合成。
美国专利6,313,216公开用于合成随机苯乙烯-异戊二烯橡胶的方法，包括：(1)将异戊二烯、苯乙烯、引发剂和溶剂连续地充入第一聚合区，(2)使得异戊二烯和苯乙烯在第一聚合区中共聚合到总转化率60至95％以产生含有活性苯乙烯-异戊二烯链的聚合物胶泥，(3)将含有活性苯乙烯-异戊二烯链的聚合物胶泥和额外的异戊二烯单体连续地充入第二聚合区，其中将5至40％总量的改变的异戊二烯充入第二聚合区，(4)使共聚合在第二聚合区中继续到至少90％的异戊二烯单体转化率，其中限制第二聚合区中苯乙烯和异戊二烯的总转化率至最大98％，(5)从第二反应区撤出具有活性链端的随机苯乙烯-异戊二烯橡胶的聚合物胶泥，(6)灭活随机苯乙烯-异戊二烯橡胶上的活性链末端，和(7)从该聚合物胶泥回收随机苯乙烯-异戊二烯橡胶，其中第一聚合区和第二聚合区中的共聚合在70℃至100℃范围内的温度实施，并且其中充入第一聚合区的苯乙烯的量比结合入橡胶中的苯乙烯的总量多至少2％。美国专利6,313,216的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明苯乙烯-异戊二烯橡胶的合成。
具有高乙烯基含量的异戊二烯-丁二烯共聚物可以通过利用美国专利5,061,765中公开的方法在短聚合时间后在有机溶剂中合成至高产率。利用该方法产生的异戊二烯-丁二烯共聚物具有在约0℃至约-60℃范围内的玻璃化转变温度并且可以用于提供改善的牵引和改善的切口增长抗性的轮胎胎面中。美国专利5,061,765更具体地公开了用于合成具有高乙烯基含量的异戊二烯-丁二烯共聚物的方法，该方法包括在有机溶剂中在约-10℃至约100℃范围内的温度在催化剂系统存在下共聚合异戊二烯单体和丁二烯单体，所述的催化剂系统由(a)有机铁化合物、(b)有机铝化合物、(c)螯合性芳香胺和(d)质子化合物组成；其中螯合胺对有机铁化合物的摩尔比在约0.1∶1至约1∶1范围内，其中有机铝化合物对有机体铁化合物的摩尔比在约5∶1至约200∶1范围内，并且其中质子化合物对有机铝化合物的摩尔比在约0.001∶1至约0.2∶1范围内。美国专利5,061,765的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明异戊二烯-丁二烯橡胶的合成。
美国专利5,137,998中公开了用于合成苯乙烯、异戊二烯和丁二烯的橡胶状三元共聚物的技术。这些橡胶状三元共聚物显示出用于轮胎胎面橡胶化合物中的特性的优异组合。通过在轮胎胎面中使用此类三元共聚物，可以产生具有改善的抗湿滑性的轮胎，而不牺牲滚动阻力或胎面磨损特征。美国专利5,137,998更具体地公开了用于制备苯乙烯、异戊二烯和丁二烯橡胶状三元共聚物的方法，所述的三元共聚物具有多个玻璃化转变温度并具有用于制造轮胎胎面中的特性的优异组合，所述的方法包括：在不高于约40℃的温度在(a)选自由三哌啶子基氧化膦和碱金属醇盐组成的组中的至少一个成员和(b)有机锂化合物存在下在有机溶剂中三元聚合苯乙烯、异戊二烯和1，3-丁二烯。美国专利5,137,998的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明苯乙烯-异戊二烯-丁二烯橡胶的合成。
可以通过美国专利6,562,895中公开的方法产生液体异戊二烯-丁二烯橡胶(IBR)，其对于制造显示出优异干燥牵引特征和耐久性的高性能汽车轮胎(包括赛车轮胎)的胎面中的用途是特别价值的。这种异戊二烯-丁二烯橡胶在室温是液体并且由衍生自约5重量百分数至约95重量百分数的异戊二烯和衍生自约5重量百分数至约95重量百分数的1，3-丁二烯的重复单元组成，其中衍生自异戊二烯和1，3-丁二烯的重复单元处于基本上随机的顺序下。这种IBR也具有在约3,000至约50,000和范围内的低数均分子量并具有在约-50℃至约20℃范围内的玻璃化转变温度。
这些异戊二烯-丁二烯共聚物利用有机锂引发剂和极性改性剂合成。所用的有机锂引发剂的水平将取决对正在合成的液体异戊二烯-丁二烯聚合物所希望的分子量。作为一般原则，在全部阴离子聚合中，产生的聚合物的分子量是反比例于所用引发剂的量。由于正在合成具有相对低的分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物，故所用引发剂的量将是相对大的。作为一般原则，将使用约0.1至约2phm(每百个重量份单体的份数)的有机锂化合物。在大多数情况下，将优选使用约0.2至约1phm的有机锂化合物，最优选使用约0.4phm至0.6phm的有机锂化合物。在任何情况下，将选择有机锂引发剂的量以引起具有在约3,000至约50,000范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物产生。
将优选地选择有机锂引发剂的量以引起具有在约5,000至约30,000范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物产生。将最优选地选择有机锂引发剂的量以引起具有在约8,000至约18,000范围内的数均分子量的液体异戊二烯-丁二烯聚合物产生。在任何情况下，重要的是在极性改性剂如N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TMEDA)存在下实施1，3-丁二烯和苯乙烯的共聚合至达到约-50℃至20℃范围内的高的玻璃化转变温度。美国专利6,562,895的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在说明液体异戊二烯-丁二烯聚合物的合成。
可以通过美国专利5,242,984中描述的方法产生含有聚异戊二烯嵌段的嵌段共聚物。例如，可以通过该方法产生苯乙烯和异戊二烯的线性二嵌段聚合物(S-I嵌段共聚物)和苯乙烯和异戊二烯的线性三嵌段聚合物(S-I-S三嵌段聚合物)。在这项技术，所述单体通过阴离子聚合在惰性有机溶剂中依次聚合。通常，使用有机碱金属化合物如烷基锂化合物来引发可以在宽温度范围内进行的聚合。
控制所述嵌段和总体聚合物的分子量的方法在美国专利3,149,182和美国专利3,231,635中描述，所述专利声称可以保持单体的量恒定并且可以通过改变催化剂的量实现不同的分子量，或者可以保持催化剂的量恒定并且可以通过变动单体的量实现不同的分子量。在依次聚合后，产物通过添加质子终止剂例如水、醇或其他试剂或用氢终止，旨在移去形成缩合的聚合物产物核心的锂基团。嵌段聚合物产物随后通过利用热水或热蒸汽或这两者的凝结法回收。美国专利5,242,984、美国专利3,149,182，和美国专利3,231,635的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导用于合成S-I嵌段共聚物和S-I-S三嵌段聚合物的方法。
用本发明异戊二烯制成的全部类型的聚合物是可验证的，因为它们用不源自石油化学来源的异戊二烯制成。另外，含有异戊二烯的本发明聚合物也可以区别于天然来源的含异戊二烯的聚合物，如天然橡胶。因此，由于来自本文所阐述的生物可再生、环境友好的来源，含有异戊二烯的本发明聚合物是以分析方式可验证的。
碳同位素13C与12C的比率可以用来鉴定或排除许多含碳样品的潜在来源。这种方法效果良好，因为：(1)两种同位素在地质时间范围上是稳定的；(2)13C对12C的比率可以使用燃烧分析法、气相色谱法和同位素比质谱法的组合以极高的精确性测量；(3)许多天然存在物质的13C/12C比率存在于这些物质特有的狭小范围内；和(4)许多物质的13C/12C比率在这些物质经历化学反应时以可预见的方式变化。
涉及在或接近天然丰度水平上13C/12C比率的研究通常将同位素数据报道为″δ值″，所述的δ值由符号δ13C代表并且相对于标准参比样品以每千份数(‰)给出。就碳而言，该参比样品一般是Pee Dee Belemite，其具有1.112328％的13C天然丰度并且指定为δ13C 0.00‰。使13C/12C比率与δ值关联的公式是：
δ13C(以‰计)对标准＝[(R样品-R标准)/R标准](1000)，其中R样品是样品的13C/12C比率并且R标准是Pee Dee Belemite的比率。
虽然碳的同位素(即13C和12C)参与相同的物理过程和相同的化学反应，但是13C和12C之间的轻微质量差异可以通过许多反应和过程中速率的极轻微差异展示出来。这导致经受化学反应或物理过程的样品的13C/12C比率之间的细微差异。例如，物理过程如蒸发或扩散区分出较重的同位素并且一般导致较重的同位素在原始样品中稍微富集，原因是较轻的同位素更迅速蒸发或扩散离去。当蒸发或扩散发生时，13C/12C比率因此轻微地增加。对于化学反应，包括酶促反应，情况更复杂，但是经常存在一种同位素与另一种的轻微区别，这可以通过测量13C/12C比率或δ13C值检测到。例如，大气CO2可以通过两种极不同的光合作用机制转化成植物物质：C3植物中发生的Calvin-Benson途径和C4植物中发生的Hatch-Slack途径。这两种机制极为不同的，以至于从相同的CO2产生δ13C的可测量差异。对于C4植物，δ13C一般是-9‰至-11‰范围，均值接近-13‰。对于C3植物，δ13C一般是-20‰至-32‰范围，均值接近-27‰。因为这些范围是如此不同并且δ13C值可以常规地测量在0.02‰范围内，因此区分来自C3植物与C4植物的植物残余物是相对容易的。这在考古学和其他领域中具有无数应用，其中在所述领域中分析来自烹制或骨骼残留物的含碳残留物可以用来追溯人和其他动物的进化、活动或膳食。
最近，δ13C值已经用来检测经济欺诈，尤其检测食物被其他材料(包括衍生自石油化学品的潜在有害合成物)掺杂。例如，玉米(corn)油被认为一种特级植物油并且对于无良制造商而言存在用更廉价油稀释玉米油的诱惑。幸运地是，玉米油衍生自C4植物，而大部分更廉价的替代物衍生自C3植物或动物。与替代物-25‰至-32‰的δ13C相比，真玉米油的δ13C因此是-13.7‰至-16.4‰。可以通过测量δ13C检测出玉米油被更廉价替代物的任何明显稀释。类似地，可以通过测量δ13C检测出添加蔗糖(C4光合作用的产物)至果汁、葡萄酒、烈酒和蜂蜜(均为C3光合作用的产物)。甚至可能通过δ13C值检出天然香料被合成性类似物掺杂和非法合成激素补充物的使用。
本发明利用精确测量δ13C值的能力，旨在产生新的同位素独特的异戊二烯聚合物，所述的异戊二烯聚合物可以是轻易区别于从基于石油的原料衍生的聚合物。本发明也利用精确测量δ13C值的能力，旨在产生可以新的同位素独特的异戊二烯聚合物，所述的异戊二烯聚合物可以是轻易区别于天然橡胶。本发明的突出特征在于它提供了具有宽δ13C值范围的新聚合物，所述的新聚合物可以定制并随后验证真实性。如较早所述，这些新聚合物满足了来自客户对可验证产品的日益增长的需求，其中所述的可验证产品不含有潜在的蛋白质过敏原或衍生自石油的原料。
本发明代表的聚合物含有与天然橡胶和含有石油衍生的异戊二烯的合成聚合物相比同位素独特的异戊二烯单元。在衍生自巴西橡胶树(即，普通天然橡胶树)的天然橡胶情况下，δ13C值范围一般是约-27‰至约-28‰。衍生自沙漠灌木的银胶菊橡胶具有约-31‰的δ13C。两种橡胶均显示对C3光合作用产物所期望的δ13C值，并且两种橡胶已知含有结合聚合物的蛋白质。
取决于异戊二烯的来源，常规的合成聚异戊二烯可以具有不同的δ13C值。对于从萃取蒸馏来自炼油厂的C5流所衍生的异戊二烯，δ13C是约-22‰至约-24‰。这个范围常见于衍生自石油的轻质不饱和烃，并且含有基于石油的异戊二烯的聚合物一般含有具有相同δ13C的异戊二烯单元。对于含有衍生自异丁烯与甲醛反应的异戊二烯的聚合物，δ13C值可以是约-34.4‰，因为甲醛往往从具有高得多的负δ13C值的原料衍生。
本发明提供了具有极不同δ13C值的含有异戊二烯的聚合物。例如，具有最小量的其他含碳养分(例如，酵母提取物)的玉米衍生葡萄糖(δ13C-10.73‰)的发酵产生了可聚合成δ13C-14.66‰至-14.85‰的聚异戊二烯的异戊二烯。这种聚合物的δ13C显然在新的范围内，其中所述的范围完全在天然橡胶和全部先前已知合成聚异戊二烯的正常值范围之外，并且所述δ13C在通常与衍生自C4植物的产品相关的范围内。这种聚合物的独特δ13值是以下事实的直接结果：该聚合物中的异戊二烯衍生自基于玉米的葡萄糖，所述葡萄糖确实是衍生自C4植物的产物。
本领域普通技术人员认识到可以使用衍生自C4植物的其他糖类或可发酵物获得相似的结果。例如，来自甘蔗(δ13C-10.4‰)的蔗糖、来自甘蔗(δ13C-15.3‰)的转化糖、来自玉米淀粉(δ13C-11.1‰)的葡萄糖和来自玉米秸秆(δ13C-11.3‰)或甘蔗渣(δ13C-13.0‰)的水解性降解的葡萄糖应当均产生可以用来产生下述异戊二烯聚合物的异戊二烯，其中所述的异戊二烯聚合物具有比天然橡胶或含有基于石油的异戊二烯的合成聚合物负得更少的δ13C值。本领域普通技术人员还会认识到应当可能从δ13C大约大于(即，负得更少)约-18‰的δ13C的可发酵原料，包括δ13C大约大于约-18‰的平均δ13C的可发酵原料混合物生产δ13C比约-22‰负得更少的异戊二烯和异戊二烯聚合物。
除了产生具有作为C4植物源产品之特征性的δ13C值的含有异戊二烯的聚合物外，本领域技术人员会认识到含有独特同位素标记的异戊二烯的聚合物可以从可发酵的非C4原料产生。例如，来自水解的软木浆(δ13C-23‰)的葡萄糖应当产生具有接近-27‰的δ13C的异戊二烯和聚异戊二烯，其中所述的δ13C处于独特范围内，所述的独特范围在对衍生自萃取蒸馏C5馏分的异戊二烯和衍生自异丁烯与甲醛反应的异戊二烯所观察到的正常值范围之间。本领域技术人员还将认识到，发酵具有大约-20‰至约-28‰的δ13C范围的其他糖类应当产生具有约-24‰至约-32‰的δ13C范围的异戊二烯和异戊二烯聚合物。这些其他的糖类可能包括(但不限于)来自水解纤维素的葡萄糖(δ13C-25±2‰)、来自甜菜糖的转化糖(δ13C-26‰至-27‰)和乳糖(δ13C-27‰至-28‰)。植物油(δ13C-26‰至-32‰)、包括棕榈油(δ13C-30‰)的发酵可能提供具有比-30‰负的更小的δ13C的异戊二烯聚合物。
本领域技术人员会认识到二种或多种原料的共发酵可以用来产生异戊二烯和因此产生具有中间δ13C值的含有异戊二烯的聚合物。例如，来自甘蔗(δ13C-10.4‰)的蔗糖和自甜菜糖(δ13C-26‰至-27‰)的蔗糖的1∶1混合物应当产生异戊二烯和因此产生含有异戊二烯的聚合物，其δ13C值与从衍生自具有平均δ13C值(即，大约-18.5‰)的单一来源的蔗糖中产生的聚合物具有大致相同的δ13C值。这应当同样适用于衍生自甘蔗和甜菜的转化糖。在两种情况下，应当显而易见，可能通过混合并随后(共)聚合从衍生自甘蔗和甜菜的蔗糖或转化糖分别制备的等量异戊二烯来合成相同的聚合物。也应当显而易见，糖类连同其他可发酵原料-如酵母提取物和植物油-的共发酵可以用来产生异戊二烯并因此产生具有中间δ13C值的含有异戊二烯的聚合物。例如，葡萄糖(δ13C-10.73‰)和酵母提取物(δ13C-26‰至-27‰)以比率181.2∶17.6的共发酵产生异戊二烯，该异戊二烯可以聚合成具有δ13C值-18‰至-20‰的聚异戊二烯。相反，葡萄糖连同最小量的酵母提取物的发酵和异戊二烯的随后聚合产生了具有-14‰至-15‰的δ13C值的聚异戊二烯。
对于异戊二烯与其他单体的共聚物，本领域技术人员认识到存在有限量的被掺入聚合物背景作为聚异戊二烯″嵌段″的异戊二烯。异戊二烯形成具有二个或多个异戊二烯单元的嵌段的倾向性-甚至在″随机共聚物″中-取决于许多因素，包括异戊二烯相对于其他单体的量、聚合所用的催化剂的类型和用于聚合的具体反应条件。通常可以通过NMR波谱法检测这些嵌段沿聚合物骨架的存在。通过使用化学降解(例如，臭氧分解法)和色谱法的组合，可以分离这些嵌段的片段用于化学分析，包括对衍生自异戊二烯的嵌段测量δ13C值。这提供了途径，其用于确定异戊二烯与其他单体的共聚物是否含有从可再生/可持续原料、尤其源自C4植物的原料衍生的异戊二烯。
用来自细胞培养物的异戊二烯单体制成的本发明聚异戊二烯聚合物可以本身借助它们的δ13C值和其他聚合物特征进行鉴定，其中所述的细胞培养物使用生物可再生碳源。例如，以下含有异戊二烯的聚合物因含有利用本发明方法所产生的异戊二烯单体而是可验证的：
(1)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰的δ13C值。此类聚异戊二烯聚合物可以具有大于-21‰的δ13C值，并且也可以具有大于-20‰的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-22‰至-10‰范围内的δ13C值，并且在其他情况下，它将具有在-21‰至-12‰范围内的δ13C值。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-20‰至-14‰范围内的δ13C值。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将是聚异戊二烯均聚物橡胶。
(2)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。此类聚异戊二烯聚合物可以具有在-30‰至-29‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有-30‰至-29‰范围内的δ13C值，并且在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-30‰至-29.5‰范围内的δ13C值。仍在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物可以具有在-29.5‰至-28.5‰范围内的δ13C值，并且仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物可以具有在-29.0‰至-28.5‰范围内的δ13C值。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将是聚异戊二烯均聚物橡胶。
(3)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物不含有蛋白质，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。在一些情况下，这种聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值，并且仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将是聚异戊二烯均聚物橡胶。
(4)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的顺-1，4-微结构含量，其中该聚异戊二烯聚合物具有小于99.9％的反-1，4-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。此类聚异戊二烯可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。该聚异戊二烯聚合物可以具有小于99.8％的顺-1，4-微结构含量。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于99.7％的顺-1，4-微结构含量。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于99.5％或甚至小于99％的顺-1，4-微结构含量。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于98.5％或甚至小于98％的顺-1，4-微结构含量。这种聚异戊二烯聚合物也可以具有小于2.0或甚至小于1.8的多分散性。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物具有小于1.6或甚至小于1.5的多分散性。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物可以具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.1的多分散性。
(5)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于2％的3，4-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。此类聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。该聚异戊二烯聚合物可以具有大于5％的3，4-微结构含量。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于10％的3，4-微结构含量。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于15％的3，4-微结构含量。
仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于20％的3，4-微结构含量。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于25％的3，4-微结构含量。这种聚异戊二烯聚合物可以具有小于2.0的多分散性。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.8的多分散性。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.6的多分散性。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物具有小于1.5或甚至小于1.4的多分散性。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.2或甚至小于1.1的多分散性。
(6)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有大于2％的1，2-微结构含量，并且其中该聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。这种类型的聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。该聚异戊二烯聚合物可以具有大于5％的1，2-微结构含量。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于10％的1，2-微结构含量。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于15％的1，2-微结构含量。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于20％的1，2-微结构含量。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于25％的1，2-微结构含量。该聚异戊二烯聚合物可以具有小于2.0的多分散性。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.8的多分散性。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.6的多分散性。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.5的多分散性。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。对于该聚异戊二烯聚合物而言可以具有小于1.1的多分散性。
(7)由衍生自异戊二烯单体的重复单元和至少一种额外单体组成的聚合物，其中该聚合物包括衍生自异戊二烯的重复单元嵌段，并且其中衍生自异戊二烯的重复单元嵌段具有大于-22‰的δ13C值。此类聚异戊二烯聚合物可以具有大于-21‰的δ13C值。在一些情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有大于-20‰的δ13C值。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-22‰至-10‰范围内的δ13C值。仍在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-21‰至-12‰范围内的δ13C值。在许多情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有在-20‰至-14‰范围内的δ13C值。
(8)由衍生自异戊二烯单体的重复单元和至少一种额外单体组成的聚合物，其中该聚合物包括衍生自异戊二烯的重复单元嵌段，并且其中衍生自异戊二烯的重复单元嵌段具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。此类共聚物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，这种类型的共聚物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，这种类型的共聚物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。这种类型的共聚物可以是异戊二烯与1，3-丁二烯的橡胶状共聚物、异戊二烯与苯乙烯的橡胶状共聚物、异戊二烯与α-甲基苯乙烯的橡胶状共聚物等。
(9)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的液体聚异戊二烯聚合物，其中该聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重量平均分子量，并且其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。此类液体聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。在其他情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。此类液体聚异戊二烯聚合物可以具有在20,000至80,000范围内的重量平均分子量。在一些情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有在30,000至50,000范围内的重量平均分子量。在其他情况下，该聚异戊二烯聚合物将具有小于2.0或甚至小于1.8的多分散性。仍在其他情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有小于1.6或甚至小于1.5的多分散性。在许多情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有小于1.4或甚至小于1.2的多分散性。对于该液体聚异戊二烯聚合物而言可以具有小于1.1的多分散性。
(10)由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的液体聚异戊二烯聚合物，其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在5,000至100,000范围内的重量平均分子量，并且其中该液体聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。此类液体聚异戊二烯聚合物可以具有在-34‰至-25‰范围内的δ13C值。在一些情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。仍在其他情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有在-32‰至-25‰范围内的δ13C值。此液体聚异戊二烯可以具有在20,000至80,000范围内的重量平均分子量。该液体聚异戊二烯聚合物一般会具有在30,000至50,000范围内的重量平均分子量。这种液体聚异戊二烯可以具有小于2.0的多分散性。在一些情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有小于1.8的多分散性。在其他情况下，该液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.6的多分散性。仍在其他情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有小于1.5或甚至小于1.4的多分散性。在许多情况下，该液体聚异戊二烯聚合物将具有小于1.2或甚至小于1.1的多分散性。
本发明由以下实施例说明，所述实施例仅用于说明目的并且不视作限制本发明的范围或可以实施本发明的方式。除非另外具体地说明。份数和百分数以重量给出。
实施例
实施例也描述和详解了上面讨论的本发明的方面和实施方式，但是实施例旨在仅仅是本发明的示例并且因此不应以任何方式被认为是限定本发明。除非另有指明，否则温度是摄氏度而压力为大气压或近大气压。前面的实例和详细说明以说明的方式提供而非限制。所有在这一说明书中引用的出版物、专利申请和专利都在此通过引用作为参考，就如同每一出版物、专利申请或专利都具体且单独地引入本文作为参考。特别地，在此引用的所有出版物出于描述和公开可用于本发明的组合物和方法的目的而明确地通过引用作为参考。尽管出于清楚理解的目的，较详细地以说明方式描述了前面的发明，但是对于本领域熟练技术人员来讲显而易见的是，根据本发明的教导，可以进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。
