CN107278230A - 增强的蛋白质表达 - Google Patents
增强的蛋白质表达 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107278230A CN107278230A CN201580076140.XA CN201580076140A CN107278230A CN 107278230 A CN107278230 A CN 107278230A CN 201580076140 A CN201580076140 A CN 201580076140A CN 107278230 A CN107278230 A CN 107278230A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus
- cell
- change
- expression
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/13—Protein-histidine kinases (2.7.13)
- C12Y207/13003—Histidine kinase (2.7.13.3)
Abstract
本发明总体上涉及具有导致感兴趣的蛋白质的表达增加的遗传改变的细菌细胞,以及制造和使用此类细胞的方法。本发明的方面包含具有遗传改变的革兰氏阳性微生物,如芽孢杆菌属的成员,该遗传改变延迟、降低、或阻断用于孢子形成的基因的表达或激活,从而导致感兴趣的蛋白质表达的增强。该遗传改变是降低kinA基因、phrA基因或phrE基因的表达的遗传改变。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求在35U.S.C.§119下于2014年12月19日提交的美国临时专利申请号62/094,751的优先权,其整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及具有导致感兴趣的蛋白质的表达增加的遗传改变的细菌细胞,以及制造和使用此类细胞的方法。本发明的方面包括具有遗传改变的革兰氏阳性微生物,如芽孢杆菌属的成员,该遗传改变延迟、降低、或阻断用于孢子形成的基因的表达或激活,从而导致感兴趣的蛋白质的表达增强。遗传改变的实例包括降低KinA、PhrA、和/或PhrE的表达或活性的那些。
序列表的引用
命名为NB40522-WO-PCT_SequenceListing.txt的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2015年11月30日,并且大小为18KB,通过引用并入本文。
本发明的背景
遗传工程已经允许改进在食品发酵中用作工业生物反应器和细胞工厂的微生物。包括多个芽孢杆菌物种的革兰氏阳性生物体被用于产生大量有用的蛋白质和代谢产物(参见,例如,Zukowski,“Production of commercially valuable products,”In:Doi andMcGlouglin(eds.)Biology of Bacilli:Applications to Industry,Butterworth-Heinemann,Stoneham.Mass pages 311-337,1992[Zukowski,“有商业价值的产品的生产”,在:Doi和McGlouglin(编辑)杆菌生物学:工业应用,巴特沃思-海涅曼出版公司(Butterworth-Heinemann),斯通哈姆,马萨诸塞州,第311-337页,1992中])。工业中使用的常见芽孢杆菌属物种包括地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。由于其GRAS(通常被认为是安全的)状态,这些芽孢杆菌属物种的菌株是用于生产用于食品和制药工业的蛋白质的天然候选物。在革兰氏阳性生物体中产生的蛋白质的实例包括酶,例如α-淀粉酶、中性蛋白酶、和碱性(或丝氨酸)蛋白酶。
尽管对细菌宿主细胞中蛋白质的生产的理解有所进展,但是仍然需要开发新的表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组菌株。
发明概述
本发明提供表达增加水平的感兴趣的蛋白质的重组革兰氏阳性细胞及其制备和使用方法。特别地,本发明涉及具有遗传改变的细菌细胞,与不具有遗传改变的细菌细胞相比,所述遗传改变导致感兴趣的蛋白质的表达增加。因此,本发明的方面包括革兰氏阳性微生物,如芽孢杆菌属的成员,这些革兰氏阳性微生物包含降低用于激活磷酸化途径的基因的表达的遗传改变(例如,参见图5中磷酸化途径原理图)并且从而导致感兴趣的蛋白质(下文称为“POI”)的表达增强。还提供了制备和使用这些重组细菌细胞的方法。
本发明的方面包括用于从革兰氏阳性细菌细胞增加POI的表达的方法,这些方法包括:(a)获得产生POI的经改变的革兰氏阳性细菌细胞,其中该经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达或活性的至少一个遗传改变,并且(b)在表达POI的条件下培养所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞,其中在基本上相同的培养条件下,该POI的增加的表达是相对于未经改变的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的表达而言的。在某些实施例中,降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达或活性的遗传改变是kinA基因、phrA基因和/或phrE基因的遗传改变。
在某些其他实施例中,该经改变的革兰氏阳性细胞源自具有一个或多个有缺陷或无活性的孢子形成基因(例如,其表达受Spo0A控制或在Spo0A下游的基因)的亲本细胞,并且因此已防止形成孢子。例如,申请人已经观察到,即使在这种非孢子形成的遗传背景下,降低激活磷酸化途径(即,控制孢子形成起始基因表达的基因)的一种或多种蛋白质的表达或活性的另外的遗传改变增加了POI从细胞中的表达。因此,本披露的遗传改变的(子代)细胞中蛋白质表达/产生的改进不仅仅是因为防止革兰氏阳性细胞的孢子形成。例如,本披露的经改变的革兰氏阳性(子代)细胞源自于其的亲本革兰氏阳性细胞可以具有非功能性孢子形成基因、突变孢子形成基因、缺失孢子形成基因等(例如,参见实例部分,其中使用孢子形成缺陷型芽孢杆菌属细胞)。
在某些实施例中,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员(例如,芽孢杆菌属细胞选自下组,该组由以下各项组成:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))。在某些实施例中,该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在某些实施例中,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞进一步包含选自下组基因中的突变,该组由以下各项组成:degU、degQ、degS、scoC4等。在某些实施例中,突变为degU(Hy)32。
在某些实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性(亲本)细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性(子代)细菌细胞中kinA、phrA、和phrE基因中一个或多个的表达水平的降低。因此,该遗传改变可导致kinA、phrA、和phrE基因中任一个;kinA、phrA、和phrE基因中任两个;或kinA、phrA、和phrE基因中所有三个的表达水平的降低。在其他实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中KinA、PhrA、和PhrE蛋白中一种或多种的活性的降低。因此,该遗传改变可导致KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任一种;KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任两种;或KinA、PhrA、和PhrE蛋白中所有三种的活性的降低。
在某些实施例中,野生型kinA基因的序列与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性,野生型phrA基因的序列与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性,并且野生型phrE基因的序列与SEQ ID NO:8具有至少60%同一性。在某些实施例中,野生型KinA蛋白的序列与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性,野生型PhrA蛋白的序列与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性,并且野生型PhrE蛋白的序列与SEQ ID NO:9具有至少80%同一性。在某些实施例中,该遗传改变是kinA、phrA、和phrE基因中的一个或多个的全部或部分的缺失。
在某些实施例中,该POI是同源蛋白质。在某些实施例中,该POI是异源蛋白质。在某些实施例中,该POI是酶。在某些实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、异构酶、转移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
在某些其他实施例中,该POI是蛋白酶。在某些实施例中,该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在某些其他实施例中,枯草杆菌蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147,枯草杆菌蛋白酶309、及其变体。
在某些实施例中,该方法进一步包括分离并回收该POI。在又其他实施例中,将该分离并回收的POI进一步纯化。
本发明的方面包括经改变的革兰氏阳性细菌细胞,其中与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达或活性的至少一个遗传改变,该磷酸化途径诱导孢子形成起始基因的表达。在某些实施例中,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。在某些实施例中,该芽孢杆菌属细胞选自下组,该组由以下各项组成:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。在某些其他实施例中,该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在某些实施例中,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞进一步包含选自下组基因中的突变,该组由以下各项组成:degU、degQ、degS、scoC4等。在某些实施例中,突变为degU(Hy)32。
在某些实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中kinA、phrA、和phrE基因中一个或多个的表达水平的降低。因此,该遗传改变可导致kinA、phrA、和phrE基因中任一个;kinA、phrA、和phrE基因中任两个;或kinA、phrA、和phrE基因中所有三个的表达水平的降低。在其他实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中KinA、PhrA、和PhrE蛋白中一种或多种的活性的降低。因此,该遗传改变可导致KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任一种;KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任两种;或KinA、PhrA、和PhrE蛋白中所有三种的活性的降低。
在某些实施例中,野生型kinA基因的序列与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性,野生型phrA基因的序列与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性,并且野生型phrE基因的序列与SEQ ID NO:8具有至少60%同一性。在某些实施例中,野生型KinA蛋白的序列与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性,野生型PhrA蛋白的序列与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性,并且野生型PhrE蛋白的序列与SEQ ID NO:9具有至少80%同一性。在某些实施例中,该遗传改变是kinA、phrA、和phrE基因中的一个或多个的全部或部分的缺失。
在某些实施例中,该经改变的细胞表达POI。在某些实施例中,该POI是同源蛋白质。在某些实施例中,该POI是异源蛋白质。在某些实施例中,该POI是酶。
在某些实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、异构酶、转移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。在其他实施例中,该POI是蛋白酶。在某些实施例中,该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在某些实施例中,该枯草杆菌蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309、及其变体。
在某些实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中kinA、phrA、和phrE基因中一个或多个的表达水平的降低。因此,该遗传改变可导致kinA、phrA、和phrE基因中任一个;kinA、phrA、和phrE基因中任两个;或kinA、phrA、和phrE基因中所有三个的表达水平的降低。在其他实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中KinA、PhrA、和PhrE蛋白中一种或多种的活性的降低。因此,该遗传改变可导致KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任一种;KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任两种;或KinA、PhrA、和PhrE蛋白中所有三种的活性的降低。
在某些实施例中,野生型kinA基因的序列与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性,野生型phrA基因的序列与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性,并且野生型phrE基因的序列与SEQ ID NO:8具有至少60%同一性。在某些实施例中,野生型KinA蛋白的序列与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性,野生型PhrA蛋白的序列与SEQ ID NO:7具有至少80%同一性,并且野生型PhrE蛋白的序列与SEQ ID NO:9具有至少80%同一性。在某些实施例中,该遗传改变是kinA、phrA、和phrE基因中的一个或多个的全部或部分的缺失。
在某些实施例中,所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞表达感兴趣的蛋白质。在某些实施例中,该方法进一步包括将编码所述感兴趣的蛋白质的表达盒引入所述亲本革兰氏阳性细菌细胞中。在某些实施例中,该方法进一步包括将编码所述感兴趣的蛋白质的表达盒引入所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞中。在某些实施例中,该感兴趣的蛋白质是同源蛋白质。在某些实施例中,该感兴趣的蛋白质是异源蛋白质。在某些实施例中,该感兴趣的蛋白质是酶。在某些实施例中,该酶选自下组,该组由以下各项组成:蛋白酶、纤维素酶、支链淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、异构酶、转移酶、激酶、和磷酸酶。在某些实施例中,该感兴趣的蛋白质是蛋白酶。在某些实施例中,该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在某些实施例中,该枯草杆菌蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309、及其变体。
在某些实施例中,该方法进一步包括在由所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞表达所述感兴趣的蛋白质的条件下培养所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞。在某些实施例中,该方法进一步包括回收所述感兴趣的蛋白质。
