CN107250365A - 增强的蛋白质表达 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及具有遗传改变的核酸和细菌细胞,以及制造和使用这些核酸和细菌细胞的方法,该遗传改变导致感兴趣的蛋白质的表达增加。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年2月19日提交、目前未决的美国临时专利申请序列号62/118,382的优先权。
序列表的引用
命名为“NB40178WOPCT-Sequence-Listing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2015年2月17日,并且大小为27KB,将其以全文通过引用特此结合。
发明领域
本发明总体上涉及具有遗传改变的细菌细胞,以及制造和使用此类细胞的方法,该遗传改变导致感兴趣的蛋白质的增加的表达。本发明的方面包括革兰氏阳性微生物(例如芽孢杆菌属物种),这些微生物具有导致感兴趣的蛋白质表达增强的遗传改变。
背景技术
遗传工程已经允许改进在食品发酵中用作工业生物反应器和细胞工厂的微生物。包括多个芽孢杆菌属物种的革兰氏阳性生物体被用于产生大量有用的蛋白质和代谢产物(参见,例如,Zukowski,“Production of commercially valuable products[有商业价值的产品的生产]”,在Doi和McGlouglin主编的Biology of Bacilli: Applications to Industry [杆菌生物学:工业应用]中,巴特沃思-海涅曼出版公司(Butterworth-Heinemann),斯通哈姆,马萨诸塞州,第311-337页,[1992])。工业中使用的常见芽孢杆菌属物种包括但不限于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。除了在一般工业环境(例如,除了其他用途之外,用于洗涤剂、生物质燃料生产的酶)中使用这些微生物,由于这些微生物的GRAS(通常被认为是安全的)状态,这些芽孢杆菌属物种的菌株是用于生产用于食品和制药工业的蛋白质的天然候选物。在革兰氏阳性生物体中产生的蛋白质的实例包括但不限于酶,例如淀粉酶、中性蛋白酶、碱性(或丝氨酸)蛋白酶和支链淀粉酶。
尽管对细菌宿主细胞中蛋白质的生产的理解有所进展,但是仍然需要开发新的表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组菌株。
发明简述
在某些实施例中,本发明涉及重组(即,遗传修饰的)细菌(宿主)细胞,以及其用于增加编码感兴趣的蛋白质的感兴趣的基因表达的方法。在一些其他实施例中,本发明涉及在本披露的重组(修饰的)细菌宿主细胞中一种或多种感兴趣的蛋白质的增加的生产。在仍然其他实施例中,本发明涉及修饰用于表达和/或产生一种或多种感兴趣的蛋白质的细菌宿主细胞的方法。在某些其他实施例中,本发明涉及本文所阐述的令人惊奇且意想不到的结果,其表明使用与感兴趣的基因可操作地组合的某些强5’UTR会导致感兴趣的蛋白质的更高表达。
因此,在某些实施例中,本发明涉及DNA分子,这些DNA分子在5'至3'方向上包含5'非翻译区(5'UTR)和感兴趣的异源基因的编码区。在其他实施例中,本发明涉及一种DNA分子,该DNA分子在5'至3'方向上包含5'非翻译区(5'UTR)和感兴趣的异源基因的编码区,其中该5’UTR衍生自来自芽孢杆菌属物种的aprE蛋白酶基因。在其他实施例中,该5’UTR衍生自来自枯草芽孢杆菌的aprE基因。
因此,在某些实施例中,用于在表达感兴趣的基因中使用的本披露的5’UTR衍生自枯草芽孢杆菌aprE-5’UTR。在某些其他实施例中,用于在表达感兴趣的基因中使用的本披露的5'UTR衍生自枯草芽孢杆菌aprE-5'UTR,其包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。在某些其他实施例中,本披露的5'UTR包含与SEQID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:17所示的核酸序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
在另一个实施例中,本发明涉及包含任何上述DNA序列的载体。
在另一个实施例中,本发明涉及包含载体的宿主细胞,该载体包含任何上述披露的DNA序列。在另一个方面中,宿主细胞属于芽孢杆菌属物种。在另一个方面中,该芽孢杆菌属物种选自下组,该组由以下各项组成:地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在另一个方面中,芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌菌株。在另一个方面中,芽孢杆菌属菌株是地衣芽孢杆菌菌株。
在一个方面中,感兴趣的基因编码一种酶。在另一个方面中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、过水解酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。
在本披露的某些其他实施例中,DNA分子包含与实例1,SEQ ID NO:3(即:SEQ IDNO:3是LAT表达盒,其包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)基因,其具有天然LAT启动子、天然LAT 5'UTR、天然LAT信号肽序列和天然LAT转录终止子)中所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在其他实施例中,DNA分子包含与实例2,SEQ ID NO:11(即:SEQ ID NO:11包含可操作地与Bacillus deramificans支链淀粉酶(PUL)连接的SEQ ID NO:2的aprE-5’UTR,其中支链淀粉酶的N-末端104个氨基酸已被缺失,在本文中称为“PULm104”)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在其他实施例中,DNA分子包含与实例3,SEQ ID NO:12(即,SEQ ID NO:12在5'至3'方向上包含:可操作地与aprE-5'UTR(SEQ ID NO:2)组合的rrnI P2启动子(SEQ ID NO:20),该aprE-5'UTR与全长LAT ORF(即,编码LAT信号肽和成熟LAT多肽)可操作地组合)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在某些其他实施例中,DNA分子包含与实例3,SEQ ID NO:13(即,SEQ ID NO:13在5'至3'方向上包括:与aprE-5'UTR(SEQ ID NO:2)可操作地组合的rrnI P2启动子(SEQ IDNO:20),该aprE-5'UTR与LAT信号肽可操作地组合,该LAT信号肽与编码PULm104的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在某些其他实施例中,DNA分子包含与实例4,SEQ ID NO:14(即,SEQ ID NO:14在5'至3'方向上包含:与aprE-5’UTR(SEQ ID NO:2)可操作地组合的LAT启动子,该aprE-5’UTR与LAT信号肽可操作地组合,该LAT信号肽与编码成熟AmyS变体多肽的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在某些其他实施例中,DNA分子包含与实例4,SEQ ID NO:15(即,SEQ ID NO:15在5'至3'方向上包含:与aprE-5’UTR(SEQ ID NO:9;又称为“V2 aprE-5’UTR”)可操作地组合的LAT启动子,该aprE-5’UTR与LAT信号肽可操作地组合,该LAT信号肽与编码成熟AmyS变体多肽的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在又另一个实施例中,DNA分子包含与实例4,SEQ ID NO:16(即,SEQ ID NO:16在5'至3'方向上包含:与aprE-5’UTR(SEQ ID NO:10;又称为“V3 aprE-5’UTR”)可操作地组合的LAT启动子,该aprE-5’UTR与LAT信号肽可操作地组合,该LAT信号肽与编码成熟AmyS变体多肽的ORF可操作地组合)所示的核酸序列具有90%序列同一性的序列。
在具体的实施例中,DNA分子包含SEQ ID NO:11的核酸序列。
在其他实施例中,本发明涉及用于增加感兴趣的蛋白质在芽孢杆菌属细菌中的表达的方法,该方法包括:使转化的芽孢杆菌属细菌在合适的培养基中生长以表达该感兴趣的蛋白质,其中将该芽孢杆菌属细菌用包含表达盒的载体进行转化,该表达盒包含编码感兴趣的蛋白质的DNA和来自芽孢杆菌属细菌的aprE蛋白酶基因的5’UTR,其中与来自用不包含aprE 5’UTR的表达盒转化的芽孢杆菌属细菌的感兴趣的蛋白质的表达相比,该感兴趣的蛋白质的表达增加了。在另外的方面中,从培养基中回收感兴趣的蛋白质。在一个方面中,感兴趣的蛋白质在细胞外分泌。在另一个方面中,感兴趣的蛋白质在细胞内积聚。
在另一个方面中,DNA分子包括来自枯草芽孢杆菌的aprE 5'UTR。
在另一个方面中,DNA分子进一步包含来自核糖体RNA基因的启动子。在另一个方面中,核糖体RNA基因启动子选自下组,该组由以下各项组成:P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnE和P3 rrnE。在另一个方面中,DNA分子还包含来自核糖体蛋白质基因的启动子。在另一个方面中,核糖体蛋白质基因启动子选自下组,该组由以下各项组成:rpsD、P1rpsJ、P2 rpsJ和σ因子启动子rpoD。在另一个方面中,启动子包含来自LAT基因的启动子。
在某些实施例中,感兴趣的蛋白质是同源蛋白质。在某些实施例中,感兴趣的蛋白质是异源蛋白质。在某些实施例中,感兴趣的蛋白质是酶。在某些实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。
在某些实施例中,该方法进一步包括回收感兴趣的蛋白质。
在某些实施例中,该方法进一步包括在由经改变的革兰氏阳性细菌细胞表达感兴趣的蛋白质的条件下培养经改变的革兰氏阳性细菌细胞。在某些实施例中,该方法进一步包括回收感兴趣的蛋白质。
本发明的方面包括通过上述方法生产的经改变的革兰氏阳性细菌细胞。
附图简述
图1是质粒pICatH-LATori1。
图2是载体pHPLT-Blich-int-盒的图谱。
图3是载体pKB360-AprE-WT-AmyS变体的图谱。
发明详述