在本发明的实施中，13C分析可以通过将0.5至1.0mg样品载入用于碳同位素分析的锡杯，使用Costech ECS4010元素分析仪作为ThermoFinniganDelta Plus XP同位素比率质谱计的入口而进行。将样品滴入处在1020℃的氧化亚钴/氧化钴燃烧反应器，同时使燃烧气体在氦气流中以85mL/分钟通过铜反应器(650℃)以转化NOx成N2。使用3-m 5
Figure BDA0000047889120000881
分子筛柱分离CO2和N2。随后，使用两种实验室标准物(乙酰苯胺B，-29.52±0.02‰m和玉米淀粉A，-11.01±0.02‰)，针对VPDB标准校正13C/12C比率，其中已经使用T.B.Coplen等人，δ13C测量的新指南(New Guidelines forδ13CMeasurements)，Anal.Chem.，78，2439-2441(2006)的2-标准方法，通过离线燃烧和双入口(dual-inlet)分析针对VPDB标准仔细校准所述的实验室标准物。Coplen的教导内容在此通过引用的方式并入，旨在教导用于测定δ13C值的技术。
实施例1、在表达重组葛异戊二烯合成酶的大肠杆菌中的异戊二烯生产
I.在大肠杆菌中表达葛异戊二烯合酶的载体构建
葛(葛麻姆(Pueraria montana)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列获自GenBank(AAQ84170)。对于大肠杆菌密码子使用进行优化的葛异戊二烯合酶基因购自DNA2.0(SEQ ID NO：1)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrdHis2B(Invitrogen)。设计构建体以便异戊二烯合酶基因终止密码子在PstI位点的5’。结果是，当表达构建体时，His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白。对得到的质粒pTrcKudzu通过测序验证(图2和3)。
也将异戊二烯合酶基因克隆到pET16b(Novagen)。这种情形下，异戊二烯合酶基因插入pET16b以便重组异戊二烯合酶蛋白含有N端His标签。通过PCR  使用引物对pET-His-Kudzu-2F：5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQ IDNO：3)和pET-HisKudzu-R：5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQID NO：4)从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。这些引物分别在基因5’端添加NdeI位点和在3’端添加BamH1位点。上述质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的指示，使用Herculase聚合酶(Stratagene)，并且以10pMol的浓度添加引物。在25μl的总体积下进行PCR。PCR产物用NdeI/BamH1消化并且克隆到用相同酶消化的pET 16b中。将连接混合物转化到大肠杆菌Top 10(Invitrogen)并通过测序筛选正确克隆。将得到的质粒(其中从T7启动子表达葛异戊二烯合酶基因)命名为pETNHisKudzu(图4和5)。
也将葛异戊二烯合酶基因克隆到低拷贝数质粒pCL1920中。使用引物来从上述pTrcKudzu扩增葛异戊二烯合酶基因。正向引物向5’端添加HindIII位点和大肠杆菌共有序列RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，就在终止密码子3’，因此构建反向引物以便最终PCR产物包括PstI位点。引物序列为：HindIII-rbs-Kudzu F：5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQ ID NO：6)和BamH1-Kudzu R：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQ ID NO：4)。使用Herculase聚合酶，以10pmol引物浓度引物和1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增方案包括30个循环的(95℃持续1分钟，60℃持续1分钟，72℃持续2分钟)。产物用HindIII和PstI消化并连接到也用HindIII和PstI消化的pCL 1920。连接混合物转化大肠杆菌Top 10。通过测序检测若干转化体。得到的质粒命名为pCL-lac-Kudzu(图6和7)。
II.异戊二烯生产的测定
对于摇瓶培养，将来自摇瓶的1ml培养物转入20ml CTC顶空瓶(Agilent瓶目录#51882753；盖目录/I 51882759)。拧紧盖并在相同温度下孵育瓶，以250rpm振荡。30分钟后，从培养箱中取出瓶并按下述分析(对于这一检测法的一些实验数值参见表1)。
在测量了发酵罐中的异戊二烯生产的情形下，从发酵罐的废气取样并按下述直接进行分析(对于这一检测法的一些实验数值参见表2)。
使用与CTC Analytics(Switzerland)CombiPAL自动进样器接口的Agilent 6890GC/MS系统，在顶空模式下进行分析。使用Agilent HP-5M5GC/MS柱(30m×0.25mm；0.25pm膜厚)分离分析物。设定取样器以注射500μL顶空气体。GC/MS法利用氦气作为载气，流速为1ml/分钟。注射口保持在250℃，分流比为50∶1。在分析期间，烘箱温度保持在37℃持续2分钟。Agilent 5793N质量选择检测器在m/z 67，以单离子监测(SIM)模式允许。从1.4至1.7分钟，关掉监测器以允许洗脱永久气体。在这些条件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在1.78分钟洗脱。使用校准表来量化异戊二烯绝对量并且发现在1μg/L至200μg/L为线性的。预计使用这一方法的检测极限为50至100ng/L。
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯生产
将上述载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以生产菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。在LA(Luria琼脂)和羧苄青霉素(50μg/ml)上涂布菌株用于分离并且在37℃过夜培养。将单菌落接种到含有20ml Luria Bertani培养基(LB)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中。培养物在20℃以200rpm振荡过夜生长。测量过夜培养物的OD600并将培养物稀释到含有30mlMagicMedia(Invitrogen)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中至OD600～0.5。在30℃以200rpm振荡培养培养物。当OD600～0.5-0.8时，加入400μM IPTG并将细胞在30℃以200rpm振荡再培养6小时。在用IPTG诱导后0、2、4和6小时后，收集1ml培养物等分试样，测定OD600并且按上述测量生产的异戊二烯的量。结果如图8所示。
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯
从补料分批培养测定由含有重组葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌大规模生产异戊二烯。每升发酵培养基的发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良的微量金属溶液(Modified Trace Metal Solution)1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化钾(KOH)调节pH至6.8并定容至体积。终产物用0.22μ过滤器过滤灭菌(只此，不高压灭菌)。1000X改良的微量金属溶液的配方如下：柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在diH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22μ过滤器过滤灭菌。
这一实验在14L生物反应器中进行以监控在想要的发酵、pH 6.7和温度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。当接种物生长至OD550＝0.6后，将2个600ml烧瓶离心并将内容物在70ml上清液中重悬浮以将细胞沉淀(70ml的OD3.1材料)转入生物反应器。接种后不同时间下，取出样品并按上述测定所生产的异戊二烯的量。结果如图9所示。
实施例2、在表达重组杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中的异戊二烯生产
杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(Schnitzler，J-P等人，(2005)Flanta 222：777-786)获自GenBank(CAC35696)。对于大肠杆菌进行密码子优化的基因购自DNA2.0(p9796-杨，图30和31)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。克隆构建体以便插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这得到His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白的构建体。对得到的质粒pTrcPoplar(图32和33)进行测序验证。
实施例3、在表达重组葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中的异戊二烯生产
将在实施例1所述的pTrcKudzu和pCL-lac Kudzu质粒电穿孔到柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。在分别含有羧苄青霉素(200μg/m1)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。按实施例1对于表达重组葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株所述进行从摇瓶生产异戊二烯并测定所生产的异戊二烯的量。结果如图10所示。
实施例4、在表达重组葛异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生产
I.用于表达葛异戊二烯合酶的枯草杆菌复制质粒的构建
使用在aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性表达盒的pBS19)，在枯草杆菌aprEnprE PxylcomK菌株(BG3594comK)中表达葛异戊二烯合酶基因。使用PCR分别扩增异戊二烯合酶基因、aprE启动子和转录终止子并融合。然后将构建体克隆到pBS19中并转化到枯草杆菌。
a)aprE启动子的扩增
使用下面的引物，从枯草杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子：
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ ID NO：58)
CF 07-43(-)与葛ispS融合的a prE启动子
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQ ID NO：59)
b)异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu扩增葛异戊二烯合酶基因(SEQ ID NO：2)。该基因对于大肠杆菌进行了密码子优化并通过DNA 2.0合成。使用下面的引物：
CF 07-42(+)将aprE启动子与葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)融合
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：60)
CF 07-45(-)将葛异戊二烯合酶基因的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：61)
c)转录终止子的扩增
使用下面的引物，从以前测序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyliquefaciens)的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF 07-44(+)将葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQ ID NO：62)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63)
使用下述引物进行PCR将葛片段与终止子片段融合：
CF 07-42(+)将aprE启动子与葛异戊二烯合酶基因融合(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQ ID NO：61)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63)
使用下述引物进行PCR将葛终止子片段与启动子片段融合：
CF 797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQ ID NO：64)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并用限制性酶MfeI和BamHI消化。这一消化的DNA片段用Qiagen试剂盒进行凝胶纯化并连接至称作pBS19的载体，该载体已经用EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化到大肠杆菌Top 10细胞，并且在LA和50羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50羧苄青霉素中过夜生长，然后用Qiagen试剂盒分离质粒。质粒用EcoRI和BamHI消化以检测插入片段并且将3个正确的质粒送去以下面的引物进行测序：
CF 149(+)aprE启动子的EcoRI起点
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：65)
CF 847(+)pXX 049的序列(aprE启动子末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQ ID NO：66)
CF 07-45(-)将葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQ ID NO：61)
CF 07-48(+)葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQ ID NO：67)
CF 07-49(+)葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQ ID NO：68)
通过测序发现名为pBS Kudzu#2的质粒是正确的(图52和12)并且将它转化到枯草杆菌宿主菌株BG 3594comK。在LA和5个氯霉素板上进行筛选。选择转化体并且在LA和5个氯霉素上挑选单菌落，然后在LB和5氯霉素中生长至其达到OD600为1.5。在甘油存在下，将其冻存在-80℃的瓶中。得到的菌株命名为CF 443。
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯生产
用来自LA和氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF 443单菌落接种过夜培养物。培养物在37℃下在LB和Cm中以200rpm摇动生长。使用这些过夜培养物(1ml)接种含有25ml Grants II培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml带挡板的摇瓶。Grants II培养基配方为10g大豆胨，3ml1MK2HPO4，75g葡萄糖，3.6g尿素，100ml的10x MOPS，用H2O定容至1L，pH 7.2；10X MOPS配方为83.72g MOPS，7.17g tricine，12g KOH颗粒，10ml 0.276M K2SO4溶液，10ml 0.528M MgCl2溶液，29.22g NaCl，100ml的100x微量营养物，用H2O定容至1L；以及100X微量营养物的配方为1.47g CaCl2＊2H2O，0.4g FeSO4＊7H2O，0.1g MnSO4＊H2O，0.1g  ZnSO4＊H2O，0.05g  CuCl2＊2H2O，0.1g  CoCl2＊6H2O，0.1gNa2MoO4＊2H2O，用H2O定容至1L。在37℃孵育摇瓶并在18、24和44小时取样。在18小时时，对CF 443和对照菌株顶空取样。这表示18小时异戊二烯累积。异戊二烯的量通过如实施例1所述的气相色谱来测定。通过表达重组异戊二烯合酶，异戊二烯的生产显著增强(图11)。
III.在14L发酵中由CF443生产异戊二烯
由补料-分批培养测定由在复制质粒上含有重组葛异戊二烯合酶基因的枯草杆菌进行的大规模异戊二烯生产。通过常规补料-分批发酵在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和磷酸钾、硫酸镁和柠檬酸、氯化铁和氯化镁溶液的营养培养基中培养表达葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF 443或不表达葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物将培养基浸软90分钟(参见W095/04134)。向14-L分批发酵罐加料60％wt/wt葡萄糖(Cargill DE99葡萄糖，ADM Versadex greens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(Western Family豆油，其中99％wt/wt是它加入细胞培养基之前的油浓度)。当检测不到批次中的葡萄糖时，开始补料。补料速率在几小时内增加并且被调整以在相等的碳基础上添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。在起泡情形下，向培养基中加入消泡剂。将发酵温度控制在37℃并且以750rpm搅拌发酵培养物。贯穿整个过程，对诸如pH、DO％、气流和压力的多种其它参数进行监控。DO％保持高于20。在36小时的时间进程中取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯生产。这些实验的结果如图53A和53B所示。
IV.在枯草杆菌中葛异戊二烯合酶(ispS)的整合
将葛异戊二烯合酶基因克隆到在aprE启动子控制下的整合质粒(pJH101-cmpR)中。在检测条件下，未检测到异戊二烯。
实施例5、在木霉中的异戊二烯生产
I.在里氏木霉中表达葛异戊二烯合酶的载体的构建
通过DNA 2.0合成解脂耶氏酵母菌密码子优化的葛IS基因(SEQ IDNO：8)(图13)。这一质粒用作下面PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10uM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQ ID  NO：9)，1μl引物EL-965(10uM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQ ID NO：10)，1μldNTP(10mM)，5μl10x PfuUltra II融合HS DNA聚合酶缓冲液，1μlPfuUltra II融合HS DNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’端含有额外的4个核苷酸，这4个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶基因对应，但为克隆到pENTR/D-TOPO载体所需的。反向引物在5’端含有额外的21个核苷酸，这21个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶基因对应，但被插入以克隆到其它载体骨架。使用MJ Research PTC-200热循环仪，按下面进行PCR反应：95℃持续2分钟(仅仅是首个循环)，95℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续30秒(重复27个循环)，最后一个循环后于72℃持续1分钟。在1.2％E-gel上分析PCR产物以确认解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶基因的成功扩增。
然后使用TOPO pENTR/D-TOPO克隆试剂盒，按照生产商说明克隆PCR产物：1μlPCR反应物，1μl盐溶液，1μlTOPO pENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积为6μl。在室温孵育反应物5分钟。将1微升TOPO反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml卡那霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml卡那霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使用QIAprep Spin Miniprep Kit，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶基因的单个pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆到定制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO 2005/001036A2。按照制造商对于Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix Kit(Invitrogen)的说明进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μlpTrex3g目的载体，6μl TE缓冲液，pH 8.0，总反应体积为8μl。反应物在室温孵育1小时然后加入1μl蛋白酶K溶液并继续在37℃孵育10分钟。然后将1μl反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml羧苄青霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen，Inc.)，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用Biolistic PDS-1000/HE Particle Delivery System进行解脂耶氏酵母密码子优化的葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向四缺失的里氏木霉的生物射弹转化(参见WO 2005/001036A2)。使用专利公开WO2005/001036A2的实施例11所列方法进行稳定转化体的分离和摇瓶评估。
II.在里氏木霉重组菌株中的异戊二烯生产
将1ml上述异戊二烯合酶转化体的15和36小时龄培养物转入顶空瓶。密封瓶并在30℃孵育5小时。测量顶空气体并且通过实施例1所述的方法鉴定异戊二烯。两个转化体显示出痕量异戊二烯。异戊二烯的量可通过14小时的孵育而增加。两个阳性样品在14小时的孵育后显示出异戊二烯水平为约0.5μg/L。未转化的对照没显示出可检测的异戊二烯水平。这一实验表明当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异戊二烯。
实施例6、在耶氏酵母中的异戊二烯生产
I.用于在解脂耶氏酵母中表达葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达葛异戊二烯合酶基因的载体构建的起点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。这一载体的完整序列(SEQ ID No：11)如图15所示。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC 120285的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增下面的片段：无启动子形式的URA3基因，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及含有XPR2和ICL1基因的启动子的两种DNA片段。使用下面的PCR引物：
ICL13
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQID NO：69)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQ ID NO：70)
XPR 3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQ ID NO：71)
XPR 5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQ ID NO：72)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQ ID NO：73)
XPRT 5
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQ ID NO：74)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQ ID NO：75)
Y18S 5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQ ID NO：76)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQ ID NO：77)
YURA 50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQ ID NO：78)
YURA 51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQ ID NO：79)
对于PCR扩增，按照生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)，生产商提供的缓冲液和dNTPs，2.5μM引物和所示的模板DNA。使用下面的循环进行扩增：95℃持续1min；34x(95℃持续30sec；55℃持续30sec；72℃持续3min)和72℃持续10min，随后4℃孵育。
对于在耶氏酵母中表达进行密码子优化的编码葛异戊二烯合酶基因的合成DNA分子得自DNA 2.0(图16；SEQ ID NO：12)。图18显示了携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的构建方案的全部细节。也构建了对照质粒，其中插入交配因子基因(MAP29)代替异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆方法可以用于表达杨(Populus alba x Populus tremula)异戊二烯合酶基因。杨异戊二烯的序列描述于Miller B.等人，(2001)Planta213，483-487并且示出于图17(SEQ ID NO：13)。图18A和B显示了产生携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建方案。
II.由解脂耶氏酵母重组菌株生产异戊二烯
载体pYLA(KZ 1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)用SacII消化并通过标准醋酸锂/聚乙二醇方法转化菌株解脂耶氏酵母CLIB122以得到尿苷原养型。简言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中过夜生长，通过离心(4000rpm，10mm)收集，用无菌水冲洗并悬浮在0.1M醋酸锂，pH 6.0中。将200μl等份细胞悬浮液与线性化质粒DNA溶液(10-20μg)混合，室温孵育10分钟并与1ml在相同缓冲液中的50％的PEG 4000混合。进一步在室温孵育悬浮液1小时，随后在42℃热激2分钟。然后将细胞接种在SC his leu平板(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，各100mg/L亮氨酸和组氨酸)上。在30℃孵育3-4天后出现转化体。