本发明的方面包括通过上述方法生产的经改变的革兰氏阳性细菌细胞。
附图简要说明
图1显示了kinA(ΔkinA)缺失的遗传图谱。
图2A显示了表达AmyE的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度的图。
图2B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的AmyE表达的图。
图3A显示了表达FNA的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度的图。
图3B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的FNA表达的图。
图4A显示了表达绿色荧光蛋白(GFP)的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度的图。
图4B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌细胞的GFP表达的图。
图5显示了调节芽孢杆菌属细胞中孢子形成起始的磷酸化途径的图示。一种或多种激酶的自身磷酸化被特异性饥饿信号触发,随后是Spo0F、Spo0B和Spo0A蛋白质的顺序磷酸化。Spo0A-P控制孢子形成级联的激活。激酶(例如,kinA、kinB、KinC、kinD、kinE)和磷酸酶(例如,RapA、RapB、RapE)由基因名称指示。箭头表示阳性效应,如磷酸化或对靶基因表达的控制,而端部截断的线(blunt-face lin)表示负效应,如去磷酸化或抑制基因表达。例如,激酶KinA磷酸化Spo0F磷酸酶,其将磷酰基基团转移到Spo0B,并且然后转移到Spo0A,而转录调节剂AbrB抑制spo0H(sigH)表达并因此抑制spo0A表达。
图6显示了phrA缺失的遗传构建体。
图7显示了phrE缺失的遗传构建体。
图8A显示了表达GFP的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的枯草芽孢杆菌细胞(即,包含phrA和phrE基因的缺失(本文为ΔphrA/ΔphrE)的经改变的枯草芽孢杆菌细胞)的细胞密度的图。
图8B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的GFP表达的图。
图9A显示了表达FNA的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度的图。
图9B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的FNA表达的图。
图10A显示了表达AmyE的未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度的图。
图10B显示了来自未经改变的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的AmyE表达的图。
发明详细说明
本发明总体上涉及具有遗传改变的细菌细胞,以及制造和使用此类细胞的方法,所述遗传改变导致感兴趣的蛋白质(下文称为“POI”)的增加的表达/生产。本发明的某些方面包括革兰氏阳性微生物,如芽孢杆菌属的成员,这些革兰氏阳性微生物包含降低激活磷酸化途径的一种或多种蛋白质的表达和/或活性的遗传改变,该遗传改变导致POI的表达增加。
在更详细地描述本发明组合物和方法之前,应当理解,本发明组合物和方法不限于所描述的具体实施例,因此当然可以变化。还应当理解,在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的,并且不旨在进行限制,因为本发明组合物和方法的范围将仅由所附权利要求书限制。
在提供了一系列值的情况下,应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示),该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内,并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内,服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下,排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。
本文提供了某些范围,其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时,接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性等值的数字。例如,关于数值,术语“约”是指数值的-10%至+10%的范围,除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中,短语“约6的pH值”是指pH值为从5.4至6.6,除非pH值另有具体定义。
本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制,这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此,将说明书作为一个整体参考时,下面即将定义的术语被定义得更全面。
将本文件分为若干部分以便于阅读;然而,读者将领会的是,在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式,用于本披露的不同部分的标题不应被解释为限制。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中,但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。
在本说明书中引用的所有公开物以及专利都通过引用并入本文。任何公开物的引用内容是针对其在申请日之前的披露,并且不能理解为承认因为先前发明而本发明组合物和方法不能获得比这些公开物更早的申请日。
根据此详细描述,适用下列简称和定义。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物,除非上下文中清楚地另外指出。因此,例如提及“酶”包括多个这样的酶,并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等效物,等等。
进一步注意的是,权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素(例如像附带条件)。因此,该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”等或利用“否定型”限定的前提基础。
进一步注意到,如本文使用的术语“基本上由……组成”是指一种组合物,其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总体组合物的以重量计小于30%的总量,并且不会有助于或干扰一种或多种组分的作用或活性。
进一步注意到,如本文所使用的术语“包含”意指包含但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的组分是必需的或强制性的,但是包含一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或可选择的一种或多种组分。
还要注意的是,如本文所使用的术语“由……组成”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此,术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的,且组合物中不存在一种或多种其他组分。
如将对于本领域技术人员显而易见的是,在阅读本披露时,本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征,这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
定义
本发明总体上涉及革兰氏阳性细菌细胞(及其制备和使用方法),其被改变或修饰以具有增加一种或多种POI的表达和/或产生的能力。
因此,某些实施例涉及经改变的革兰氏阳性细菌细胞,所述革兰氏阳性细菌细胞包含降低种用于激活磷酸化途径(例如,编码KinA、PhrA、PhrE的基因)的一个或多个基因的表达的至少一个遗传改变。例如,枯草芽孢杆菌中的磷酸化途径(即,信号转导系统)通常被认为围绕转录因子Spo0A循环(参见,“Bacillus subtilis and Other Gram-PositiveBacteria:Biochemistry,Physiology and Molecular Genetics”;Eds.A.L.Sonenshein,J.A.Hoch,R.Losick,Am.Society of Micorbiology,1993[“枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌:生物化学、生理学和分子遗传学”;编辑,A.L.Sonenshein、J.A.Hoch、R.Losick,美国微生物学会,1993])。
更具体地说,据信磷酸化信号转导系统的作用是最终将(无活性)Spo0A转录因子磷酸化成Spo0A~P,其中该活性Spo0A~P转录因子负责参与孢子形成初始阶段的基因的转录。不希望受到本发明的任何特定理论或操作模式的约束,图5总体上显示了调节芽孢杆菌属细胞中孢子形成起始的磷酸化途径的图示。例如,某些激酶(例如,KinA、KinB等)被认为参与解释环境信号并将该信息转导到自身磷酸化的激酶蛋白质中(例如,KinA至KinA~P)。磷酸化激酶然后将磷酸盐转移到Spo0F蛋白质以产生Spo0F~P,该Spo0F~P被认为在磷酸化中用作次级信使,其中Spo0F~P将其磷酸转移到Spo0B以产生Spo0B~P,然后该Spo0B~P转移该磷酸基团Spo0A以产生Spo0A~P。
不希望受到任何特定理论约束或束缚,以下阐述的实例部分证明阻断或降低KinA活性(其阻断或降低Spo0A转录因子的磷酸化和激活),导致芽孢杆菌属细胞中一种或多种POI的表达增加。此外,不希望受到任何特定理论约束或束缚,五肽PhrA和五肽PhrE(参见,图5)分别用来阻断RapA和RapE磷酸酶的功能,其脱抑制由KinA激活的磷酸化途径。如实例部分所证实的,阻断PhrA和/或PhrE对Rap磷酸酶的抑制活性导致在芽孢杆菌属细胞中POI的表达增加。
如本文所定义的,“经改变的细胞”、“修饰的细胞”、“经改变的细菌细胞”、“修饰的细菌细胞”、“经改变的宿主细胞”或“修饰的宿主细胞”可互换使用并且是指重组革兰氏阳性细菌细胞,这些重组革兰氏阳性细菌细胞包含降低用于激活磷酸化途径的一个或多个基因的表达的至少一个遗传改变。例如,本披露的“经改变的”革兰氏阳性细菌细胞可以被进一步定义为源自亲本细菌细胞的“经改变的细胞”,其中该经改变的(子代)细胞包含降低用于激活磷酸化途径的一个或多个基因的表达的至少一个遗传改变。
如本文所定义的,“未经改变的细胞”、“未修饰的细胞”、“未经改变的细菌细胞”、“未修饰的细菌细胞”、“未经改变的宿主细胞”或“未修饰的宿主细胞”可互换使用并且是指“未经改变的”‘亲本’革兰氏阳性细菌细胞,这些革兰氏阳性细菌细胞不包含降低用于激活磷酸化途径的一个或多个基因的表达的至少一个遗传改变。在某些实施例中,未经改变的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞称为“对照细胞”或未经改变的(亲本)革兰氏阳性细菌“对照”细胞。
例如,本披露的某些实施例涉及表达增加量的POI的“经改变的”革兰氏阳性细菌(子代)细胞,其中该POI的增加的量是相对于在“未经改变的”革兰氏阳性细菌(亲本)细胞(即,未经改变的革兰氏阳性细菌“对照”细胞)中相同POI的表达而言的。因此,如本文定义的,当术语或短语“一个或多个未经改变的细菌细胞”、“一个或多个未经改变的革兰氏阳性细菌细胞”、“一个或多个未经改变的革兰氏阳性细菌‘对照’细胞”等用于与本披露的一个或多个“经改变的细菌细胞”进行比较的上下文中时,应理解经改变的(子代)细胞和未经改变的亲本(对照)细胞均在基本上相同的条件和培养基下生长/培养。
如本文所使用的,“宿主”细胞是指具有作为新引入的DNA序列的宿主或表达载体的能力的“革兰氏阳性细菌细胞”。
在本发明的某些实施例中,宿主细胞是芽孢杆菌属的成员胞。.
如本文所使用的,“芽孢杆菌属”或“芽孢杆菌属物种”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种,这些所有物种包括但不限于:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
我们意识到芽孢杆菌属在不断进行分类学重组。因此,该属旨在包括已重新分类的物种,这些物种包括但不限于:如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)的此类生物体。在氧气存在下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性,尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属、线性杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
如本文所使用的,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分,以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA、和RNA,无论其代表正义或反义链。应当理解,由于遗传密码的简并性,许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。
如本文所使用的,术语“载体”是指可以在细胞中复制并且可以携带新基因或DNA(多核苷酸)片段到细胞中的任何核酸。因此,该术语是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。“靶向载体”是包含与其转化的宿主细胞的染色体中的区域同源的多核苷酸序列并且可以驱动该区域的同源重组的载体。靶向载体可用于通过同源重组将突变引入细胞染色体中。在一些实施例中,靶向载体包括其他非同源序列,例如添加到末端的非同源序列(即,填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合,这样使得靶向载体形成闭环,例如像,插入载体中。合适的一种或多种载体的选择和/或构建在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所使用的,术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体,并且其在许多细菌和一些真核生物中形成额外的染色体自复制遗传元件。在一些实施例中,质粒被合并入宿主细胞的基因组中。
“纯化的”或“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离进行,以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。随后可以进一步向纯化或分离的生物分子组合物中添加成分,该成分提供了额外的益处,例如是活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或其他酶或化学品。
如本文所使用的,当提及感兴趣的生物分子(例如,感兴趣的蛋白质)的表达时,术语“增加”、“增强”和“改进”在本文中可互换使用,以指示生物分子的表达(即,在经改变的细胞中)高于在基本上相同的生长条件下生长的对应的未改变(亲本)细胞中的表达水平。
如本文定义的,关于基因序列、ORF序列或多核苷酸序列的术语“表达”或“表达的”是指基因、ORF或多核苷酸的转录,并且在适当情况下将所得mRNA转录物翻译成蛋白质。因此,如将从上下文清楚看出的,蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译产生的。所希望产物在宿主微生物中的表达水平可以基于存在于宿主中的相应mRNA的量或所选序列编码的所需产物的量来确定。例如,可以通过PCR或通过RNA杂交来定量从所选序列转录的mRNA(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989[Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室出版社,1989])。由所选序列编码的蛋白质可以通过各种方法进行定量(例如,通过ELISA,通过测定蛋白质的生物学活性,或通过采用使用识别并结合蛋白质的抗体的、独立于此类活性的测定,如蛋白质印迹或放射免疫测定)。基因(或其多核苷酸)的上下文中的术语“表达”是基于该基因(或其多核苷酸)的核酸序列产生蛋白质的方法,并且因此包括转录和翻译两者。