在详细地描述本发明的组合物和方法之前,为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义,否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明,本披露的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程和微生物学的常规技术。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本披露的实践,但是本文描述了一些合适的方法和材料。通过参考作为一个整体的说明书,更全面地描述下面即将定义的术语。
除非上下文另有明确指示,如本文所使用的,单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有说明,否则核酸序列从左至右以5'至3'取向写出;并且氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。应当理解的是,在没有相反的指示的情况下,本披露不限于本文所述的具体方法、方案和试剂。
在本说明书全文中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度,如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度,如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书全文中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围,如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
如本文所使用的,关于数值,术语“约”是指数值的+/-0.5的范围,除非术语在上下文中另有具体定义。例如,短语“约6的pH值”是指pH值为从5.5至6.5,除非pH值另有具体定义。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中,但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有公开物和专利都通过引用结合在此,就好像每个单独的公开物或专利被具体地并单独地指示为通过引用结合,并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对其在申请日之前的披露,并且不能理解为承认因为先前发明而本发明组合物和方法不能获得比这些公开物更早的申请日。此外,所提供的公开日期可能与实际公开日期不同,实际公开日期可能需要独立地证实。
A.定义
如本文所使用的,“宿主细胞”是指具有作为新引入的核酸序列的宿主或表达载体的能力的细胞。
在本发明的某些实施例中,宿主细胞是细菌细胞,例如革兰氏阳性宿主细胞芽孢杆菌属细胞。
如本文所使用的,“芽孢杆菌属”或“芽孢杆菌属物种”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种,包括但不限于:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽胞杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽胞杆菌和苏云金芽孢杆菌。我们意识到芽孢杆菌属在不断进行分类学重组。因此,该属旨在包括已重新分类的物种,包括但不限于:例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)的此类生物体。在氧气的存在下,抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性,尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽胞杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
如本文所使用的,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分,以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA和RNA,无论是代表有义链还是反义链。应当理解,由于遗传密码的简并性,许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。
如本文所使用的,术语“载体”是指可以在细胞中复制并且可以携带新基因或DNA片段到细胞中的任何核酸。因此,该术语是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中整合并表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。“靶向载体”是包含与其转化的宿主细胞的染色体中的区域同源的多核苷酸序列并且可以驱动该区域的同源重组的载体。靶向载体用于通过同源重组将突变引入细胞染色体。在一些实施例中,靶向载体包含其他非同源序列,例如添加到末端(即,填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合,这样使得靶向载体形成闭环,例如像,插入载体中。合适载体的选择和/或构建是在本领域技术人员的知识范围中的。
如本文所使用的,术语“质粒”是指用作载体的环状双链(ds)DNA构建体,并且其在许多细菌和真核生物中形成染色体外自我复制遗传因子。在一些实施例中,质粒可以并入宿主细胞的基因组中。
如本文所定义的,术语“LAT淀粉酶”是指地衣芽孢杆菌α-淀粉酶“AmyL”,因此这些术语可以互换使用。
“纯化的”或“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离进行,以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。随后可以进一步向纯化或分离的生物分子组合物中添加成分,该成分提供了额外的益处,例如是活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或其他酶或化学品。
如本文所使用的,当提及感兴趣的生物分子(例如,感兴趣的蛋白质)的表达时,术语“增强”、“改进”和“增加”在本文中可互换使用,以表明生物分子的表达高于在相应的宿主菌株(例如,野生型和/或亲本菌株)中的表达水平,该相应的宿主菌株根据本文的教导未被改变,但已经在基本上相同的生长条件下生长。
如本文所使用的,当应用于蛋白质时,术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生蛋白质并且因此包括转录和翻译两者的过程。
如本文所使用的,在将多核苷酸引入细胞中的上下文中,术语“引入”是指适合于将多核苷酸转移到细胞中的任何方法。这种引入方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、缀合和转导(参见例如Ferrari等人,“Genetics[遗传学]”,在Hardwood等人所编的Bacillus[芽孢杆菌]中,普莱南出版公司(Plenum Publishing Corp.),第57-72页,[1989])。
如本文所使用的,术语“转化的”和“稳定转化的”是指通过人为干预被引入多核苷酸序列的细胞。多核苷酸可以整合到细胞的基因组中,或作为保持至少两代的附加型质粒存在。
如本文所使用的,术语“可选择的标志物”或“选择性标志物”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如,基因),其允许容易地选择包含该核酸的那些宿主。这些可选择的标志物的实例包括但不限于抗微生物剂。因此,术语“可选择的标志物”是指提供宿主细胞已经摄取了感兴趣的输入DNA,或者已经发生了一些其他反应的指示。通常,可选择的标志物是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势的基因,以允许在转化期间将包含外源DNA的细胞与未接受任何外源序列的细胞区分开来。根据本发明有用的其他标志物包括但不限于营养缺陷型标志物,如色氨酸;和检测标志物,如β-半乳糖苷酶。
如本文所使用的,术语“启动子”是指用于引导下游基因转录的核酸序列。在实施例中,启动子适用于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起是表达给定的基因所必须的。通常,转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。
如本文所使用的,“功能附接”或“可操作地连接”意指具有已知或所期望活性的调节区域或功能结构域(如启动子、终止子、信号序列或增强子区域)按这样一种方式附接于或连接于靶标(例如,基因或多肽),以允许调节区域或功能结构域根据其已知或期望的活性来控制该靶标的表达、分泌或功能。
当用于描述重组细胞时,术语“遗传改变”或“遗传变化”意味着与亲本细胞相比,细胞具有至少一个遗传差异。一个或多个遗传差异可以是染色体突变(例如,插入、缺失、取代、倒位、用一个染色体区域替代另一个染色体区域(例如用异源启动子替代染色体启动子)等)和/或引入染色体外多核苷酸(例如,质粒)。在一些实施例中,可以将染色体外多核苷酸整合到宿主细胞染色体中,以产生稳定转染子/转化子。
基因的“失活”意味着基因的表达或其编码的生物分子的活性被阻断,或不能发挥其已知的功能。灭活可以通过任何合适的手段发生,例如通过如上所述的遗传改变。在一个实施例中,灭活基因的表达产物是具有蛋白质的生物活性相应变化的截短蛋白质。
在一些实施例中,通过缺失实现失活。在一些实施例中,通过同源重组缺失靶向缺失的区域(例如,基因)。例如,使用包括具有选择性标志物的输入序列的DNA构建体,该选择性标志物在每侧侧翼有与靶向缺失的区域同源的序列(其中该序列在本文中称为“同源盒”)。DNA构建体与宿主染色体的同源序列对齐,并且在双重交叉事件中,将靶向缺失的区域从宿主染色体上切除。
“插入”或“添加”是与天然存在的或亲本的序列相比分别导致添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列的改变。
如本文所使用的,“取代”由一或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸替代产生。
使基因突变的方法是本领域熟知的,并且包括但不限于位点定向突变、随机突变的产生、和缺口双链体方法(参见例如,美国专利4,760,025;Moring等人,Biotech.[生物技术],2:646[1984];和Kramer等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],12:9441[1984])。
如本文所使用的,“同源基因”是指来自不同的、但通常相关的物种的一对或多个基因,这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即,新物种的发育)(例如,直系同源基因)分离的基因、以及通过遗传重复分离的基因(例如,旁系同源基因)。
如本文所使用的,“直向同源物”和“直向同源基因”是指通过物种形成从共同祖先基因(即,同源基因)演化的不同物种中的基因。通常,直系同源物在进化过程中保持相同的功能。直系同源物的鉴定可用于新测序基因组中基因功能的可靠预测。
如本文所使用的,“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指与基因组内重复相关的基因。虽然直系同源物在进化过程中保持相同的功能,但旁系同源物发展新功能,即使一些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、和凝血酶的基因,上述酶都是丝氨酸蛋白酶并且在同一物种内一起发生。
如本文所使用的,“同源性”是指序列相似性或同一性,同一性优先。使用本领域已知的标准技术来确定这种同源性(参见,例如,Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展],2:482[1981];Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443[1970];Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊],85:2444[1988];程序如在Wisconsin Genetics[威斯康星州遗传学]软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics Computer Group[遗传学计算机集团],威斯康星州麦迪逊);和Devereux等人,Nucl.Acid Res.[核酸研究],12:387-395[1984])。
如本文所使用的,“类似的序列”是其中基因的功能基本上与指定来自枯草芽孢杆菌菌株168的基因相同的序列。另外,类似的基因与枯草芽孢杆菌菌株168基因的序列包括至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性。可替代地,类似的序列具有在枯草芽孢杆菌168区域中发现的在70%至100%之间的基因的对齐和/或在与枯草芽孢杆菌168染色体中的基因对齐的区域中发现的至少在5至10个之间的基因。在另外的实施例中,多于一个上述性质适用于该序列。类似的序列由已知的序列比对方法确定。通常使用的比对方法是BLAST,尽管如上下文所示,存在也可用于比对序列的其他方法。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多个序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化方法(Feng和Doolittle,J.Mol.Evol.[分子进化杂志],35:351-360[1987])。该方法类似于Higgins和Sharp(Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153[1989])描述的方法。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重,为0.10的默认空位长度权重,以及加权的末端空位。
有用的算法的另一个实例是由Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],215:403-410[1990];和Karlin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊],90:5873-5787[1993])。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见,Altschul等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],266:460-480[1996])。WU-BLAST-2使用若干个搜索参数,其中大部分设置为默认值。可调参数设置为以下值:重叠跨度=1,重叠分数=0.125,字阈值(T)=11。HSP S和HSP S2参数是动态值,并且由程序本身根据特定序列的组成以及具体数据库的组成针对所搜索的感兴趣的序列是哪个来建立。然而,可以调整这些值以增加灵敏度。氨基酸序列同一性值%由匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数来确定。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(通过WU-Blast-2引入以最大化比对得分的空位被忽略)。
如本文所使用的,相对于本文鉴定的氨基酸或核苷酸序列,“序列同一性百分比(%)”被定义为在比对序列并引入空位(必要的话)以实现最大百分比序列同一性之后,并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代,候选序列中与感兴趣的序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
“同系物”(或“同源物”)是指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有特定程度的同一性的实体。使用常规序列比对工具(例如,Clustal、BLAST等等),同源序列可以包括与主题序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列。通常,除非另有说明,同系物将包括与受试氨基酸序列相同的活性位点残基。
进行序列比对并且确定序列同一性的方法是本领域技术人员已知的,可以在不进行过多实验的情况下实施,并且可以明确地获得同一性值的计算。参见,例如,Ausubel等人编辑的(1995)Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],第19章(格林出版与威利交叉科学出版社(Greene Publishing and Wiley-Interscience),纽约);以及ALIGN程序(Dayhoff(1978),在Atlas of Protein Sequence and Structure5:Suppl.3[蛋白质序列和结构图集5:增刊3]中(国家生物医学研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation),华盛顿)。许多算法可用于比对序列并确定序列同一性,并且包括,例如,Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443的同源性比对算法;Smith等人(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482的局部同源性算法;Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院刊]85:2444的相似性捜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.[分子生物学方法]70:173-187(1997));和BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(参见Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410)。
使用这些算法的计算机化程序也是可用的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或WU-BLAST-2(Altschul等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],266:460-480(1996));或可在遗传学计算机组(GCG)包,版本8,麦迪逊,威斯康星州,美国中获得的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA;以及智能遗传学(Intelligenetics),山景城,加利福尼亚州的PC/基因程序中的CLUSTAL。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在进行比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的算法。优选地,使用由程序确定的默认参数来确定序列同一性。具体来说,序列同一性可以通过使用具有默认参数的Clustal W(Thompson J.D.等人(1994),Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680)来确定。
如本文所使用的,术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程,如本领域已知的。
如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交,则认为核酸序列可与参考核酸序列“选择性杂交”。杂交条件是基于结合复合物或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如,“最大严格”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5°);“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃;“中等严格”发生在低于探针的Tm约10℃-20℃;并且“低严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。在功能上,最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列;而中等或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同系物。
中等和高严格杂交条件是本领域公知的。高严格条件的实例包括在约42℃下在50%甲酰胺,5X SSC,5X登哈特溶液,0.5%SDS和100μg/ml变性载体DNA中进行的杂交,随后在室温下在2X SSC和0.5%SDS中洗涤两次,并在42℃下在0.1X SSC和0.5%SDS中再洗涤两次。中严格条件的实例包括在37℃下在包括20%甲酰胺,5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH 7.6),5×登哈特溶液,10%葡聚糖硫酸盐和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜孵育,然后在约37℃-50℃下以1x SSC洗涤滤器来进行。如果需要,本领域技术人员知道如何调节温度、离子强度等以适应因素如探针长度等等。
当用于提及生物组分或组合物(例如,细胞、核酸、多肽/酶、载体等)时,术语“重组体”表示该生物组分或组成物处于自然界中未发现的状态。换句话说,生物组分或组合物已经通过人类干预从其天然状态进行了修饰。例如,重组细胞涵盖表达在其天然亲本(即,非重组)细胞中未发现的一个或多个基因的细胞,表达与其天然亲本细胞不同的量的一个或多个天然基因的细胞,和/或在不同于其天然亲本细胞的条件下表达一个或多个天然基因的细胞。重组核酸可以与天然序列相差一个或多个核苷酸,可操作地连接到异源序列(例如,异源启动子,编码非天然或变体信号序列的序列等),没有内含子序列,和/或处于分离形式。重组多肽/酶可以与天然序列相差一个或多个氨基酸,可以与异源序列融合,可能被截短或具有氨基酸的内部缺失,能以在天然细胞中未发现的方式表达(例如,来自由于细胞中存在编码多肽的表达载体而过表达该多肽的重组细胞),和/或处于分离形式。需要强调的是,在一些实施例中,重组多核苷酸或多肽/酶具有与其野生型对应物相同但处于非天然形式(例如,分离或富集形式)的序列。
如本文所使用的,术语“靶序列”是指宿主细胞中编码如下序列的DNA序列:其中希望将输入序列插入宿主细胞基因组中。在一些实施例中,靶序列编码功能性野生型基因或操纵子,而在其他实施例中,靶序列编码功能性突变基因或操纵子、或非功能基因或操纵子。
如本文所使用的,“侧翼序列”是指正在讨论的序列的上游或下游的任何序列(例如,针对基因A-B-C,基因B以A和C基因序列为侧翼)。在一个实施例中,输入序列每侧侧翼有同源盒。在另一个实施例中,输入序列和同源盒包括在每侧侧翼有填充序列的单元。在一些实施例中,侧翼序列仅存在于单侧(3’或5’),但在实施例中,序列的每侧均有侧翼序列。每个同源盒的序列与芽孢杆菌属染色体中的序列同源。这些序列指导在芽孢杆菌属染色体中,新构建体被整合,并且部分芽孢杆菌属染色体将被输入序列替代。在一个实施例中,选择性标志物的5’和3’端侧翼有包含失活染色体区段的部分的多核苷酸序列。在一些实施例中,侧翼序列仅存在于单侧(3’或5’),而在实施例中,其存在于所侧翼序列的每侧。
如本文所使用的,术语“可扩增标志物”、“可扩增基因”、和“扩增载体”是指基因或编码基因的载体,其允许在适当生长条件下扩增该基因。
在大多数扩增技术中通过酶的选择实现“模板特异性”。扩增酶是在使用它们的条件下仅在核酸的不均匀混合物中处理核酸的特定序列的酶。例如,在Qβ复制酶的情况下,MDV-1 RNA是复制酶的特异性模板(参见例如,Kacian等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]69:3038[1972])。其他核酸不被该扩增酶复制。类似地,在T7 RNA聚合酶的情况下,该扩增酶对其自身的启动子具有严格的特异性(参见Chamberlin等人,Nature[自然],228:227[1970])。在T4 DNA连接酶的情况下,该酶将不连接两个寡核苷酸或多核苷酸,其中寡核苷酸或多核苷酸底物与连接接合处的模板之间存在错配(参见Wu和Wallace,Genomics[基因组学],4:560[1989])。最后,发现Taq和Pfu聚合酶由于其在高温下起作用的能力而对引物限制并由此限定的序列显示出高特异性;高温导致有利于与靶序列引物杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件。
如本文所使用的,术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样本模板”。
如本文所使用的,术语“样品模板”是指源自样品的核酸,将该样品对“靶标”的存在进行分析(下文所定义)。相比之下,“背景模板”用于提及除样品模板之外的核酸,其可以存在或不存在于样品中。背景模板通常是无意中存在的。它可能是遗留(carryover)的结果,或者它可能是因为试图从样品中纯化掉的核酸污染物的存在导致的。例如,来自生物体的而非待检测那些的核酸可作为背景存在于测试样品中。
如本文所使用的,术语“引物”是指当置于以下条件下能作为合成起始点的寡核苷酸,无论是纯化的限制性消化物中天然存在的还是经合成而产生的:其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成(即,在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶存在下并在合适的温度和pH下)。引物优选是单链,用于最大效率的扩增,但是可替代地可以是双链。如果是双链,引物首先经过处理以分离其双链,然后再用于制备延伸产物。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长,以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于多个因素,包括温度、引物来源和方法的使用。
如本文所使用的,术语“探针”是指能与另一感兴趣的寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸序列),无论是在纯化的限制性消化中天然存在还是以合成,重组或通过PCR扩增产生的。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期的是,本发明所用的任何探针都将用任何“报道分子”标记,这样使得在任何检测系统中都可检测,所述检测系统包括但不限于酶(例如ELISA、以及基于酶的组织化学测定)系统、荧光系统、放射性系统、和发光系统。本发明并不旨在限于任何具体的检测系统或标记。
如本文所使用的,术语“靶”当用于提及聚合酶链式反应时,是指由用于聚合酶链式反应的引物所界定的核酸区域。因此,试图从其他核酸序列分选“靶标”。“区段”被定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的,术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)(尤其)是指通过引用并入本文的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法,其包括用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中靶序列的区段浓度的方法。
如本文所使用的,“遗传改变的宿主菌株”(例如,遗传改变的芽孢杆菌属菌株)是指遗传工程化的宿主细胞,也称为重组宿主细胞。在一些实施例中,与在基本上相同的生长条件下生长的相应未经改变的宿主菌株中相同感兴趣的蛋白质的表达和/或产生相比,遗传改变的宿主细胞具有增强的(增加的)感兴趣的蛋白质的表达。在一些实施例中,经改变的菌株是经遗传工程化的具有一个或多个缺失的固有染色体区或其片段的芽孢杆菌属物种,其中与在基本上相同的生长条件下生长的相应的未经改变的芽孢杆菌属宿主菌株相比,感兴趣的蛋白质具有增强的表达或产生水平。
如本文所使用的,“相应的未经改变的芽孢杆菌菌株”等是宿主菌株(例如,原始(亲本)和/或野生型菌株),该菌株不具有指示的遗传改变。
如本文所使用的,术语“染色体整合”是指将输入序列引入宿主细胞(例如,芽孢杆菌属)的染色体的过程。转化DNA的同源区域与染色体的同源区域对齐。随后,在双交换(即同源重组)中,同源盒之间的序列被输入序列替代。在本发明的一些实施例中,DNA构建体的灭活染色体区段的同源段与芽孢杆菌属染色体的固有染色体区域的侧翼同源区域对齐。随后,在双交换(即同源重组)中,通过DNA构建体缺失固有染色体区域。
“同源重组”意指在相同或几乎相同核苷酸序列位点处的两个DNA分子或配对染色体之间的DNA片段的交换。在一个实施例中,染色体整合是同源重组。
如本文所使用的“同源序列”意指,当最佳比对用于比较时,与另一个核酸或多肽序列具有100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、75%、或70%序列同一性的核酸或多肽序列。在一些实施例中,同源序列具有85%至100%之间的序列同一性,而在其他实施例中,存在在90%至100%之间的序列同一性,并且在更多实施例中,存在95%和100%的序列同一性。
如本文所使用的,“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
如本文所使用的,“感兴趣的蛋白质”和“感兴趣的多肽”是指期望和/或被评估的蛋白质/多肽。在一些实施例中,感兴趣的蛋白质是细胞内的,而在其他实施例中,其是分泌的多肽。具体地,多肽包括酶,这些酶包括但不限于选自以下各项的那些:淀粉分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。更具体地,这些酶包括,但不限于:酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。在一些实施例中,感兴趣的蛋白质是与信号肽融合的分泌多肽(即,待分泌的蛋白质上的氨基末端延伸)。几乎所有分泌的蛋白质都使用氨基末端蛋白质延伸,其在前体蛋白质穿过膜的靶向和易位中起关键作用。在膜转移期间或之后可以通过信号肽酶水解去除该延伸。
在本发明的一些实施例中,感兴趣的多肽或蛋白质选自激素、抗体、生长因子、受体等。涵盖本发明的激素包括但不限于:卵泡刺激素、黄体生成激素、促皮质素释放因子、生长激素抑制素、促性腺激素、加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。生长因子包括但不限于:血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、细胞因子如白介素(例如,IL-1至IL-13)、干扰素、集落刺激因子等。抗体包括但不限于:直接从需要产生抗体的任何物种获得的免疫球蛋白。此外,本发明涵盖修饰的抗体。多克隆和单克隆抗体也由本发明所涵盖。在具体实施例中,抗体是人抗体。
如本文所使用的,多肽的“衍生物”或“变体”意指一种多肽,该多肽通过以下方式来自前体多肽(例如,天然多肽):向C-和N-末端之一或二者添加一个或多个氨基酸,在氨基酸序列的不同位点的一个或多个处取代一个或多个氨基酸,在多肽的一端或两端处或在氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸,在氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸,以及其任何组合。多肽的衍生物或变体的制备能以任何方便的方式实现,例如通过修饰编码天然多肽的DNA序列,将该DNA序列转化到合适的宿主中,以及修饰的DNA序列的表达以形成衍生物/变体多肽。衍生物或变体进一步包括经化学修饰的多肽。
如本文所使用的,术语“异源蛋白质”是指在天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多肽。在一些实施例中,编码蛋白质的基因是天然存在的基因,而在其他实施例中,可以使用突变的和/或合成的基因。在一些实施例中,编码异源蛋白质的DNA与本质上是异源的5'UTR连接,这意味着5'UTR和编码感兴趣的蛋白质的DNA来自不同的基因或不同的生物体。因此,术语异源的以其最广泛的意义使用,即两个元件不是来自相同的来源(例如,物种、细胞、核酸等)。
如本文所使用的,“同源蛋白质”是指天然的或天然存在于细胞中的蛋白质或多肽。在实施例中,细胞是革兰氏阳性细胞,而在具体实施例中,细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。在替代性实施例中,同源蛋白质是由其他生物体产生的天然蛋白质,包括但不限于大肠杆菌。本发明涵盖通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。
B.非翻译区(UTR)
非翻译区或“UTR”是mRNA的序列或通常未被翻译的相应DNA。UTR可以在mRNA的5'或3'端。5’非翻译区(5'UTR)(也称为前导序列或前导RNA)是起始密码子上游的mRNA的区域。该区域对于通过病毒、原核生物和真核生物中的机制的分化的转录物的翻译的调节很重要。虽然称为非翻译的,但是其5'UTR或其一部分有时被翻译成蛋白质产物。该产物然后可以调节mRNA的主要编码序列的翻译。然而,在许多其他生物体中,5'UTR是非翻译的,而不能形成复杂的二级结构以调节翻译。相应的DNA序列也通常称为5'或3'UTR序列。
5'UTR可以在转录起始位点开始,并且可以在翻译起始位点或编码区的第一个密码子处或附近结束。5'UTR的长度从3-10个核苷酸到数千个核苷酸变化。5'UTR通常含有核糖体结合位点、顺式作用调节元件以及其他调控元件。
来自芽孢杆菌的各种基因含有5'UTR。来自地衣芽孢杆菌的LAT(α淀粉酶)基因包括以下5'UTR:
GTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATC(SEQ ID NO:8),而来自枯草芽孢杆菌的aprE基因包括以下5'UTR:
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA(SEQ IDNO:2)。
Hambraeus等人已经表明来自枯草芽孢杆菌的aprE基因的、58个核苷酸的长前导序列(5'UTR)是mRNA稳定性的决定因素(Hambraeus等人,Microbiology[微生物学](2002)148:1795-1803)。他们表明,该区域在5'端形成茎-环结构,并与完整的核糖体结合位点(RBS)一起导致mRNA的稳定性增强。然而,Hambraeus等人没有研究也没有教导,也不建议,而且此外没有意识到并且因此不会使本领域技术人员有动机想到在表达载体中使用强的5'UTR可能导致感兴趣的蛋白质的更高表达。诸位发明人现在发现,表达载体中的强5'UTR确实导致在修饰的宿主细胞中更高的感兴趣的蛋白质的表达。
C.启动子
具体地,用于细菌宿主细胞的合适的启动子的实施例包括但不限于例如PamyE、PamyQ、PamyL、PpstS、PsacB、PSPAC、PAprE、PVeg、PHpaII启动子,嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌(BAN)淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的启动子、短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子、苏云金芽孢杆菌cryIIIA的启动子、和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子。另外的启动子包括但不限于A4启动子,以及噬菌体λPR或PL启动子,以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。另外,已经发现核糖体蛋白质和RNA启动子可用于异源蛋白质的生产(参见例如WO 2013/086219,其公开内容通过引用整体并入本文)。考虑了以下启动子。
表2-1:显示了rpsD、rpsJ和rpoD(P1)的启动子序列。-35和-10序列以粗体显示,且每个启动子加了下划线。对于rpsJ,两个启动子可用(P1和P2)。rpsJ P1的-35和-10序列是rpsJ P2序列的-35和-10序列的上游(即5')。
当使用核糖体启动子时,编码异源感兴趣的蛋白质的核酸序列的意想不到的高水平的表达具有若干益处。在一个实施例中,当与来自其天然启动子的感兴趣的编码序列的表达相比时,用核糖体启动子表达感兴趣的编码序列允许增加感兴趣的编码序列的表达水平。增加的表达水平对于不稳定的转录物特别有用。
在另一个实施例中,用核糖体启动子表达感兴趣的编码序列允许在不扩增含有核糖体启动子的表达构建体的情况下增加感兴趣的编码序列的表达水平。当使用本领域的其他表达构建体时,为了达到感兴趣的编码序列的高表达水平,通常需要扩增表达构建体。然而,用本文所述的核糖体启动子获得的表达水平足够高,使得表达构建体的扩增可能不是必需的(但可用于获得甚至更高表达的感兴趣的蛋白质)。这提供了若干益处。首先,宿主菌株更稳定,因为宿主菌株不会经历扩增的表达构建体的丢失。此外,如果表达构建体不需要扩增,那么菌株构建更有效。因此,节省了时间、金钱和材料。
D.感兴趣的编码序列
本发明所涵盖的启动子可操作地连接到编码感兴趣的蛋白质的核酸(即感兴趣的编码序列)。由编码序列编码的多肽可以是酶、激素、生长因子、细胞因子、抗生素或其部分、受体或其部分、报告基因(例如,绿色荧光蛋白)或其他次级代谢物。
在一些实施例中,酶是蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶、植酸酶、漆酶、脂肪酶、异构酶、酯酶、甘露聚糖酶、糖酶、水解酶、氧化酶、通透酶、支链淀粉酶、还原酶、差向异构酶、互变异构酶、转移酶、激酶、磷酸酶,或来源于细菌或真菌的类似物。
在其他实施例中,酶是蛋白酶,例如丝氨酸、金属、硫醇或酸性蛋白酶。在一些实施例中,蛋白酶将是丝氨酸蛋白酶(例如,枯草杆菌蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶描述于Markland等人,(1983)Honne-Seyler's Z Physiol.Chem,364:1537-1540;Drenth,J.等人,(1972),Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志],26:177-181;美国专利号4,760,025(RE 34,606)、5,182,204和6,312,936和EP 0 323,299中。碱性蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶,特别是衍生自芽孢杆菌属的那些(例如,枯草杆菌蛋白酶迟缓、枯草杆菌蛋白酶解淀粉、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)。可以用于本发明的蛋白酶也描述在例如美国专利公开号2010/0152088和国际公开号WO 2010/056635中。在KM Kalisz,“Microbial Proteinases[微生物蛋白酶]”,ADVANCESIN BIOCHEMICAL ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY[生化工程和生物技术进展],A.Fiecht主编,1988年中公开了测定蛋白水解活性的方法。
在其他实施例中,酶是淀粉酶,例如衍生自芽孢杆菌的淀粉酶(如地衣芽孢杆菌LAT淀粉酶)、衍生自土芽孢杆菌属的淀粉酶(如嗜热脂肪土芽孢杆菌)或木霉属的淀粉酶(如里氏木霉)。细菌和真菌淀粉酶描述于例如美国专利号8,058,033、美国专利公开号2010/0015686、美国专利公开号2009/0314286、英国申请号1011513.7和国际申请号PCT/IB2011/053018中。这些参考文献的每一个的说明书全部内容通过引用并入本文。
在其他实施例中,酶是木聚糖酶。在某些实施例中,木聚糖酶衍生自木霉属(如里氏木霉)。细菌和真菌木聚糖酶描述于例如国际公开号WO 2001/027252和美国专利号7,718,411中。这些参考文献的每一个的说明书全部内容通过引用并入本文。
在其他实施例中,酶是植酸酶。在某些实施例中,植酸酶衍生自柠檬酸杆菌属(如弗氏柠檬酸杆菌)或大肠杆菌。在其他实施例中,植酸酶可以是布丘氏菌属植酸酶如乡间布丘菌植酸酶。植酸酶描述于例如国际公开号WO 2006/043178、WO 2006/038062、WO 2008/097619、WO 2009/129489、WO 2006/038128、WO 2008/092901、WO 2009/129489和WO 2010/122532中。这些参考文献的每一个的说明书全部内容通过引用并入本文。
在一些实施例中,酶是纤维素酶。纤维素酶是水解纤维素中β-D-糖苷键的酶。纤维素分解酶传统上分为三大类:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶(Knowles,J.等人,TIBTECH,5:255-261(1987))。许多纤维素酶已经在科学文献中有描述,这是本领域技术人员所熟知的。
在一些实施例中,激素是卵泡刺激素、黄体生成激素、促皮质素释放因子、生长激素抑制素、促性腺激素、加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。
在一些实施例中,生长因子(生长因子是结合细胞表面上的受体并以活化细胞增殖和/或分化为主要结果的蛋白质)包括血小板衍生生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子等。
在一些实施例中,生长因子是细胞因子。细胞因子包括但不限于集落刺激因子、白介素(IL-1(α和β),IL-2至IL-13)和干扰素(α、β和γ)。
在一些实施例中,抗体包括但不限于来自任何需要大量产生的物种的免疫球蛋白,特别优选的是抗体是人抗体。免疫球蛋白可以来自任何类别,即G、A、M、E或D。
编码序列对宿主细胞而言可以是天然的或异源的。此外,编码序列可以编码全长蛋白质或全长蛋白质的截短形式。本发明不限于特定的编码序列,而是涵盖与本发明的启动子可操作地连接的大量编码序列。
E.信号序列
在一些实施例中,特别是当感兴趣的编码序列编码胞外酶(例如纤维素酶、蛋白酶或淀粉降解酶)时,信号序列可以连接到编码序列的N端部分。该信号可用于促进DNA序列的分泌。信号序列对宿主生物而言可以是内源的或外源的。信号序列可以是通常与编码的多肽相关联的信号序列。在一些实施例中,可以如国际专利公开号WO 2011/014278和WO2010/123754中所述经改变或修改信号序列,其说明书通过引用整体并入本文。在一些实施例中,信号序列包括来自链霉菌属纤维素酶基因的信号序列。在一个实施例中,优选的信号序列是变铅青链霉菌纤维素酶,celA(Bently等人,(2002)Nature[自然],417:141-147)。然而,本领域技术人员知道许多信号肽(例如地衣芽孢杆菌淀粉酶信号肽),这些信号肽可以根据要在宿主生物中表达和分泌的蛋白质来使用。
F.DNA构建体和载体
包含感兴趣的编码区的本发明的核酸构建体可以通过已建立的标准方法来合成制备,例如由Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Letters[四面体快报],22:1859-1869,或由Matthes等人,(1984)EMBO Journal[欧洲分子生物学组织杂志],3:801-805描述的亚磷酰胺方法。核酸构建体可以是混合的合成和基因组来源,并且可以通过连接合成或基因组DNA的片段来制备。也可以通过聚合酶链式反应使用特异性引物来制备核酸构建体,例如美国专利号4,683,202或Saiki等人,在Science[科学]239(1988),487-491中所述。
可以将本发明的DNA构建体插入载体(例如表达载体)中。适合于在真菌、酵母和细菌中克隆、转化和表达多肽的各种载体是本领域技术人员已知的。通常,载体或盒将包含本发明的启动子,任选地包含信号序列、感兴趣的编码区和终止子序列。在优选的实施例中,载体将包括位于信号序列和终止子序列之间的一个或多个克隆位点。
G.转化
本发明的载体将被转化到宿主细胞中。一般转化技术是本领域已知的(Ausubel等人,1994,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY[现代分子生物学实验技术]和Campbell等人,1989,Curr.Genet[现代遗传学],16:53-56)。这些一般技术中的一些包括但不限于使用颗粒或基因枪(基因枪法),在转化过程之前丝状真菌细胞壁的透化(例如,通过使用高浓度的碱,例如0.05M至0.4M CaCl2或乙酸锂),原生质体融合,电穿孔或农杆菌介导的转化(美国专利号6,255,115)并且用聚乙二醇和CaCl.sub.2处理原生质体或原生质球的方法描述于Campbell等人(1989),Curr.Genet.[现代遗传学],16:53-56,1989和Penttila,M.等人,(1988)Gene[基因],63:11-22。
Brigidi、DeRossi、Bertarini、Riccardi和Matteuzzi,(1990),于FEMSMicrobiol.Lett.[欧洲微生物学会联合会微生物学快报],55:135-138中公开了细菌的转化和表达方法。在Ferrari等人的美国专利号5,264,366中提供了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的优选的一般转化和表达方案。
链霉菌中的转化和表达可以在Hopwood等人,GENETIC MANIPULATION OFSTREPTOMYCES:A LABORATORY MANUAL[链霉菌的遗传操作:实验室手册](1985)John InnisFoundation[约翰·英尼斯基金会],英国诺维奇中找到。
在其他实施例中,曲霉属和木霉属中的转化和表达见描述于例如美国专利号5,364,770;美国专利号6,022,725;和Nevalainen等人,1992,The Molecular Biology ofTrichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous andHeterologous Genes[木霉及其在同源和异源基因的表达中应用的分子生物学],MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY[分子工业真菌学],Leon和Berka主编,马塞尔德克尔公司,第129-148页中。
H.宿主细胞
可根据本发明使用的宿主细胞包括细菌和真菌细胞。优选的真菌宿主细胞包括丝状真菌细胞,例如曲霉属和木霉属细胞。优选的细菌宿主细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞,包括芽孢杆菌、分支杆菌、放线菌和链霉菌属细胞。宿主细胞还包括但不限于:大肠杆菌、假单胞菌属(例如,铜绿假单胞菌和产碱假单胞菌)、链霉菌属(例如,变色青链霉菌)、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
I.细胞培养
可以在常规营养培养基中培养宿主细胞和转化细胞。用于转化的宿主细胞的培养基可以适当地修饰以激活启动子并选择转化体。特定培养条件(如温度、pH等)可以是用于选择用于表达的宿主细胞的那些条件,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。此外,优选的培养条件可以在诸如Sambrook,(1982)同上,Kieser,T、M J.Bibb、M J.Buttner、KFChater、和DA Hopwood(2000),PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS[实用链霉菌属遗传学],John Innes Foundation[约翰·内斯基金会],英国诺维奇,Harwood等人,(1990),MOLECULAR BIOLOGICAL METHODS FOR BACILLUS[芽孢杆菌的分子生物学方法],约翰威利公司和/或来自美国典型培养物保藏中心(ATCC,“http://www.atcc.org/”))的科学文献中找到。真菌宿主细胞(如木霉属细胞)的稳定转化体通常可以通过其较快的生长速度或者在固体培养基上形成具有光滑而不是粗糙轮廓的圆形菌落来与不稳定转化体区分开来。
J.表达多肽的回收
可以通过常规方法从培养基中回收由转化的宿主细胞产生的多肽,包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞,或者如果需要,破坏细胞并从细胞部分和碎片中除去上清液。通常经过澄清后,上清液或滤液的蛋白质组分通过盐(例如硫酸铵)沉淀。然后沉淀的蛋白质被溶解,并且可以通过各种色谱法进行纯化,例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲和色谱法和其他本领域公认的程序。
K.构建体组装
在一个一般的实施例中,本发明涉及在体外组装DNA构建体,然后将这种构建体直接克隆到感受态宿主细胞(例如,芽孢杆菌宿主细胞)中,使得构建体整合到宿主基因组中。例如,在一些实施例中,使用PCR融合和/或连接在体外组装DNA构建体。在优选的实施例中,DNA构建体是非质粒DNA构建体。在另一个实施例中,DNA构建体包含其中已引入突变的DNA。然后将该构建体用于转化宿主细胞。在这方面,优选使用宿主细胞(例如,芽孢杆菌)的高度感受态的突变体来促进构建体直接克隆到细胞中。例如,携带在木糖诱导型启动子(Pxyl-comK)控制下的ocmK基因的芽孢杆菌可以以非常高的效率被可靠地转化,如本文所述。可以使用本领域已知的任何合适的方法来转化细胞。在转化前可将DNA构建体插入载体(即,质粒)中。在一些优选的实施例中,使用适当的限制酶(即,不破坏DNA构建体的限制酶)来切割环状质粒。因此,在一些实施例中,环形质粒可用于本发明。然而,在替代性实施例中,使用线性质粒。在一些实施例中,在不存在质粒DNA的情况下使用DNA构建体(即,PCR产物)。
为了进一步说明本发明及其优点,给出以下具体实例是为了说明本发明而提供的,不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
无论DNA构建体是否并入到载体中或者在质粒DNA的不存在下使用,将其用于转化微生物。据预期,任何合适的转化方法将用于本发明。在实施例中,将DNA构建体的至少一个拷贝整合到宿主芽孢杆菌染色体中。在一些实施例中,使用本发明的一种或多种DNA构建体转化宿主细胞。
实验
提供以下实例以便证实和进一步说明本发明的某些实施例和方面,而不应被解释为限制其范围。
在下面的实验披露中,应用以下缩写中的某些:℃(摄氏度);rpm(每分钟转数);μg(微克);mg(毫克);μl(微升);ml(毫升);mM(毫摩尔);μM(微摩尔);sec(秒);min(s)(分钟);hr(s)(小时);OD280(在280 nm处的光密度);OD600(在600 nm处的光密度);PCR(聚合酶链反应);RT-PCR(逆转录PCR);SDS(十二烷基硫酸钠);Abs(吸光度)。
实例1
通过aprE 5'UTR改善地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)的产量
将包含具有天然LAT启动子、LAT 5’UTR、LAT信号肽序列和LAT转录终止子的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)基因的表达构建体克隆进US 7968691中描述的pICatH载体的Xhol位点上。LAT表达盒(XhoI片段)显示在SEQ ID NO:1中。
LAT前体基因用斜体显示,而LAT 5'UTR以粗体显示(SEQ ID NO:1)。
将pICatH-LATori1质粒(见图1)转化到地衣芽孢杆菌菌株BML780的基因组中,如美国专利号7,968,691所述。切除后,扩增表达盒至50 ppm氯霉素被证明是LAT 5'UTR菌株中LAT产生的最佳选择。
通过融合PCR技术,将pICatH-LATori1中的LAT 5'UTR替换为枯草芽孢杆菌aprE5'UTR。在5’端具有另外的鸟嘌呤的枯草芽孢杆菌aprE 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
GACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGA
带有aprE 5'UTR(XhoI-NotI片段)的LAT表达盒显示于SEQ ID NO:3中。LAT前体基因用斜体字显示,而aprE-5'UTR以粗体显示:
含有与aprE-5'UTR融合的LAT(即地衣芽孢杆菌AmyL)基因的pICatH质粒被转化并整合到如上所述的菌株BML780的基因组中。切除后,扩增至25ppm的氯霉素被证明是在aprE-5'UTR菌株LAT生产中的最佳选择。
通过在生产培养基(每升:10g淀粉、10g大豆胨、10g大豆粉、20g葡萄糖、3.6g尿素、0.75g CaCl2.2H2O、21.75g K2HPO4、17g KH2PO4、MOPS缓冲液,微量营养素;pH为6.8)中生长两种菌株来比较通过菌株BML780-LAT-CAP50(LAT 5'UTR)的LAT生产和BML780-[aprE-5’UTR]-LAT-CAP25(aprE 5’UTR)的生产。在Infors孵育器(37℃,300rpm)中生长68小时后,根据供应商(梅格泽姆国际公司(Megazyme International),爱尔兰)的指示,使用梅格泽姆公司(Megazyme)α-淀粉酶测定试剂盒,使用Ceralpha作为底物测定上清液中的LAT活性。活性的相对数量(即生产率)如表3所示。
表3
在LAT 5'UTR菌株中对比在aprE 5’UTR菌株中LAT的产生
LAT 5'UTR | aprE 5'UTR | |
LATα淀粉酶 | 100 | 119 |
实例2
通过aprE 5’UTR提高支链淀粉酶PULm104的产量
PULM104是Bacillus deramificans支链淀粉酶,其N-端104个氨基酸已被缺失。产生PULm104的地衣芽孢杆菌菌株的构建在US 8354101中作了描述。US 8354101中描述的最佳生产菌株是BML780-PULm104-Ori1-CAP75,其含有amyL(LAT)5'UTR。
该amyL(LAT)5'UTR被如下列的aprE 5'UTR替换。首先,质粒pHPLT-Blich-int-盒由DNA2.0 Inc.[DNA2.0公司](美国加利福尼亚州门洛帕克)合成地构建。该质粒的设计基于载体pHPLT(US 5871550)、载体pICatH(US 8354101)和来自枯草芽孢杆菌的aprE 5'UTR、UTR V2或UTR V3(下表列出序列)。载体pHPLT-Blich-int-盒的图谱示于图2中。
5'aprE UTR-PULm104表达盒的DNA序列如下所示(5'UTR加了下划线)(SEQ ID NO:11):
CTCGAGGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCTTCAGCAGCTGCTAAACCGGCAGTCAGCAACGCTTATCTGGATGCCAGCAACCAAGTCCTGGTCAAACTGAGCCAACCGCTGACACTTGGAGAAGGAGCGAGCGGATTTACGGTCCATGATGACACGGCGAACAAAGATATCCCGGTCACGAGCGTTAAAGATGCTAGCCTGGGCCAAGATGTCACAGCAGTTCTGGCGGGCACGTTTCAACATATCTTTGGCGGATCAGATTGGGCACCGGATAATCACAGCACGCTGCTGAAAAAAGTCACGAACAACCTGTATCAGTTTAGCGGAGATCTGCCGGAAGGCAACTATCAATATAAAGTCGCCCTGAACGATAGCTGGAACAATCCGAGCTATCCGAGCGATAACATCAATCTGACAGTCCCGGCAGGCGGAGCACATGTCACGTTTAGCTATATCCCGAGCACACATGCCGTCTATGACACGATCAACAACCCGAACGCCGATCTTCAAGTCGAAAGCGGCGTCAAAACGGATCTGGTCACAGTCACATTGGGAGAAGATCCGGATGTCAGCCATACACTGAGCATCCAAACGGATGGCTATCAAGCGAAACAAGTCATCCCGAGAAACGTCCTGAACAGCAGCCAGTATTATTATAGCGGCGATGATCTGGGCAACACGTATACACAAAAAGCGACGACGTTTAAAGTTTGGGCGCCGACAAGCACACAAGTCAACGTCCTGCTGTATGATTCAGCAACAGGCAGCGTCACAAAAATCGTCCCGATGACAGCATCAGGACATGGAGTCTGGGAAGCGACGGTCAACCAAAACCTGGAAAACTGGTATTATATGTATGAAGTCACGGGCCAAGGATCAACAAGAACAGCGGTCGATCCGTATGCTACAGCAATCGCCCCGAATGGAACAAGAGGCATGATCGTCGATCTGGCAAAAACAGACCCGGCAGGCTGGAATAGCGATAAACATATCACGCCGAAAAACATCGAAGATGAAGTCATCTATGAAATGGACGTCCGGGATTTTAGCATCGATCCGAACAGCGGCATGAAAAACAAAGGCAAATATCTGGCGCTGACGGAAAAAGGAACAAAAGGCCCGGATAACGTCAAAACAGGCATCGATAGCCTGAAACAACTGGGCATCACACATGTCCAACTGATGCCGGTCTTTGCTAGCAATAGCGTCGATGAAACGGACCCGACACAAGATAACTGGGGCTATGACCCGAGAAATTATGATGTCCCGGAAGGCCAATATGCCACGAACGCCAATGGAAACGCCCGGATCAAAGAATTTAAAGAAATGGTCCTGAGCCTTCATAGAGAACATATCGGCGTCAACATGGACGTCGTCTATAACCATACGTTTGCCACACAGATCAGCGACTTTGATAAAATCGTGCCGGAATATTATTATCGGACGGATGACGCCGGCAATTATACGAATGGCAGCGGCACAGGAAATGAAATCGCCGCCGAAAGACCGATGGTCCAGAAATTTATCATCGACAGCCTTAAATATTGGGTCAACGAATATCATATCGACGGCTTTCGCTTTGATCTGATGGCGCTGCTGGGCAAAGATACAATGAGCAAAGCGGCGAGCGAACTTCATGCTATCAATCCGGGCATCGCTCTTTATGGAGAACCGTGGACAGGAGGAACATCAGCACTGCCGGATGATCAACTGCTGACAAAAGGCGCCCAAAAAGGAATGGGAGTCGCCGTCTTTAACGACAACCTGAGAAATGCCCTGGATGGCAACGTTTTTGATAGCAGCGCCCAAGGATTTGCTACAGGAGCGACAGGACTGACAGATGCCATCAAAAATGGCGTCGAAGGCAGCATCAACGATTTTACAAGCAGCCCGGGAGAGACGATCAATTATGTCACGAGCCATGACAACTATACGCTGTGGGACAAAATCGCTCTGAGCAACCCGAATGATAGCGAAGCGGACCGGATCAAAATGGATGAACTGGCACAAGCAGTCGTCATGACATCACAAGGCGTCCCGTTTATGCAAGGCGGAGAAGAAATGCTGAGAACGAAAGGCGGCAACGACAACAGCTATAATGCCGGCGATGCCGTCAATGAATTTGACTGGAGCCGGAAAGCACAATATCCGGACGTCTTTAACTATTATTCAGGACTTATCCATCTGAGACTGGACCATCCGGCGTTTAGAATGACGACGGCGAACGAAATCAACAGCCATCTTCAGTTTCTGAACAGCCCGGAAAATACGGTCGCCTATGAACTGACGGACCATGTGAACAAAGACAAATGGGGCAACATCATCGTCGTTTATAACCCGAACAAAACGGTCGCCACAATCAATCTTCCGAGCGGCAAATGGGCAATCAATGCCACAAGCGGCAAAGTTGGAGAAAGCACACTGGGACAAGCAGAAGGATCAGTCCAAGTCCCGGGAATCAGCATGATGATCCTTCATCAAGAAGTCAGCCCGGACCACGGCAAAAAATAAGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTAAGCTTGGAGACAAGGTAAAGGATAAAACAGCTGCGGCCGC(SEQ ID NO:11)
接下来,使用pHPLT-Blich-int-盒(1ng/μl)作为模板,用引物PULm104-载体-RV(CGGTTTAGCAGCTGCGCTAGCTGCAGAATGAGGC(SEQ ID NO:4))和PULm104-载体-FW(CGGCAAAAAATGAAAGCTTCTCGAGGTTAACAGAGG(SEQ ID NO:5))进行PCR。使用BML780-PULm104-Ori1-CAP75的细胞材料作为模板,用引物PulM104-Assbl.-FW(CAGCTAGCGCAGCTGCTAAACCGGCAGTCAGCAAC(SEQ ID NO:6))和PulM104-Assbl.-RV(CGAGAAGCTTTCATTTTTGCCGTGGTCCGGGCTG(SEQ ID NO:7))进行第二次PCR。两种PCR均按照NEB Q5标准方案进行,26个循环。
将柱状纯化的PULm104片段首先用HindIII(NEB)完全水解,然后通过NheI(NEB)部分水解。载体片段也进行柱纯化,并用NheI和HindIII完全水解。再次纯化载体和PULm104水解混合物,然后使用Roche T4快速连接试剂盒(#11635379001)进行连接。在RCA扩增(来自GE Healthcare Life Sciences[通用电气医疗集团生命科学部]的TempliPhi DNA扩增试剂盒)后,将RCA产物转化为活性枯草芽孢杆菌细胞,铺在含有5ppm氯霉素和10ppm新霉素的心输液琼脂(Difco)上,并在37℃下孵育过夜。第二天,在具有5ppm氯霉素和10ppm新霉素的新鲜心脏输液琼脂平板上重复地将来自转化板的24cfu的复制,并孵育过夜。第二天早晨,用含有在100mM的NaAc pH 5中的0.1%AZCL-支链淀粉的1%琼脂覆盖板。将板在37℃下孵育3小时,从复制板中挑取阳性(支链淀粉酶阳性),并在含有5ppm氯霉素和10ppm新霉素的10ml TSB中生长。将2ml培养物用于制备质粒DNA,并将30μl DNA制备物用NotI和ApaI进行水解。从凝胶中纯化含有5'-重复-catH-PULm104表达盒的4Kb片段,并自连接(T4连接酶Roche),扩增RCA并转化进地衣芽孢杆菌菌株BML780中。在选择含有7.5ppm氯霉素的心输液琼脂后,如上所述,使用AZCL-支链淀粉覆盖法检查转化体的支链淀粉酶活性。通过DNA测序(BaseClear,荷兰)证实了4个支链淀粉酶阳性克隆中表达盒的序列。如US 8354101中所述扩增表达盒。对于在aprE 5’UTR菌株中支链淀粉酶的生产,扩增至25ppm的氯霉素被证明是最佳的,并且BML780-[aprE-5’UTR]-PULm104-Ori1-CAP25菌株被用于进一步的研究中。
通过在生产培养基中生长两种菌株来比较通过菌株BML780-PULm104-Ori1-CAP75(LAT 5'UTR)的PULm104的生产与BML780-[aprE 5'UTR]-PULm104-Ori1-CAP25(aprE 5'UTR)的生产(参见实例1)。在Infors孵化器(300ppm,37℃)生长68小时后,根据供应商(梅格泽姆国际公司(Megazyme International),爱尔兰)的说明,用梅格泽姆公司(Megazyme)支链淀粉酶测定法,使用红色支链淀粉作为底物测定上清液中的支链淀粉酶活性。活性的相对数量(即生产率)如表4所示。5'aprE UTR的版本2和3表现出可比较的蛋白质产量。
表4
在LAT 5'UTR菌株中对比在aprE 5'UTR菌株中PULm104的生产
LAT 5'UTR | aprE 5'UTR | |
PULm104 | 100 | 129 |
实例3
利用具有核糖体RNA启动子的aprE 5'UTR的感兴趣的蛋白质的改善的生产
将包含核糖体RNA启动子(例如,P1 rrnB、P1 rrnI、P2 rrnI、P1 rrnE、P2 rrnE或P3 rrnE)或核糖体蛋白质启动子(例如,PrpsD、P1 rpsJ、P2 rpsJ)或σ因子启动子(例如PrpoD)、aprE 5'UTR、如本文所述的合适的信号序列(例如,LAT、aprE、CBH1、链霉菌纤维素酶基因信号序列)、本文所述的合适的感兴趣的基因和转录终止子的表达构建体克隆到合适的载体(例如,pICatH)的合适的限制性位点(例如,XhoI)。表达盒示于SEQ ID NO:12和13中。
将含有感兴趣的基因的质粒载体转化并整合到合适的细菌菌株的基因组中(例如,如上所述的菌株BML780)。
通过在生产培养基(每升:10g淀粉、10g大豆胨、10g大豆粉、20g葡萄糖、3.6g尿素、0.75g CaCl2.2H2O、21.75g K2HPO4、17g KH2PO4、MOPS缓冲液,微量营养素;pH为6.8)中培养菌株来比较通过细菌菌株的感兴趣的蛋白质的生产和各种对照菌株。在Infors培养箱(37℃,300 rpm)中生长68小时后,测定上清液中的蛋白质活性。
该rrnI P2启动子(来自枯草芽孢杆菌)显示为小写字母。该aprE 5'UTR以黑体和 下划线显示。成熟的编码链用斜体显示。终止密码子以粗体显示。具有转录终止子的序列加下划线。
rrnI P2启动子-aprE 5'UTR-LAT信号肽-成熟LAT表达构建体如下所示(SEQ IDNO:12):
rrnI P2启动子-aprE 5'UTR-LAT信号肽-成熟PULm104表达构建体如下所示(SEQID NO:13):
实例4
使用aprE 5’UTR和其变体的嗜热脂肪土芽孢杆菌淀粉酶变体的改善的生产
在标准地衣芽孢杆菌整合载体,含有LAT(地衣芽孢杆菌AmyL)启动子下游嗜热脂肪土芽孢杆菌(AmyS)变体基因的pKB360-CatH中,LAT 5'-UTR序列由AprE-WT 5'-UTR和AprE-V2-5'-UTR或AprE-V3-5'-UTR替代(参见图3的通用质粒图谱)。表达盒的序列如下所示。
LAT启动子以小写字母显示,该aprE 5'UTR在粗体和下划线显示,LAT信号肽以小写字母和下划线显示,AmyS变体的成熟链是用斜体显示,终止密码子是以粗体显示,具有转录终止子的序列是以下划线显示。
LAT启动子-aprE 5'UTR-LAT信号肽-成熟AmyS变体(SEQ ID NO:14):
LAT启动子-V2_5'UTR-LAT信号肽-成熟AmyS变体(SEQ ID NO:15):
LAT启动子-V3_5'UTR-LAT信号肽-成熟AmyS变体(SEQ ID NO:16)
转化后,将质粒整合到地衣芽孢杆菌染色体的cat位点上。随后,通过切除载体序列获得‘环出’菌株,仅将整合到染色体中的cat-LAT-5'-UTR-AmyS变体表达盒除外。然后通过使菌株逐渐增加氯霉素浓度来扩增表达盒(cap5、cap25、cap50、cap75μ克/毫升)中。测定分泌的淀粉酶活性,如表5所示。
表5
此外,在扩增后测量表达盒的拷贝数,并与淀粉酶产生比较,并且总结在表6中。
表6
相对分泌淀粉酶活性和表达盒的拷贝数
因此,可以看出,包含aprE 5'UTR或其变体的表达盒需要较低量的氯霉素浓度以实现与LAT 5'UTR相当的淀粉酶生产和分泌。换句话说,需要较少的扩增来实现更高的表达效价。
虽然前述组合物和方法已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述,但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文的传授内容显而易见的是可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
因此,前面仅仅举例说明了本发明组合物和方法的原理。将了解的是本领域技术人员将能够设计不同的安排,这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示,但体现本发明组合物和方法的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外,本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解诸位发明人所贡献的本发明的组合物和方法的原理和概念以推动本领域发展,并且将被视为而不限于这些具体叙述的实例和条件。此外,本文中叙述本发明组合物和方法的原理、方面、以及实施例的所有陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外,预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者,即不论结构如何而执行相同功能的任何开发的要素。因此,本发明的组合物和方法的范围不是旨在受限于本文显示和描述的示例性实施例。
Claims (34)
1.一种DNA分子,该DNA分子在5'至3'方向上包含与编码感兴趣的基因(GOI)的核酸序列可操作地连接的5'非翻译区(5'UTR)核酸序列,其中该5'UTR衍生自芽孢杆菌属物种aprE蛋白酶基因并且其中该5'UTR与其中该5'UTR可操作连接的GOI是异源的。
2.如权利要求1所述的DNA分子,其中该5'UTR衍生自来自枯草芽孢杆菌的aprE基因。
3.如权利要求1所述的DNA分子,其中该5'UTR包含与SEQ ID NO:9具有至少90%序列同一性的序列。
4.如权利要求1所述的DNA分子,其中该5'UTR包含与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的序列。
5.如权利要求1所述的DNA分子,其中该5'UTR包含与SEQ ID NO:10具有至少90%序列同一性的序列。
6.如权利要求1所述的DNA分子,其中该5'UTR包含与SEQ ID NO:17具有至少90%序列同一性的序列。
7.一种表达盒,包含如权利要求1所述的DNA分子。
8.一种宿主细胞,包含如权利要求7所述的表达盒。
9.一种载体,包含如权利要求1所述的DNA分子。
10.一种宿主细胞,包含如权利要求9所述的载体。
11.一种宿主细胞,包含如权利要求1所述的DNA分子。
12.根据权利要求8、10或11中任一项所述的宿主细胞,其中该宿主细胞属于芽孢杆菌属物种。
13.如权利要求12所述的宿主细胞,其中该芽孢杆菌属物种选自下组,该组由以下各项组成:地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、灿烂芽胞杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
14.如权利要求13所述的宿主细胞,其中该芽孢杆菌属物种是地衣芽孢杆菌。
15.如权利要求1所述的DNA分子,其中该感兴趣的基因编码酶。
16.如权利要求15所述的DNA分子,其中该感兴趣的基因编码野生型芽孢杆菌属物种的酶或变体芽孢杆菌属物种的酶。
17.如权利要求15所述的DNA分子,其中该酶选自下组,该组由以下各项组成:酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。
18.如权利要求15所述的DNA分子,其中该酶是淀粉酶或支链淀粉酶。
19.一种DNA分子,该DNA分子包含与选自下组的序列具有90%序列同一性的序列,该组由以下各项组成:SEQ ID NO:3和11-16。
20.一种DNA分子,该DNA分子包含选自下组的序列,该组由以下各项组成:SEQ ID NO:3和11-16。
21.一种用于增加感兴趣的蛋白质在芽孢杆菌属宿主细胞中的表达的方法,该方法包括:使修饰的芽孢杆菌属宿主细胞在合适的培养基中生长以表达该感兴趣的蛋白质;其中将该修饰的芽孢杆菌属宿主细胞用包含表达盒的载体进行转化,该表达盒在5’至3’方向上至少包含(i)衍生自芽孢杆菌属物种的aprE-5’UTR和(ii)编码感兴趣的蛋白质的核酸序列;其中与从亲本芽孢杆菌属宿主细胞中表达的感兴趣的蛋白质的表达相比,该相同的感兴趣的蛋白质的表达增加了至少5%,该亲本芽孢杆菌属宿主细胞不包含可操作地连接到编码该感兴趣的蛋白质的核酸序列上的aprE-5’UTR。
22.一种使用不超过50ppm的氯霉素用于扩增在修饰的芽孢杆菌属宿主细胞中增加感兴趣的蛋白质的表达的方法,该方法包括:使修饰的芽孢杆菌属宿主细胞在合适的培养基中生长以表达该感兴趣的蛋白质;其中将该修饰的芽孢杆菌属宿主细胞用包含表达盒的载体进行转化,该表达盒在5’至3’方向上包含(i)衍生自芽孢杆菌属物种的aprE-5’UTR和(ii)编码该感兴趣的蛋白质的核酸序列;其中与从亲本芽孢杆菌属宿主细胞中表达的感兴趣的蛋白质的表达相比,该相同的感兴趣的蛋白质的表达增加至少5%,该亲本芽孢杆菌属宿主细胞不包含可操作地连接到编码该感兴趣的蛋白质的核酸序列上的aprE-5’UTR。
23.如权利要求21或22所述的方法,其中该aprE 5'-UTR衍生自枯草芽孢杆菌。
24.如权利要求21或22所述的方法,进一步包含来自核糖体RNA基因的启动子。
25.如权利要求24所述的方法,其中该核糖体RNA基因启动子选自下组,该组由以下各项组成:P1rrnB、P1rrnI、P2rrnI、P1rrnE、P2rrnE和P3rrnE。
26.如权利要求21或22所述的方法,进一步包含来自核糖体蛋白质基因的启动子。
27.如权利要求26所述的方法,其中该核糖体蛋白质基因启动子选自下组,该组由以下各项组成:PrpsD、P1rpsJ、P2rpsJ和PrpoD。
28.如权利要求21或22所述的方法,进一步包含来自LAT(AmyL)基因的启动子。
29.如权利要求21或22所述的方法,进一步包括从培养基中回收该感兴趣的蛋白质。
30.如权利要求21或22所述的方法,其中该感兴趣的蛋白质由细菌分泌。
31.如权利要求21或22所述的方法,其中该感兴趣的蛋白质在细菌中积聚。
32.如权利要求21或22所述的方法,其中该感兴趣的蛋白质是野生型芽孢杆菌属物种的酶或变体芽孢杆菌属物种的酶。
33.如权利要求21或22所述的方法,其中该感兴趣的蛋白质是选自下组的酶,该组由以下各项组成:酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂肪氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、多半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶和木糖苷酶。
34.如权利要求32所述的方法,其中该酶是淀粉酶或支链淀粉酶。
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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