将三个来自pYLA(KZ1)转化的分离菌，三个来自pYLI(KZ1)转化的分离菌，两个来自pYLA(MAP29)转化的分离菌以及两个来自pYLI(MAP29)转化的分离菌在30℃于YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH 7.0)中振荡生长24小时。通过离心收集来自10ml培养物的细胞，在3ml新鲜YEP7中重悬浮并放入15ml螺口盖瓶。将瓶在室温温和(60rpm)振荡过夜培养。通过气相色谱使用如实施例1所述的质谱检测器分析这些瓶的顶空中异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化体产生可容易检测量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带植酸酶基因而不是异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中没有检测到异戊二烯。
实施例7：在表达葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.构建编码葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的载体
i)构建pTrcKudzuKan
用赋予卡那霉素抗性的基因代替pTrcKudzu(实施例1所述)的bla基因。为了除去bla基因，pTrcKudzu用BspHI消化，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热处死，然后用Klenow片段和dNTPs末端填平。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大片段并将它连接到kanr基因，其已经使用引物MCM225’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQ ID NO：14)和MCM235’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQID NO：15)从pCR-Blunt-II-TOPO进行PCR扩增，用HindIII和PvuI消化并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选携带有赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。
ii)构建pTrcKudzu yIDI Kan
pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自酿酒酵母的idi的PCR产物。PCR的引物          为            NsiI-YIDI           1          F5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC  (SEQID NO：16)和PstIYIDI 1R 5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQ ID NO：17)；以及模板是酿酒酵母基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。连接混合物转化到化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35)。
iii)构建pTrcKudzu DXS Kan
质粒pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。PCR的          引       物           为          MCM         135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG  (SEQ  ID  NO：18)和MCM145’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)；以及模板是大肠杆菌基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。将所得的转化反应物转化到TOP 10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzuDXS(kan)(图36和37)。
iv)构建pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)
pTrcKudzu-yIDI(kan)用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成的RBS连接到编码大肠杆菌dxs的PCR产物(引物MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG    (SEQ  ID  NO：18)和MCM145’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQ ID NO：19)，模板TOP 10细胞)，该产物以及用NsiI和PstI消化并凝胶纯化。最终质粒称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。
v)构建pCL PtrcKudzu
使用SspI从pTrcKudzu消化来自上述实施例1的含有启动子、结构基因和终止子的DNA片段并凝胶纯化。其连接至已经用PvuII消化，用SAP处理以及热处死的pCL 1920。得到的连接混合物转化TOP 10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，选择两个克隆。pCL PtrcKudzu和pCL PtrcKudzu(A3)具有相反方向的插入片段(图38-41)。
vi)pCL PtrcKudzu yIDI的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的IDI PCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCL PtrcKudzu。连接混合物转化到TOP 10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCL PtrcKudzu yIDI(图42和43)。
vii)pCL PtrcKudzu DXS的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的DXS PCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCL PtrcKudzu(A3)。连接混合物转化得TOP 10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCL PtrcKudzu DXS(图44和45)。
II.在来自以不同拷贝数表达葛异戊二烯合酶，idi，和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯测量
在LB卡那霉素50μg/mL上生长之前转化有质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDI  kan  (B)、pTrcKudzu-DXS  kan  (C)、pTrcKudzu-yIDIDXS kan(D)的大肠杆菌BL21(λDE3)培养物。在LB壮观霉素50μg/mL上生长pCL PtrcKudzu(E)、pCL PtrcKudzu、pCLPtrcKudzu-yIDI(F)和pCL PtrcKudzu-DXS(G)的培养物。培养物在时间0用400μM IPTG诱导(OD600接近0.5)并且取样用于异戊二烯顶空测量(参见实施例1)。结果如图23A-23G所示。
将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)通过转化导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrc Kudzu IDI DXS在20℃下于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长并用于接种含1％葡萄糖的TM3(13.6g K2PO4，13.6g KH2PO4，2.0g MgSO4＊7H2O，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml 1000x改良的微量金属溶液(Modified Trace Metal Solution)，调节至pH 6.8并用H2O定容，并灭菌过滤)培养瓶。培养瓶在30℃孵育直到OD600达到0.8，然后用400μM IPTG诱导。在诱导后多个时间取样并按实施例1所述测量顶空中的异戊二烯的量。结果如图23H所示。
III.在大肠杆菌/pTrcKudzu yIDI DXS中从生物量生产异戊二烯
检测菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物量：甘蔗渣、玉米秸秆和软材木浆产生异戊二烯的能力，以葡萄糖为对照。生物量的水解物由酶促水解来制备(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准检测法Lap-009“Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”)并且根据葡萄糖当量以稀释液使用。这一实例中，葡萄糖当量等于1％葡萄糖。使用来自新鲜的转化细胞BL21(DE3)pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB加卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣或软材木浆。葡萄糖用作阳性对照而没有葡萄糖用作阴性对照。在30℃以180rpm振荡孵育培养物。监测培养物的OD600并且当它达到OD600为～0.8时，在1和3小时按实施例1所述分析培养物的异戊二烯生产。培养物未被诱导。所有含有添加的原料的培养物产生的异戊二烯与由葡萄糖阳性对照所产生的异戊二烯相等。实验以一式两份进行并且示出于图46。
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯
使用来自新鲜的转化细胞BL21(λDE3)/pTrcKudzu yIDI DXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB和卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是葡萄糖、转化葡萄糖或玉米秸秆。转化糖原料(Danisco Invert Sugar)通过酶处理蔗糖糖浆来制备。AFEX玉米秸秆按下述(第V部分)制备。细胞在30℃生长并且当培养物达到OD600为～0.8-1.0(0小时)时，测量第一个样品。按由OD600所测来分析培养物的生长以及按照实施例1，在0、1和3小时分析异戊二烯生产。结果如图47所示。
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
AFEX预处理的玉米秸秆获自Michigan Biotechnology Institute。预处理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理的玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。糖化工艺如下：将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.8，2.25ml的Accellerase 1000，0.1ml的Grindamyl H121(来自用于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)，以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l的葡萄糖，21.8g/l的木糖，和10.3g/l的葡萄糖和/或木糖寡聚物。
VI.酵母提取物对在补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯生产的影响
以14-L规模按前面所述，用含有上述pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。以指数速率喂饲酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时发酵期间，送至发酵罐中的酵母提取物的总量在70-830之间变化。在550nm波长测量发酵液的光密度。发酵罐中的最终光密度与所添加的酵母提取物的量成比例(图48A)。按前述测定发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随发酵进程增加(图48B)。所生产的异戊二烯的量与喂饲的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。
VII.在pTrcKudzu DXS yIDI的500-L发酵中生产异戊二烯
使用具有葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI以及大肠杆菌DXS核酸(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrc Kudzu dxs yidi)的大肠杆菌细胞的500升发酵来生产异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变化。在平均异戊二烯浓度的基础上，通过装置的平均流量以及异戊二烯漏出的程度，收集的异戊二烯的量被计算为接近17g。
VIII.在补料分批培养中生长的大肠杆菌的500L发酵中的异戊二烯生产
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氨气(NH3)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调节pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在DI H2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在500-L生物反应器中，用含有pTrcKudzu yIDI DXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH 7.0以及温度30℃下从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物。当接种物生长至在550nm处测量的OD为0.15后，使用20ml接种含有2.5-L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。该2.5-L生物反应器在30℃下生长至OD 1.0并将2.0-L转入500-L生物反应器。
以指数速率喂饲酵母提取物(Bio Springer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别为181.2kg和17.6kg。图49A显示了生物反应器中随着时间的光密度。按前述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随着发酵进程而增加(图49B)。在50小时发酵期间产生的异戊二烯总量为55.1g并且生产的时间进程如图49C所示。
实施例8、在表达葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.下游MVA途径的克隆
克隆下游甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的四种基因；甲羟戊酸激酶(MVK)，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶基因并且分别克隆到pCR BluntII TOPO质粒(Invitrogen)。在一些情形下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。设计引物使得在5’端起始密码子上游8bp处插入大肠杆菌共有序列RBS(AGGAGGT(SEQID NO：80)或AAGGAGG(SEQ ID NO：81))以及在3’端添加PstI位点。然后一个接一个地将这些基因克隆到pTrcHis2B载体直到组装了整个途径。
酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC 204508D)。使用PfuTurbo  按照生产商的说明书，用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQ    ID    NO：21)和MVK-Pstl-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQ ID NO：22)从酿酒酵母染色体扩增MVK基因。通过1.2％E-gel(Invitrogen)电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)并将其克隆pZeroBLUNT TOPO。将得到的质粒称作pMVK1。用SacI和Taq 1限制性内切核酸酶消化质粒pMVK1并对片段凝胶纯化并连接到用SacI和BsIBI消化的pTrcHis2B。将得到的质粒命名为pTrcMVK1。
使用引物PstI-PMK1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQ    ID    NO：23)和BsiHXA    I-PMK1F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQ ID NO：24)，通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二种基因PMK。使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)按照生产商的说明书进行PCR反应。将正确大小的产物(1387bp)用PstI和BsiHKI消化并连接到用PstI消化了的pTrcMVK1中。将得到的质粒命名为pTrcKK。以相同方式克隆MVD  和idi基因。使用引物对PstI-MVD                1    R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQ ID NO：25)和NsiI-MVD 1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQ ID NO：26)进行PCR以扩增MVD基因，并且使用引物对PstI-YIDI1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQ ID NO：27)和NsiI-YIDI                1                       F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQID NO：28)扩增yIDI基因。在一些情形下，使用来自大肠杆菌的IPP异构酶基因，idi。为了扩增来自大肠杆菌染色体DNA的idi，使用下面的引物对：PstI-CIDI 1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQID          NO：29   )      和     NsiI-CIDI  1     F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQ IDNO：30)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO 96/35796和WO 2004/033646，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于核酸的分离)。最终的质粒命名为pKKDIy用于编码酵母idi基因的构建体或者命名为pKKDIc用于编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化到大肠杆菌宿主BL21用于随后分析。在一些情形下，将来自葛的异戊二烯合酶克隆到pKKDIy，产生质粒pKKDIyIS。
也将下游MVA途径克隆到含有卡那霉素抗生素抗性标记的pTrc。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％琼脂糖E-gel上分离5930bp片段并使用Qiagen Gel Purification试剂盒按照制造商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化在实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用Qiagen Gel Purification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化3338bp含有载体的片段。使用Roche Quick Ligation试剂盒连接该3338bp载体片段和5930bp下游MVA途径片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP 10细胞并将转化体在37℃下过夜生长，用含有卡那霉素(50μg/ml)的LA筛选。转化体通过限制性酶消化验证并将1个冷冻作为原种。质粒命名为pTrcKanKKDIy。
II.葛异戊二烯合酶基因在pTrcKanKKDIy中的克隆
使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT    (SEQ  ID  NO：31)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQID NO：32)，通过PCR从实施例1所述的pTrcKudzu扩增葛异戊二烯合酶基因。将得到的PCR片段克隆到pCR2.1中并转化大肠杆菌TOP 10。这一片段含有葛异戊二烯合酶的编码序列以及含有大肠杆菌RBS的上游区。转化体在37℃下过夜孵育，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上筛选。通过测序验证正确的片段插入并将这一菌株命名为MCM93。
用限制性内切核酸酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒以释放含有RBS和葛异戊二烯合酶的1724bp插入片段。在1.2％琼脂糖E-gel上分离该1724bp片段并使用Qiagen Gel Purification试剂盒按照生产商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，在37℃用SAP处理30分钟并使用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。使用Roche Quick Ligation试剂盒连接质粒和编码葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP 10细胞并且将转化体在37℃下过夜生长，在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。通过限制性酶切验证正确的转化体并且将质粒命名为pTrcKKDyIkISKan(图24和25)。将这一质粒转化得BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。
III.在表达重组下游甲羟戊酸途径以及来自葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯
在MOPS培养基中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology 119：736-747)，调节至pH 7.1并补充0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸。使用相同的条件只是不添加0.5％甲羟戊酸来建立对照培养。培养从用1％接种物的过夜种子培养物开始并且当培养物达到OD600为0.3至0.5时用500μM IPTG诱导。在30℃以250rpm振荡生长培养物。在使用实施例1所述的顶空测定法诱导3小时后分析异戊二烯生产。异戊二烯的最大产量为6.67×104nmol/L培养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。没有补充甲羟戊酸的对照培养物没有产生可测量的异戊二烯。
IV.上游MVA途径的克隆
从粪肠球菌克隆包括两个编码三种酶促活性的基因的上游甲羟戊酸生物合成途径。mvaE基因编码一种蛋白质，该蛋白质具有在该途径中的第一和第三蛋白质乙酰-CoA乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)还原酶的酶促活性，并且mvaS基因编码该途径中第二种酶HMG-CoA合酶。使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增mvaE基因，该基因前面为大肠杆菌核糖体结合位点和间隔区。
CF 07-60(+)mvaE w/RBS+ATG起始密码子SacI起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQID NO：34)
CF 07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：35)
使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC 700802D-5)扩增mvaS基因，该基因前面为大肠杆菌RBS和间隔区：
CF 07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-
GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：36)
CF 07-102(-)mvaS基因BglII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：37)。
使用下面的引物，用PCR将PCR片段融合在一起：
CF 07-60(+)mvaE w/RBS+ATG起始密码子SacI的起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQID NO：34)
CF 07-102(-)mvaS基因BglII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：37)
融合PCR片段用Qiagen试剂盒纯化并用限制性内切酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并将它连接到可商购的载体pTrcHis2A，该载体已经用SacI和BglII消化以及凝胶纯化。
将连接混合物转化大肠杆菌TOP 10细胞并且在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中过夜生长并使用Qiagen试剂盒分离质粒。用SacI和BglII消化质粒以检验插入片段并且用下面的引物对一个正确的质粒进行测序：
CF 07-58(+)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(S EQ ID NO：38)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQ ID NO：39)
CF 07-82(+)mvaS基因起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：40)
CF 07-83(-)mvaS基因末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：41)
CF 07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：42)
CF 07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：43)
CF 07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：44)
CF 07-89(+)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：45)