如本文定义的,术语“引入”,如短语中所使用的,如“向细菌细胞中引入”至少一种多核苷酸开放阅读框(ORF)、或其基因、或其载体,包括本领域已知用于将多核苷酸引入细胞的方法,这些方法包括但不限于原生质体融合、转化(例如,氯化钙、电穿孔)、转导、转染、缀合等(参见,例如,Ferrari et al.,“Genetics,”in Hardwood et al,(eds.),Bacillus,Plenum Publishing Corp.,pages 57-72,1989[Ferrari等人,在Hardwood等人(编辑)的“遗传学”中,芽孢杆菌属,普莱南出版公司,第57-72页,1989])。
如本文所使用的,术语“转化的”和“稳定转化的”是指通过人为干预被引入多核苷酸序列的细胞。多核苷酸可以整合到细胞的基因组中,或作为保持至少两代的附加型质粒存在。
如本文所使用的,术语“可选择的标志物”或“选择性标志物”是指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如,基因),其允许容易地选择包含该核酸的那些宿主。这些可选择的标志物的实例包括但不限于抗微生物剂。因此,术语“可选择的标志物”是指提供宿主细胞已经摄取了感兴趣的输入DNA,或者已经发生了一些其他反应的指示。通常,可选择的标志物是赋予宿主细胞抗微生物抗性或代谢优势的基因,以允许在转化期间将包含外源DNA的细胞与未接受任何外源序列的细胞区分开来。根据本发明有用的其他标志物包括但不限于营养缺陷型标志物,如色氨酸;和检测标志物,如β-半乳糖苷酶。
如本文所使用的,术语“启动子”是指用于引导下游基因转录的核酸序列。在实施例中,启动子适用于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起是表达给定的基因所必须的。通常,转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。
如本文所使用的,“功能附接”或“可操作地连接”意指具有已知或所期望活性的调节区域或功能结构域(如启动子、终止子、信号序列或增强子区域)按这样一种方式附接于或连接于靶标(例如,基因或多肽),以允许调节区域或功能结构域根据其已知或期望的活性来控制该靶标的表达、分泌或功能。
当用于描述重组细胞(例如,“经改变的”革兰氏阳性细菌细胞)时,术语“遗传改变”意指与亲本细胞相比,该细胞具有至少一个遗传差异。一个或多个遗传改变可以是染色体突变(例如,插入、缺失、取代、倒位、用一个染色体区域替代另一个染色体区域(例如用异源启动子替代染色体启动子)等)和/或引入染色体外多核苷酸(例如,质粒)。在一些实施例中,可以将染色体外多核苷酸整合到宿主细胞染色体中,以产生稳定转染子/转化子。本披露的实施例包括降低KinA、PhrA、和/或PhrE蛋白的表达或活性的遗传改变(经转录、翻译或通过降低蛋白质本身的活性,例如通过氨基酸序列的突变)。如本文详细描述的,这种改变改进感兴趣的蛋白质的表达。
基因的“失活”意味着基因的表达或其编码的蛋白质的活性被阻断,或不能发挥其已知的功能。基因的失活可以通过任何合适的手段进行,例如通过如上所述的遗传改变。在某些实施例中,灭活基因的表达产物是具有蛋白质生物活性相应变化的截短蛋白质。在一些实施例中,经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含导致稳定和不可恢复性失活的一个或多个基因的失活。
在一些实施例中,通过缺失实现基因失活。在一些实施例中,通过同源重组缺失靶向缺失的区域(例如,基因)。例如,使用包括具有选择性标志物的输入序列的DNA构建体,该选择性标志物在每侧侧翼有与靶向缺失的区域同源的序列(其中该序列在本文中称为“同源盒”)。DNA构建体与宿主染色体的同源序列对齐,并且在双重交叉事件中,将靶向缺失的区域从宿主细胞染色体上切除。
“插入”或“添加”是与天然存在的或亲本的序列相比分别导致添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列的改变。
如本文所使用的,“取代”由一或多个多核苷酸或氨基酸分别被不同的多核苷酸或氨基酸替代产生。
使基因突变的方法是本领域熟知的,并且包括但不限于位点定向突变、随机突变的产生、和缺口双链体方法(参见,例如,美国专利4,760,025;Moring et al.,Biotech.2:646[1984][Moring等人,生物技术2:646[1984]];和Kramer et al.,Nucleic Acids Res.,12:9441[1984][Kramer等人,核酸研究,12:9441])。
如本文所使用的,“同源基因”是指来自不同的、但通常相关的物种的基因对,这些基因彼此对应并且彼此相同或非常相似。该术语涵盖通过物种形成(即,新物种的发育)(例如,直系同源基因)分离的基因、以及通过遗传重复分离的基因(例如,旁系同源基因)。
如本文所使用的,“直向同源物”和“直向同源基因”是指通过物种形成从共同祖先基因(即,同源基因)演化的不同物种中的基因。通常,直系同源物在进化过程中保持相同的功能。直系同源物的鉴定可用于新测序基因组中基因功能的可靠预测。
如本文所使用的,“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指与基因组内重复相关的基因。虽然直系同源物在进化过程中保持相同的功能,但旁系同源物发展新功能,即使一些功能通常与原始功能相关。旁系同源基因的实例包括但不限于编码胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、和凝血酶的基因,上述酶都是丝氨酸蛋白酶并且在同一物种内一起发生。
如本文所使用的,“同源性”是指序列相似性或同一性,同一性优先。该同源性是使用本领域已知的标准技术来确定的(参见,例如,Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482[1981];Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443[1970];Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444[1988];programs such as GAP,BESTFIT,FASTA,andTFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group,Madison,WI);and Devereux et al.,Nucl.Acid Res.,12:387-395[1984][Smith和Waterman,应用数学进展,2:482[1981];Needleman和Wunsch,分子生物学杂志,48:443[1970];Pearson和Lipman,美国科学院院刊85:2444[1988];程序,如威斯康星遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA(遗传学计算机组,麦迪逊,威斯康星州);和Devereux等人,核酸研究,12:387-395[1984]])。
如本文所使用的,“类似的序列”是其中基因的功能基本上与指定来自枯草芽孢杆菌菌株168的基因相同的序列。另外,类似的基因与枯草芽孢杆菌菌株168基因的序列包括至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性。可替代地,类似的序列具有在枯草芽孢杆菌168区域中发现的在70%至100%之间的基因的对齐和/或在与枯草芽孢杆菌168染色体中的基因对齐的区域中发现的至少在5-10个之间的基因。在另外的实施例中,多于一个上述性质适用于该序列。类似的序列由已知的序列比对方法确定。通常使用的比对方法是BLAST,尽管如上下文所示,存在也可用于比对序列的其他方法。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多个序列比对。它还可以标绘显示用于创建该比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng and Doolittle,J.Mol.Evol.,35:351-360[1987][Feng和Doolittle,分子进化杂志,35:351-360[1987]])。该方法类似于Higgins和Sharp所述的方法(Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153[1989])。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重,为0.10的默认空位长度权重,以及加权的末端空位。
有用的算法的另一个实例是由Altschul等人描述的BLAST算法(Altschul etal.,J.Mol.Biol.,215:403-410,[1990];and Karlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787[1993][Altschul等人,分子生物学杂志,215:403-410,[1990];和Karlin等人,美国科学院院刊90:5873-5787[1993]])。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见,Altschul et al.,Meth.Enzymol.,266:460-480[1996][Altschul等人,酶学方法,266:460-480[1996]])。
如本文所使用的,相对于本文鉴定的氨基酸或核苷酸序列,“序列同一性百分比(%)”被定义为在比对序列并引入空位(必要的话)以实现最大百分比序列同一性之后,并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代,候选序列中与感兴趣的序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
“同系物”(或“同源物”)是指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有特定程度的同一性的实体。使用常规序列比对工具(例如,Clustal、BLAST等等),同源序列可以包括与主题序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列。通常,除非另有说明,同系物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。
进行序列比对并且确定序列同一性的方法是本领域技术人员已知的,可以在不进行过多实验的情况下实施,并且可以明确地获得同一性值的计算。参见,例如,Ausubel etal.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 19(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York);and the ALIGN program(Dayhoff(1978)in Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3(NationalBiomedical Research Foundation,Washington,D.C.)[Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法,第19章(格林出版与威利交叉科学出版社,纽约);和ALIGN程序(Dayhoff(1978),在蛋白质序列和结构图集5:增刊3中(国家生物医学研究基金会,华盛顿)]。许多算法可用于比对序列并确定序列同一性,并且包括,例如,Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.48:443[Needleman等人(1970)分子生物学杂志48:443]的同源性比对算法;Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482[Smith等人(1981)应用数学进展2:482]的局部同源性算法;Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444[Pearson等人(1988)美国科学院院刊85:2444]的相似性捜索方法;Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)[分子生物学方法70:173-187(1997)]);和BLASTP、BLASTN、和BLASTX算法(参见Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410[Altschul等人(1990)分子生物学杂志215:403-410])。
使用这些算法的计算机化程序也是可用的,并且包括但不限于:ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,或WU-BLAST-2(Altschul et al.,Meth.Enzym.,266:460-480(1996)[Altschul等人,酶学方法,266:460-480(1996)]);或可在遗传学计算机组(GCG)包,版本8,麦迪逊,威斯康星州,美国中获得的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、和TFASTA;以及智能遗传学(Intelligenetics),山景城,加利福尼亚州的PC/基因程序中的CLUSTAL。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数,包括在进行比较的序列的整个长度上实现最大比对所需的算法。
如本文所使用的,术语“杂交”是指通过碱基配对将核酸链与互补链连接的过程,如本领域已知的。
如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交,则认为核酸序列可与参考核酸序列“选择性杂交”。杂交条件是基于结合复合物或探针的核酸的解链温度(Tm)。例如,“最大严格”通常发生在约Tm-5℃(低于探针的Tm 5°);“高严格”发生在低于Tm约5℃-10℃;“中等严格”发生在低于探针的Tm约10℃-20℃;并且“高严格”发生在低于Tm约20℃-25℃。在功能上,最大严格条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或近乎严格同一性的序列;而中等或低严格杂交可用于鉴定或检测多核苷酸序列同系物。
中和高严格杂交条件是本领域熟知的。高严格条件的实例包括在约42℃下在50%甲酰胺,5X SSC,5X登哈特溶液,0.5%SDS和100μg/ml变性载体DNA中进行的杂交,随后在室温下在2X SSC和0.5%SDS中洗涤两次,并在42℃下在0.1X SSC和0.5%SDS中再洗涤两次。中严格杂交条件的实例包括在37℃下在包括20%甲酰胺,5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH 7.6),5×登哈特溶液,10%葡聚糖硫酸盐和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中过夜孵育,然后在约37℃-50℃下以1x SSC洗涤滤器来进行。如果需要,本领域技术人员知道如何调节温度、离子强度等以适应因素如探针长度等等。
当用于提及生物组分或组合物(例如,细胞、核酸、多肽/酶、载体等)时,术语“重组体”表示该生物组分或组成物处于自然界中未发现的状态。换句话说,生物组分或组合物已经通过人类干预从其天然状态进行了修饰。例如,重组细胞涵盖表达在其天然亲本(即,非重组)细胞中未发现的一个或多个基因的细胞,表达与其天然亲本细胞不同的量的一个或多个天然基因的细胞,和/或在不同于其天然亲本细胞的条件下表达一个或多个天然基因的细胞。重组核酸可以与天然序列相差一个或多个核苷酸,可操作地连接到异源序列(例如,异源启动子,编码非天然或变体信号序列的序列等),没有内含子序列,和/或处于分离形式。重组多肽/酶可以与天然序列相差一个或多个氨基酸,可以与异源序列融合,可能被截短或具有氨基酸的内部缺失,能以在天然细胞中未发现的方式表达(例如,来自由于细胞中存在编码多肽的表达载体而过表达该多肽的重组细胞),和/或处于分离形式。需要强调的是,在一些实施例中,重组多核苷酸或多肽/酶具有与其野生型对应物相同但处于非天然形式(例如,分离或富集形式)的序列。
如本文所使用的,术语“靶序列”是指宿主细胞中编码如下序列的DNA序列:其中希望将输入序列插入宿主细胞基因组中。在一些实施例中,靶序列编码功能性野生型基因或操纵子,而在其他实施例中,靶序列编码功能性突变基因或操纵子、或非功能基因或操纵子。
如本文所使用的,“侧翼序列”是指正在讨论的序列的上游或下游的任何序列(例如,针对基因A-B-C,基因B以A和C基因序列为侧翼)。在一个实施例中,输入序列每侧侧翼有同源盒。在另一个实施例中,输入序列和同源盒包括在每侧侧翼有填充序列的单元。在一些实施例中,侧翼序列仅存在于单侧(3’或5’),但在实施例中,序列的每侧均有侧翼序列。每个同源盒的序列与芽孢杆菌属染色体中的序列同源。这些序列指导在芽孢杆菌属染色体中,新构建体被整合,并且部分芽孢杆菌属染色体将被输入序列替代。在一个实施例中,选择性标志物的5’和3’端侧翼有包含失活染色体区段的部分的多核苷酸序列。在一些实施例中,侧翼序列仅存在于单侧(3’或5’),而在实施例中,其存在于所侧翼序列的每侧。