通过测序确认命名为pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的并将其转化到可商购的大肠杆菌菌株BL21中。在LA和50μg/ml羧苄青霉素上进行筛选。选择两个转化体并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中生长至它们达到OD600为1.5。在甘油存在下，将两个菌株在-80℃下在瓶中冷冻。对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#l，分离菌#1，将菌株命名为CF449，对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#1，分离菌#2，命名为CF450。发现两个克隆在分析时表现相同。
V.UpperMVA途径在pCL1920中的克隆
用限制性内切核酸酶SspI消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放含有pTrc-mvaE-mvaS-(His-标签)-终止子的片段。在这一片段中，his-标签并未被翻译。使用Qiagen Gel Purification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化这一平末端4.5kbp片段。通过用限制性内切核酸酶PvuII消化载体，用SAP处理并使用Qiagen Gel Purification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端4.2kbp片段。使用Roche Quick Ligation Kit连接两个片段并将它转化到TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过利用PCR筛选插入片段的存在来鉴定正确菌落。将质粒命名为pCL PtrcUpperPathway(图26和27)。
VI.表达组合的上和下游甲羟戊酸途径的菌株
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径加葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKXDylkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化到BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)中并且在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过质粒制备来检查转化体以确保两种质粒都保留在宿主中。菌株命名为MCM127。
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/p pTrcHis2A-mvaE/mvaS的单菌落接种到LB和羧苄青霉素(100μg/ml)中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。在250ml带挡板培养瓶中将这些培养物稀释到50ml培养基中至OD600为0.1。培养基为TM3，1或2％葡萄糖，羧苄青霉素(100ug/ml)或者TM3，1％葡萄糖，水解豆油，和羧苄青霉素(100ug/ml)或者TM3和生物量(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm振荡生长约2-3小时至达到OD600为0.4。在该点，通过添加IPTG(400μM)来诱导从mvaE mvaS构建体的表达。进一步培育培养物20或40小时，以2小时间隔取样至诱导后6小时，然后按需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物完成取样，测量OD600，在微量离心机中沉淀细胞，除去上清液并分析它的甲羟戊酸。
用TM3培养基和2％葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠杆菌细胞的14升发酵产生22克甲羟戊酸。用LB培养基和1％葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶产生2-4克甲羟戊酸/升。这些菌株中的甲羟戊酸生产表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。
VIII.从含有上和下游MVA途径加葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
通过将含有上和下游MVA途径以及上述葛异戊二烯合酶基因的质粒与含有实施例7所述的idi、dxs、和dxr以及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合来转化而产生下面的菌株。所用宿主细胞为化学感受态BL21(λDE3)并且通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素加壮观霉素(浓度均为50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。在37℃培养平板。得到的菌株按下面命名：
在卡那霉素加壮观霉素(各50μg/ml)上生长
MCM127-BL21(λDE3)中的pCL Upper MVA和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM131-BL21(λDE3)中的pCL 1920和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM125-BL21(λDE3)中的pCL Upper MVA和pTrcHis2B(kan)
在卡那霉素(50μg/ml)上生长
MCM64-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu yIDI DXS(kan)
MCM50-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu(kan)
MCM123-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu yIDI DXS DXR(kan)
上述菌株从冷冻母液在LA和适当抗生素上划线并在37℃过夜生长得到。每个板的单菌落用来接种摇瓶(25ml LB和适当抗生素)。将培养瓶在22℃以200rpm振荡过夜孵育。第二天早晨，将培养瓶转入37℃培养箱并以200rpm再振荡生长4.5小时。将25ml培养物离心以沉淀细胞并在5ml LB和适当抗生素中重悬细胞。将培养物稀释到25ml LB，％葡萄糖和适当抗生素中至OD600为0.1。每个菌株建立两个培养瓶，一套用IPTG(800μM)诱导，另一套不诱导。在37℃以250rpm振荡孵育培养物。一套培养物在1.50小时后诱导(紧接着取样时间点1)。在每个取样时间点，测量OD600并按实施例1所述测定异戊二烯的量。结果如表3所示。所生成的异戊二烯的量以特定菌株的峰值生产量来表示。
表3.在大肠杆菌菌株中的异戊二烯生产
Figure BDA0000047889120001131
ND：未检测到
痕量：存在峰值但不可积分。
IX.甲羟戊酸的分析
甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI，USA)提供，其溶解在水(7.7mL)中作为浆液并用氢氧化钾(7.7mmol)处理以产生甲羟戊酸的钾盐。向甲羟戊酸的转化通过1H NMR分析来确认。通过在14,000rpm下离心5分钟除去细胞，随后向900μl的H2O中添加300μl等份上清液来制备用于HPLC分析的样品。然后添加高氯酸(36μl的70％溶液)，接着混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000rpm，5分钟)并将上清液转入HPLC。以相同方式制备甲羟戊酸标准品(20，10，5，1和0.5g/L)。使用BioRad Aminex 87-H+柱(300mm×7.0mm)通过HPLC进行甲羟戊酸(20uL注射体积)的分析，该柱用5mM硫酸以0.6mL/min洗脱，以折射率(RI)检测。在这些条件下，在18.5分钟时，甲羟戊酸以内酯形式洗脱。
实施例9、用于整合到枯草杆菌中的上和下游MVA途径的构建
I.在枯草杆菌中上游MVA途径的构建
来自粪肠球菌的上游途径整合到枯草杆菌中处于aprE启动子控制下。上游途径由两种基因组成：编码AACT和HMGR的mvaE，以及编码HMGS的mvaS。这两种基因融合在一起，其间有终止密码子，RBS在mvaS前，并且在aprE启动子控制下。终止子位于mvaE基因后。在mvaE基因后克隆氯霉素抗性标记并且使用同源性侧翼区进行双交换而在aprE基因座处整合该构建体。
通过PCR扩增四个DNA片段以便它们含有使得它们通过PCR反应融合在一起的突出端序列。使用Herculase聚合酶按照生产商说明书进行PCR扩增。
1：PaprE
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82)
CF 07-94(-)PaprE与mvaE融合
5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQ ID NO：83)
模板：枯草杆菌染色体DNA
2：mvaE
CF 07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：84)
CF 07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQ ID NO：35)
模板：粪肠杆菌染色体DNA(来自ATCC)
3.mvaS
CF 07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-
GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQ ID NO：36)
CF 07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ IDNO：85)
模板：粪肠杆菌染色体DNA
4.解淀粉芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶终止子
CF 07-123(+)mvaS末端与终止子融合
5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQ IDNO：86)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63)
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA
PCR融合反应
5.mvaE与mvaS融合
CF 07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQ ID NO：84)
CF 07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ IDNO：85)
模板：上述#2和3
6.mvaE-mvaS与aprE启动子融合
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82)
CF 07-124(-)mvaS的末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ IDNO：85)
模板：上述#1和#4
7.PaprE-mvaE-mvaS与终止子融合
CF 07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82)
CF 07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQ ID NO：63)
模板：#4和#6
产物用限制性内切核酸酶PstI/BamHI消化并连接到用PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis，p.615-624.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch，以及R.Losick(编)，Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria：biochemistry，physiology，and molecular genetics.American Society for Microbiology，Washington，D.C.)。连接物转化到大肠杆菌TOP 10化学感受态细胞并且在含有羧苄青霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过测序鉴定正确质粒并命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。纯化后的质粒DNA转化到枯草杆菌aprEnprE Pxyl-comK并且在含有氯霉素(50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。选择正确菌落并且在含有氯霉素10、15和25μg/ml的L琼脂顺序平板接种以扩增含有上游途径的表达盒的拷贝数。
通过在含有1％葡萄糖的LB中生长来检测得到的菌株的甲羟戊酸生产。通过GC分析培养物的甲羟戊酸生产。
顺序使用这一菌株作为宿主用于下游甲羟戊酸途径的整合。
使用下面的引物来测序上面的多个构建体。
测序引物：
CF 07-134(-)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQ ID NO：82)
CF 07-58(-)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQ ID NO：38)
CF 07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQ ID NO：39)
CF 07-82(-)mvaS基因的起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQ ID NO：40)
CF 07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQ ID NO：41)
CF 07-86(-)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQ ID NO：42)
CF 07-87(-)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQ ID NO：43)
CF 07-88(-)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQ ID NO：44)
CF 07-89(-)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQ ID NO：45)
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上筛选转化体。通过测序确认一个菌落具有正确的整合，并将该菌落在若干天内平板接种在含有增加浓度至最终水平为25μg/ml的氯霉素的LA上。这导致含有目的基因的表达盒的扩增。得到的菌株命名为CF 455：pJMupperpathway#l X Bacillussubtilis aprEnprE Pxyl comK(扩增以在含有氯霉素25μg/ml的LA上生长)。
II.下游MVA途径在枯草杆菌中的构建
由基因mvkl、pmk、mpd和idi组成的下游MVA途径组合在表达盒中，该表达盒由来自枯草杆菌染色体的nprE区域的侧翼DNA区域(整合位点)、aprE启动子、以及壮观霉素抗性标记组成(参见图28和29)。通过DNA 2.0合成这一表达盒并将它整合到含有在aprE基因座处整合上游MVA途径的枯草杆菌的染色体中。从实施例4所述的复制质粒表达葛异戊二烯合酶基因并将它转化到整合有上和下游途径的菌株中。
实施例10、在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.编码马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)和银白杨异戊二烯合酶的载体和菌株的构建
(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建
大肠杆菌BL21(Novagen牌，EMD Biosciences，Inc.)是转导有MCM331P1裂解物(根据Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons，Inc.所述的方法制备的裂解物)的受体菌株。通过将细胞涂布于L Agar和20μg/μl氯霉素上筛选转导子。将板在30℃过夜孵育。对转导子的分析显示对照板(水+细胞对照板用于返回以及水和P1裂解物对照板用于裂解物污染)上没有菌落。
挑取4个转导子并用于接种5mL L Broth和20μg/μl氯霉素。在30℃以200rpm振荡过夜生长培养物。为了得到每个转导子的基因组DNA制备物用于PCR分析，将1.5mL过夜细胞培养物离心。用400μl重悬浮缓冲液(Resuspension Buffer)(20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH 7.5)重悬细胞沉淀并加入4μl RNase，无DNase(Roche)。试管在37℃孵育30分钟，随后加入4μl 10％SDS和4μl的10mg/ml Proteinase K母液(Sigma-Aldrich)。试管在37℃孵育1小时。将细胞裂解物转入2ml PhaseLock Light Gel管(Eppendorf)并且加入各200μl饱和苯酚pH7.9(AmbionInc.)和氯仿。充分混合试管并微量离心5分钟。用400μl氯仿进行第二次萃取并将含水层转入新的离心管中。通过加入1ml的100％乙醇沉淀基因组DNA并离心5分钟。用1ml 70％乙醇冲洗基因组DNA沉淀。除去乙醇并允许基因组DNA沉淀快速风干。将基因组DNA沉淀用200μl TE重悬浮。
使用Pfu Ultra II DNA聚合酶(Stratagene)以及200ng/μl的基因组DNA作为模板，按照生产商的方法制备两套不同的PCR反应管。对于第1套，使用引物MCM 130和GB Cm-Rev(表4)以保证转导子成功地整合到attTn7基因座中。第1套的PCR参数为95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续25秒(重复步骤2-4持续28个循环)，72℃持续1分钟。对于第2套，使用引物MVD For和MVD Rev(表4)以确保正确整合gi1.2-KKDyI操纵子。第2套的PCR参数为95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续10秒(重复步骤2-4持续28个循环)，72℃持续1分钟。在1.2％E-gel(Invitrogen Corp.)上的PCR扩增子的分析表明所有4个转导子都是正确的(挑取一个并命名为菌株EWL201)。
ii)菌株EWL204(BL21，环出序列-GI1.2-KKDyI)的构建
使用质粒pCP20按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人，Proc Nati.Acad.Sci USA 97：6640-6645，2000)所述从菌株环出氯霉素标记。使用PCR产物在大肠杆菌K-12中进行染色体基因的一步失活(Datsenko等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在L Broth中生长至对数中期然后在冰预冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与1μl的pCP20混合并在2.5伏特和25uFd下使用Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Inc.)在2mm杯(Invitrogen Corp.)中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。允许在30℃生长细胞1小时来回收它。在L Agar和20μg/μl氯霉素和50μg/μl羧苄青霉素上筛选转化体并在30℃过夜孵育。第二天，于30℃下，在10ml的L Broth和50μg/μl羧苄青霉素中生长单个克隆直到早对数期。然后将生长培养物的温度转至42℃持续2小时。进行一系列稀释，然后将细胞涂布在LA板(无抗生素筛选)上并在30℃过夜孵育。第二天，挑取20个菌落并接种到L Agar(无抗生素)以及LA和20μg/μl氯霉素板上。然后在30℃过夜孵育平板。能够在LA板上生长，但不能在LA和20μg/μl氯霉素板上生长的细胞被认为环出了氯霉素标记(挑取一个并命名为菌株EWL204)。
iii)质粒pEWL230(pTrc P.alba)的构建
根据对大肠杆菌表达的密码子优化方法，由DNA2.0Inc.(Menlo Park，CA)负责制备编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因。该合成基因被定制克隆到质粒pET24a(Novagen牌，EMD Biosciences，Inc.)中并冻干递送(图54、55A和55B)。
按照生产商的方案，使用pET24P.alba HGS作为模板，引物MCM182和MCM 192，以及Herculase II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应来扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)。PCR条件如下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续20秒，72℃持续1分钟，重复25个循环，在72℃最终延伸3分钟。
使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen Inc.)纯化银白杨异戊二烯合酶PCR产物
然后在20μl含有1μl BspHI内切核酸酶(New England Biolabs)以及2μl 10x NEB缓冲液4的反应物中，消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。反应物在37℃孵育2小时。然后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化经消化的PCR片段。在20μl含有1μl PstI内切核酸酶(Roche)的反应物中，用2μl 10x Buffer H进行第二次限制性消化。反应物在37℃孵育2小时。然后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化经消化的PCR片段。在20μl含有1μl NcoI内切核酸酶(Roche)、1μl PstI内切核酸酶和2μl 10xBuffer H的反应物中消化质粒pTrcHis2B(Invitrogen Corp.)。反应物在37℃孵育2小时。使用1.2％E-gel(Invitrogen Corp.)凝胶纯化经消化的pTrcHis2B载体并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)提取(图56)。使用BspHI和NcoI位点的相容性粘性末端，制备含有5μl银白杨异戊二烯合酶插入片段，2μl pTrc载体，1μlT4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)，2μl 10X连接酶缓冲液和10μl ddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在室温孵育40分钟。通过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝酸纤维素滤膜(Millipore)并在室温下将连接混合物轻轻地放在硝酸纤维素滤膜上30分钟使连接混合物脱盐。MCM446细胞(参见第II部分)在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与5μl脱盐pTrc银白杨HGS连接混合物混合。使用Gene PulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。在30℃生长细胞2小时来回收它。在L Agar和50μg/μl羧苄青霉素和10mM甲羟戊酸上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6个转化体并于30℃下，在5ml的L Broth和50μg/μl羧苄青霉素试管中过夜生长。使用QIAquick Spin Miniprep Kit(Qiagen)对过夜培养物进行质粒制备。由于使用BL21细胞来繁殖质粒，对生产商标准方法进行用PBBuffer 5X和PE Buffer 3X冲洗离心柱的修改以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质粒都是正确的大小并且送至Quintara Biosciences(Berkeley，CA)，用引物MCM65、MCM66、EL 1000测序(表4)。DNA测序结果显示所有6个质粒都是正确的。挑取一个并命名质粒为EWL230(图57、58A和58B)。
iv)质粒pEWL244(pTrc P.alba-mMVK)的构建
按照生产商的方法，使用MCM376作为模板(见第v部分)，引物MCM 165和MCM 177(见表4)，以及Pfu Ultra II Fusion DNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应来扩增马氏甲烷八叠球菌MVK基因。PCR条件如下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续18秒，重复28个循环，在72℃最终延伸1分钟。使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen Inc.，)纯化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。
然后在40μl含有8μl的PCR产物，2μl PmeI内切核酸酶(New England Biolabs)，4μl 10x NEB缓冲液4，4μl 10x NEB BSA和22μl的ddH2O的反应物中，消化马氏甲烷八叠球菌MVK PCR产物。反应物在37℃孵育3小时。然后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化经消化的PCR片段。在47μl含有2μl NsiI内切核酸酶(Roche)，4.7μl 10x缓冲液H和40μl的PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的反应物中，进行第二次限制酶消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消化的PCR片段并使用QIAquick Gel Extraction Kit提取。在40μl含有10μl质粒，2μl PmeI内切核酸酶，4μl 10x NEB缓冲液4，4μl 10x NEB缓冲液4，4μl 10x NEB BSA和20μl的ddH2O的反应物中，消化质粒EWL230。反应物在37℃孵育3小时。然后使用QIAquick PCR Purification Kit纯化经消化的PCR片段。在47μl含有2μl PstI内切核酸酶，4.7μl 10x缓冲液H和40μl的PmeI消化的EWL230线性片段的反应物中，进行第二次限制性消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消化的PCR片段并使用QIAquick Gel Extraction Kit提取(图59)。使用NsiI和PstI位点的相容性粘性末端，制备含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插入片段，3μl EWL230质粒，1μl T4DNA连接酶，2μl 10X连接缓冲液和6μlddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在16℃过夜孵育。第二天，通过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝酸纤维素滤膜并在室温下将连接混合物轻轻地放在硝酸纤维素滤膜上面30分钟使连接混合物脱盐。MCM446细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与5μl脱盐pTrc P.alba-mMVK连接混合物混合。使用GenePulser Electroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后将细胞转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸板上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6个转化体并于30℃下，在5ml的LB和50μg/μl羧苄青霉素试管中过夜生长。使用QIAquick Spin Miniprep Kit对过夜培养物进行质粒制备。由于使用BL21细胞来繁殖质粒，向标准生产商方法中加入用PB缓冲液5X和PE缓冲液3X冲洗旋转柱的修改以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正确的大小并且送至Quintara Biosciences，以用引物MCM65、MCM66、EL 1000、EL 1003和EL 1006测序(表4)。DNA测序结果表明所有3个质粒都是正确的。取一个并命名为质粒为EWL244(图60和61A-B)。
v)在pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lower的质粒MCM376-MVK的构建
使用Invitrogen Platinum HiFi PCR混合物，用引物MCM 161和MCM162(表4)对来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lower Pathway操纵子的MVK ORF(图73A-C)进行PCR扩增。将45uL的PCR混合物与1uL模板，1uL的10uM各引物，以及2uL水组合。反应循环如下：94℃持续2:00分钟；94℃持续0:30分钟，55℃持续0:30分钟，和68℃持续1:15分钟，30个循环；以及随后在72℃持续7:00分钟，并置于4℃至冷却。按照生产商的方法，将3uL的这一PCR反应物与Invitrogen pET200D质粒相连。将3uL这一连接物导入Invitrogen TOP 10细胞，然后在LA/kan50上筛选转化体。分离来自转化体的质粒并对插入片段测序，得到MCM376(图74A-C)。
vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK)的构建
将MCM331细胞(含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸酶激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。混合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒EWL244。使用Gene PulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸板上筛选转化体并在37℃孵育。选择一个菌落并命名为菌株EWL251。
vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK，pCL Upper MVA)的构建
将EWL251细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。混合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒MCM82(它是编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCL PtrcUpperPathway)。使用Gene PulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和50μg/μl壮观霉素板上筛选转化体并在37℃孵育。挑取一个菌落并命名为EWL256。
表4：引物序列
II.构建具有FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI的MCM442-449：BL21和BL21(DE3)
I)重组模板的构建
基于FRT-的重组盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗生素标记环出序列获自Gene Bridges GmbH(Germany)。按照Gene Bridges方法进行使用这些材料的步骤。使用Stratagene Herculase II Fusion试剂盒，按照生产商方法，使用引物MCM193和MCM 195从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。50μl反应物循环如下：95℃，2分钟；(95℃，20秒，55℃，20秒，72℃，1分钟)×5，(95℃，20秒，60℃，20秒，72℃，1分钟)×25；72℃，3分钟，4℃至冷却。通过Qiagen PCR柱，按照制造商方法纯化扩增子并在30uL EB(Elution Buffer)中洗脱。在具有1x RocheH缓冲液和0.5uL BSA的20uL反应物中将DNA用NdeI和PciI消化。在各含有1uL的NdeI，NcoI，和Roche H缓冲液的10uL反应物中，消化质粒MCM376。在37℃过夜进行反应，然后在Qiagen PCR柱上纯化切下的DNA并在30uL的EB中洗脱。在含有1uL载体，3uL PCR产物，1uL Roche Quick Ligase缓冲液2，5uL缓冲液1以及1uL连接酶的反应物中，将PCR产物连接到MCM376中。反应在室温进行3小时然后按照生产商的方法将5uL转化到Invitrogen TOP 10细胞。于37℃在L琼脂(LA)和氯霉素(10ug/mLO)上筛选转化体过夜。
将转化体菌落铺到含氯霉素(30ug/mL)和卡那霉素(50ug/ml)的LA上用于储存并送至Quintara(Berkeley，CA)测序。发现四个克隆具有对于插入的启动子的正确序列，该四个克隆中每个在引物MCM195的“N”处具有四个不同的核苷酸。克隆在5mL含有氯霉素(30ug/mL)和卡那霉素(50ug/ml)的LB中生长并用于制备质粒DNA。这一质粒再转化到TOP10细胞并且冷冻菌株：
表5：MCM484-487
  MCM484   cmR-gi1.6-MVK(mazei)in pET(克隆A1-3，可变nt A)
  MCM485   cmR-gi1.0-MVK(mazei)in pET(克隆B4-6，可变nt C)
  MCM486   cmR-gi1.2-MVK(mazei)in pET(克隆C1-5，可变nt G)
  MCM487   cmR-gi1.5-MVK(mazei)in pET(克隆C3-3，可变nt T)
ii)重组靶菌株MCM349和MCM441的产生
使用质粒pGB706按照制造商的说明书从菌株MCM331环出氯霉素抗性(cmR)标记。MCM331细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的1μlpGB706DNA加入50μl的细胞悬浮物中并在2.5伏特和25uFd下在2mm杯(Invitrogen Corp.)中对这一混合物进行电穿孔，随后立即在30℃下在500μl的LB中回收1小时。于30℃下，在含有四环素(5ug/ml)的LB中筛选转化体。第二天，将一个克隆在30℃下在含有四环素(5ug/ml)的LB中生长直到可见的浑浊(OD600～0.5-0.8)。将这一培养物划线到LB上并在37℃过夜生长。将不能在含有氯霉素(10ug/mL)的LB或含有四环素(5ug/mL)的LB上生长的克隆冷冻为MCM348。按上述对质粒MCM356(pRedET羧苄青霉素；GeneBridges)进行电穿孔并且在30℃下在含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB上筛选转化体。在30℃下在LB羧苄青霉素(50ug/mL)上生长克隆并冷冻为MCM349。
通过按上述将质粒MCM356电转化到EWL204中产生菌株MCM441。
iii)FRT-cmR-FRT-gi1.x-mMVK向MCM349和MCM441中的重组
按照生产商方法，使用质粒MCM484-487作为模板，以引物MCM 120和MCM 196和Herculase II Fusion试剂盒进行PCR扩增。每个模板以0、1、或3uL DMSO进行三个反应。50μl反应循环如下：95℃，2分钟；(95℃，20秒，55℃，20秒，72℃，1.5分钟)进行5个循环；(95℃，20秒，60℃，20秒，72℃，1.5分钟)进行25个循环；72℃，3分钟，4℃过夜。合并来自给定模板的三个反应物并在Qiagen PCR柱上纯化以及在60℃下用30uL的EB洗脱。在37℃用1uL在1x Roche Buffer A中的DpnI消化5uLDNA 3小时。然后对过量水微透析这一DNA 30分钟。
来自新划线的菌株在5mL含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB中于30℃生长至OD600为～0.5。加入40mM的L-阿拉伯糖并在37℃孵育培养物1.5小时。收集细胞并用3uL上述透析的扩增子进行电穿孔，然后在37℃下在500uL SOC中回收1.5-3小时。在37℃下，在含有氯霉素(5ug/mL)的LB板上筛选转化体。
通过PCR筛选卡那霉素抗性克隆的扩增子插入。对来自阳性克隆的PCR产物测序以验证插入的DNA的序列。扩增子与在MCM441attTn7处FRT-gi1.2-yKKDyI一致并且348个被FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI代替(yK和mK指分别来自酿酒酵母和马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶)。
表6A：下列菌株在含氯霉素(5ug/mL)的LB中生长并冷冻
Figure BDA0000047889120001271
表6B：引物
Figure BDA0000047889120001272
III.酵母提取物对表达来自甲羟戊酸途径的基因并且以15-L规模在补料-分批培养中生长的大肠杆菌中异戊二烯生产的影响
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl 0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在Di H2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)和高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二烯合酶的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH 7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻冷冻瓶的大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种15-L生物反应器，使初始体积达到5-L。
i)在没有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞(EL256)的异戊二烯生产
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在67小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.9kg。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值9时，IPTG浓度达到102uM。当OD550达到140时，IPTG浓度升至192uM。图67A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为35.6g/L(图67B)。在67小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为320.6g而生产的时间进程如图67C所示。如TCER所测量的代谢活性谱如图67D所示。在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的摩尔产率为17.9％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产率为8.1％。
在具有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞(EL256)中的异戊二烯生产
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在68小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为7.1kg。发酵期间也加料总计1.06kg的酵母提取物。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值7时，IPTG浓度达到208uM。当OD550达到180时，IPTG浓度升至193uM。图68A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至最大值为32.2g/L(图68B)。在68小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为395.5g而生产的时间进程如图68C所示。图68D示出体积生产力的时间进程并且示出在23和63小时之间，维持平均速率为1.1g/L/hr。如CER所测量的代谢活性谱如图68E所示。在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的摩尔产率为10.3％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产率为5.2％。
IV.在含有甲羟戊酸(MVA)途径和异戊二烯合酶(EWL256)的大肠杆菌中从不同碳源生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分顺序溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。添加碳源至终浓度为1％。在灭菌以及调整pH后，添加所需的抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在di H2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
i)AFEX生物量水解物的制备
水解AFEX预处理玉米秸秆来制备含有木糖、葡萄糖和乙酸的生物量水解物。
使用获自Michigan Biotechnology Institute的AFEX预处理玉米秸秆。预处理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。所用酶为Accellerase 1000，Grindamyl H121(来自用于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)。
对于糖化，将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液，pH 4.8，2.25ml的Accellerase 1000，0.1ml的Grindamyl H121，以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。
为了分析，从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有37.2g/l的葡萄糖，24.3g/L的木糖，和7.6g/L葡萄糖和/或木糖的寡聚物。此外，水解物也含有1.17g/L乙酸盐。
ii)实验方法
含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株EWL256的接种物取自冷冻瓶并划线到含有壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL)的LB液体培养基琼脂板上并在30℃过夜培养。将单菌落接种到含有葡萄糖、木糖、丙三醇、乙酸盐或生物量作为唯一碳源的TM3培养基中并在30℃过夜生长。在乙酸盐上生长的细胞达到了明显更低的光密度。将在葡萄糖、丙三醇、生物量水解物或乙酸盐上生长的细胞稀释成20mL含有各自碳源的TM3培养基以达到在600nM处测量的光密度为0.1之间。从葡萄糖过夜培养物来制备不含有任何碳源的阴性对照。用葡萄糖和木糖进行单独的实验，其中培养物都稀释到光密度为0.05。所有培养条件(除了乙酸盐和丙三醇)都一式两份检测并且呈现的结果是这些培养物之间的平均值。从实验开始，由200μM IPTG诱导异戊二烯的生产。培养瓶在定轨摇床(200rpm)中在30℃孵育并生长，随后测量光密度。当葡萄糖供料培养物达到光密度接近0.4后，对所有检测的碳源每小时分析样品的异戊二烯生产，持续3小时。将100μL样品一式两份转入2mL玻璃瓶中，密封并在30℃孵育30min。然后通过在80℃孵育8分钟来热处死细菌。使用GC-MS测量产生的异戊二烯的量并计算比生产力(μg/L＊hr)。
iii)结果
在所有检测碳源上生长期间，可以阐明显著的异戊二烯生产。这些碳源是含有5或6个碳单元(C5或C6)的常用醇、有机酸、糖，以及生物量水解物的实例。
在生物量水解物上的初始生长速率与在葡萄糖上的生长速率是相当的(图69A)。生物量水解物上生长期间的初始比生产力明显比在葡萄糖上生长期间的要高。这证明生物量水解物可以用作有效的碳源来生产异戊二烯。在生长255分钟后，在生物量水解物上的比生产力下降(图69B)。相比于葡萄糖，以木糖作为唯一碳源的细菌具有较低的生长速率(图69C)，但是测量到明显的比异戊二烯生产力(图69D)。这表明可以利用C5和C6糖来通过甲羟戊酸途径生产异戊二烯。
出人意料地，在乙酸盐作为唯一碳源上生长的细菌的异戊二烯比生产力为在葡萄糖上生长期间的约两倍高(图69A)。当相比于葡萄糖，在乙酸盐上的细菌生长较慢(图69B)，但是所进行的实验表明乙酸盐也可以用作碳源来生产异戊二烯。如由HPLC所测量，乙酸盐也存在于生物量水解物中。
以丙三醇作为唯一碳源的细菌生长良好(图69A)并且示出了显著的异戊二烯生产(图69B)。这表明常用醇也可用作碳源来通过甲羟戊酸途径生产异戊二烯。
实施例11、来自植物的异戊二烯合酶在链霉菌属中的表达
葛异戊二烯合酶的基因获自质粒pJ201:19813。质粒pJ201:19813编码来自野葛(Pueraia lobata)(葛植物)的异戊二烯合酶并且是对于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、金红红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)和棒杆菌(Corynebacterium)进行密码子优化的(图9A-79C(SEQ ID NO：123))。用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI对质粒pJ201：19813的消化释放了基因iso19813，它连接到链霉菌-大肠杆菌穿梭载体pUWL201PW(Doumith等，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000；图71)以产生pUWL201_iso。通过对pUWL201_iso的限制性分析来验证成功的克隆。异戊二烯合酶iso19813的表达在erm-启动子控制下，该启动子允许在链霉菌种中的组成型表达而不在大肠杆菌中表达。
通过如Hopwood等人，The John innes foundation，Norwich，1985所述的原生质体转化将PUWL201PW(无插入片段)和pUWL201_iso导入白色链霉菌(Streptomyces albus)J1074(Sanchez等人，Chem.Biol.9：519-531，2002)。
用1.9μg pUWL201PW或2.9μg pUWL201_iso转化200μl等份原生质体悬液。在非选择性R5-琼脂板上于28℃过夜孵育后，通过进一步在含有硫链丝菌肽(250μg/ml)的覆盖R3的琼脂中孵育4天来筛选阳性转化体。使用Plasmid Mini Kit(Qiagen)通过质粒制备来检验硫链丝菌肽抗性转化体中pUWL-质粒的存在。将制备的质粒再导入大肠杆菌DH5α以产生足量待通过限制性分析来分析的质粒DNA。在含有氨苄青霉素的L-琼脂板上筛选阳性转化体并通过由NdeI和BamHI内切核酸酶消化质粒DNA来进行插入片段的分析。在阳性pUWL201iso克隆中鉴定的异戊二烯合酶为1.7kb片段，而在对照菌株(pUWL201PW)中，没有观察到此片段。
分析白色链霉菌野生型菌株和含有对照质粒pUWL201PW或异戊二烯合酶编码pUWL201_iso的转化体的异戊二烯形成。在硫链丝菌肽(200μg/ml)存在或不存在下，在固体培养基(胰蛋白胨大豆肉汤琼脂，TSB；2.5ml)上一式两份培养菌株并在28℃下在密封顶空瓶(总体积20ml)中孵育4天。通过GC-MS以SIM-模式分析500μl顶空样品(终点测量)并根据参考保留时间和分子量(67m/z)来鉴定异戊二烯。通过之前产生的校准曲线来量化存在于顶空样品中的异戊二烯。虽然野生型白色链霉菌和带有pUWL201PW的对照菌株产生的异戊二烯的浓度略高于检测极限(0.04-0.07ppm)，但是带有pUWL201_iso的白色链霉菌产生的异戊二烯相比于对照(0.75ppm；图72)超出至少10倍。结果表明植物来源的异戊二烯合酶在放线菌组中的原核生物中成功表达。
实施例12、在含有上游或上和下游甲羟戊酸途径加葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC LS5218中从脂肪酸或棕榈油生产异戊二烯或甲羟戊酸
大肠杆菌fadR atoC菌株LS5218(#6966)获自Coli Genetic StockCenter。FadR编码转录抑制物，该转录抑制物负调控编码脂肪酸降解酶的基因的表达(Campbell等人，J.Bacteriol.183：5982-5990，2001)。AtoC是双组分调控系统中的应答调控子，而AtoS调控乙酰乳酸代谢。fadR atoC菌株允许脂肪酸降解基因的组成型表达并且将长链脂肪酸掺入长链长度的多羟基链烷酸。当将棕榈油用作碳源来生产甲羟戊酸或异戊二烯时，棕榈油转化成丙三醇加脂肪酸。用于此的方法是本领域公知的，并且它可以通过由脂肪酶(例如猪胰脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或其他类似脂肪酶)孵育来酶促完成或这通过用诸如氢氧化钠的碱来皂化而化学完成。
i)表达上游甲羟戊酸途径的大肠杆菌fadR atoC菌株
使用标准方法(Sambrooke等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ed.，Cold Spring Harbor，1989)将pCLPtrcUpperPathway电穿孔到LS5218来产生菌株WW4。通过在补充有C12脂肪酸(FA)或棕榈油作为碳源的TM3培养基中培养细胞时甲羟戊酸(MVA)的生产来证明质粒的掺入。为了证明由WWC从脂肪酸生产MVA，将来自过夜培养物的细胞在5mL补充有0.25％C12FA(Sigma目录号#L9755)的改良TM3培养基(没有酵母提取物的TM3)中稀释1至100倍。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(24mg/L)是明显的。生产在3天的时间内增加，产生的MVA的最终水平为194mg/L。为了证明WW4从油生产MVA，将来自过夜培养物的细胞在改良TM3培养基中稀释1至100倍，该TM3培养基每5mL补充有200mg经消化的棕榈油。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(50mg/L)是明显的。生产在3天的时间内增加，生产的MVA的最终水平为500mg/L。
ii)表达上和下甲羟戊酸途径加葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadR atoC菌株
用pMCM 118[pTrcKKDyIkIS]转化大肠杆菌菌株WW4(LS5218fadR atoC pCLPtrcUpperPathway)以得到WW10。当菌株在TM3和葡萄糖中培养并用IPTG(100，300或900uM)诱导时产生异戊二烯的证据证明了质粒的掺入。菌株对于IPTG是相对敏感的并且即使在100uMIPTG时都显示了明显的生长缺陷。这些结果如图70A所示。
为了检测从十二烷酸的异戊二烯生产，于37℃在含有壮观霉素(50ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的L液体培养基中以200rpm振荡过夜培养WW10。通过离心用改良的TM3培养基冲洗细胞并用这一培养基以它们的原始培养体积重悬细胞。将来自这一初始培养物的经冲洗和重悬的细胞以1∶100和1∶10稀释到5mL含有0.125％C12FA(Sigma目录号#L9755)的改良TM3培养基中。
为了阐明来自棕榈油的甲羟戊酸的生产，将油在37℃和250rpm用脂肪酶预消化若干天以释放脂肪酸(水解证据由振荡试管时形成的泡沫来判断)。
此外，通过将冲洗过的细胞在具有棕榈油的检测管中所含的改良TM3培养基中稀释10倍来建立培养物。通过向冲洗过的细胞的剩余物(2.5mL)加入0.125％C12FA而不进一步稀释(生物转化)而建立又一个管。在30℃以250rpm振荡生长3.75小时后，通过添加50uM IPTG来诱导所有培养物。继续孵育4小时，此后，用改良的顶空检测法(在30℃以500rpm振荡下的1小时累积)检测200uL每种培养基的异戊二烯累积。在GCMS分析前，通过12小时孵育测定玻璃组(assay glass block)来进行其它异戊二烯检测法。继续对该诱导的培养物的过夜孵育并且于第二天早晨，再次对200uL等份试样进行异戊二烯生产的测定(1小时，30摄氏度，500rpmShel-Lab摇床)。这些培养物的分析显示出显著水平的异戊二烯生产。在过夜起始培养物经孵育并过夜诱导后，将它以1/10稀释接种，在培养物中观察到最高水平的异戊二烯。这一结果表明这一培养物继续生长并且细胞密度增加。这些结果示出于图70B。由于脂肪酸悬液具有浑浊的外观，因而不能直接测量细胞密度。因此通过将等份培养物铺板来测定这一培养物的细胞密度，并且显示为8×107个菌落形成单位。这几乎对应于OD600为0.1。然而，这一培养物提供了显著的异戊二烯生产；在没有这一实例中所述途径的类似菌株中没有观察到异戊二烯。
实施例13、通过ybhE在大肠杆菌中的组成型表达改善异戊二烯生产
这一实例示出相比于具有野生型ybhE的对照菌株，在组成型表达ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯生产。基因ybhE(pgl)编码6-磷酸葡糖酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白的翻译后葡糖酸化并提高产物可溶性和产量，同时也提高通过磷酸戊糖途径的生物量产量和流量(Aon等人，Applied and Environmental Microbiology，74(4)：950-958，2008)。
用ybhE基因在复制质粒pBBR1MCS5(Gentamycin)(获自Dr.K.Peterson，Louisiana State University)上的组成型表达来构建产生异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)。
基于FRT-的重组表达盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗生素标记环出序列获自Gene Bridges GmbH(Germany)。按照GeneBridges方法进行使用这些材料的步骤。使用Stratagene Herculase IIFusion试剂盒，按照生产商方法，使用引物Pgl-F和Pg1GI1.5-R从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(50uL终体积)包括：5uL缓冲液，1uL模板DNA(来自Gene Bridges的FRT-gb2-Cm-F)，10pmol每种引物和1.5uL 25mM dNTP混合物，以dH2O制成50uL。反应循环如下：1×2分钟，95℃，然后30个循环(95℃，30秒，63℃，30秒，72℃，3分钟)。
使用QiaQick PCR纯化试剂盒(Qiagen)对得到的PCR产物进行纯化并将其如下电穿孔到携带含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞。通过在30℃生长于5mL的L液体培养基中至OD600～0.6而制备细胞。通过向细胞加入4％阿拉伯糖并允许在30℃生长30分钟随后在37℃生长30分钟来诱导重组酶表达。在冰预冷dH2O中将等份的1.5mL细胞冲洗3-4次。将最终的细胞沉淀在40uL的冰预冷dH2O中重悬浮并加入2-5uL的PCR产物。在Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Inc.)中以1.3kV在1-mm通道杯中进行电穿孔。在30℃回收细胞1-2小时并在含有氯霉素(5ug/mL)的L琼脂上铺板。通过PCR分析5个转化体并使用整合位点侧翼的引物来测序(2个引物对：pgl和49rev以及3’EcoRV-pglstop；Bottom Pgb2和Top GB’s CMP(946))。筛选正确的转化体并将这一菌株命名为MG1655GI1.5-pgl::CMP。