如本文所使用的,术语“可扩增标志物”、“可扩增基因”、和“扩增载体”是指基因或编码基因的载体,其允许在适当生长条件下扩增该基因。
在大多数扩增技术中通过酶的选择实现“模板特异性”。扩增酶是在使用它们的条件下仅在核酸的不均匀混合物中处理核酸的特定序列的酶。例如,在Qβ复制酶的情况下,MDV-1RNA是复制酶的特异性模板(参见,例如,Kacian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:3038[1972][Kacian等人,美国科学院院刊69:3038[1972]])。其他核酸不被该扩增酶复制。类似地,在T7RNA聚合酶的情况下,该扩增酶对其本身的启动子具有严格的特异性(参见,Chamberlin et al.,Nature 228:227[1970][Chamberlin等人,自然,228:227[1970]])。在T4DNA连接酶的情况下,该酶将不连接两个寡核苷酸或多核苷酸,其中寡核苷酸或多核苷酸底物与连接接合处的模板之间存在错配(参见,Wu and Wallace,Genomics4:560[1989][Wu和Wallace,基因组学,4:560[1989]])。最后,发现Taq和Pfu聚合酶由于其在高温下起作用的能力而对引物限制并由此限定的序列显示出高特异性;高温导致有利于与靶序列引物杂交而不与非靶序列杂交的热力学条件。
如本文所使用的,术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样本模板”。
如本文所使用的,术语“样品模板”是指源自样品的核酸,将该样品对“靶标”的存在进行分析(下文所定义)。相比之下,“背景模板”用于提及除样品模板之外的核酸,其可以存在或不存在于样品中。背景模板通常是无意的。它可能是遗留(carryover)的结果,或者它可能是因为试图从样品中纯化掉的核酸污染物的存在导致的。例如,来自生物体的而非待检测那些的核酸可作为背景存在于测试样品中。
如本文所使用的,术语“引物”是指当置于以下条件下能作为合成起始点的寡核苷酸,无论是纯化的限制性消化物中天然存在的还是经合成而产生的:其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成(即,在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶存在下并在合适的温度和pH下)。引物优选是单链,用于最大效率的扩增,但是可替代地可以是双链。如果是双链,引物首先经过处理以分离其双链,然后再用于制备延伸产物。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长,以在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于多个因素,包括温度、引物来源和方法的使用。
如本文所使用的,术语“探针”是指能与另一感兴趣的寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸序列),无论是在纯化的限制性消化中天然存在还是以合成,重组或通过PCR扩增产生的。探针可以是单链或双链的。探针可用于检测、鉴定和分离特定基因序列。预期的是,本发明所用的任何探针都将用任何“报道分子”标记,这样使得在任何检测系统中都可检测,所述检测系统包括但不限于酶(例如ELISA、以及基于酶的组织化学测定)系统、荧光系统、放射性系统、和发光系统。本发明并不旨在限于任何具体的检测系统或标记。
如本文所使用的,术语“靶”当用于提及聚合酶链式反应时,是指由用于聚合酶链式反应的引物所界定的核酸区域。因此,试图从其他核酸序列分选“靶标”。“区段”被定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的,术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指通过引用并入本文的美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法,其包括用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中靶序列的区段浓度的方法。
如本文所使用的,术语“扩增试剂”是指除引物、核酸模板和扩增酶之外的扩增所需的那些试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液等)。通常,将扩增试剂以及其他反应组分放置并包含在反应容器中(试管,微孔等)中。
使用PCR,可以将基因组DNA中特异性靶序列的单拷贝扩增至通过若干种不同方法可检测的水平(例如,与标记的探针杂交;掺入生物素化引物,再经抗生物素蛋白-酶缀合物检测;将32P标记的脱氧核苷酸三磷酸(如dCTP或dATP)掺入扩增区段)。除基因组DNA外,任何寡核苷酸或多核苷酸序列可以用适当的引物分子组来扩增。具体地讲,经PCR方法本身所产生的扩增区段自身就是用于随后的PCR扩增的有效模板。
如本文所使用的,术语“PCR产物”、“PCR片段”、及“扩增产物”是指在变性、退火及延伸的PCR步骤的两个或更多个循环完成之后所得到的化合物的混合物。这些术语涵盖一个或多个靶序列的一个或多个区段已经扩增的情况。
如本文所使用的,术语“RT-PCR”是指RNA序列的复制和扩增。在该方法中,将逆转录与PCR偶联,最常使用其中采用热稳定聚合酶的一种酶程序,如美国专利5,322,770中所述,其通过引用并入本文。在RT-PCR中,由于聚合酶的逆转录酶活性,将RNA模板转化为cDNA,并且然后使用聚合酶的聚合活性扩增(即,如在其他PCR方法中)。
如本文所使用的,术语“染色体整合”是指将输入序列引入宿主细胞(例如,芽孢杆菌属)的染色体的过程。转化DNA的同源区域与染色体的同源区域对齐。随后,在双交换(即同源重组)中,同源盒之间的序列被输入序列替代。在本发明的一些实施例中,DNA构建体的灭活染色体区段的同源段与芽孢杆菌属染色体的固有染色体区域的侧翼同源区域对齐。随后,在双交换(即同源重组)中,通过DNA构建体缺失固有染色体区域。
“同源重组”意指在相同或几乎相同核苷酸序列位点处的两个DNA分子或配对染色体之间的DNA片段的交换。在一个实施例中,染色体整合是同源重组。
如本文所使用的“同源序列”意指,当最佳比对用于比较时,与另一个核酸或多肽序列具有100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、85%、80%、75%、或70%序列同一性的核酸或多肽序列。在一些实施例中,同源序列具有85%至100%之间的序列同一性,而在其他实施例中,存在在90%至100%之间的序列同一性,并且在更多实施例中,存在95%和100%的序列同一性。
如本文所使用的,“氨基酸”是指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用。
如本文所使用的,“感兴趣的蛋白质”(POI)是指所期望的和/或进行评估的蛋白质/多肽。在一些实施例中,感兴趣的蛋白质是细胞内的,而在其他实施例中,其是分泌的多肽。多肽包括酶,这些酶包括但不限于选自以下各项的那些:淀粉分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。更具体地说,这些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、过水解酶,多元醇氧化酶、果胶酸裂解酶、葡糖苷酶、异构酶、转移酶、半乳糖苷酶和几丁质酶。在本发明的具体实施例中,感兴趣的多肽是蛋白酶。在一些实施例中,感兴趣的蛋白质是与信号肽融合的分泌多肽(即,待分泌的蛋白质上的氨基末端延伸)。几乎所有分泌的蛋白质都使用氨基末端蛋白质延伸,其在前体蛋白质穿过膜的靶向和易位中起关键作用。在膜转移期间或之后立即通过信号肽酶水解去除该延伸。
在本发明的一些实施例中,感兴趣的多肽选自激素、抗体、生长因子、受体等。涵盖本发明的激素包括但不限于:卵泡刺激素、黄体生成激素、促皮质素释放因子、生长激素抑制素、促性腺激素、加压素、催产素、促红细胞生成素、胰岛素等。生长因子包括但不限于:血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子、细胞因子如白介素(例如,IL-1至IL-13)、干扰素、集落刺激因子等。抗体包括但不限于:直接从需要产生抗体的任何物种获得的免疫球蛋白。此外,本发明涵盖修饰的抗体。多克隆和单克隆抗体也由本发明所涵盖。在具体实施例中,抗体是人抗体。
如本文所使用的,多肽的“衍生物”或“变体”意指一种多肽,该多肽通过以下方式来自前体多肽(例如,天然多肽):向C-和N-末端之一或二者添加一个或多个氨基酸,在氨基酸序列的不同位点的一个或多个处取代一个或多个氨基酸,在多肽的一端或两端处或在氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸,在氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸,以及其任何组合。多肽的衍生物或变体的制备能以任何方便的方式实现,例如通过修饰编码天然多肽的DNA序列,将该DNA序列转化到合适的宿主中,以及修饰的DNA序列的表达以形成衍生物/变体多肽。衍生物或变体进一步包括经化学修饰的多肽。
如本文所使用的,术语“异源蛋白质”是指在天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多肽。异源蛋白质的实例包括酶如水解酶,包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、糖酶、和脂肪酶;异构酶如消旋酶、差向异构酶、互变异构酶、或变位酶;转移酶、激酶和磷酸酶。在一些实施例中,蛋白质是治疗上重要的蛋白质或肽,包括但不限于:生长因子、细胞因子、配体、受体和抑制剂,连同疫苗和抗体。在另外的实施例中,蛋白质是商业上重要的工业蛋白质/肽(例如,蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂肪酶)。在一些实施例中,编码蛋白质的基因是天然存在的基因,而在其他实施例中,使用突变的和/或合成的基因。
如本文所使用的,“同源蛋白质”是指天然的或天然存在于细胞中的蛋白质或多肽。在某些实施例中,细胞是革兰氏阳性细胞,而在某些其他实施例中,革兰氏阳性细胞是芽孢杆菌属细胞。在替代性实施例中,同源蛋白质是由其他生物体产生的天然蛋白质,包括但不限于大肠杆菌。本发明涵盖通过重组DNA技术产生同源蛋白质的宿主细胞。
如本文所使用的,“操纵子”包含可以从共同启动子转录成单个转录单元的一组连续基因,并且从而进行共调节。在一些实施例中,操纵子可以包括驱动多个不同mRNA的转录的多个启动子。
如上所述,本披露的某些实施例涉及经改变的细菌细胞,以及制备和使用这些细胞的方法,这些经改变的细菌细胞包含导致POI表达增加的遗传改变。因此,本发明的某些方面包括经改变的革兰氏阳性细胞,如芽孢杆菌属成员的细胞,其中该经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞包含导致选自kinA基因、phrA基因和/或phrE基因的至少一个基因的表达水平降低的遗传改变。如本文所述,并且在实例部分中进一步描述的,本发明的经改变的革兰氏阳性细菌细胞(即,包含导致选自kinA基因、phrA基因和/或phrE基因的至少一个基因的表达水平降低的遗传改变)当与在基本上相同的培养条件下生长的对应未经改变的革兰氏阳性细菌(亲本)细胞相比时,证明一种或多种POI的表达增加。因此,本披露的遗传改变是降低kinA、phrA、和phrE基因中任一个;kinA、phrA、和phrE基因中任两个;或kinA、phrA、和phrE基因中所有三个的表达水平的任何改变。在其他实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌(亲本)细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞中KinA、PhrA、和PhrE蛋白中一种或多种的活性的降低。因此,在某些实施例中,遗传改变是降低KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任一种;KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任两种;或KinA、PhrA、和PhrE蛋白中所有三种的活性的任何改变。
如上所述,本发明的方面包括用于从革兰氏阳性细菌细胞增加POI的表达的方法,并且是基于以下观察:在已被遗传改变以具有降低的激活磷酸化途径的一个或多个基因的表达的革兰氏阳性(子代)细胞中POI的产生增加,这是相对于对应的未经改变的革兰氏阳性(亲本)细胞中相同POI的产生而言的。如上所述,遗传改变被定义为宿主细胞中改变宿主细胞的遗传构成的任何改变,例如通过附加体添加和/或染色体插入、缺失、倒位、碱基变换等。在这方面不意图进行限制。
在某些实施例中,亲本革兰氏阳性细胞具有一个或多个有缺陷或无活性的孢子形成起始基因(即,其表达受Spo0A或Spo0A下游控制的基因),并且从而防止亲本细胞形成孢子。令人惊奇的是,本发明的申请人发现即使在这种遗传背景(即,包括一个或多个有缺陷或无活性的孢子形成起始基因的亲本革兰氏阳性细胞)中,另外的遗传改变(例如,导致选自kinA基因、phrA基因和/或phrE基因的至少一个基因的表达水平降低的遗传改变)增加了此类经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞中POI的表达。因此,本披露的遗传改变的(子代)细胞中蛋白质表达/产生的改进不仅仅是因为防止革兰氏阳性细胞的孢子形成。例如,本披露的经改变的革兰氏阳性细胞源自于其的亲本革兰氏阳性细胞可以具有通过Spo0A或通过σ因子SigF、SigG、SigE和SigK调节的非功能性/突变的/缺失的孢子形成基因(例如,参见实例部分,其中使用孢子形成缺陷型芽孢杆菌属细胞)。
在某些实施例中,本发明涉及用于产生或获得经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞的方法(及其组合物),该细胞包含降低激活磷酸化途径的一个或多个基因表达的至少一个遗传改变。在其他实施例中,当在由经改变的革兰氏阳性(子代)细菌细胞表达感兴趣的蛋白质的条件下培养时,该经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞(其包含降低激活磷酸化途径的一个或多个基因的表达的至少一个遗传改变)表达和/或产生增加的量的一种或多种POI。因此,当与在基本上相同培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌(亲本)细胞中POI的表达和/或产生相比(即,相对于其)时,经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞中相同的POI的表达和/或产生增加。
根据某些实施例,遗传改变的革兰氏阳性细菌细胞(或产生遗传改变的革兰氏阳性细菌细胞的亲本细胞)是芽孢杆菌属成员的细胞。在一些实施例中,芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌属细胞。许多嗜碱芽孢杆菌属细胞是本领域已知的(参见例如,美国专利5,217,878;和Aunstrup et al.,Proc IV IFS:Ferment.Technol.Today,299-305[1972][Aunstrup等人,Proc IV IFS:当今发酵技术,299-305[1972]])。在一些实施例中,该芽孢杆菌属细胞是工业相关的芽孢杆菌属细胞。工业芽孢杆菌属细胞的实例包括但不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、和解淀粉芽孢杆菌。在另外的实施例中,芽孢杆菌属细胞选自下组,该组由以下各项组成:地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌、以及芽孢杆菌属内的其他生物体,如以上所讨论的。在具体实施例中,使用枯草芽孢杆菌细胞。例如,美国专利5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述了可用于本发明的各种芽孢杆菌属宿主细胞,尽管其他合适的细胞也被考虑用于本发明。
如本文所述的遗传改变的革兰氏阳性细胞的亲代细胞(例如,亲本芽孢杆菌属细胞)是重组革兰氏阳性细胞,其中编码POI的异源多核苷酸已被引入细胞。虽然引入编码POI的多核苷酸可以在亲本细胞中进行,但是该步骤也可以在已经被遗传改变的细胞中进行以增加多肽产生,如本文所详述的。在一些实施例中,宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主菌株,例如重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。
已知许多枯草芽孢杆菌菌株可用于本发明的方面,包括但不限于例如1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110、和PEP211菌株(参见例如,Hoch et al.,Genetics,73:215-228[1973][Hoch等人,遗传学,73:215-228[1973]];美国专利号4,450,235;美国专利号4,302,544;和EP 0134048)。Palva等人以及其他人进一步描述了使用枯草芽孢杆菌作为表达宿主(参见,Palva et al.,Gene19:81-87[1982][Palva等人,基因,19:81-87[1982]];还参见Fahnestock and Fischer,J.Bacteriol.,165:796-804[1986][Fahnestock和Fischer,细菌学杂志,165:796-804[1986]];以及Wang et al.,Gene 69:39-47[1988][Wang等人,基因,69:39-47[1988]])。
在某些实施例中,产生工业蛋白酶的芽孢杆菌属菌株可用作亲本表达宿主。在一些实施例中,本发明中这些菌株的使用进一步提高了效率和蛋白酶生产。两种一般类型的蛋白酶通常由芽孢杆菌属物种分泌,即中性(或“金属蛋白酶”)和碱性(或“丝氨酸”)蛋白酶。丝氨酸蛋白酶是催化肽键的水解的酶,其中在活性位点存在必需的丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶具有在25,000至30,000范围内的分子量(参见,Priest,Bacteriol.Rev.,41:711-753[1977][Priest,细菌学评论,41:711-753[1977]])。枯草杆菌蛋白酶是用于本发明的丝氨酸蛋白酶。已经鉴定并测序了多种枯草芽孢杆菌蛋白酶,例如枯草杆菌蛋白酶168,枯草杆菌蛋白酶BPN’,枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,枯草杆菌蛋白酶DY,枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶309(参见,例如,EP 414279B;WO89/06279;和Stahl et al.,J.Bacteriol.,159:811-818[1984][Stahl等人,细菌学杂志,159:811-818[1984]])。在本发明的一些实施例中,芽孢杆菌宿主菌株产生突变体(例如,变体)蛋白酶。许多参考文献提供了变体蛋白酶的实例(参见例如,WO 99/20770;WO 99/20726;WO 99/20769;WO 89/06279;RE 34,606;美国专利号4,914,031;美国专利号4,980,288;美国专利号5,208,158;美国专利号5,310,675;美国专利号5,336,611;美国专利号5,399,283;美国专利号5,441,882;美国专利号5,482,849;美国专利号5,631,217;美国专利号5,665,587;美国专利号5,700,676;美国专利号5,741,694;美国专利号5,858,757;美国专利号5,880,080;美国专利号6,197,567;和美国专利号6,218,165)。
这里注意到,本发明不限于作为感兴趣的蛋白质的蛋白酶。实际上,本披露涵盖了多种感兴趣的蛋白质,针对它们而言在革兰氏阳性细胞中的增加的表达是所希望的(详述如下)。
在其他实施例中,用于本发明方面的革兰氏阳性细菌细胞可能在提供有益表型的其他基因中具有额外的遗传改变。例如,可以使用包括以下基因中的至少一个的突变或缺失的芽孢杆菌属细胞:degU、degS、degR和degQ。在一些实施例中,突变为degU基因,例如degU(Hy)32突变。(参见,Msadek et al.,J.Bacteriol.,172:824-834[1990][Msadek等人,细菌学杂志,172:824-834[1990]];和Olmos et al.,Mol.Gen.Genet.,253:562-567[1997][Olmos等人,分子遗传和基因组学,253:562-567[1997]])。因此,可用于本发明的方面的亲本/遗传改变的革兰氏阳性细胞的一个实例是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌细胞。在另一个实施例中,芽孢杆菌属宿主可以包括在以下各项中的突变或缺失:scoC4(参见,Caldwell et al.,J.Bacteriol.,183:7329-7340[2001][Caldwell等人,细菌学杂志,183:7329-7340[2001]]);spoIIE(参见,Arigoni et al.,Mol.Microbiol.,31:1407-1415[1999][Arigoni等人,分子微生物学,31:1407-1415[1999]]);oppA或opp操纵子的其他基因(参见,Perego et al.,Mol.Microbiol.,5:173-185[1991][Perego等人,分子微生物学,5:173-185[1991]])。实际上,预期引起与oppA基因突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本发明的经改变的芽孢杆菌属细胞的一些实施例中。在一些实施例中,这些突变单独发生,而在其他实施例中,存在突变的组合。在一些实施例中,本发明的改变的芽孢杆菌获得自已经包括对一种或多种上述基因的突变的亲本芽孢杆菌宿主菌株。在替代实施例中,将本发明的前述经遗传改变的芽孢杆菌进一步工程化以包括上述基因中的一个或多个的突变。
如上所述,与亲本细胞(在基本相同的条件下生长的)相比,在遗传改变的革兰氏阳性细胞中降低了激活磷酸化途径的至少一个基因的表达。表达的这种降低能以任何方便的方式实现,并且可以是在转录、mRNA稳定性、翻译的水平上,或者可能是由于从此类基因产生的一种或多种多肽中存在降低其活性的变异导致的(即,它是基于多肽的活性的、表达的“功能性”降低)。因此,不意图限制遗传改变的类型或诱导孢子形成起始基因表达的至少一个基因表达的方式。例如,在一些实施例中,革兰氏阳性细胞中的遗传改变是改变感兴趣的基因的一个或多个启动子的遗传改变,这导致转录活性降低。
在某些实施例中,与对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中kinA、phrA、和phrE基因中一个或多个的表达水平的降低。因此,该遗传改变可导致kinA、phrA、和phrE基因中任一个;kinA、phrA、和phrE基因中任两个;或kinA、phrA、和phrE基因中所有三个的表达水平的降低。在其他实施例中,与对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞相比,遗传改变导致在经改变的革兰氏阳性细菌细胞中KinA、PhrA、和PhrE蛋白中一种或多种的活性的降低。因此,该遗传改变可导致KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任一种;KinA、PhrA、和PhrE蛋白中任两种;或KinA、PhrA、和PhrE蛋白中所有三种的活性的降低。
在某些实施例中,在磷酸化途径中用于激活孢子形成起始基因表达的基因的表达在遗传改变的革兰氏阳性细胞中降低至在基本相同培养条件下培养的野生型和/或亲本细胞中表达水平的约3%,包括约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约11%、约12%、约13%、约14%、约15%、约16%、约17%、约18%、约19%、约20%、约21%、约22%、约23%、约24%、约25%、约26%、约27%、约28%、约29%、约30%、约35%、约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、或约80%。因此,诱导孢子形成起始基因表达的一个或多个基因表达的降低范围可以从约3%至约80%、从约4%至约75%、从约5%至约70%、从约6%至约65%、从约7%至约60%、从约8%至约50%、从约9%至约45%、从约10%至约40%、从约11%至约35%、从约12%至约30%、从约13%至约25%、从约14%至约20%等。预期了在上述范围内的表达的任何子范围。
在某些实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞中这些基因的表达相比,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞降低了kinA、phrA和phrE基因中任何一个、两个或三个的表达。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低kinA基因表达的遗传改变。亲本革兰氏阳性细胞中的kinA基因(即,在如本文所述进行遗传改变之前)是与SEQ ID NO:1具有至少60%同一性的基因,包括与SEQ ID NO:1具有至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性。在某些实施例中,遗传改变是kinA基因全部或部分的缺失。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低phrA基因表达的遗传改变(或突变)。亲本革兰氏阳性细胞中的phrA基因(即,在如本文所述进行遗传改变之前)是与SEQ ID NO:6具有至少60%同一性的基因,包括与SEQ ID NO:6具有至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性。在某些实施例中,遗传改变是phrA基因全部或部分的缺失。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低phrE基因表达的遗传改变(或突变)。亲本革兰氏阳性细胞中的phrE基因(即,在如本文所述进行遗传改变之前)是与SEQ ID NO:8具有至少60%同一性的基因,包括与SEQ ID NO:8具有至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或100%同一性。在某些实施例中,遗传改变是phrE基因全部或部分的缺失。
在某些实施例中,与在基本上相同的培养条件下生长的对应的未经改变的革兰氏阳性细菌细胞中这些基因的表达相比,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞降低了kinA、phrA和phrE基因中任何一个、两个或三个的表达。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低KinA蛋白的活性的遗传改变(或突变),例如,变体KinA蛋白(例如,与野生型序列相比,具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代)。变体KinA蛋白可以包含与SEQ ID NO:2具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低PhrA蛋白的活性的遗传改变(或突变),例如,变体PhrA蛋白(例如,与野生型序列相比,具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代)。变体PhrA蛋白可以包含与SEQ ID NO:7具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同一性的氨基酸序列。
在某些实施例中,遗传改变(或突变)是降低PhrE蛋白的活性的遗传改变(或突变),例如,变体PhrE蛋白(例如,与野生型序列相比,具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代)。变体PhrE蛋白可以包含与SEQ ID NO:9具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约99%同一性的氨基酸序列。
如上所述,许多不同的蛋白质可用作革兰氏阳性细胞中的POI(即,其表达在遗传改变的细胞中增加的蛋白质)。POI可以是同源蛋白质或异源蛋白质,并且可以是野生型蛋白质、天然变体或重组变体。在某些实施例中,该POI是酶,其中在某些实施例中,该酶选自乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
在某些其他实施例中,该POI是蛋白酶,其中该蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶,例如选自以下各项的枯草杆菌蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309、及其变体。在某些实施例中,该POI是荧光蛋白,例如,绿色荧光蛋白(GFP)。
在某些实施例中,其方法和组合物进一步包括回收感兴趣的蛋白质。因为在遗传改变的革兰氏阳性(子代)细胞中,感兴趣的蛋白质的表达/产生水平增加(与未经改变的亲本细胞相比),当在基本相同的培养条件(和相同的规模)下培养时,回收的POI量相对于对应的革兰氏阳性(亲代)细胞是增加的。本领域普通技术人员已知有用于检测和测量细胞内和细胞外所表达的多肽的表达水平/产生的各种测定。这些测定由本发明的用户确定,并且可以取决于POI的同一性和/或活性(例如酶活性)而变化。例如,为了测定蛋白酶,存在基于从酪蛋白或血红蛋白的酸溶性肽的释放的测定,该释放以280nm的吸光度或使用Folin方法经比色法进行测量(参见例如,Bergmeyer et al.,“Methods of Enzymatic Analysis”vol.5,Peptidases,Proteinases and their Inhibitors,Verlag Chemie,Weinheim[1984][Bergmeyer等人,“酶分析方法”,第5卷,肽酶,蛋白酶及其抑制剂,化学出版社,魏因海姆[1984]])。其他测定涉及显色底物的溶解(参见例如,Ward,“Proteinases,”inFogarty(ed.).,Microbial Enzymes and Biotechnology,Applied Science,London,[1983],pp251-317[Ward,“蛋白酶”,在:福格蒂(编辑),微生物酶与生物技术,应用科学出版社,伦敦[1983],第251-317页])。测定的其他实例包括但不限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺测定(SAAPFpNA)和2,4,6-三硝基苯磺酸钠盐测定(TNBS测定)。许多本领域技术人员已知的附加参考文献提供了合适的方法(参见,例如,Wells et al.,NucleicAcids Res.11:7911-7925[1983];Christianson et al.,Anal.Biochem.,223:119-129[1994];and Hsia et al.,Anal Biochem.,242:221-227[1999][Wells等人,核酸研究,11:7911-7925[1983];Christianson等人,分析生物化学,223:119-129[1994];以及Hsia等人,分析生物化学,242:221-227[1999]])。
同样如上所述,用于确定POI在宿主细胞中的分泌水平并检测所表达的蛋白质的手段包括对感兴趣的蛋白质具有特异性的多克隆或单克隆抗体的免疫测定的使用。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)以及荧光激活细胞分选术(FACS)。然而,其他方法是本领域技术人员已知的,并且可用于评估感兴趣的蛋白质(参见例如,Hampton et al.,Serological Methods,A Laboratory Manual,APS Press,St.Paul,MN[1990];and Maddox et al.,J.Exp.Med.,158:1211[1983][Hampton等人,血清 学方法,实验室手册,APS出版社,圣保罗,明尼苏达州[1990];和Maddox等人,实验医学杂志,158:1211[1983]])。如本领域已知的,将使用本发明产生的经改变的芽孢杆菌属细胞在适于从细胞培养物中表达和回收POI的条件下维持和生长(参见例如,Hardwood andCutting(eds.)Molecular Biological Methods for Bacillus,John Wiley&Sons[1990][Hardwood和Cutting(编辑)芽孢杆菌属的分子生物学方法,约翰威利父子公司[1990]])。进一步注意到,如本文所述的遗传改变的细胞可以表达多于一种POI,包括两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种等。在一些实施例中,需要在细菌分泌物中增加蛋白质的表达,其包括从细胞分泌的许多不同的蛋白质。
本发明的方面包括用于获得具有改进的蛋白质生产能力的经改变的革兰氏阳性细菌细胞的方法。通常,这些方法包括遗传改变亲本革兰氏阳性细胞以产生遗传改变的子代革兰氏阳性细胞,其中激活磷酸化系统的一个或多个基因的表达(如上所述)。
在某些实施例中,该方法包括将多核苷酸序列引入亲本革兰氏阳性细菌细胞中,当整合到染色体中或作为附加体遗传元件维持时,该方法产生遗传改变的革兰氏阳性细胞,在该细胞中激活磷酸化系统的一个或多个基因的表达水平降低。