将MG1655GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板来产生含有FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下将这一构建体克隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)中。该片段，在此称作CMPGI1.5-pgl，是使用5’引物Pglconfirm-F和3’引物3’Ec0RV-pglstop来扩增的。使用Invitrogen TOPO-Blunt克隆试剂盒，按照生产商的建议，将得到的片段克隆到质粒载体pCR-Blunt II-TOPO。将含有CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)的PstI位点。制备20μl连接反应物，其包含5μlCMP-GI1.5-pgl插入片段，2μl pBBR1MCS5(Gentamycin)载体，1μlT4DNA连接酶(New England Biolabs)，2μl 10x连接酶缓冲液，和10μl ddH2O。室温孵育连接混合物40分钟然后使用上面公开的参数将2-4uL电穿孔到电感受态Top 10细胞(Invitrogen)。在含有10ug/ml氯霉素和5ug/ml庆大霉素的L琼脂上筛选转化体。使用上述多个引物以及由Sequetech，CA提供的内部T3和反向引物，测定所筛选克隆的序列。这一质粒命名为pBBRCMPGI1.5-pgl(图77A-B和SEQ ID NO：122)。
按上面在实施例10中所述，将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔到EWL256并且将转化体在含有氯霉素(10ug/mL)、庆大霉素(5ug/mL)、壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL)的L琼脂上铺板。筛选一个转化体并命名为RM11608-2。
引物：
Pgl-F
5’-
ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAA
GGGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：115)
PglGI1.5-R
5’-
GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAAC
GCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGC
GTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQ ID NO：116)
3′EcoRV-pglstop：
5’-CTT GAT ATC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC(SEQ ID NO：117)
pgl+49rev：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQ ID NO：118)
Bottom Pgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQ ID NO：119)
Top GB’s CMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQ ID NO：120)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQ ID NO：121)
i)小规模分析
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。在灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖5.0g和抗生素。
1000X微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在di H2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
a)实验步骤
通过在来自MicroReactor Technologies，Inc.的CelleratorTM中生长菌株来分析异戊二烯生产。24孔中每孔的工作体积为4.5mL。温度维持在30℃，pH设定点为7.0，氧气流设定点为20sccm并且搅拌速率为800rpm。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线到LB液体培养基琼脂板上(具有抗生素)并在30℃培养。将单菌落接种到含有抗生素的培养基并过夜生长。将细菌稀释到4.5mL的带抗生素的培养基中至达到在550nm处测量的光密度为0.05。
使用气相色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空检测法进行异戊二烯的废气分析。如下制备样品：将100μL的整个液体培养基至于密封GC瓶中并在30℃孵育固定时间30分钟。在由70℃温育5分钟的热处死步骤后，将样品装载到GC。
在运行期间，使用微板读数器获得在550nm波长下的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以OD读数和时间(小时)来获得比生产力。
在200和400uM IPTG诱导水平下评估两菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75和8小时分析样品的异戊二烯生产和细胞生长(OD550)。样品一式两份进行。
b)结果
实验表明在2种不同IPTG浓度下，表达ybhE(pgl)的菌株相比于对照菌株的异戊二烯比生产力显著增加了2-3倍。
ii)来自表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和pgl过表达(RHM 111608-2)并且在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O 2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl 0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O 40g，MnSO4＊H2O 30g，NaCl 10g，FeSO4＊7H2O 1g，CoCl2＊6H2O 1g，ZnSO4＊7H2O 1g，CuSO4＊5H2O 100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O 100mg。以每次在Di H2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)，高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二烯合酶以及高表达pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监测在期望的发酵pH 7.0以及温度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻冷冻瓶的大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500mL接种15-L生物反应器，使初始体积达到5-L。
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在40小时(59小时)发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.1kg(在59小时为4.2kg)。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值4时，IPTG浓度达到110uM。当OD550达到150时，IPTG浓度升至192uM。图78A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至在40小时的最大值为33.2g/L(在59小时为48.6g/L)(图78B)。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至在40小时的最大值为40.0g/L(在59小时为60.5g/L)(图78C)。在40小时(59小时)发酵期间所产生的异戊二烯的总量为281.3g(在59小时为451.0g)，生产的时间进程如图78D所示。体积生产力的时间进程如图78E所示并且示出在0和40小时之间维持平均速率在1.0g/L/hr(在19和59小时之间为1.4g/L/hr)。如通过CER所测量的代谢活性谱如图78F所示。在40小时发酵期间进入到生产异戊二烯的所利用碳的摩尔产率为19.6％(在59小时为23.6％)。在40小时来自葡萄糖的异戊二烯的重量百分产率为8.9％(在59小时为10.7％)。
制备用于聚合的异戊二烯样品
(a)制备1000×改良的微量金属溶液：
以下组分每种一次一种溶解于diH2O中：柠檬酸＊H2O(40g)，MnSO4＊H2O(30g)，NaCl(10g)，FeSO4＊7H2O(1g)，CoCl2＊6H2O(1g)，ZnSO4＊7H2O(1g)，CuSO4＊5H2O(100mg)，H3BO3(100mg)，NaMoO4＊2H2O(100mg)。pH用HCl/NaOH调节至3.0，随后补足至体积，并且用0.22μM滤器过滤除菌。
(b)发酵培养基的制备：
每升发酵培养基含有K2HPO4(7.5g)，MgSO4＊7H2O(2g)，一水合柠檬酸(2g)，柠檬酸铁铵(0.3g)，酵母提取物(0.5g)，1000×改良的微量金属溶液(1ml)。全部组分一起添加并溶解于diH2O中。该溶液进行高压灭菌。pH用氨气(NH3)调节至7.0并补足至体积。在灭菌和pH调节后，添加葡萄糖(10g)、硫胺素＊HCl(0.1g)和抗生素。
(c)收集异戊二烯样品用于纯化和聚合
通过使发酵废气穿过排气歧管上平行排列的活性炭罐吸附在活性炭上而收集异戊二烯。
(d)使用大肠杆菌制备来自葡萄糖的异戊二烯聚合样品A
发酵在pH 7.0和30℃在带有BL21(DE3)大肠杆菌细胞的15升生物反应器中进行，其中所述的大肠杆菌细胞含有pCL PtrcUpperMVA和pTrcKKDyIkIS质粒。取自冷冻小瓶的大肠杆菌菌株的接种物划线到LB培养液琼脂平板(带抗生素)上并且在37℃孵育过夜。将单菌落接种到胰蛋白胨-酵母提取物培养基中。接种物长至550nm处测量的OD 1.0后，使用500mL接种5-L生物反应器。
葡萄糖以指数速率补料直至细胞达到稳定期。在这个时间后，减少葡萄糖补料以满足代谢要求。54小时发酵期间递送至生物反应器的葡萄糖的总量是3.7kg。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)实现诱导。当550nm处光密度(OD550)达到值10时，IPTG浓度达到25μM。当OD550达到值190时，IPTG浓度上升至50μM。在38小时发酵时，IPTG浓度上升至100μM。在图1中显示生物反应器内随时间的OD550曲线。异戊二烯滴度在发酵过程期间上升至终值2.2g/L(图2)。54小时发酵期间产生的异戊二烯的总量是15.9g并且在图3中显示了产生的时程。发酵期间参与产生异戊二烯的所用碳的摩尔产率是1.53％。(见图80、81和82)。
(e)使用大肠杆菌制备来自葡萄糖和酵母提取物的异戊二烯聚合样品B
从葡萄糖和酵母提取物的异戊二烯形成在pH 7.0和30℃在带有大肠杆菌细胞的15升生物反应器中进行，其中所述的大肠杆菌细胞含有pTrcKudzu+yIDI+DXS质粒。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻小瓶的大肠杆菌菌株的接种物。在该接种物长至(在550nm处测量的)OD 0.15后，使用20mL来接种含有2.5升大豆胨-酵母提取物培养基的生物反应器。该2.5升生物反应器在30℃培育至OD 1.0并将2.0升培养物转移至500升生物反应器。酵母提取物(Bio Springer，Montreal，魁北克，加拿大)和葡萄糖以指数速率补料。50小时发酵期间递生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别是181.2kg和17.6kg。在图4中显示生物反应器内随时间的光密度。异戊二烯滴度在发酵过程期间增加(图5)。50小时发酵期间产生的异戊二烯的总量是55.1g并且在图6中显示产生的时程。
从活性炭解吸异戊二烯(方法A)
将已经暴露于发酵罐废气流的活性炭(130g)连同一枚搅拌棒置入1000mL烧瓶中。添加环己烷(563mL)至该烧瓶并且搅拌浆液2小时。通过线内低温阱(in-line cryogenic trap)(30mL容积，浸泡在液氮中)施加真空(100mbar)。收集并组合4个馏分以产生异戊二烯/环己烷溶液(2.1wt％异戊二烯，总体积＝53.1g)。在100mbar进行真空蒸馏该溶液并且收集新的异戊二烯/环己烷溶液(产量＝10.1g)，后者在3A分子筛上干燥。对该溶液的GC分析显示异戊二烯含量为7.7wt.％。
从活性炭解吸异戊二烯(方法B)
将已经暴露于发酵罐废气流的活性炭(65g)连同一枚搅拌棒置入500mL烧瓶中。添加Jarytherm DBT(250g)至该活性炭并且搅拌浆液2小时。通过线内低温阱(in-line cryogenic trap)(30mL容积，浸泡在液氮中)施加真空(5mbar)。1小时后，将该阱加温至室温。该阱中存在两种液相(总重量1.82g)。有机相用环己烷(3.26g)稀释、倾析并在3A分子筛上干燥。对该溶液的GC分析显示异戊二烯含量为27.3wt.％，或1.22g)。
钕催化剂的制备
neodymium versatate(2.68mL，己烷中0.51M)、三异丁基铝(54mL，己烷中1.0M)和二乙基氯化铝(3.40mL，己烷中1.0M)由配有钢套管的塑料注射器吸起。将前两种组分添加至己烷中1，3-丁二烯的溶液(22.4mL，15wt.％1，3-丁二烯)，置入带隔片盖的100mL玻璃容器中并在室温搅拌0.5小时。将最后一种组分添加至该溶液，之后所述溶液在65℃下热老化0.5小时。最终溶液是清澈和黄色的。该溶液基于钕的浓度是0.0164M。
钛催化剂的制备
将带隔膜入口并含有磁力搅拌棒的100mL玻璃反应容器置于0℃的冰浴中，充以正己烷(5.07mL，无水)并且在剧烈搅拌下充以无水TiCl4(1.5mL，13.7mmol)。另外产生由二苯醚(1.2mL，7.6mmol)和三异丁基铝(14.6mL，12.6mmol，己烷中25wt.％溶液)组成的溶液。该溶液经5分钟过程添加至该反应容器。棕色沉淀在添加期间形成。将该悬浊液搅拌10分钟并随后贮存在-40C备用。
聚合
通过用钕催化剂和n-BuLi聚合异戊二烯聚合样品A产生主要衍生自葡萄糖的聚异戊二烯样品。通过用钕催化剂、钛催化剂、n-BuLi催化剂和乳液自由基聚合法聚合异戊二烯聚合样品B，产生主要衍生自葡萄糖和酵母提取物共发酵的聚异戊二烯样品。下文描述代表性聚合条件。
采用钕催化剂的异戊二烯的溶液聚合
带有特氟隆涂层搅拌棒的4mL螺口盖玻璃小瓶在烘箱中于150℃退火3小时。所述小瓶配有特氟隆表面处理的硅酮隔片及带孔的盖。使用注射器，小瓶随后充以异戊二烯溶液(1.5g，无水环己烷中7.7wt.％)。用微量注射器将钕催化剂溶液(60μL)注射到小瓶中。将小瓶放置在调节到65℃的搅拌/加热平台上，搅拌棒以500转/分钟转动。15分钟后，该溶液变得明显更粘稠。在1.5小时反应时间后，用异丙醇和丁基化羟基甲苯(BHT)(30μL，10wt.％BHT)的溶液猝灭该反应。取出100mg胶泥样品用于GPC分析。剩余的聚合物胶泥在环境条件下干燥。确定分离的110mg重的聚合物具有935,000的重量平均分子量(GPC法)和大于90％的顺-微结构含量(13C-NMR法)。
采用Ti催化剂的异戊二烯的溶液聚合
带有特氟隆涂层搅拌棒的4mL螺口盖玻璃小瓶在烘箱中于150℃退火3小时。所述小瓶配有预刻痕的特氟隆表面处理的硅酮隔片及带孔的盖。使用注射器，将小瓶随后充以异戊二烯溶液(1.5g，无水环己烷中7.7wt.％)。磁力搅拌钛催化剂悬浊液并用一次性尖头吸管取出样品(70μL)，所述样品随后经预刻痕的隔片添加至反应小瓶。将反应小瓶隔片替换为实心盖，并且将小瓶放置在调节到65℃的搅拌/加热平台上，搅拌棒以500转/分钟转动。5分钟后，该溶液变得明显更粘稠。在1.5小时反应时间后，用异丙醇和丁基化羟基甲苯(BHT)(30μL，10wt.％BHT)的溶液猝灭该反应。取出100mg胶泥样品用于GPC分析。剩余的聚合物胶泥在环境条件下干燥。分离的108mg重的聚合物具有221,000的重量平均分子量(GPC法)并具有大于94％的顺-微结构含量(13C-NMR法)。
异戊二烯的乳液聚合
使用20mL小瓶作为聚合容器。金属盖子用锥子穿透两次，并且将纸板内衬替换为橡胶垫圈和特氟隆内衬。小瓶用去离子水淋洗并在氮气下干燥。
向小瓶添加7.05g去离子水、1.14g 10％肥皂(混合的脂肪酸钾盐)、174mg 10％过硫酸铵溶液和24mg正十二烷基硫醇。小瓶用氮气冲洗30秒并盖紧。通过橡胶/特氟隆垫圈向小瓶充入3mL的bio-HG(2.033克异戊二烯)。小瓶置于标准的瓶聚合浴(第二个空白小瓶允许该小瓶装配于一个4oz瓶架中)中。在65℃(+/-0.2℃)翻动混合物25.5小时。
完善
将乳胶转移至50mL梨形烧瓶并用10mL水稀释。通过真空下(54mmHg，40-50℃)蒸发2mL水来除去未反应的挥发性有机物。向乳胶添加抗氧化剂分散体140mg的50％活性多酚AO(Bostex 24)。通过添加乳胶至稀酸溶液(150mL RO水中的12mL 18％硫酸)使乳胶共凝结。聚合物凝结成单一大片状物，其中将所述片状物压缩并用RO水洗涤。样品是灰白色的柔软橡胶状物质。产量是1.24克湿屑。
最终总固体含量(TSC＝100＊干重/湿重)是18.9wt％或大约84％的转化率。
采用丁基锂的异戊二烯的聚合
丁基锂(己烷中的1.6M)用正己烷(无水)以比率1∶10稀释。该溶液对THF中的标准物N-新戊酰-邻苄基苯胺滴定。通过使环己烷中异戊二烯的溶液(4mL)穿过含有热处理的硅胶的小柱来干燥该溶液。
(150℃烘箱干燥的)4mL玻璃小瓶充以小的特氟隆涂层的磁力搅拌棒和环己烷中异戊二烯的溶液(1.35g，21.5wt％)。通过注射器添加丁基锂(0.14M，己烷)并在搅拌加热平台上加热小瓶至65℃持续3小时。聚合物反应用BHT/异丙醇溶液(异丙醇中的10wt％BHT)猝灭。真空下除去全部挥发物。该方法产生290mg聚合物，所述聚合物代表约100％的理论产率。通过GPC分析法测定该聚合物具有17,880的重量平均分子量(Mw)并通过13C-NMR法测定该聚合物具有67％的顺-微结构含量；25％的反-微结构含量和8％的3，4-微结构含量。
聚合物的GPC分析
大小排阻层析(SEC)是测量聚合物分子量和多分散性(Mw/Mn)的充分建立的技术。使用串联的两个聚合物实验室用C微量凝胶柱，以四氢呋喃作为载体溶剂，流速0.7ml/分钟并且柱温度是40℃。使用与HewlettPackard 1047A折射率检测仪偶联的Wyatt Technologies miniDawn光散射检测仪进行SEC。使用聚苯乙烯标准物来校正该仪器。
聚合物的NMR分析
在Varian Unity-Plus 400MHz质谱仪上在氯仿-d1溶剂中通过13C-NMR分析法测定聚合物微结构。
来自13C/12C同位素分析的数据
  条目 样品(注：PI＝聚异戊二烯)   13C
  1   来自甜菜转化糖的PI   ～
  2   来自异丁烯的商业PI   -34.43
  3   来自异丁烯的商业PI   -34.42
  4   银胶菊橡胶   -31.10
  5   棕榈油   -30.03
  6   棕榈油   -30.00
  7   天然橡胶(Neco)   -28.11
  8   天然橡胶(Pumpic)   -27.92
  9   天然橡胶(Negato)   -27.86
  10   天然橡胶(Nivco)   -27.79
  11   天然橡胶(Naplo)   -27.74
  12   天然橡胶(Krado 1)   -27.68
  13   天然橡胶(Krado 1)   -27.55
  14   天然橡胶(Krado 2)   -27.54
  15   天然橡胶(Krado 2)   -27.52
  16   天然橡胶(Krado 2)   -27.49
  17   天然橡胶(Nolo)   -27.38
  18   酵母提取物   -25.70
  19   酵母提取物   -25.68
  20   来自萃取蒸馏的商业PI(样品2)   -23.83
  21   来自萃取蒸馏的商业PI(样品2)   -23.83
  22   来自软木浆的糖(样品2)   -23.25
  23   来自软木浆的糖(样品1)   -23.00
  24   来自软木浆的糖(样品1)   -22.96
  25   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.95
  26   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.95
  27   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.94
  28   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.92
  29   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.90
  30   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.89
  31   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.89
  32   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.89
  33   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.87
  34   来自萃取蒸馏的商业PI(样品3)   -22.84
  35   来自萃取蒸馏的商业PI(样品1)   -22.63
  36   来自萃取蒸馏的商业PI(样品1)   -22.62
  37   来自萃取蒸馏的商业PI(样品1)   -22.54
  38   来自异戊二烯样品B的PI(乳液聚合)   -19.67
  39   来自异戊二烯样品B的PI(钕催化剂)   -19.14
  40   来自异戊二烯样品B的PI(钕催化剂)   -18.80
  41   来自异戊二烯样品B的PI(钕催化剂)   -18.37
  42   来自异戊二烯样品B的PI(n-BuLi催化剂)   -18.12
  43   来自异戊二烯样品B的PI(n-BuLi催化剂)   -18.12
  44   转化糖(样品1)   -15.37
  45   转化糖(样品2)   -15.36
  46   转化糖(样品1)   -15.34
  47   转化糖(样品1)   -15.31
  48   转化糖(样品1)   -15.25
  49   来自异戊二烯样品A的PI(钕催化剂)   -14.85
  50   来自异戊二烯样品A的PI(n-BuLi催化剂)   -14.69
  51   来自异戊二烯样品A的PI(n-BuLi催化剂)   -14.69
  52   来自异戊二烯样品A的PI(n-BuLi催化剂)   -14.66
  53   来自甘蔗渣的葡萄糖(样品2)   -13.19
  54   来自甘蔗渣的葡萄糖(样品1)   -13.00
  55   来自甘蔗渣的葡萄糖(样品1)   -12.93
  56   来自玉米秸秆的葡萄糖(样品2)   -11.42
  57   来自玉米秸秆的葡萄糖(样品1)   -11.23
  58   来自玉米秸秆的葡萄糖(样品1)   -11.20
  59   玉米淀粉   -11.12
  60   玉米淀粉   -11.11
  61   玉米淀粉   -11.10
  62   玉米淀粉   -11.07
  63   葡萄糖   -10.73
除非本文另外定义，本发明所属领域的技术人员通常理解本文中所用的全部术语及科学术语的含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology，第2版，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale与Markham，The Harper Collins Dictionary of Biology，HarperPerennial，NY(1991)为本文中所用的众多术语提供一般定义。
在此提供的标题不限于本发明多个方面或实施方式，可以通过参考作为整体的说明书来得到它们。对于在此所使用，除非另有明确指示，否则术语“一个”或类似术语的使用指一个或多个。在此所指的“约”某数值或参数包括(并且描述了)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。应理解的是，在此所述的本发明的方面和实施方式包括“包括”该方面和实施方式、“由该方面和实施方式组成”和“基本上由该方面和实施方式组成”。
尽管已经出于说明本发明的目的显示了某些代表性实施方案和细节，但是本领域技术人员显而易见的是在其中可以做出多种变化和修改而不脱离主题发明的范围。应当理解本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂，因为它们可以变动。本领域技术人员也理解，也可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料来实施或测试本发明。
附录1
示例性1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
ATH：AT3G21500(DXPS1)AT4G15560(CLA1)AT5G11380(DXPS3)
OSA：433876843400904342614
CME：CMF089C
PFA：MAL13P1.186
TAN：TA20470
TPV：TP01_0516
ECO：b0420(dxs)
ECJ：JW0410(dxs)
ECE：Z0523(dxs)
ECS：ECs0474
ECC：c0531(dxs)
ECI：UTI89C0443(dxs)
ECP：ECP_0479
ECV：APECO1_1590(dxs)
ECW：EcE24377A_0451(dxs)
ECX：EcHS_A0491
STY：STY0461(dxs)
STT：t2441(dxs)
SPT：SPA2301(dxs)
SEC：SC0463(dxs)
STM：STM0422(dxs)
YPE：YPO3177(dxs)
YPK：y1008(dxs)
YPM：YP_0754(dxs)
YPA：YPA_2671
YPN：YPN_0911
YPP：YPDSF_2812
YPS：YPTB0939(dxs)
YPI：YpsIP31758_3112(dxs)
SFL：SF0357(dxs)
SFX：S0365(dxs)
SFV：SFV_0385(dxs)
SSN：SSON_0397(dxs)
SBO：SBO_0314(dxs)
SDY：SDY_0310(dxs)
ECA：ECA1131(dxs)
PLU：plu3887(dxs)
BUC：BU464(dxs)
BAS：BUsg448(dxs)
WBR：WGLp144(dxs)
SGL：SG0656
KPN：KPN_00372(dxs)
BFL：Bfl238(dxs)
BPN：BPEN_244(dxs)
HIN：HI1439(dxs)
HIT：NTHI1691(dxs)
HIP：CGSHiEE_04795
HIQ：CGSHiGG_01080
HDU：HD0441(dxs)
HSO：HS_0905(dxs)
PMU：PM0532(dxs)
MSU：MS1059(dxs)
APL：APL_0207(dxs)
XFA：XF2249
XFT：PD1293(dxs)
XCC：XCC2434(dxs)
XCB：XC_1678
XCV：XCV2764(dxs)
XAC：XAC2565(dxs)
XOO：XOO2017(dxs)
XOM：XOO_1900(XOO1900)
VCH：VC0889
VVU：VV1_0315
VVY：VV0868
VPA：VP0686
VFI：VF0711
PPR：PBPRA0805
PAE：PA4044(dxs)
PAU：PA14_11550(dxs)
PAP：PSPA7_1057(dxs)
PPU：PP_0527(dxs)
PST：PSPTO_0698(dxs)
PSB：Psyr_0604
PSP：PSPPH_0599(dxs)
PFL：PFL_5510(dxs)
PFO：Pfl_5007