已知使用本领域技术人员熟知的多核苷酸载体(例如,质粒构建体)来转化芽孢杆菌属物种,以改变染色体或维持芽孢杆菌属细胞中的附加型遗传元件的各种方法。用于将多核苷酸序列引入芽孢杆菌属细胞的合适方法见于例如Ferrari et al.,“Genetics,”inHarwood et al.(ed.),Bacillus,Plenum Publishing Corp.[1989],pages 57-72[Ferrari等人,“遗传学,”在:Harwood等人(编辑),芽孢杆菌属,Plenum出版公司,[1989],第57-72页]中;还参见,Saunders et al.,J.Bacteriol.,157:718-726[1984];Hoch etal.,J.Bacteriol.,93:1925-1937[1967];Mann et al.,Current Microbiol.,13:131-135[1986];and Holubova,Folia Microbiol.,30:97[1985][Saunders等人,细菌学杂志,157:718-726[1984];Hoch等人,细菌学杂志,93:1925-1937[1967];Mann等人,当代微生物学,13:131-135[1986];和Holubova,微生物学大观,30:97[1985]];针对解淀粉芽孢杆菌,Chang et al.,Mol.Gen.Genet.,168:11-115[1979][Chang等人,分子遗传学与基因组学,168:11-115[1979]];针对巨大芽孢杆菌,Vorobjeva et al.,FEMS Microbiol.Lett.,7:261-263[1980][Vorobjeva等人,FEMS微生物学快报,7:261-263[1980]];针对解淀粉芽孢杆菌,Smith et al.,Appl.Env.Microbiol.,51:634(1986)[Smith等人,应用与环境微生物学,51:634(1986)];针对苏云金芽孢杆菌,Fisher et al.,Arch.Microbiol.,139:213-217[1981][Fisher等人,微生物学文献集,139:213-217[1981]];以及针对球形芽孢杆菌,McDonald,J.Gen.Microbiol.,130:203[1984][McDonald,普通微生物学杂志,130:203[1984]]。实际上,包括原生质体转化和中板集合、转导、和原生质体融合在内的转化方法是已知的并且适合用于本发明。转化方法具体是将本发明提供的DNA构建体引入宿主细胞。
此外,将DNA构建体引入宿主细胞包含本领域已知的将DNA插入宿主细胞而不将靶向DNA构建体插入质粒或载体中的物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸DNA、脂质体等。在另外的实施例中,DNA构建体可以与质粒一起共转化而不插入该质粒中。
在可选择的标志物基因用于选择稳定转化体的实施例中,可能需要使用任何方便的方法从遗传改变的革兰氏阳性菌株中删除可选择的标志物,其中许多方法是本领域已知的(参见,Stahl et al.,J.Bacteriol.,158:411-418[1984];and Palmeros et al.,Gene247:255-264[2000][Stahl等人,细菌学期刊,158:411-418[1984];和Palmeros等人,基因,247:255-264[2000]])。
在一些实施例中,将两个或更多个DNA构建体(即,各自被设计用于遗传改变宿主细胞的DNA构建体)引入亲本革兰氏阳性细胞中,导致在细胞中引入两个或更多个遗传改变,例如,在两个或更多个染色体区域的改变。在一些实施例中,这些区域是连续的(例如,在单个操纵子内的两个区域),而在其他实施例中,这些区域是分开的。在一些实施例中,一种或多种遗传改变是通过添加附加型遗传元件实现的。
在一些实施例中,用根据本发明的一种或多种DNA构建体转化宿主细胞以产生改变的芽孢杆菌菌株,其中两个或更多个基因已经在宿主细胞中失活。在一些实施例中,从宿主细胞染色体中缺失两个或更多个基因。在替代实施例中,通过插入DNA构建体使两个或更多个基因失活。在一些实施例中,灭活的基因是连续的(无论通过缺失和/或插入失活),而在其他实施例中,它们不是连续的基因。
一旦产生遗传改变的宿主细胞,就可以将其在表达感兴趣的蛋白质的条件下培养,其中在某些实施例中回收该POI。
在一些实施例中,本发明包括DNA构建体,该DNA构建体包含进入序列,当稳定并入宿主细胞时,该进入序列遗传改变该细胞,这样使得降低了激活诱导孢子形成起始基因表达的磷酸化系统的一个或多个基因的表达降低(如上文详细描述的)。在一些实施例中,将DNA构建体在体外组装,然后将构建体直接克隆到感受态革兰氏阳性(例如芽孢杆菌属)宿主中,这样使得DNA构建体整合入宿主细胞染色体中。例如,可以采用PCR融合和/或连接以在体外组装DNA构建体。在一些实施例中,DNA构建体是非质粒构建体,而在其他实施例中,其被并入载体(例如,质粒)中。在一些实施例中,使用环状质粒。在实施例中,环状质粒被设计为使用适当的限制酶(即,不破坏DNA构建体的限制酶)。因此,线性质粒可用于本发明。然而,如本领域技术人员已知的,其他方法适用于本发明(参见,例如,Perego,“Integrational Vectors for Genetic Manipulation in Bacillus subtilis,”in(Sonenshein et al.(eds.),Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria,American Society for Microbiology,Washington,DC[1993][Perego,“枯草芽孢杆菌遗传操作的整合载体”,在:(Sonenshein等人(编辑),枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性菌,美国微生物学会,华盛顿,哥伦比亚特区[1993]中])。
在某些实施例中,设计DNA靶向载体以使全部或部分kinA基因、phrA基因、或phrE基因缺失(或允许其缺失)。在某些实施例中,同时或依次使用多个DNA构建体来使kinA基因、phrA基因、和phrE基因中的任何两个或三个缺失。在某些实施例中,DNA靶向载体包括选择性标志物。在一些实施例中,选择性标志物位于两个loxP位点之间(参见,Kuhn andTorres,Meth.Mol.Biol.,180:175-204[2002][Kuhn和Torres,分子生物学方法,180:175-204[2002]]),并且然后通过Cre蛋白的作用来使抗微生物基因缺失。
本发明的方面包括用于增强POI在革兰氏阳性细菌细胞中的表达的方法,该方法包括用上述DNA构建体或载体(即,包括进入序列的DNA构建体或载体,当稳定并入宿主细胞时,遗传上改变该细胞,这样使得磷酸化途径的一个或多个基因的表达降低),允许载体和亲本革兰氏阳性细菌细胞的感兴趣基因中的相应区域的同源重组以产生经改变的革兰氏阳性细菌细胞;并在适于表达POI的条件下生长经改变的革兰氏阳性细菌细胞,其中与革兰氏阳性细菌(亲本)细胞相比,经改变的革兰氏阳性细菌(子代)细胞中POI的产生增加。上文详细描述了可用于本发明的这个方面的革兰氏阳性细胞、突变和其他特征的实例。
无论DNA构建体是否并入到载体中或者在质粒DNA的不存在下使用,将其用于转化微生物。预期,任何合适的转化方法将用于本发明。在某些实施例中,将DNA构建体的至少一个拷贝整合到宿主芽孢杆菌染色体中。在一些实施例中,使用本发明的一种或多种DNA构建体转化宿主细胞。
通过参考以下实例,本领域技术人员可以更充分地理解实施本发明的方式和方法,这些实例不旨在以任何方式限制本发明或涉及其的权利要求的范围。
实例
提供以下实例以便证实和进一步说明本发明的某些实施例和方面,而不应被解释为限制其范围。
在下面的实验披露中,应用以下缩写中的某些:℃(摄氏度);rpm(每分钟转数);μg(微克);mg(毫克);μl(微升);ml(毫升);mM(毫摩尔);μM(微摩尔);sec(秒);min(s)(分钟);hr(s)(小时);OD280(在280nm下的光密度);OD600(在600nm下的光密度);PCR(聚合酶链式反应);RT-PCR(逆转录PCR);SDS(十二烷基硫酸钠)。
实例1
在kinA基因中通过缺失增加芽孢杆菌属中的蛋白质表达
A.在枯草芽孢杆菌中kinA基因座的缺失
通过使用kinA缺失盒的同源重组将kinA中的缺失引入亲本枯草芽孢杆菌细胞中(图1)。通过PCR和kinA基因座的测序证实缺失。所得到的子代细胞由ΔkinA和未经改变的枯草芽孢杆菌细胞(本文称为亲本细胞)表示。SEQ ID NO:1显示了kinA基因的野生型序列,并且SEQ ID NO:2显示了KinA蛋白序列。
B.kinA缺失菌株中的淀粉酶表达
将淀粉酶表达构建体引入ΔkinA(子代细胞)和未经改变的亲本细胞的aprE基因座,该淀粉酶表达构建体驱动来自aprE启动子的AmyE的表达,并且包括氯霉素乙酰转移酶抗性(catR)标记基因(本文中为“PaprE-amyE catR”)。成熟的AmyE蛋白序列如SEQ ID NO:3所示。
在包含25μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上扩增细胞。将ΔkinA(子代)细胞和亲本细胞在5mL的Luria肉汤培养基中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在37℃,250rpm下的摇瓶中的25ml Luria肉汤培养基以测试AmyE淀粉酶蛋白的表达。使用SpectraMax分光光度计在600nm下以每小时间隔测量细胞密度(分子器件公司,唐宁镇,宾夕法尼亚州,美国)。将600nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且将结果示于图2A中。例如,图2A显示亲本细胞和ΔkinA(子代)细胞的细胞生长是等效的,表明(子代)细胞中kinA基因的缺失不影响细胞生长。
使用Ceralpha试剂(梅格泽姆公司(Megazyme),威克洛,爱尔兰)测量全发酵液的AmyE淀粉酶活性。首先将来自Ceralpha HR试剂盒的Ceralpha试剂混合物溶解在10ml的MilliQ水中,随后添加30ml的50mM苹果酸盐缓冲液(pH 5.6)。将培养物上清液在MilliQ水中稀释40倍,并将5μl的稀释的样品添加到55μL稀释的工作底物溶液中。在震荡后,将MTP板于室温下孵育4分钟。通过添加70μl的200mM硼酸盐缓冲液(pH 10.2)(终止溶液)来淬灭反应。使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司,唐宁镇,宾夕法尼亚州,美国)在400nm下测量溶液的吸光度。将400nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且将结果示于图2B中。图2B中的图显示出在经改变的(ΔkinA;子代)细胞中在生长6小时处开始的增加的AmyE生产。鉴于经改变的(ΔkinA;子代)细胞中细胞生长不受影响(如图2A所示),相对于未经改变的(亲本)芽孢杆菌细属胞(在相同的培养条件下生长的),经改变的(ΔkinA;子代)芽孢杆菌属细胞中AmyE产生的增加不是由于培养物中细胞数量的增加,而是由于细胞本身的表达水平增加导致的(即,在逐个细胞的基础上)。
C.kinA缺失菌株中的蛋白酶(FNA)表达
在包含FNA表达盒(本文中称为“PaprE-FNA-catR”)的枯草芽孢杆菌细胞中测试kinA缺失(ΔkinA)对FNA蛋白酶(包含Y217L取代的枯草杆菌蛋白酶BPN’;SEQ ID NO:4)表达的影响。通过用图1所示的构建体转化菌株来使经改变的枯草芽孢杆菌(子代)细胞中的kinA基因缺失。在包含25μg/ml氯霉素的LA平板上扩增携带缺失kinA的壮观霉素霉素抗性菌落。将亲本枯草芽孢杆菌细胞和ΔkinA敲除子代细胞在5mL的Luria肉汤培养基中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在250rpm下的Thompson烧瓶中的25ml 2XNB(描述于PCT国际公开号WO 2010/14483中的2X营养肉汤,1XSNB盐)以测试蛋白酶表达。将全发酵液的细胞密度稀释20倍,并使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司,唐宁顿,宾夕法尼亚州,美国)在600nm下以每小时间隔进行测量。将600nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且将结果示于图3A中,该图3A显示了表达FNA的枯草芽孢杆菌亲本细胞和表达FNA的枯草芽孢杆菌子代细胞(即,ΔkinA)的细胞生长是相等的,表明子代细胞中的kinA缺失不影响细胞生长。
使用如PCT国际公开号WO 2010/144283中所述的N-suc-AAPF-pNA底物(来自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.))监测FNA蛋白酶表达。简言之,在测定缓冲液(100mMTris,0.005%Tween 80,pH 8.6)中将全发酵液稀释40倍,并且将10μl稀释的样品排列在微量滴定板中。将AAPF原液在测定缓冲液(100mg/ml AAPF储备液,在DMSO中,稀释100倍)中稀释,并将190μl该溶液添加到微量滴定板中,并使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司,唐宁顿,宾夕法尼亚州,美国)在405nm下测量溶液的吸光度。将405nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且将结果示于图3B中,该图3B显示了与在相同培养条件下生长的亲本芽孢杆菌属细胞的培养物相比,包含ΔkinA缺失的子代芽孢杆菌属细胞培养物中的FNA产量增加。鉴于经改变的(ΔkinA)芽孢杆菌属子代细胞中细胞生长不受影响(如图3A所示),相对于未经改变的亲本芽孢杆菌属细胞(在相同的培养条件下生长的),芽孢杆菌属(ΔkinA)子代细胞中FNA产生的增加不是由于培养物中细胞数量的增加,而是由于经改变的细胞本身的表达水平的增加(即,在逐个细胞的基础上)。
D.在kinA缺失菌株中的绿色荧光蛋白(GFP)表达
为了测试kinA缺失对其他蛋白质表达的影响,将在aprE启动子控制下的并且进一步包含氯霉素乙酰转移酶抗性标志物(SEQ ID NO:5显示了GFP的氨基酸序列)的GFP表达盒(本文中称为“PaprE-GFP catR”)引入未经改变的枯草芽孢杆菌亲本细胞和经改变的(ΔkinA)枯草芽孢杆菌子代细胞的aprE基因座。在包含5μg/ml氯霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。表达GFP的经改变的枯草芽孢杆菌(ΔkinA)子代细胞和表达GFP的未经改变的枯草芽孢杆菌亲本细胞在5mL的Luria肉汤中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在37℃,250rpm下的摇瓶中的25ml的2XNB培养基(2X营养肉汤,1X SNB盐)中以测试绿色荧光蛋白(GFP)的表达。使用SpectraMax分光光度计在600nm下以每小时间隔测量稀释20倍的全肉汤的细胞密度(分子器件公司(Molecular Devices),唐宁镇,宾夕法尼亚州,美国)。将600nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且将结果示于图4A中,该图4A显示了与表达GFP的枯草芽孢杆菌(ΔkinA)子代细胞相比,表达GFP的枯草芽孢杆菌亲本细胞的细胞生长降低了,表明这些表达GFP的细胞中的kinA缺失对细胞生长有积极的影响。
为了测量GFP表达,将100μl培养物转移到96孔微量滴定板中,并在荧光板读数器中使用485nm的激发波长,508nm的发射波长用495nm发射截止滤光片测量GFP表达。将485/508nm下的相对荧光单位(RFU)作为时间的函数作图,并且将结果示于图4B中。该图显示由于kinA缺失导致的6小时生长的GFP生成的增加。与未经改变的枯草芽孢杆菌亲本细胞相比,经改变的枯草芽孢杆菌(ΔkinA)子代细胞中增加的GFP表达水平超过了仅从图4A中所见的细胞活力的改进的预期。
实例2
通过phrA和phrE基因的缺失增加芽孢杆菌属中的蛋白质表达
A.在枯草芽孢杆菌中phrA基因座的缺失
将phrA基因中的缺失通过图6中示意性示出的缺失盒的同源重组引入亲本枯草芽孢杆菌细胞中。通过PCR和phrA基因座测序证实phrA缺失(ΔphrA)。使用编码Cre重组酶的质粒除去壮观霉素标志物(specR)。
B.在经改变的(ΔphrA)芽孢杆菌属细胞中phrE基因座的缺失
在实例2中,还缺失了phrE基因。通过图7中示意性示出的缺失盒的同源重组所描述的经改变的(ΔphrA)枯草芽孢杆菌子代细胞。通过PCR和phrE基因座测序证实phrE缺失。
C.经改变的(ΔphrA/ΔphrE)芽孢杆菌属细胞中的蛋白质表达
将前文在实施例1中描述的表达盒(即,“PaprE-FNA catR”盒、“PaprE-GFP catR”盒或“PaprE-amyE catR”盒)引入到未经改变的(亲代)枯草芽孢杆菌细胞和经改变的(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的染色体中。如实例1所述进行菌株选择、细胞生长、和酶测定。在氯霉素25ppm平板上选择包含“Paper-FAN caR”盒的枯草芽孢杆菌细胞。在氯霉素5ppm平板上选择包含“Paper-GFP caR”盒或“Paper-AmyE caR”盒的枯草芽孢杆菌细胞。如实例1所述测量细胞密度和蛋白质表达。
图8A显示了表达GFP的亲本枯草芽孢杆菌细胞和表达GFP的子代(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的细胞生长是相等的,表明枯草芽孢杆菌(子代)细胞中的phrA-phrE缺失不影响细胞生长。图8B显示了由于phrA-phrE缺失导致的4小时生长的GFP产生的增加。
图9A显示了表达FNA的亲本枯草芽孢杆菌细胞和表达FNA的子代(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的细胞生长是相等的,表明枯草芽孢杆菌(子代)细胞中的phrA-phrE缺失不影响细胞生长。图9B显示了由于phrA-phrE缺失导致的4小时生长的FNA产生的增加。
图10A显示了表达AmyE的亲本枯草芽孢杆菌细胞和表达AmyE的子代(ΔphrA/ΔphrE)枯草芽孢杆菌细胞的细胞生长是相等的,表明枯草芽孢杆菌(子代)细胞中的phrA-phrE缺失不影响细胞生长。图10B显示了由于phrA-phrE缺失导致的AmyE产生的增加。
虽然前述组合物和方法已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述,但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文的传授内容显而易见的是可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。
因此,前面仅仅举例说明了本发明组合物和方法的原理。将了解的是本领域技术人员将能够设计不同的安排,这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示,但体现本发明组合物和方法的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外,本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解诸位发明人所贡献的本发明的组合物和方法的原理和概念以推动本领域发展,并且将被视为而不限于这些具体叙述的实例和条件。此外,本文中叙述本发明组合物和方法的原理、方面、以及实施例的所有陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外,预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者,即不论结构如何而执行相同功能的任何开发的要素。因此,本发明的组合物和方法的范围不是旨在受限于本文显示和描述的示例性实施例。
序列
SEQ ID NO:1-kinA野生型编码序列
GTGGAACAGGATACGCAGCATGTTAAACCACTTCAAACAAAAACCGATATTCATGCAGTCTTGGCCTCTAATGGACGCATCATTTATATATCTGCCAACTCCAAACTGCATTTGGGCTATCTCCAAGGAGAGATGATCGGATCATTCCTCAAAACGTTTCTGCATGAGGAAGACCAATTTTTGGTTGAAAGCTATTTTTATAATGAACATCATCTGATGCCGTGCACCTTTCGTTTTATTAAAAAAGATCATACGATTGTGTGGGTGGAGGCTGCGGTAGAAATTGTTACGACAAGAGCTGAGCGGACAGAACGGGAAATCATTTTGAAAATGAAGGTTCTTGAAGAAGAAACAGGCCATCAATCCCTAAACTGCGAAAAACATGAAATCGAACCTGCAAGCCCGGAATCGACTACATATATAACGGATGATTATGAACGGTTGGTTGAAAATCTCCCGAGTCCGCTATGCATCAGTGTCAAAGGCAAGATCGTCTATGTAAACAGCGCGATGCTTTCAATGCTGGGAGCCAAAAGCAAGGATGCTATTATTGGTAAATCGTCCTATGAATTTATTGAAGAAGAATATCATGATATCGTGAAAAACAGGATTATACGAATGCAAAAAGGAATGGAAGTCGGAATGATTGAACAGACGTGGAAAAGGCTTGATGGCACACCTGTTCATTTAGAAGTGAAAGCATCCCCGACCGTCTACAAAAACCAGCAGGCTGAGCTGCTGCTGCTGATCGATATCTCTTCAAGGAAAAAATTCCAAACCATCCTGCAAAAAAGCCGTGAACGATATCAGCTGCTGATTCAAAATTCCATTGATACCATTGCGGTGATTCACAATGGAAAATGGGTATTTATGAATGAATCGGGAATTTCCCTGTTTGAAGCGGCTACATATGAGGATTTAATTGGCAAAAACATATACGATCAGCTGCATCCTTGCGATCACGAGGATGTAAAAGAGAGAATCCAAAACATTGCCGAGCAAAAAACAGAATCTGAAATTGTCAAGCAATCCTGGTTCACCTTTCAGAACAGGGTCATCTATACGGAGATGGTCTGCATTCCGACGACCTTTTTTGGTGAAGCGGCCGTCCAGGTCATTCTTCGGGACATCTCAGAGAGAAAACAAACAGAAGAATTGATGCTGAAATCGGAAAAATTATCAATCGCAGGGCAGCTCGCGGCGGGAATCGCCCATGAGATCCGCAACCCTCTTACAGCGATCAAAGGATTTTTACAGCTGATGAAACCGACAATGGAAGGCAACGAACATTACTTTGATATTGTGTTTTCTGAACTCAGCCGTATCGAATTAATACTCAGTGAACTGCTCATGCTGGCGAAACCTCAGCAAAATGCTGTCAAAGAATATTTGAACTTGAAAAAATTAATTGGTGAGGTTTCAGCCCTGTTAGAAACGCAGGCGAATTTAAATGGCATTTTTATCAGAACAAGTTATGAAAAAGACAGCATTTATATAAACGGGGATCAAAACCAATTAAAGCAGGTATTCATTAATTTAATCAAAAATGCAGTTGAATCAATGCCTGATGGGGGAACAGTAGACATTATCATAACCGAAGATGAGCATTCTGTTCATGTTACTGTCAAAGACGAAGGGGAAGGTATACCTGAAAAGGTACTAAACCGGATTGGAGAGCCATTTTTAACAACAAAAGAAAAAGGTACGGGGCTTGGATTAATGGTGACATTTAATATCATTGAAAACCATCAGGGAGTTATACATGTGGACAGCCATCCTGAAAAAGGCACAGCGTTTAAAATTTCATTTCCAAAAAAATAA
SEQ ID NO:2-KinA蛋白序列
MEQDTQHVKPLQTKTDIHAVLASNGRIIYISANSKLHLGYLQGEMIGSFLKTFLHEEDQFLVESYFYNEHHLMPCTFRFIKKDHTIVWVEAAVEIVTTRAERTEREIILKMKVLEEETGHQSLNCEKHEIEPASPESTTYITDDYERLVENLPSPLCISVKGKIVYVNSAMLSMLGAKSKDAIIGKSSYEFIEEEYHDIVKNRIIRMQKGMEVGMIEQTWKRLDGTPVHLEVKASPTVYKNQQAELLLLIDISSRKKFQTILQKSRERYQLLIQNSIDTIAVIHNGKWVFMNESGISLFEAATYEDLIGKNIYDQLHPCDHEDVKERIQNIAEQKTESEIVKQSWFTFQNRVIYTEMVCIPTTFFGEAAVQVILRDISERKQTEELMLKSEKLSIAGQLAAGIAHEIRNPLTAIKGFLQLMKPTMEGNEHYFDIVFSELSRIELILSELLMLAKPQQNAVKEYLNLKKLIGEVSALLETQANLNGIFIRTSYEKDSIYINGDQNQLKQVFINLIKNAVESMPDGGTVDIIITEDEHSVHVTVKDEGEGIPEKVLNRIGEPFLTTKEKGTGLGLMVTFNIIENHQGVIHVDSHPEKGTAFKISFPKK
SEQ ID NO:3-AmyE蛋白序列
LTAPSIKSGTILHAWNWSFNTLKHNMKDIHDAGYTAIQTSPINQVKEGNQGDKSMSNWYWLYQPTSYQIGNRYLGTEQEFKEMCAAAEEYGIKVIVDAVINHTTSDYAAISNEVKSIPNWTHGNTQIKNWSDRWDVTQNSLLGLYDWNTQNTQVQSYLKRFLDRALNDGADGFRFDAAKHIELPDDGSYGSQFWPNITNTSAEFQYGEILQDSASRDAAYANYMDVTASNYGHSIRSALKNRNLGVSNISHYASDVSADKLVTWVESHDTYANDDEESTWMSDDDIRLGWAVIASRSGSTPLFFSRPEGGGNGVRFPGKSQIGDRGSALFEDQAITAVNRFHNVMAGQPEELSNPNGNNQIFMNQRGSHGVVLANAGSSSVSINTATKLPDGRYDNKAGAGSFQVNDGKLTGTINARSVAVLYPD
SEQ ID NO:4-FNA蛋白序列
AGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ
SEQ ID NO:5-GFP蛋白序列
VNRNVLKNTGLKEIMSAKASVEGIVNNHVFSMEGFGKGNVLFGNQLMQIRVTKGGPLPFAFDIVSIAFQYGNRTFTKYPDDIADYFVQSFPAGFFYERNLRFEDGAIVDIRSDISLEDDKFHYKVEYRGNGFPSNGPVMQKAILGMEPSFEVVYMNSGVLVGEVDLVYKLESGNYYSCHMKTFYRSKGGVKEFPEYHFIHHRLEKTYVEEGSFVEQHETAIAQLTTIGKPLGSLHEWV
SEQ ID NO:6-phrA野生型编码序列
ATGAAATCTAAATGGATGTCAGGTTTGTTGCTCGTTGCGGTCGGGTTCAGCTTTACTCAGGTGATGGTTCATGCAGGTGAAACAGCAAACACAGAAGGGAAAACATTTCATATTGCGGCACGCAATCAAACATGA
SEQ ID NO:7-PhrA蛋白序列
MKSKWMSGLLLVAVGFSFTQVMVHAGETANTEGKTFHIAARNQT
SEQ ID NO:8-phrE野生型编码序列
ATGAAATCTAAATTGTTTATCAGTTTATCCGCCGTTTTAATTGGACTTGCCTTTTTCGGATCTATGTATAATGGCGAAATGAAGGAAGCATCCCGGAATGTAACTCTCGCACCTACTCATGAATTCCTTGTTTAA
SEQ ID NO:9-PhrE蛋白序列
MKSKLFISLSAVLIGLAFFGSMYNGEMKEASRNVTLAPTHEFLV
Claims (33)
1.一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加感兴趣的蛋白质(POI)的表达的方法,该方法包括:
(a)获得产生POI的经改变的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低kinA基因、phrA基因或phrE基因的表达的至少一个遗传改变;并且
(b)在表达所述POI的条件下培养所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞,
其中该POI的增加的表达是相对于未经改变的革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的表达而言的。
2.如权利要求1所述的方法,其中步骤(b)的经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低选自kinA、phrA和phrE的至少两个基因的表达的至少两个遗传改变。
3.如权利要求1所述的方法,其中步骤(b)的经改变的革兰氏阳性细菌细胞包含降低kinA的表达的遗传改变、降低phrA的表达的遗传改变和降低phrE的表达的遗传改变。
4.如权利要求1所述的方法,其中该遗传改变进一步被定义为kinA mRNA转录物水平的降低、phrA mRNA转录物水平的降低和/或phrE mRNA转录物水平的降低。
5.如权利要求1所述的方法,其中该POI的表达的增加进一步被定义为该POI mRNA转录物水平的增加。
6.如权利要求1所述的方法,其中该经改变的革兰氏阳性细菌细胞和该未经改变的革兰氏阳性细菌细胞进一步包含至少一个有缺陷或无活性的孢子形成基因。
7.如权利要求6所述的方法,其中该至少一个有缺陷或无活性的孢子形成基因选自下组,该组由以下各项组成:Spo0A、SigF、SigG、SigE、SigK、spoIIAA、spoIIAB、spoIIR、spoIIGA、spoIIIAA、spoIIIAB、spoIIIAC、spoIIIAD、spoIIIAE、spoIIIAF、spoIIIAG、spoIIIAH、spoIVB、bofC、spoIVFA、spoIVFB、spoIVCA、spoIVCB、spoIIIC、和spoIIE。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述经改变的革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。
9.如权利要求8所述的方法,其中该芽孢杆菌属细胞选自下组,该组由以下各项组成:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
10.如权利要求9所述的方法,其中该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述遗传改变是kinA、phrA、和phrE基因中的一个或多个的全部或部分的缺失。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述遗传改变导致KinA、PhrA、和PhrE蛋白中的一种或多种的活性的降低。
13.如权利要求1所述的方法,其中该POI是一种酶。
14.如权利要求13所述的方法,其中该酶选自下组,该组由以下各项组成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
15.如权利要求13所述的方法,其中酶是蛋白酶。
16.如权利要求1所述的方法,进一步包括回收该POI。
17.如权利要求1所述的方法,其中相对于该未经改变的革兰氏阳性细胞,所表达的POI的增加的量是增加至少10%。
18.一种经改变的革兰氏阳性细菌细胞,该经改变的革兰氏阳性细菌细胞相对于未经改变的革兰氏阳性细菌细胞中的POI的表达,表达了增加的量的相同POI,其中该经改变的细菌细胞包含降低kinA基因、phrA基因或phrE基因的表达的至少一个遗传改变。
19.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中该经改变的细胞包含降低选自kinA、phrA和phrE的至少两个基因的表达的至少两个遗传改变。
20.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中该经改变的细胞包含降低kinA的表达的遗传改变、降低phrA的表达的遗传改变和降低phrE的表达的遗传改变。
21.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中该经改变的细胞和该未经改变的细胞进一步包含至少一个有缺陷或无活性的孢子形成基因。
22.如权利要求21所述的细胞,其中该至少一个有缺陷或无活性的孢子形成基因选自下组,该组由以下各项组成:Spo0A、SigF、SigG、SigE、SigK、spoIIAA、spoIIAB、spoIIR、spoIIGA、spoIIIAA、spoIIIAB、spoIIIAC、spoIIIAD、spoIIIAE、spoIIIAF、spoIIIAG、spoIIIAH、spoIVB、bofC、spoIVFA、spoIVFB、spoIVCA、spoIVCB、spoIIIC、和spoIIE。
23.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中该经改变的细胞是芽孢杆菌属的成员。
24.如权利要求23所述的经改变的细胞,其中该芽孢杆菌属细胞选自下组,该组由以下各项组成:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌。
25.如权利要求24所述的经改变的细胞,其中该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。