PEN：PSEEN0600(dxs)
PMY：Pmen_3844
PAR：Psyc_0221(dxs)
PCR：Pcryo_0245
ACI：ACIAD3247(dxs)
SON：SO_1525(dxs)
SDN：Sden_2571
SFR：Sfri_2790
SAZ：Sama_2436
SBL：Sbal_1357
SLO：Shew_2771
SHE：Shewmr4_2731
SHM：Shewmr7_2804
SHN：Shewana3_2901
SHW：Sputw3181_2831
ILO：IL2138(dxs)
CPS：CPS_1088(dxs)
PHA：PSHAa2366(dxs)
PAT：Patl_1319
SDE：Sde_3381
PIN：Ping_2240
MAQ：Maqu_2438
MCA：MCA0817(dxs)
FTU：FTT1018c(dxs)
FTF：FTF1018c(dxs)
FTW：FTW_0925(dxs)
FTL：FTL_1072
FTH：FTH_1047(dxs)
FTA：FTA_1131(dxs)
FTN：FTN_0896(dxs)
NOC：Noc_1743
AEH：Mlg_1381
HCH：HCH_05866(dxs)
CSA：Csal_0099
ABO：ABO_2166(dxs)
AHA：AHA_3321(dxs)
BCI：BCI_0275(dxs)
RMA：Rmag_0386
VOK：COSY_0360(dxs)
NME：NMB1867
NMA：NMA0589(dxs)
NMC：NMC0352(dxs)
NGO：NGO0036
CVI：CV_2692(dxs)
RSO：RSc2221(dxs)
REU：Reut_A0882
REH：H16A_2732(dxs)
RME：Rmet_2615
BMA：BMAA0330(dxs)
BMV：BMASAVP1_1512(dxs)
BML：BMA10299_1706(dxs)
BMN：BMA10247_A0364(dxs)
BXE：Bxe_B2827
BUR：Bcep18194_B2211
BCN：Bcen_4486
BCH：Bcen2424_3879
BAM：Bamb_3250
BPS：BPSS1762(dxs)
BPM：BURPS1710b_A0842(dxs)
BPL：BURPS1106A_A2392(dxs)
BPD：BURPS668_A2534(dxs)
BTE：BTH_II0614(dxs)
BPE：BP2798(dxs)
BPA：BPP2464(dxs)
BBR：BB1912(dxs)
RFR：Rfer_2875
POL：Bpro_1747
PNA：Pnap_1501
AJS：Ajs_1038
MPT：Mpe_A2631
HAR：HEAR0279(dxs)
MMS：mma_0331
NEU：NE1161(dxs)
NET：Neut_1501
NMU：Nmul_A0236
EBA：ebA4439(dxs)
AZO：azo1198(dxs)
DAR：Daro_3061
TBD：Tbd_0879
MFA：Mfla_2133
HPY：HP0354(dxs)
HPJ：jhp0328(dxs)
HPA：HPAG1_0349
HHE：HH0608(dxs)
HAC：Hac_0968(dxs)
WSU：WS1996
TDN：Tmden_0475
CJE：Cj0321(dxs)
CJR：CJE0366(dxs)
CJJ：CJJ81176_0343(dxs)
CJU：C8J_0298(dxs)
CJD：JJD26997_1642(dxs)
CFF：CFF8240_0264(dxs)
CCV：CCV52592_1671(dxs)CCV52592_1722
CHA：CHAB381_1297(dxs)
CCO：CCC13826_1594(dxs)
ABU：Abu_2139(dxs)
NIS：NIS_0391(dxs)
SUN：SUN_2055(dxs)
GSU：GSU0686(dxs-1)GSU1764(dxs-2)
GME：Gmet_1934Gmet_2822
PCA：Pcar_1667
PPD：Ppro_1191Ppro_2403
DVU：DVU1350(dxs)
DVL：Dvul_1718
DDE：Dde_2200
LIP：LI0408(dsx)
DPS：DP2700
ADE：Adeh_1097
MXA：MXAN_4643(dxs)
SAT：SYN_02456
SFU：Sfum_1418
PUB：SAR11_0611(dxs)
MLO：mlr7474
MES：Meso_0735
SME：SMc00972(dxs)
ATU：Atu0745(dxs)
ATC：AGR_C_1351
RET：RHE_CH00913(dxs)
RLE：RL0973(dxs)
BME：BMEI1498
BMF：BAB1_0462(dxs)
BMS：BR0436(dxs)
BMB：BruAb1_0458(dxs)
BOV：BOV_0443(dxs)
BJA：bll2651(dxs)
BRA：BRADO2161(dxs)
BBT：BBta_2479(dxs)
RPA：RPA0952(dxs)
RPB：RPB_4460
RPC：RPC_1149
RPD：RPD_4305
RPE：RPE_1067
NWI：Nwi_0633
NHA：Nham_0778
BHE：BH04350(dxs)
BQU：BQ03540(dxs)
BBK：BARBAKC583_0400(dxs)
CCR：CC_2068
SIL：SPO0247(dxs)
SIT：TM1040_2920
RSP：RSP_0254(dxsA)RSP_1134(dxs)
JAN：Jann_0088Jann_0170
RDE：RD1_0101(dxs)RD1_0548(dxs)
MMR：Mmar10_0849
HNE：HNE_1838(dxs)
ZMO：ZMO1234(dxs)ZMO1598(dxs)
NAR：Saro_0161
SAL：Sala_2354
ELI：ELI_12520
GOX：GOX0252
GBE：GbCGDNIH1_0221GbCGDNIH1_2404
RRU：Rru_A0054Rru_A2619
MAG：amb2904
MGM：Mmc1_1048
SUS：Acid_1783
BSU：BG11715(dxs)
BHA：BH2779
BAN：BA4400(dxs)
BAR：GBAA4400(dxs)
BAA：BA_4853
BAT：BAS4081
BCE：BC4176(dxs)
BCA：BCE_4249(dxs)
BCZ：BCZK3930(dxs)
BTK：BT9727_3919(dxs)
BTL：BALH_3785(dxs)
BLI：BL01523(dxs)
BLD：BLi02598(dxs)
BCL：ABC2462(dxs)
BAY：RBAM_022600
BPU：BPUM_2159
GKA：GK2392
GTN：GTNG_2322
LMO：lmo1365(tktB)
LMF：LMOf2365_1382(dxs)
LIN：lin1402(tktB)
LWE：lwe1380(tktB)
LLA：L108911(dxsA)L123365(dxsB)
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Bxe_C0332Bxe_C0574Bxe_C0915
BVI：Bcep1808_0519Bcep1808_1717Bcep1808_2877Bcep1808_3594
Bcep1808_4015Bcep1808_5507Bcep1808_5644
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Bcep18194_A6102Bcep18194_B0263Bcep18194_B1439
Bcep18194_C6652Bcep18194_C6802Bcep18194_C6874
Bcep18194_C7118Bcep18194_C7151Bcep18194_C7332
BCN：Bcen_1553Bcen_1599Bcen_2158Bcen_2563Bcen_2998Bcen_6289
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Bcen2424_6232Bcen2424_6276
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BURPS1710b_2453(atoB-2)
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BTE：BTH_I2144BTH_I2256BTH_I2261
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Rfer_3839
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BME：BMEI0274BMEII0817
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RPA：RPA0513(pcaF)RPA0531RPA3715(pimB)
RPB：RPB_0509RPB_0525RPB_1748
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JAN：Jann_0262Jann_0493Jann_4050
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GBE：GbCGDNIH1_0447
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MGM：Mmc1_1165
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BSU：BG11319(mmgA)BG13063(yhfS)
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BCY：Bcer98_2722Bcer98_3865
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GKA：GK1658GK3397
SAU：SA0342SA0534(vraB)
SAV：SAV0354SAV0576(vraB)
SAM：MW0330MW0531(vraB)
SAR：SAR0351(thl)SAR0581
SAS：SAS0330SAS0534
SAC：SACOL0426SACOL0622(atoB)
SAB：SAB0304(th1)SAB0526
SAA：SAUSA300_0355SAUSA300_0560(vraB)
SAO：SAOUHSC_00336SAOUHSC_00558
SAJ：SaurJH9_0402
SAH：SaurJH1_0412
SEP：SE0346SE2384
SER：SERP0032SERP0220
SHA：SH0510(mvaC)SH2417
SSP：SSP0325SSP2145
LMO：lmo1414
LMF：LMOf2365_1433
LIN：lin1453
LWE：lwe1431
LLA：L11745(thiL)L25946(fadA)
LLC：LACR_1665LACR_1956
LLM：llmg_0930(thiL)
SPY：SPy_0140SPy_1637(atoB)
SPZ：M5005_Spy_0119M5005_Spy_0432M5005_Spy_1344(atoB)
SPM：spyM18_0136spyM18_1645(atoB)
SPG：SpyM3_0108SpyM3_1378(atoB)
SPS：SPs0110SPs0484
SPH：MGAS10270_Spy0121MGAS10270_Spy0433MGAS10270_Spy1461(atoB)
SPI：MGAS10750_Spy0124MGAS10750_Spy0452MGAS10750_Spy1453(atoB)
SPJ：MGAS2096_Spy0123MGAS2096_Spy0451MGAS2096_Spy1365(atoB)
SPK：MGAS9429_Spy0121MGAS9429_Spy0431MGAS9429_Spy1339(atoB)
SPF：SpyM50447(atoB2)
SPA：M6_Spy0166M6_Spy0466M6_Spy1390
SPB：M28_Spy0117M28_Spy0420M28_Spy1385(atoB)
SAK：SAK_0568
LJO：LJ1609
LAC：LBA0626(thiL)
LSA：LSA1486
LDB：Ldb0879
LBU：LBUL_0804
LBR：LVIS_2218
LCA：LSEI_1787
LGA：LGAS_1374
LRE：Lreu_0052
EFA：EF1364
OOE：OEOE_0529
STH：STH2913STH725STH804
CAC：CAC2873CA_P0078(thiL)
CPE：CPE2195(atoB)
CPF：CPF_2460
CPR：CPR_2170
CTC：CTC00312
CNO：NT01CX_0538NT01CX_0603
CDF：CD1059(thlA1)CD2676(thlA2)
CBO：CBO3200(thl)
CBE：Cbei_0411Cbei_3630
CKL：CKL_3696(thlA1)CKL_3697(thlA2)CKL_3698(thlA3)
AMT：Amet_4630
AOE：Clos_0084Clos_0258
CHY：CHY_1288CHY_1355(atoB)CHY_1604CHY_1738
DSY：DSY0632DSY0639DSY1567DSY1710DSY2402DSY3302
DRM：Dred_0400Dred_1491Dred_1784Dred_1892
SWO：Swol_0308Swol_0675Swol_0789Swol_1486Swol_1934Swol_2051
TTE：TTE0549(paaJ)
MTA：Moth_1260
MTU：Rv1135A Rv1323(fadA4)Rv3546(fadA5)
MTC：MT1365(phbA)
MBO：Mb1167Mb1358(fadA4)Mb3576(fadA5)Mb3586c(fadA6)
MBB：BCG_1197BCG_1385(fadA4)BCG_3610(fadA5)BCG_3620c(fadA6)
MLE：ML1158(fadA4)
MPA：MAP2407c(fadA3)MAP2436c(fadA4)
MAV：MAV_1544MAV_1573MAV_1863MAV_5081
MSM：MSMEG_2224MSMEG_4920
MUL：MUL_0357
MVA：Mvan_1976Mvan_1988Mvan_4305Mvan_4677Mvan_4891
MGI：Mflv_1347Mflv_1484Mflv_2040Mflv_2340Mflv_4356Mflv_4368
MMC：Mmcs_1758Mmcs_1769Mmcs_3796Mmcs_3864
MKM：Mkms_0251Mkms_1540Mkms_1805Mkms_1816Mkms_2836Mkms_3159
Mkms_3286Mkms_3869Mkms_3938Mkms_4227Mkms_4411Mkms_4580
Mkms_4724Mkms_4764Mkms_4776
MJL：Mjls_0231Mjls_1739Mjls_1750Mjls_2819Mjls_3119Mjls_3235
Mjls_3800Mjls_3850Mjls_4110Mjls_4383Mjls_4705Mj ls_4876
Mjls_5018Mjls_5063Mjls_5075
CGL：NCgl2309(cgl2392)
CGB：cg2625(pcaF)
CEF：CE0731CE2295
CJK：jk1543(fadA3)
NFA：nfa10750(fadA4)
RHA：RHA1_ro01455RHA1_ro01623RHA1_ro01876RHA1_ro02517(catF)
RHA1_ro03022RHA1_ro03024RHA1_ro03391RHA1_ro03892
RHA1_ro04599RHA1_ro05257RHA1_ro08871
SCO：SCO5399(SC8F4.03)
SMA：SAV1384(fadA5)SAV2856(fadA1)
ART：Arth_1160Arth_2986Arth_3268Arth_4073
NCA：Noca_1371Noca_1797Noca_1828Noca_2764Noca_4142
TFU：Tfu_1520Tfu_2394
FRA：Francci3_3687
FRE：Franean1_1044Franean1_2711Franean1_2726Franean1_3929Franean1_4037Franean1_4577
FAL：FRAAL2514FRAAL2618FRAAL5910(atoB)
ACE：Acel_0626Acel_0672
SEN：SACE_1192(mmgA)SACE_2736(fadA6)SACE_4011(catF)SACE_6236(fadA4)
STP：Strop_3610
SAQ：Sare_1316Sare_3991
RXY：Rxyl_1582Rxyl_1842Rxyl_2389Rxyl_2530
FNU：FN0495
BGA：BG0110(fadA)
BAF：BAPKO_0110(fadA)
LIL：LA0457(thiL1)LA0828(thiL2)LA4139(fadA)
LIC：LIC10396(phbA)
LBJ：LBJ_2862(paaJ-4)
LBL：LBL_0209(paaJ-4)
SYN：slr1993(phaA)
SRU：SRU_1211(atoB)SRU_1547
CHU：CHU_1910(atoB)
GFO：GFO_1507(atoB)
FJO：Fjoh_4612
FPS：FP0770FP1586FP1725
RRS：RoseRS_3911RoseRS_4348
RCA：Rcas_0702Rcas_3206
HAU：Haur_0522
DRA：DR_1072DR_1428DR_1960DR_2480DR_A0053
DGE：Dgeo_0755Dgeo_1305Dgeo_1441Dgeo_1883
TTH：TTC0191TTC0330
TTJ：TTHA0559
TME：Tmel_1134
FNO：Fnod_0314
PMO：Pmob_0515
HMA：rrnAC0896(acaB3)rrnAC2815(aca2)rrnAC3497(yqeF)
rrnB0240(aca1)rrnB0242(acaB2)rrnB0309(acaB1)
TAC：Ta0582
TVO：TVN0649
PTO：PTO1505
APE：APE_2108
SSO：SSO2377(acaB-4)
STO：ST0514
SAI：Saci_0963Saci_1361(acaB1)
MSE：Msed_0656
PAI：PAE1220
PIS：Pisl_0029Pisl_1301
PCL：Pcal_0781
PAS：Pars_0309Pars_1071
CMA：Cmaq_1941
示例性HMG-CoA合酶核酸和多肽
HSA：3157(HMGCS1)3158(HMGCS2)
PTR：457169(HMGCS2)461892(HMGCS1)
MCC：702553(HMGCS1)713541(HMGCS2)
MMU：15360(Hmgcs2)208715(Hmgcs1)
RNO：24450(Hmgcs2)29637(Hmgcs1)
CFA：479344(HMGCS1)607923(HMGCS2)
BTA：407767(HMGCS1)
SSC：397673(CH242-38B5.1)
GGA：396379(HMGCS1)
XLA：380091(hmgcs1)447204(MGC80816)
DRE：394060(hmgcs1)
SPU：578259(LOC578259)
DME：Dmel_CG4311(Hmgs)
CEL：F25B4.6
ATH：AT4G11820(BAP1)
OSA：43314184347614
CME：CMM189C
SCE：YML126C(ERG13)
AGO：AGOS_ADL356C
PIC：PICST_83020
CAL：CaO19_7312(CaO19.7312)
CGR：CAGL0H04081g
SPO：SPAC4F8.14c(hcs)
MGR：MGG_01026
ANI：AN4923.2
AFM：AFUA_3G10660AFUA_8G07210
AOR：AO090003000611AO090010000487
CNE：CNC05080CNG02670
UMA：UM05362.1
ECU：ECU10_0510
DDI：DDBDRAFT_0217522DDB_0219924(hgsA)
TET：TTHERM_00691190
TBR：Tb927.8.6110
YPE：YPO1457
YPK：y2712(pksG)
YPM：YP_1349(pksG)
YPA：YPA_0750
YPN：YPN_2521
YPP：YPDSF_1517
YPS：YPTB1475
CBD：COXBU7E912_1931
TCX：Tcr_1719
DNO：DNO_0799
BMA：BMAA1212
BPS：BPSS1002
BPM：BURPS1710b_A2613
BPL：BURPS1106A_A1384
BPD：BURPS668_A1470
BTE：BTH_II1670
MXA：MXAN_3948(tac)MXAN_4267(mvaS)
BSU：BG10926(pksG)
OIH：OB2248
SAU：SA2334(mvaS)
SAV：SAV2546(mvaS)
SAM：MW2467(mvaS)
SAR：SAR2626(mvaS)
SAS：SAS2432
SAC：SACOL2561
SAB：SAB2420(mvaS)
SAA：SAUSA300_2484
SAO：SAOUHSC_02860
SAJ：SaurJH9_2569
SAH：SaurJH1_2622
SEP：SE2110
SER：SERP2122
SHA：SH0508(mvaS)
SSP：SSP0324
LMO：lmo1415
LMF：LMOf2365_1434(mvaS)
LIN：lin1454
LWE：lwe1432(mvaS)
LLA：L13187(hmcM)
LLC：LACR_1666
LLM：llmg_0929(hmcM)
SPY：SPy_0881(mvaS.2)
SPZ：M5005_Spy_0687(mvaS.1)
SPM：spyM18_0942(mvaS2)
SPG：SpyM3_0600(mvaS.2)
SPS：SPs1253
SPH：MGAS10270_Spy0745(mvaS1)
SPI：MGAS10750_Spy0779(mvaS1)
SPJ：MGAS2096_Spy0759(mvaS1)
SPK：MGAS9429_Spy0743(mvaS 1)
SPF：SpyM51121(mvaS)
SPA：M6_Spy0704
SPB：M28_Spy0667(mvaS.1)
SPN：SP_1727
SPR：spr1571(mvaS)
SPD：SPD_1537(mvaS)
SAG：SAG1316
SAN：gbs1386
SAK：SAK_1347
SMU：SMU.943c
STC：str0577(mvaS)
STL：stu0577(mvaS)
STE：STER_0621
SSA：SSA_0338(mvaS)
SSU：SSU05_1641
SSV：SSU98_1652
SGO：SGO_0244
LPL：lp_2067(mvaS)
LJO：LJ1607
LAC：LBA0628(hmcS)
LSA：LSA1484(mvaS)
LSL：LSL_0526
LDB：Ldb0881(mvaS)
LBU：LBUL_0806
LBR：LVIS_1363
LCA：LSEI_1785
LGA：LGAS_1372
LRE：Lreu_0676
PPE：PEPE_0868
EFA：EF1363
OOE：OEOE_0968
LME：LEUM_1184
NFA：nfa22120
SEN：SACE_4570(pksG)
BBU：BB0683
BGA：BG0706
BAF：BAPKO_0727
FJO：Fjoh_0678
HAL：VNG1615G(mvaB)
HMA：rrnAC1740(mvaS)
HWA：HQ2868A(mvaB)
NPH：NP2608A(mvaB_1)NP4836A(mvaB_2)
示例性羟甲基戊二酰-CoA还原酶核酸和多肽
HSA：3156(HMGCR)
PTR：471516(HMGCR)
MCC：705479(HMGCR)
MMU：15357(Hmgcr)
RNO：25675(Hmgcr)
CFA：479182(HMGCR)
BTA：407159(HMGCR)
GGA：395145(RCJMB04_14m24)
SPU：373355(LOC373355)
DME：Dmel_CG10367(Hmgcr)
CEL：F08F8.2
OSA：4347443
SCE：YLR450W(HMG2)YML075C(HMG1)
AGO：AGOS_AER152W
CGR：CAGL0L11506g
SPO：SPCC162.09c(hmg1)
ANI：AN3817.2
AFM：AFUA_1G11230AFUA_2G03700
AOR：AO090103000311AO090120000217
CNE：CNF04830
UMA：UM03014.1
ECU：ECU10_1720
DDI：DDB_0191125(hmgA)DDB_0215357(hmgB)
TBR：Tb927.6.4540
TCR：506831.40509167.20
LMA：LmjF30.3190
VCH：VCA0723
VCO：VC0395_0662
VVU：VV2_0117
VVY：VVA0625
VPA：VPA0968
VFI：VFA0841
PAT：Patl_0427
CBU：CBU_0030CBU_0610
CBD：COXBU7E912_0151COXBU7E912_0622(hmgA)
TCX：Tcr_1717
DNO：DNO_0797
CVI：CV_1806
SUS：Acid_5728Acid_6132
SAU：SA2333(mvaA)
SAV：SAV2545(mvaA)
SAM：MW2466(mvaA)
SAB：SAB2419c(mvaA)
SEP：SE2109
LWE：lwe0819(mvaA)
LLA：L10433(mvaA)
LLC：LACR_1664
LLM：llmg_0931(mvaA)
SPY：SPy_0880(mvaS.1)
SPM：spyM18_0941(mvaS1)
SPG：SpyM3_0599(mvaS.1)
SPS：SPs1254
SPH：MGAS10270_Spy0744
SPI：MGAS10750_Spy0778
SPJ：MGAS2096_Spy0758
SPK：MGAS9429_Spy0742
SPA：M6_Spy0703
SPN：SP_1726
SAG：SAG1317
SAN：gbs1387
STC：str0576(mvaA)
STL：stu0576(mvaA)
STE：STER_0620
SSA：SSA_0337(mvaA)
LPL：lp_0447(mvaA)
LJO：LJ1608
LSL：LSL_0224
LBR：LVIS_0450
LGA：LGAS_1373
EFA：EF1364
NFA：nfa22110
BGA：BG0708(mvaA)
SRU：SRU_2422
FPS：FP2341
MMP：MMP0087(hmgA)
MMQ：MmarC5_1589
MAC：MA3073(hmgA)
MBA：Mbar_A1972
MMA：MM_0335
MBU：Mbur_1098
MHU：Mhun_3004
MEM：Memar_2365
MBN：Mboo_0137
MTH：MTH562
MST：Msp_0584(hmgA)
MSI：Msm_0227
MKA：MK0355(HMG1)
AFU：AF1736(mvaA)
HAL：VNG1875G(mvaA)
HMA：rrnAC3412(mvaA)
HWA：HQ3215A(hmgR)
NPH：NP0368A(mvaA_2)NP2422A(mvaA_1)
TAC：Ta0406m
TVO：TVN1168
PTO：PTO1143
PAB：PAB2106(mvaA)
PFU：PF1848
TKO：TK0914
RCI：RCIX1027(hmgA)RCIX376(hmgA)
APE：APE_1869
IHO：Igni_0476
HBU：Hbut_1531
SSO：SSO0531
STO：ST1352
SAI：Saci_1359
PAI：PAE2182
PIS：Pisl_0814
PCL：Pcal_1085
PAS：Pars_0796
示例性甲羟戊酸激酶核酸和多肽
HSA：4598(MVK)
MCC：707645(MVK)
MMU：17855(Mvk)
RNO：81727(Mvk)
CFA：486309(MVK)
BTA：505792(MVK)
GGA：768555(MVK)
DRE：492477(zgc：103473)
SPU：585785(LOC585785)
DME：Dmel_CG33671
OSA：4348331
SCE：YMR208W(ERG12)
AGO：AGOS_AER335W
PIC：PICST_40742(ERG12)
CGR：CAGL0F03861g
SPO：SPAC13G6.11c
MGR：MGG_06946
ANI：AN3869.2
AFM：AFUA_4G07780
AOR：AO090023000793
CNE：CNK01740
ECU：ECU09_1780
DDI：DDBDRAFT_0168621
TET：TTHERM_00637680
TBR：Tb927.4.4070
TCR：436521.9509237.10
LMA：LmjF31.0560
CBU：CBU_0608CBU_0609
CBD：COXBU7E912_0620(mvk)
LPN：lpg2039
LPF：lpl2017
LPP：lpp2022
BBA：Bd1027(lmbP)Bd1630(mvk)
MXA：MXAN_5019(mvk)
OIH：OB0225
SAU：SA0547(mvaK1)
SAV：SAV0590(mvaK1)
SAM：MW0545(mvaK1)
SAR：SAR0596(mvaK1)
SAS：SAS0549
SAC：SACOL0636(mvk)
SAB：SAB0540(mvaK1)
SAA：SAUSA300_0572(mvk)
SAO：SAOUHSC_00577
SEP：SE0361
SER：SERP0238(mvk)
SHA：SH2402(mvaK1)
SSP：SSP2122
LMO：lmo0010
LMF：LMOf2365_0011
LIN：lin0010
LWE：lwe0011(mvk)
LLA：L7866(yeaG)
LLC：LACR_0454
LLM：llmg_0425(mvk)
SPY：SPy_0876(mvaK1)
SPZ：M5005_Spy_0682(mvaK1)
SPM：spyM18_0937(mvaK1)
SPG：SpyM3_0595(mvaK1)
SPS：SPs1258
SPH：MGAS10270_Spy0740(mvaK1)
SPI：MGAS 10750_Spy0774(mvaK1)
SPJ：MGAS2096_Spy0753(mvaK1)
SPK：MGAS9429_Spy0737(mvaK1)
SPF：SpyM51126(mvaK1)
SPA：M6_Spy0699
SPB：M28_Spy0662(mvaK1)
SPN：SP_0381
SPR：spr0338(mvk)
SPD：SPD_0346(mvk)
SAG：SAG1326
SAN：gbs1396
SAK：SAK_1357(mvk)
SMU：SMU.181
STC：str0559(mvaK1)
STL：stu0559(mvaK1)
STE：STER_0598
SSA：SSA_0333(mvaK1)
SSU：SSU05_0289
SSV：SSU98_0285
SGO：SGO_0239(mvk)
LPL：lp_1735(mvaK1)
LJO：LJ1205
LAC：LBA1167(mvaK)
LSA：LSA0908(mvaK1)
LSL：LSL_0685(eRG)
LDB：Ldb0999(mvk)
LBU：LBUL_0906
LBR：LVIS_0858
LCA：LSEI_1491
LGA：LGAS_1033
LRE：Lreu_0915
PPE：PEPE_0927
EFA：EF0904(mvk)
OOE：OEOE_1100
LME：LEUM_1385
NFA：nfa22070
BGA：BG0711
BAF：BAPKO_0732
FPS：FP0313
MMP：MMP1335
MAE：Maeo_0775
MAC：MA0602(mvk)
MBA：Mbar_A1421
MMA：MM_1762
MBU：Mbur_2395
MHU：Mhun_2890
MEM：Memar_1812
MBN：Mboo_2213
MST：Msp_0858(mvk)
MSI：Msm_1439
MKA：MK0993(ERG12)
HAL：VNG1145G(mvk)
HMA：rrnAC0077(mvk)
HWA：HQ2925A(mvk)
NPH：NP2850A(mvk)
PTO：PTO1352
PHO：PH1625
PAB：PAB0372(mvk)
PFU：PF1637(mvk)
TKO：TK1474
RCI：LRC399(mvk)
APE：APE_2439
HBU：Hbut_0877
SSO：SSO0383
STO：ST2185
SAI：Saci_2365(mvk)
MSE：Msed_1602
PAI：PAE3108
PIS：Pisl_0467
PCL：Pcal_1835
示例性磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽
HSA：10654(PMVK)
PTR：457350(PMVK)
MCC：717014(PMVK)
MMU：68603(Pmvk)
CFA：612251(PMVK)
BTA：513533(PMVK)
DME：Dmel_CG10268
ATH：AT1G31910
OSA：4332275
SCE：YMR220W(ERG8)
AGO：AGOS_AER354W
PIC：PICST_52257(ERG8)
CGR：CAGL0F03993g
SPO：SPAC343.01c
MGR：MGG_05812
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LMA：LmjF15.1460
MXA：MXAN_5017
OIH：OB0227
SAU：SA0549(mvaK2)
SAV：SAV0592(mvaK2)
SAM：MW0547(mvaK2)
SAR：SAR0598(mvaK2)
SAS：SAS0551
SAC：SACOL0638
SAB：SAB0542(mvaK2)
SAA：SAUSA300_0574
SAO：SAOUHSC_00579
SAJ：SaurJH9_0615
SEP：SE0363
SER：SERP0240
SHA：SH2400(mvaK2)
SSP：SSP2120
LMO：lmo0012
LMF：LMOf2365_0013
LIN：lin0012
LWE：lwe0013
LLA：L10014(yebA)
LLC：LACR_0456
LLM：llmg 0427
SPY：SPy_0878(mvaK2)
SPZ：M5005_Spy_0684(mvaK2)
SPM：spyM18_0939
SPG：SpyM3_0597(mvaK2)
SPS：SPs1256
SPH：MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SPI：MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ：MGAS2096_Spy0755(mvaK2)
SPK：MGAS9429_Spy0739(mvaK2)
SPF：SpyM51124(mvaK2)
SPA：M6_Spy0701
SPB：M28_Spy0664(mvaK2)
SPN：SP_0383
SPR：spr0340(mvaK2)
SPD：SPD_0348(mvaK2)
SAG：SAG1324
SAN：gbs1394
SAK：SAK_1355
SMU：SMU.938
STC：str0561(mvaK2)
STL：stu0561(mvaK2)
STE：STER_0600
SSA：SSA_0335(mvaK2)
SSU：SSU05_0291
SSV：SSU98_0287
SGO：SGO_0241
LPL：lp_1733(mvaK2)
LJO：LJ1207
LAC：LBA1169
LSA：LSA0906(mvaK2)
LSL：LSL_0683
LDB：Ldb0997(mvaK)
LBU：LBUL_0904
LBR：LVIS_0860
LCA：LSEI_1092
LGA：LGAS_1035
LRE：Lreu_0913
PPE：PEPE_0925
EFA：EF0902
NFA：nfa22090
BGA：BG0710
BAF：BAPKO_0731
NPH：NP2852A
SSO：SSO2988
STO：ST0978
SAI：Saci_1244
示例性二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽
HSA：4597(MVD)
PTR：468069(MVD)
MCC：696865(MVD)
MMU：192156(Mvd)
RNO：81726(Mvd)
CFA：489663(MVD)
GGA：425359(MVD)
DME：Dmel_CG8239
SCE：YNR043W(MVD1)
AGO：AGOS_AGL232C
PIC：PIC ST_90752
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SPO：SPAC24C9.03
MGR：MGG_09750
ANI：AN4414.2
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CBU：CBU_0607(mvaD)
CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN：lpg2040
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TCX：Tcr_1734
DNO：DNO_0504(mvaD)
BBA：Bd1629
MXA：MXAN_5018(mvaD)
OIH：OB0226
SAU：SA0548(mvaD)
SAV：SAV0591(mvaD)
SAM：MW0546(mvaD)
SAR：SAR0597(mvaD)
SAS：SAS0550
SAC：SACOL0637(mvaD)
SAB：SAB0541(mvaD)
SAA：SAUSA300_0573(mvaD)
SAO：SAOUHSC_00578
SAJ：SaurJH9_0614
SAH：SaurJH1_0629
SEP：SE0362
SER：SERP0239(mvaD)
SHA：SH2401(mvaD)
SSP：SSP2121
LMO：lmo0011
LMF：LMOf2365_0012(mvaD)
LIN：lin0011
LWE：lwe0012(mvaD)
LLA：L9089(yeaH)
LLC：LACR_0455
LLM：llmg_0426(mvaD)
SPY：SPy_0877(mvaD)
SPZ：M5005_Spy_0683(mvaD)
SPM：spyM18_0938(mvd)
SPG：SpyM3_0596(mvaD)
SPS：SPs1257
SPH：MGAS10270_Spy0741(mvaD)
SPI：MGAS10750_Spy0775(mvaD)
SPJ：MGAS2096_Spy0754(mvaD)
SPK：MGAS9429_Spy0738(mvaD)
SPF：SpyM51125(mvaD)
SPA：M6_Spy0700
SPB：M28_Spy0663(mvaD)
SPN：SP_0382
SPR：spr0339(mvd1)
SPD：SPD_0347(mvaD)
SAG：SAG1325(mvaD)
SAN：gbs1395
SAK：SAK_1356(mvaD)
SMU：SMU.937
STC：str0560(mvaD)
STL：stu0560(mvaD)
STE：STER_0599
SSA：SSA_0334(mvaD)
SSU：SSU05_0290
SSV：SSU98_0286
SGO：SGO_0240(mvaD)
LPL：lp_1734(mvaD)
LJO：LJ1206
LAC：LBA1168(mvaD)
LSA：LSA0907(mvaD)
LSL：LSL_0684
LDB：Ldb0998(mvaD)
LBU：LBUL_0905
LBR：LVIS_0859
LCA：LSEI_1492
LGA：LGAS_1034
LRE：Lreu_0914
PPE：PEPE_0926
EFA：EF0903(mvaD)
LME：LEUM_1386
NFA：nfa22080
BBU：BB0686
BGA：BG0709
BAF：BAPKO_0730
GFO：GFO_3632
FPS：FP0310(mvaD)
HAU：Haur_1612
HAL：VNG0593G(dmd)
HMA：rrnAC1489(dmd)
HWA：HQ1525A(mvaD)
NPH：NP1580A(mvaD)
PTO：PTO0478PTO1356
SSO：SSO2989
STO：ST0977
SAI：Saci_1245(mvd)
MSE：Msed_1576
示例性异戊烯磷酸激酶(IPK)核酸和多肽
Methanobacterium thermoautotrophicumgi|2621082
Methanococcus jannaschiiDSM 2661gi|1590842；
Methanocalddococcus jannaschii gi|1590842
Methanothermobacter thermautotrophicus gi|2621082
Picrophilus torridus DSM9790(IG-57)gi|48477569
Pyrococcus abyssigi|14520758
Pyrococcus horikoshiiOT3gi|3258052
Archaeoglobus fulgidus DSM4304gi|2648231
示例性异戊烯基二磷酸δ异构酶(IDI)核酸和多肽
HSA：3422(IDI1)91734(IDI2)
PTR：450262(IDI2)450263(IDI1)
MCC：710052(LOC710052)721730(LOC721730)
MMU：319554(Idi1)
RNO：89784(Idi1)
GGA：420459(IDI1)
XLA：494671(LOC494671)
XTR：496783(idi2)
SPU：586184(LOC586184)
CEL：K06H7.9(idi-1)
ATH：AT3G02780(IPP2)
OSA：43387914343523
CME：CMB062C
SCE：YPL117C(IDI1)
AGO：AGOS_ADL268C
PIC：PICST_68990(IDI1)
CGR：CAGL0J06952g
SPO：SPBC106.15(idi1)
ANI：AN0579.2
AFM：AFUA_6G11160
AOR：AO090023000500
CNE：CNA02550
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ECU：ECU02_0230
DDI：DDB_0191342(ipi)
TET：TTHERM_00237280TTHERM_00438860
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EHI：46.t00025
ECO：b2889(idi)
ECJ：JW2857(idi)
ECE：Z4227
ECS：ECs3761
ECC：c3467
ECI：UTI89_C3274
ECP：ECP_2882
ECV：APECO1_3638
ECW：EcE24377A_3215(idi)
ECX：EcHS_A3048
STY：STY3195
STT：t2957
SPT：SPA2907(idi)
SEC：SC2979(idi)
STM：STM3039(idi)
SFL：SF2875(idi)
SFX：S3074
SFV：SFV_2937
SSN：SSON_3042SSON_3489(yhfK)
SBO：SBO_3103
SDY：SDY_3193
ECA：ECA2789
PLU：plu3987
ENT：Ent638_3307
SPE：Spro_2201
VPA：VPA0278
VFI：VF0403
PPR：PBPRA0469(mvaD)
PEN：PSEEN4850
CBU：CBU_0607(mvaD)
CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN：lpg2051
LPF：lpl2029
LPP：lpp2034
TCX：Tcr_1718
HHA：Hhal_1623
DNO：DNO_0798
EBA：ebA5678p2A143
DVU：DVU1679(idi)
DDE：Dde_1991
LIP：LI1134
BBA：Bd1626
AFW：Anae109_4082
MXA：MXAN_5021(fni)
RPR：RP452
RTY：RT0439(idi)
RCO：RC0744
RFE：RF_0785(fni)
RBE：RBE_0731(fni)
RAK：A1C_04190
RBO：A1I_04755
RCM：A1E_02555
RRI：A1G_04195
MLO：mlr6371
RET：RHE_PD00245(ypd00046)
XAU：Xaut_4134
SIL：SPO0131
SIT：TM1040_3442
RSP：RSP_0276
RSH：Rsph17029_1919
RSQ：Rsph17025_1019
JAN：Jann_0168
RDE：RD1_0147(idi)
DSH：Dshi_3527
BSU：BG11440(ypgA)
BAN：BA1520
BAR：GBAA1520
BAA：BA_2041
BAT：BAS1409
BCE：BC1499
BCA：BCE_1626
BCZ：BCZK1380(fni)
BCY：Bcer98_1222
BTK：BT9727_1381(fni)
BTL：BALH_1354
BLI：BL02217(fni)
BLD：BLi02426
BAY：RBAM_021020(fni)
BPU：BPUM_2020(fni)
OIH：OB0537
SAU：SA2136(fni)
SAV：SAV2346(fni)
SAM：MW2267(fni)
SAR：SAR2431(fni)
SAS：SAS2237
SAC：SACOL2341(fni)
SAB：SAB2225c(fni)
SAA：SAUSA300_2292(fni)
SAO：SAOUHSC_02623
SEP：SE1925
SER：SERP1937(fni-2)
SHA：SH0712(fni)
SSP：SSP0556
LMO：lmo1383
LMF：LMOf2365_1402(fni)
LIN：lin1420
LWE：lwe1399(fni)
LLA：L11083(yebB)
LLC：LACR_0457
LLM：llmg_0428(fni)
SPY：SPy_0879
SPZ：M5005_Spy_0685
SPM：spyM18_0940
SPG：SpyM3_0598
SPS：SPs1255
SPH：MGAS 10270_Spy0743
SPI：MGAS 10750_Spy0777
SPJ：MGAS2096_Spy0756
SPK：MGAS9429_Spy0740
SPF：SpyM51123(fni)
SPA：M6_Spy0702
SPB：M28_Spy0665
SPN：SP_0384
SPR：spr0341(fni)
SPD：SPD_0349(fni)
SAG：SAG1323
SAN：gbs1393
SAK：SAK_1354(fni)
SMU：SMU.939
STC：str0562(idi)
STL：stu0562(idi)
STE：STER_0601
SSA：SSA_0336
SGO：SGO_0242
LPL：lp_1732(idi1)
LJO：LJ1208
LAC：LBA1171
LSA：LSA0905(idi)
LSL：LSL_0682
LDB：Ldb0996(fni)
LBU：LBUL_0903
LBR：LVIS_0861
LCA：LSEI_1493
LGA：LGAS_1036
LRE：Lreu_0912
EFA：EF0901
OOE：OEOE_1103
STH：STH1674
CBE：Cbei_3081
DRM：Dred_0474
SWO：Swol_1341
MTA：Moth_1328
MTU：Rv1745c(idi)
MTC：MT1787(idi)
MBO：Mb1774c(idi)
MBB：BCG_1784c(idi)
MPA：MAP3079c
MAV：MAV_3894(fii)
MSM：MSMEG_1057(fni)MSMEG_2337(fni)
MUL：MUL_0380(idi2)
MVA：Mvan_1582Mvan_2176
MGI：Mflv_1842Mflv_4187
MMC：Mmcs_1954
MKM：Mkms_2000
MJL：Mjls_1934
CGL：NCgl2223(cgl2305)
CGB：cg2531(idi)
CEF：CE2207
CDI：DIP1730(idi)
NFA：nfa19790nfa22100
RHA：RHA1_ro00239
SCO：SCO6750(SC5F2A.33c)
SMA：SAV1663(idi)
LXX：Lxx23810(idi)
CMI：CMM_2889(idiA)
AAU：AAur_0321(idi)
PAC：PPA2115
FRA：Francci3_4188
FRE：Franean1_5570
FAL：FRAAL6504(idi)
KRA：Krad_3991
SEN：SACE_2627(idiB_2)SACE_5210(idi)
STP：Strop_4438
SAQ：Sare_4564Sare_4928
RXY：Rxyl_0400
BBU：BB0684
BGA：BG0707
SYN：sll1556
SYC：syc2161_c
SYF：Synpcc7942_1933
CYA：CYA_2395(fni)
CYB：CYB_2691(fni)
TEL：tll1403
ANA：all4591
AVA：Ava_2461Ava_B0346
TER：Tery_1589
SRU：SRU_1900(idi)
CHU：CHU_0674(idi)
GFO：GFO_2363(idi)
FJO：Fjoh_0269
FPS：FP1792(idi)
CTE：CT0257
CCH：Cag_1445
CPH：Cpha266_0385
PVI：Cvib_1545
PLT：Plut_1764
RRS：RoseRS_2437
RCA：Rcas_2215
HAU：Haur_4687
DRA：DR_1087
DGE：Dgeo_1381
TTH：TT_P0067
TTJ：TTHB110
MJA：MJ0862
MMP：MMP0043
MMQ：MmarC5_1637
MMX：MmarC6_0906
MMZ：MmarC7_1040
MAE：Maeo_1184
MVN：Mevan_1058
MAC：MA0604(idi)
MBA：Mbar_A1419
MMA：MM_1764
MBU：Mbur_2397
MTP：Mthe_0474
MHU：Mhun_2888
MLA：Mlab_1665
MEM：Memar_1814
MBN：Mboo_2211
MTH：MTH48
MST：Msp_0856(fni)
MSI：Msm_1441
MKA：MK0776(lldD)
AFU：AF2287
HAL：VNG1818G(idi)VNG6081G(crt_1)VNG6445G(crt_2)
VNG7060VNG7149
HMA：rrnAC3484(idi)
HWA：HQ2772A(idiA)HQ2847A(idiB)
NPH：NP0360A(idiB_1)NP4826A(idiA)NP5124A(idiB_2)
TAC：Ta0102
TVO：TVN0179
PTO：PTO0496
PHO：PH1202
PAB：PAB1662
PFU：PF0856
TKO：TK1470
RCI：LRC397(fni)
APE：APE_1765.1
SMR：Smar_0822
IHO：Igni_0804
HBU：Hbut_0539
SSO：SSO0063
STO：ST2059
SAI：Saci_0091
MSE：Msed_2136
PAI：PAE0801
PIS：Pisl_1093
PCL：Pcal_0017
PAS：Pars_0051
TPE：Tpen_0272
示例性异戊二烯合酶核酸和多肽
Genbank检索号
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241。

Claims (20)

1.由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于-22‰或在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值。
2.如权利要求1中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-21‰至-12‰范围内的δ13C值。
3.如权利要求1中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-29.5‰至-28.5‰范围内的δ13C值。
4.如权利要求1中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-30‰至-29‰范围内的δ13C值。
5.如权利要求1中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物是均聚物。
6.由衍生自异戊二烯单体的重复单元组成的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-34‰至-24‰范围内的δ13C值，并且其中该聚异戊二烯(i)不含蛋白质，或(ii)具有小于99.9％的顺-1，4-微结构含量和小于99.9％的反-1，4-微结构含量，或(iii)具有大于2％的3，4-微结构含量，或(iv)具有大于2％的1，2-微结构含量，或(v)具有在5,000至100,000范围内的重量平均分子量。
7.如权利要求6中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有在-33‰至-25‰范围内的δ13C值。
8.如权利要求7中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有大于5％的1，2-微结构含量。
9.如权利要求8中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述聚异戊二烯聚合物具有小于2.0的多分散性。
10.如权利要求6中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有在30,000至50,000范围内的重量平均分子量。
11.由衍生自异戊二烯单体的重复单元和至少一种额外单体组成的聚合物，其中所述聚合物包括衍生自异戊二烯的重复单元嵌段，并且其中衍生自异戊二烯的重复单元嵌段具有大于-22‰或在-34‰至-24‰范围内的δ13C值。
12.如权利要求11中所述的聚合物，其中所述聚合物是共聚物，其选自由(i)异戊二烯与1，3-丁二烯的共聚物，(ii)异戊二烯与苯乙烯的共聚物，(iii)异戊二烯、1，3-丁二烯与苯乙烯的共聚物和(iv)异戊二烯与α-甲基苯乙烯的共聚物组成的组。
13.如权利要求12中所述的聚异戊二烯聚合物，其中所述液体聚异戊二烯聚合物具有小于1.8的多分散性。
14.由衍生自异戊二烯的重复单元组成的聚合物，其中所述异戊二烯通过(a)在用于产生异戊二烯的合适培养条件下培养包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞，(b)产生异戊二烯和(c)从培养物回收异戊二烯来产生。
15.如权利要求14中所述的聚合物，其中通过聚合步骤(c)中回收的异戊二烯合成所述聚合物。
16.如权利要求1中所述的聚合物，其中该聚合物由衍生自异戊二烯的重复单元组成，其中所述异戊二烯通过(a)在用于产生异戊二烯的合适培养条件下培养包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞，(b)产生异戊二烯和(c)从培养物回收异戊二烯来产生。
17.如权利要求6中所述的聚合物，其中该聚合物由衍生自异戊二烯的重复单元组成，其中所述异戊二烯通过(a)在用于产生异戊二烯的合适培养条件下培养包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞，(b)产生异戊二烯和(c)从培养物回收异戊二烯来产生。
18.用于验证聚异戊二烯均聚物来自可持续的可再生非石油衍生来源的方法，其包括：(I)确定该聚异戊二烯均聚物的δ13C值；(II)如果该聚异戊二烯均聚物具有在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值，则额外地分析该聚异戊二烯均聚物以确定(1)其顺-微结构含量、(2)其3，4-微结构含量、(3)其1，2-微结构含量、(4)其重量平均分子量或(5)存在或不存在作为天然橡胶指示物的残余蛋白质、皂类、脂类、树脂或糖类；并且(III)如果该聚异戊二烯均聚物具有(i)大于-22‰的δ13C值、(ii)在-30‰至-28.5‰范围内的δ13C值或者(iii)在-34‰至-30‰范围内或在-28.5‰至-24‰范围内的δ13C值并且如果它a)具有小于100％的顺-微结构含量、(b)含有3，4-微结构、(c)含有1，2-微结构、(d)具有小于100,000的重量平均分子量或(e)不含有作为天然橡胶指示物的残余蛋白质、皂类、脂类、树脂或糖类，则验证该聚异戊二烯均聚物来自可持续的可再生的非石油衍生来源。
19.如权利要求18中所述的方法，其中通过表明该聚异戊二烯均聚物具有在-34‰至-30‰范围内的δ13C值和通过表明该聚异戊二烯均聚物不含有作为天然橡胶指示物的残余蛋白质、皂类、脂类、树脂或糖类作出验证。
20.用于验证具有衍生自异戊二烯的重复单元的共聚物含有来自可持续性的可再生非石油衍生来源的异戊二烯的方法，所述方法包括：(I)确定该共聚物中至少一个聚异戊二烯嵌段的δ13C值；和(II)如果该聚异戊二烯嵌段具有(i)大于-22‰的δ13C值或(ii)在-34‰至-28.5范围内的δ13C值，则验证该共聚物中的异戊二烯来自可持续的可再生非石油衍生来源。
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