26.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中所述遗传改变进一步被定义为kinA mRNA转录物水平的降低、phrA mRNA转录物水平的降低和/或phrE mRNA转录物水平的降低。
27.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中降低kinA基因、phrA基因或phrE基因的表达的所述遗传改变是kinA、phrA、和phrE基因的全部或部分的缺失。
28.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中所述遗传改变导致KinA、PhrA、和/或PhrE蛋白的活性降低。
29.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中该POI是一种酶。
30.如权利要求29所述的经改变的细胞,其中该酶选自下组,该组由以下各项组成:乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
31.如权利要求29所述的经改变的细胞,其中酶是蛋白酶。
32.如权利要求18所述的经改变的细胞,进一步包括回收该POI。
33.如权利要求18所述的经改变的细胞,其中相对于该未经改变的革兰氏阳性细胞,所表达的POI的增加的量是增加至少10%。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462094751P | 2014-12-19 | 2014-12-19 | |
US62/094,751 | 2014-12-19 | ||
PCT/US2015/065296 WO2016100128A1 (en) | 2014-12-19 | 2015-12-11 | Enhanced protein expression |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107278230A true CN107278230A (zh) | 2017-10-20 |
CN107278230B CN107278230B (zh) | 2021-10-29 |
Family
ID=55135518
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580076140.XA Active CN107278230B (zh) | 2014-12-19 | 2015-12-11 | 增强的蛋白质表达 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20170369537A1 (zh) |
EP (1) | EP3234149A1 (zh) |
JP (1) | JP2017538433A (zh) |
KR (1) | KR20170093247A (zh) |
CN (1) | CN107278230B (zh) |
WO (1) | WO2016100128A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108949785A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-12-07 | 齐鲁工业大学 | 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用 |
CN112512325A (zh) * | 2018-08-21 | 2021-03-16 | 科·汉森有限公司 | 使用孢子形成阴性芽孢杆菌菌株生产改善的乳制品的方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10940170B2 (en) | 2014-07-07 | 2021-03-09 | University Of Massachusetts | Anthelmintic probiotic compositions and methods |
CN111148524A (zh) * | 2017-05-23 | 2020-05-12 | 马萨诸塞大学 | 经纯化的抗蠕虫组合物及相关方法 |
CN117881772A (zh) * | 2021-08-20 | 2024-04-12 | 丹尼斯科美国公司 | 编码新型核酸酶的多核苷酸、其组合物及其从蛋白质制剂中消除dna的方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006296268A (ja) * | 2005-04-19 | 2006-11-02 | Kao Corp | 組換え微生物 |
WO2008089970A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Dsm Ip Assets B.V. | Sporeformers and screening for sporeformers |
WO2010144283A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | Danisco Us Inc. | Bacillus strain for increased protein production |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4302544A (en) | 1979-10-15 | 1981-11-24 | University Of Rochester | Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system |
US4450235A (en) | 1982-04-21 | 1984-05-22 | Cpc International Inc. | Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system |
US5310675A (en) | 1983-06-24 | 1994-05-10 | Genencor, Inc. | Procaryotic carbonyl hydrolases |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
WO1985000382A1 (en) | 1983-07-06 | 1985-01-31 | Gist-Brocades N.V. | Molecular cloning and expression in industrial microorganism species |
US5264366A (en) | 1984-05-29 | 1993-11-23 | Genencor, Inc. | Protease deficient bacillus |
US5763257A (en) | 1984-05-29 | 1998-06-09 | Genencor International, Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
EP0254735B2 (en) | 1986-01-15 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS |
US4980288A (en) | 1986-02-12 | 1990-12-25 | Genex Corporation | Subtilisin with increased thermal stability |
GB8608194D0 (en) | 1986-04-03 | 1986-05-08 | Massey Ferguson Services Nv | Valve control system |
US5322770A (en) | 1989-12-22 | 1994-06-21 | Hoffman-Laroche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription |
AU620026B2 (en) | 1987-02-27 | 1992-02-13 | Genencor International, Inc. | Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes |
US4914031A (en) | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
DK6488D0 (da) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Novo Industri As | Enzymer |
PT89702B (pt) | 1988-02-11 | 1994-04-29 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de novos enzimas proteoliticos e de detergentes que os contem |
US5665587A (en) | 1989-06-26 | 1997-09-09 | Novo Nordisk A/S | Modified subtilisins and detergent compositions containing same |
DK97190D0 (da) | 1990-04-19 | 1990-04-19 | Novo Nordisk As | Oxidationsstabile detergentenzymer |
US5482849A (en) | 1990-12-21 | 1996-01-09 | Novo Nordisk A/S | Subtilisin mutants |
JP3471797B2 (ja) | 1991-05-01 | 2003-12-02 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 安定化酵素及び洗剤 |
DE4411223A1 (de) | 1994-03-31 | 1995-10-05 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Verwendung alkalischer Proteasen in gewerblichen Textilwaschverfahren |
MA25044A1 (fr) | 1997-10-23 | 2000-10-01 | Procter & Gamble | Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees. |
US6835550B1 (en) | 1998-04-15 | 2004-12-28 | Genencor International, Inc. | Mutant proteins having lower allergenic response in humans and methods for constructing, identifying and producing such proteins |
DK1472347T3 (da) * | 2002-02-15 | 2011-04-04 | Danisco Us Inc | Forbedret proteinekspression i Bacillus Subtilis |
US20100022861A1 (en) | 2008-07-28 | 2010-01-28 | Medtronic, Inc. | Implantable optical hemodynamic sensor including an extension member |
-
2015
- 2015-12-11 KR KR1020177020040A patent/KR20170093247A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-12-11 CN CN201580076140.XA patent/CN107278230B/zh active Active
- 2015-12-11 US US15/533,487 patent/US20170369537A1/en not_active Abandoned
- 2015-12-11 JP JP2017533232A patent/JP2017538433A/ja active Pending
- 2015-12-11 WO PCT/US2015/065296 patent/WO2016100128A1/en active Application Filing
- 2015-12-11 EP EP15823862.6A patent/EP3234149A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006296268A (ja) * | 2005-04-19 | 2006-11-02 | Kao Corp | 組換え微生物 |
WO2008089970A1 (en) * | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Dsm Ip Assets B.V. | Sporeformers and screening for sporeformers |
WO2010144283A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | Danisco Us Inc. | Bacillus strain for increased protein production |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WESTERS HELGA等: "genome engineering reveals large dispensable regions in Bacillus subtilis", 《MOLECULAR BIOLOGY AND EVOLUTION》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108949785A (zh) * | 2018-08-06 | 2018-12-07 | 齐鲁工业大学 | 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用 |
CN112512325A (zh) * | 2018-08-21 | 2021-03-16 | 科·汉森有限公司 | 使用孢子形成阴性芽孢杆菌菌株生产改善的乳制品的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016100128A1 (en) | 2016-06-23 |
KR20170093247A (ko) | 2017-08-14 |
US20170369537A1 (en) | 2017-12-28 |
EP3234149A1 (en) | 2017-10-25 |
CN107278230B (zh) | 2021-10-29 |
JP2017538433A (ja) | 2017-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Veith et al. | The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential | |
CN107278230A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
CN110520520A (zh) | 用于增加地衣芽孢杆菌中蛋白质产生的组合物和方法 | |
CN101903519B (zh) | 杆菌中增强的蛋白质生产 | |
CN105238801A (zh) | 具有修饰的原区的蛋白酶 | |
CN107250365A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
CN111670244B (zh) | 突变的和遗传修饰的芽孢杆菌属细胞及其用于增加蛋白质产生的方法 | |
CN108779154A (zh) | 增强的蛋白质产生及其方法 | |
CN101652468B (zh) | 重组微生物 | |
CN107250371A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
CN106103470A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
US20220282234A1 (en) | Compositions and methods for increased protein production in bacillus lichenformis | |
CN106068273A (zh) | 增强的蛋白质表达 | |
CN115335503A (zh) | 用于增强芽孢杆菌属细胞中蛋白质产生的组合物和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |