CN108779154A - 增强的蛋白质产生及其方法 - Google Patents
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Abstract
本公开总体上涉及产生增加的量的一种或多种目的蛋白质的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此本公开的某些实施例针对相对于未经修饰的(即,亲本)革兰氏阳性细菌细胞,表达增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的(即,子)细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。在某些实施例中,本公开涉及修饰细菌细胞的方法,使得经修饰的(子)细胞产生增加水平的目的蛋白质。在其他实施例中,本公开涉及通过发酵本公开的经修饰的细菌细胞产生的目的蛋白质。本公开的某些其他实施例针对包含如此制备的一种或多种目的蛋白质的一种或多种蛋白质性组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请号62/387,578(2015年12月23日提交)和美国临时申请号62/308,440(2016年3月15日提交)的权益,每个申请通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本公开总体上涉及细菌学、微生物学、遗传学、分子生物学、酶学等领域。某些实施例针对表达和产生增加的量的一种或多种目的蛋白质的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。
序列表的引用
命名为“NB40883WOPCT_SequenceListing.txt”的文本文件序列表的电子提交的内容创建于2016年11月16日,并且大小为39KB,将其通过引用以其全文结合在此。
背景技术
微生物宿主中蛋白质(例如酶、抗体、受体等)的产生在生物技术领域中是特别有意义的。同样,用于产生和分泌一种或多种目的蛋白质的微生物宿主细胞的优化具有高度相关性,特别是在如下工业生物技术环境中,其中当蛋白质以大的工业产量生产时该蛋白质产率的微小改善具有重大意义。
革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌由于其优异的发酵特性和高产量(高达25克/升培养物;Van Dijl和Hecker,2013年),经常被用作微生物工厂,用于产生工业相关蛋白质。例如,枯草芽孢杆菌因其产生食品、纺织品、洗衣、制药工业等所必需的α-淀粉酶(Jensen等人,2000;Raul等人,2014)和蛋白酶(Brode等人,1996)而为人熟知(Westers等人,2004)。由于这些非致病性革兰氏阳性细菌产生完全不含毒性副产物(例如脂多糖;LPS,也称为内毒素)的蛋白质,因此它们已经获得了欧洲食品安全局的“安全资格认定”(QPS)状态,并且其许多产品获得了美国食品和药品管理局的“通常认为安全”(GRAS)状态(Olempska-Beer等人,2006;Earl等人,2008;Caspers等人,2010)。
革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌使用各种途径以分泌蛋白质,其中Tat-机构(Raul等人,2014;Goosens等人,2014;Tjalsma等人,2004)和Sec-机构(Tjalsma等人,2004)是研究得最为彻底的两个。大部分蛋白质经由Sec-途径(Harwood和Cranenburgh,2007)以未折叠(非天然)构象分泌,其中疏水性信号肽将蛋白质引导至细胞的易位机构。在经由SecYEG易位子易位后不久,由ATP酶SecA促进,蛋白质的信号肽被信号肽酶SipS-SipW(Tjalsma等人,1997)之一释放(切割),并随后被信号肽肽酶TepA和SppA降解(Bolhuis等人,1999)。
在过去的30年中,已经进行了许多研究以改善枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等的异源蛋白质的分泌。这种优化的主要靶标是信号肽的组成、SRP、易位机构、信号肽酶和调控因子(Kang等人,2014)。最近,发现必需蛋白质PrsA(参与翻译后折叠)和分子伴侣DnaK的过表达导致枯草芽孢杆菌中淀粉酶分泌的增加(Chen等人,2015),证明了正确折叠对高效蛋白质分泌的影响,其中PrsA被认为是高效蛋白质分泌的限制性因素(Kontinen和Sarvas,1993)。此外,最近已证明,PrsA可以被位于细胞壁中的WprA和其他蛋白酶降解(Krishnappa等人,2014),使其不适用于工业用途。
因此,由于这些微生物细胞工厂的高商业/工业用途,生物技术领域非常需要用于改善革兰氏阳性细菌中工业相关蛋白质的分泌和/或产生的新靶标。本公开解决并满足对革兰氏阳性细菌细胞中目的蛋白质产生和/或分泌的增加的未满足需求。更具体地,如以下在发明详述中阐述的,本公开是针对令人惊讶和意外的发现,即,革兰氏阳性细菌细胞被修饰以表达或过表达rasP基因,所述rasP基因编码“调节抗σ因子蛋白酶(regulating anti-sigma factor protease)”或“RasP”(以前称为YluC),导致从经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的一种或多种目的蛋白质的产生增加。
发明内容
在某些实施例中,本公开针对相对于未经修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞产生增加的量的目的蛋白质(下文称为“POI”)的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。在某些实施例中,增加rasP基因表达的修饰是对内源染色体rasP基因的修饰。在其他实施例中,内源染色体rasP基因的天然启动子被具有比天然rasP启动子更高活性的任何启动子取代。在某些其他实施例中,内源染色体rasP基因的天然启动子被spoVG启动子或aprE启动子取代。在又其他实施例中,所述spoVG启动子包含与SEQ ID NO:3具有95%序列同一性的核苷酸序列。在其他实施例中,所述aprE启动子包含与SEQ ID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
在某些其他实施例中,所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。在其他实施例中,天然rasP染色体5'-UTR被与SEQ ID NO:5的aprE 5'-UTR具有95%序列同一性的5'-UTR置换。在又其他实施例中,所述内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然启动子和天然5'-UTR二者的修饰。
在某些其他实施例中,增加rasP基因表达的修饰是包含rasP基因的外源多核苷酸。在具体的实施例中,包含rasP基因的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。在另一个实施例中,所述染色体外质粒是表达盒。在其他实施例中,所述染色体外质粒是整合质粒。在某些其他实施例中,所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
在其他实施例中,增加rasP表达的遗传修饰是包含外源rasP可读框(ORF)的多核苷酸,其中所述ORF有效地连接并处于组成型启动子、诱导型启动子或条件型启动子(conditional promoter)的控制下。在某些实施例中,包含rasP ORF的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。在某些实施例中,所述染色体外质粒是表达盒。在某些其他实施例中,所述染色体外质粒是整合质粒。在具体的实施例中,将质粒整合到经修饰的细胞的染色体中。
在其他实施例中,rasP基因包含与SEQ ID NO:1的可读框(ORF)核酸序列具有至少60%序列同一性的核酸序列。在其他实施例中,SEQ ID NO:1的ORF编码RasP多肽,其中RasP多肽被进一步定义为具有位点-2蛋白酶(S2P)活性的Zn2+金属蛋白酶。在另一个实施例中,rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有60%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:6的活性位点共有序列(LVFFHELGHLL),其与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基16至26对齐。在又其他实施例中,rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有80%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列(HEXXH),其与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基20至24对齐。
在其他实施例中,相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的增加的量为至少5%的增加。在另一个实施例中,相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的增加的量为至少10%的增加。
在某些其他实施例中,所述革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。在又其他实施例中,该芽孢杆菌属选自:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、B.marmaresis、和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。在另一个实施例中,所述芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
在某些其他实施例中,所述POI由经修饰的细菌细胞的外源基因或经修饰的细菌细胞的内源基因编码。在又其他实施例中,所述POI是细胞外分泌或转运的。另外的实施例中,细胞外分泌或转运的POI被进一步分离和纯化。
在某些其他实施例中,所述POI是酶。在其他实施例中,该酶选自下组,该组由以下组成:乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
在另一个实施例中,本公开针对由本公开的经修饰的细胞产生的分离的POI。
在某些其他实施例中,本公开针对一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加POI的产生的方法,该方法包括:(a)获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰,以及(b)在使POI表达的条件下培养所述经修饰的细胞,其中所述产生增加的量的POI的经修饰的细菌细胞是相对于在未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的产生而言的。
在某些其他实施例中,本公开针对由本公开的方法产生的分离的POI。
在其他实施例中,本公开针对一种用于获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的方法,该方法包括:(a)将增加rasP基因表达的至少一个基因修饰引入亲本革兰氏阳性细菌细胞,以及(b)选择表达增加的量的POI的一个或多个子细胞,其中针对产生增加的量的POI选择的一个或多个子细胞被定义为经修饰的(子)革兰氏阳性细菌细胞。
附图说明
图1比较了从经修饰的枯草芽孢杆菌细胞分泌至培养基的AmyE淀粉酶、AmyL淀粉酶和蛋白酶BPN'-Y217L的表达,所述经修饰的枯草芽孢杆菌细胞相对于未经修饰的(亲本;野生型)枯草芽孢杆菌细胞,包含缺失的tepA基因(ΔtepA)抑或缺失的rasP基因(ΔrasP)。图1A显示了从与枯草芽孢杆菌(亲本)细胞相比,缺少rasP或tepA基因的枯草芽孢杆菌细胞分泌的酶(AmyE、AmyL和BPN'-Y217L)的LDS-PAGE凝胶。图1B显示了使用ImageJ的分泌的AmyE、AmyL和BPN'-Y217L蛋白质的定量,呈现为相对于从未经修饰的(亲本)野生型枯草芽孢杆菌细胞分泌的蛋白质的比率,从枯草芽孢杆菌细胞(所述枯草芽孢杆菌细胞包含缺失的rasP(ΔrasP)或tepA(ΔtepA)基因)分泌的蛋白质的比率(即ΔtepA细胞/wt细胞和ΔrasP/wt细胞)。
图2显示了在OD600测量的细胞密度(图2A)和来自野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞的AmyE的产生(图2B),经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因,以及经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子和aprE 5′UTR(即,“PspoVG-UTR-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因。
图3显示了来自野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞的淀粉酶PcuAmy1-v6的摇瓶产生,以及经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因。
图4显示了来自野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞的淀粉酶PcuAmy1-v6的细胞密度(图4A)和产生(图4B),以及经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-tepA”表达盒)的控制下表达/过表达tepA基因。
图5显示了来自野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞的β-D-葡聚糖酶(BglC)的产生,以及经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因。
图6显示了来自野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞的Properase的细胞密度(图6A)和产生(图6B),以及经修饰的枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因。
图7显示了从野生型(亲本)枯草芽孢杆菌细胞表达的“AmyAc家族”α-淀粉酶的细胞密度(图7A)和产生(图7B),以及经修饰的(子)枯草芽孢杆菌细胞包含并在spoVG启动子(即,“PspoVG-rasP”表达盒)的控制下表达/过表达rasP基因。用于该实验的亲本和经修饰的(子)枯草芽孢杆菌细胞使用5SM12生长培养基生长于深孔微量滴定板(DWMTP)中。
发明详述
本公开总体上涉及产生增加的量的一种或多种目的蛋白质(下文称为“POI”)的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此,本公开的某些实施例针对相对于产生相同POI的未经修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞,产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
如本文所阐述的,rasP基因编码“调节抗σ因子蛋白酶”或“RasP”(以前称为YluC)。RasP属于一组依赖锌的膜内切割蛋白酶(或“iClip”),并且在本文中进一步定义为位点-2蛋白酶(S2P)或位点-2锌金属蛋白酶(参见例如Saito等人,2011;Heinrich等人,2008)。在某些实施例中,本公开的RasP多肽进一步定义为属于酶学委员会(EC)类别3.4.24(EC3.4.24)的水解酶(例如,肽酶),并且更具体地是金属内肽酶。
鉴于本文描述的经修饰的细菌细胞、其组合物及其方法,定义以下术语和短语。在此未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中,但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。在此引用的所有公开物以及专利都通过引用结合在此。
进一步注意的是,权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此,该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”、“排除”等或利用“否定型”限定的前提基础。
如将对于本领域技术人员显而易见的是,在阅读本公开时,本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征,这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。
如本文所定义的,“经修饰的细胞”、“经修饰的细菌细胞”或“经修饰的宿主细胞”可互换使用并且是指重组革兰氏阳性细菌(宿主)细胞,这些重组革兰氏阳性细菌(宿主)细胞包含增加rasP基因表达的修饰(例如,遗传修饰)。例如,本公开的“经修饰的”革兰氏阳性细菌细胞可以进一步定义为“经修饰的(宿主)细胞”,其源自亲本细菌细胞,其中经修饰的(子)细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
如本文所定义的,“未经修饰的细胞”、“未经修饰的细菌细胞”或“未经修饰的宿主细胞”可互换使用并且是指“未经修饰的”(亲本)革兰氏阳性细菌(宿主)细胞,这些“未经修饰的”(亲本)革兰氏阳性细菌(宿主)细胞不包含增加rasP基因表达的修饰。
如本文所使用的,当将“未经修饰”(亲本)细胞中的POI的表达和/或产生和/或分泌与“经修饰的”(子)细胞中的相同POI的表达和/或产生和/或分泌相比较时,应该理解,在基本上相同的条件下(例如,相同的条件,如培养基、温度、pH等)生长/培养/发酵“经修饰的”和“未经修饰的”细胞。
同样,如本文所定义的,术语“增加产生”,“增强产生”,“增加POI产生”,“增强POI产生”等是指“经修饰的”(子)细胞包含增加rasP基因表达的修饰,其中“增加”总是与表达相同POI的“未经修饰”(亲本)细胞相对(相对应)。
如本文所使用的,“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分,以及可能是双链或单链的基因组或合成来源的DNA、cDNA和RNA,无论是代表有义链还是反义链。应该理解,由于遗传密码的简并性,许多核苷酸序列可以编码给定的蛋白质。
应该理解本文所述的多核苷酸(或核酸分子)包括“基因”、“载体”或“质粒”。因此,术语“基因”是指编码氨基酸具体序列的多核苷酸,其包括所有或部分蛋白质编码序列,并且可以包括调节(非转录的)DNA序列,如启动子序列,该启动子序列决定例如基因在其下表达的条件。基因的转录区域可以包括非翻译区域(UTR)(这些非翻译区域包括内含子、5'-非翻译区(UTR)、和3'-UTR),以及编码序列。
当用于本文时,术语“编码序列”指的是直接确定其(编码的)蛋白质产物氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由通常以ATG起始密码子开始的可读框确定。编码序列典型地包括DNA、cDNA、和重组核苷酸序列。
如本文定义的,术语“可读框”(下文称为“ORF”)意指包含不间断阅读框的核酸或核酸序列(无论是天然存在的、非天然存在的、或合成的),不间断阅读框由以下组成:(i)起始密码子,(ii)一系列代表氨基酸的两(2)个或更多个密码子,和(iii)终止密码子,该ORF以5'至3'方向阅读(或翻译)。例如,在某些实施例中,包含“增加rasP基因表达”的经修饰的细胞、经修饰的细菌细胞或经修饰的宿主细胞涵盖包含编码RasP多肽的ORF的重组革兰氏阳性细菌细胞,其中编码RasP多肽的ORF序列的表达有效地连接并处于组成型启动子、诱导型启动子、条件型启动子等的控制下;并任选地包含5'和3'调节(非转录)核酸序列。
如本文所使用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核酸序列。通常,编码序列位于启动子序列3'(下游)。启动子能以其整体来自天然基因,或者由来自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成,或甚至包含合成的核酸区段。本领域技术人员应该理解,不同启动子可以在不同细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件或生理条件来指导基因表达。引起基因在大多数细胞类型中表达的启动子大多数时候通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到,由于在大多数情况下还不能完全确定调节序列的确切边界,不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
如本文所使用的术语“有效地连接”是指核酸序列在单个核酸片段上的缔合,这样使得一个核酸片段的功能受到另一个影响。例如,当能够实现该编码序列的表达(即编码序列在启动子的转录控制下)时,启动子与该编码序列(例如ORF)有效地连接。编码序列可以在正义或反义方向上有效地连接到调节序列上。
如本文定义的,“适合的调节序列”是指位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列),并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构等。
如本文所定义的,术语“引入”,如短语中所使用的,如“向细菌细胞中引入”至少一种多核苷酸可读框(ORF)、或其基因、或其载体,包括本领域已知用于将多核苷酸引入细胞的方法,这些方法包括但不限于原生质体融合、转化(例如,氯化钙、电穿孔)、转导、转染、缀合等(参见,例如,Ferrari等人,1989)。
如本文所使用的,“转化的”或“转化”意指已经通过使用重组DNA技术转化的细胞。转化典型地通过将一个或多个核苷酸序列(例如,多核苷酸、ORF或基因)插入细胞中而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源的核苷酸序列(即发生在待转化的细胞中不是天然的序列。如本文所使用的,“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物体的基因组中,导致转移的核酸分子的遗传稳定的遗传。
如本文所定义的,宿主细胞“基因组”,细菌(宿主)细胞“基因组”或革兰氏阳性细菌(宿主)细胞“基因组”包括染色体基因和染色体外基因。
如本文所使用的,术语“质粒”、“载体”和“盒”意指染色体外元件,其通常携带典型地不是细胞的中心代谢的一部分的基因,并且通常处于环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性或环状自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列,其中许多核苷酸序列已连接或重组到单一结构中,该单一结构能够将针对选定基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当3'未翻译序列引入到细胞中。
“转化盒”意指包含外源基因(或其ORF),并且除了促进具体宿主细胞的转化的外源基因之外,还具有元件的特定载体。
“表达盒”是指包含外源基因(或其ORF),并且除了允许在宿主细胞中“增加”外源(异源)基因的表达的外源基因之外,还具有元件的特定载体。
许多原核和真核表达载体可商购获得并且是本领域熟知的。适合的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。
如本文所使用的,术语“载体”是核酸可以在生物体、细胞、或细胞组分之间传播和/或转移的任何手段。载体包括为“附加体”的病毒、噬菌体、前病毒、质粒、噬菌粒、转座子、和人造染色体如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、和PLAC(植物人工染色体)等,即,其自主复制或可以整合到宿主微生物的染色体中。
“表达载体”是指具有在外来细胞中并入并表达异源DNA的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。
“靶向载体”是包含与其转化的宿主细胞的染色体中的区域同源的多核苷酸序列并且可以驱动该区域的同源重组的载体。靶向载体用于通过同源重组将突变或外源性基因序列引入细胞的染色体中。在一些实施例中,靶向载体包含其他非同源序列,例如添加到末端(即,填充序列或侧翼序列)。末端可以闭合,这样使得靶向载体形成闭环,例如像,插入载体中。适当载体的选择和/或构建在本领域技术人员的知识内。
如本文所使用的,术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体,并且其在许多细菌和一些真核生物中形成额外的染色体自复制遗传元件。在一些实施例中,质粒被合并入宿主细胞的基因组中。
如本文所使用的,术语“目的蛋白质”或“POI”是指期望在经修饰的革兰氏阳性细菌细胞(例如“宿主”细胞)中表达的目的多肽,其中所述POI以增加的水平产生(即,相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞)。因此,如本文所使用的,POI可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、受体蛋白、抗体等。
类似地,如本文所定义的,“目的基因”或“GOI”是指编码POI的核酸序列(例如,多核苷酸、基因或可读框)。编码POI的GOI可以是天然存在的基因、突变的基因或合成的基因。
如本文所使用的,术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用,并且是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用,用于氨基酸残基的常规单(1)字母或三(3)字母代码。多肽可以是线性的或支化的,它可以包含经修饰的氨基酸,并且它可以被非氨基酸中断。
术语多肽还涵盖已经天然地或通过干预被经修饰的氨基酸聚合物;这些修饰是例如,二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰,例如与标记组分轭合。该定义中还包括,例如,包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如,非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他经修饰的多肽。
在某些实施例中,本公开的基因编码商业相关的工业目的蛋白质,例如酶(例如乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖苷水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合)。
如本文所定义的,“内源基因”是指位于生物体基因组的其天然位置中的基因。
如本文所定义的,“异源”基因、“非内源”基因、或“外源”基因是指通常不在宿主生物体中被发现,但通过基因转移引入宿主生物体中的基因(或ORF)。外源(异源)基因包含插入非天然生物体中的天然基因(或ORF)和/或插入天然或非天然生物体中的嵌合基因。
如本文所使用的,术语“表达”是指源自本公开的核酸分子的正义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此,术语“表达”包括与多肽产生有关的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。
如本文所使用的,“变体”多肽是指通过取代、添加或缺失一个或多个氨基酸,通常通过重组DNA技术衍生自亲本(或参考)多肽的多肽。变体多肽与亲本多肽可以相差小数量的氨基酸残基,并且可以通过它们与亲本(参比)多肽在一级氨基酸序列同源性/同一性的水平来定义。
优选地,变体多肽与亲本(参比)多肽序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%氨基酸序列同一性。如本文所使用的,“变体”多核苷酸是指编码变体多肽的多核苷酸,其中“变体多核苷酸”与亲本多核苷酸具有特定程度的序列同源性/同一性,或与亲本多核苷酸(或其补体)在严格的杂交条件下杂交。优选地,变体多核苷酸与亲本(参比)多核苷酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%核苷酸序列同一性。
如本文所使用的,“突变”是指核酸序列中的任何变化或改变。存在若干种类型的突变,包括点突变、缺失突变、沉默突变、框位移突变、剪接突变等。可以特异性地进行突变(例如,经由定点诱变)或随机地进行突变(例如,经由化学试剂、通过修复减去的细菌菌株)。
如本文所使用的,在多肽或其氨基酸序列的语境中,术语“取代”是指用一个氨基酸替代(即取代)另一个氨基酸。
如本文所定义的,“异源”核酸构建体或“异源”核酸序列具有不是其被表达的细胞的天然的序列的一部分。
如本文所定义的,“异源控制序列”是指实际上不起调节(控制)GOI表达作用的基因表达控制序列(例如启动子或增强子)。通常,异源的核酸序列对于它们存在的细胞或部分基因组不是内源的(天然的),并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔、原生质体融合等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以包含与在天然宿主细胞中发现的控制序列/DNA编码(ORF)序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
如本文所使用的,术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟蛋白质或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。典型地,信号序列位于前体或成熟蛋白序列的N-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白质中一般不存在信号序列。典型地,在蛋白质转运后,信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。
如本文所使用的,“亲本”细胞是指其中“亲本”细胞的基因组被修饰(例如,引入亲本细胞一个或多个突变或者引入亲本细胞一个或多个基因或ORF)以产生经修饰的“子”细胞的微生物的任何细胞或菌株。
术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“创建的”,并且通常表示一种指定的材料或组合物在另一种指定的材料或组合物中找到它的起源或具有可以参考另一种指定材料或组合物描述的特征。
如本文所使用的,“增加”蛋白质产生是指产生的蛋白质的增加的量。蛋白质可以在宿主细胞内产生,或分泌(或转运)到培养基中。在某些实施例中,目的蛋白质被产生到培养基中。
增加的蛋白质产生可以被检测为如与未经修饰的(亲本)细胞相比,更高的最大水平的蛋白质或酶活性,例如蛋白酶活性、淀粉酶活性、纤维素酶活性或半纤维素酶活性等,或由经修饰的(子)细胞生产的总的细胞外蛋白质。
如本文所使用的,术语“同源性”涉及同源多核苷酸或多肽。如果两个或更多个多核苷酸或两个或更多个多肽是同源的,则这意味着同源多核苷酸或多肽具有至少60%、更优选至少70%、甚至更优选至少85%、还更优选至少90%、更优选至少95%、并且最优选至少98%的“同一性的程度”。两个多核苷酸或多肽序列是否具有如本文所定义的同源程度足够高的同一性,可以通过使用本领域已知的计算机程序,例如GCG程序包(Program Manualfor the Wisconsin Package[威斯康星程序包手册],版本8,1994年8月,遗传学计算机集团(Genetics Computer Group),575科学驱动,麦迪逊,威斯康星州,美国53711)(Needleman和Wunsch,(1970)中提供的“GAP”对齐两个序列来适合地研究。
如本文所使用的,术语“百分比(%)同一性”是指当使用序列对齐程序对齐时,编码多肽或多肽的氨基酸序列的核酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。
如本文所使用的,“比生产力”是在给定时间段内生产的蛋白质的总量/细胞/时间。
如本文所定义的,术语“纯化的”或“分离的”或“富集的”意指生物分子(例如,多肽或多核苷酸)通过将其与它在自然界中相关联的天然存在的成分中的一些或所有分离而被从其天然状态改变。这种分离或纯化可以通过本领域公认的分离技术如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、尺寸排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离进行,以去除最终组合物中所不希望的全细胞、细胞碎片、杂质、外来蛋白质或酶。随后可以进一步向纯化或分离的生物分子组合物中添加成分,该成分提供了额外的益处,例如是活化剂、抗抑制剂、期望的离子、控制pH的化合物或其他酶或化学品。
I.RasP多肽和其编码基因
如前文所阐述的,rasP基因编码“调节抗σ因子蛋白酶”或“RasP”(以前称为YluC);其属于一组锌依赖性膜内切割蛋白酶(或“iClip”),并且在本文中进一步定义为位点-2蛋白酶(S2P)或位点-2锌金属蛋白酶(参见例如Saito等人,2011;Heinrich等人,2008)。如本文所定义的,“rasP”基因(或其ORF)编码“RasP”多肽,并且不意味着限于特定的RasP多肽序列(或rasP基因或编码它的ORF序列)。
因此,在某些实施例中,本公开的rasP基因(或其ORF)可以是编码特征在于具有S2P Zn2+金属蛋白酶活性的多肽的任何核酸(多核苷酸)或其任何同源物或直系同源物核酸序列,只要这种编码多肽(具有S2P Zn2+金属蛋白酶活性)在本公开的经修饰的革兰氏阳性细菌中表达或过表达rasP核酸或其同源物或直系同源物核酸序列时,增加POI产生。
例如,从枯草芽孢杆菌菌株168分离的RasP多肽(例如参见UniProtKB;RASP_BACSU;登录号O31754)包含在SEQ ID NO:2中阐述的422个氨基酸(约46.7kDa),其中位置20和24处的组氨酸氨基酸残基是推定的Zn2+配位/结合位点,并且位置21处的谷氨酸残基是蛋白水解活性位点。
因此,在某些实施例中,编码本公开内的RasP多肽的基因(或其ORF)是编码与SEQID NO:2中阐述的RasP多肽具有约60%序列同一性的多肽的基因或ORF。例如,在UniProtKB数据库中进行BLAST搜索(使用SEQ ID NO:2的枯草芽孢杆菌RasP多肽序列作为主题序列以及以下搜索参数:E-阈值=10;基质=自动;缺口=是)鉴定了一系列与SEQ ID NO:2具有100%至约60%序列同一性的RasP多肽。
在某些其他实施例中,编码本公开的RasP多肽的基因(或其ORF)是包含SEQ IDNO:6的连续活性位点共有序列(LVFFHELGHLL;其中下划线的组氨酸氨基酸是Zn2+结合位点,并且粗体谷氨酸残基是活性位点残基)的多肽,其中SEQ ID NO:6的RasP多肽共有序列的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基16至26对齐,并且结果为至少60%的序列同源性。
在其他实施例中,编码本公开的RasP多肽的基因(或其ORF)是包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列(HEXXH;其中下划线的组氨酸氨基酸是Zn2+结合位点,粗体谷氨酸残基是活性位点残基并且X是任何氨基酸)的多肽,其中SEQ ID NO:7的RasP多肽共有序列的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基20至24对齐,并且结果为至少80%的序列同源性。
在某些实施例中,本公开的RasP多肽进一步定义为属于EC类别3.4.24(EC3.4.24)的金属内肽酶。
II.细菌细胞和使用方法
本公开总体上涉及产生增加的量的一种或多种目的蛋白质的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞。因此本公开的某些实施例针对相对于未经修饰的(即,亲本)革兰氏阳性细菌细胞,表达增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的(即,子)细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
在某些实施例中,本公开涉及修饰细菌细胞的方法,使得经修饰的(子)细胞产生增加水平的目的蛋白质。在其他实施例中,本公开涉及通过发酵本公开的经修饰的细菌细胞产生的目的蛋白质。本公开的某些其他实施例针对包含如此制备的一种或多种目的蛋白质的一种或多种蛋白质性组合物。在又其他实施例中,本公开涉及采用本文所阐述的经修饰的细菌细胞产生一种或多种目的蛋白质的方法,连同产生和使用包含一种或多种目的蛋白质的一种或多种蛋白质性组合物的方法。
在某些实施例中,增加rasP基因表达的细菌细胞的修饰可以是增强或增加经修饰的宿主中rasP基因(或其ORF)表达的任何类型的遗传修饰。例如,在某些实施例中,增加rasP基因表达的细菌细胞的修饰包括rasP基因(或其ORF)的密码子优化,以增强在期望宿主细胞中的表达。在其他实施例中,增加rasP基因表达的宿主细胞的修饰是编码RasP多肽的表达盒,其中将表达盒引入(经修饰的)细胞中。在某些其他实施例中,包含编码RasP多肽的基因或ORF的表达盒处于诱导型启动子、组成型启动子、条件型启动子等的控制下。
在某些实施例中,用于指导编码POI或RasP多肽的多核苷酸序列的转录的启动子是PCT国际公开WO 2001/51643中所阐述的野生型aprE启动子、突变体aprE启动子或共有aprE启动子。在某些其他实施例中,用于指导编码POI或RasP多肽的多核苷酸序列的转录的启动子是野生型spoVG启动子、突变体spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber,1991)。
在某些实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞是芽孢杆菌科成员。在其他实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。在某些实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞是芽孢杆菌细胞,所述芽孢杆菌细胞选自:枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、饲料芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、黏琼脂芽孢杆菌、秋叶氏芽孢杆菌、库拉奇芽孢杆菌、假坚强芽孢杆菌、列城芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌、B.marmarensis。在其他实施例中,该芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
据本领域的认识,芽孢杆菌属继续经历分类学重组。因此,该属旨在包括已重新分类的物种,包括但不限于:例如嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(现在称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)(现在是“多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)”)的此类生物体。
III.产生增加水平的目的蛋白质的经修饰的细胞
为确认经修饰的革兰氏阳性细菌细胞产生POI水平的增加,可以应用各种筛选方法。例如,表达载体可以编码与靶蛋白融合并且用作可检测标签的多肽,或者可替代地,靶蛋白本身可以用作可选择或可筛选的标记。还可以使用蛋白质印迹、斑点印迹(这样的方法的详细描述可获自冷泉港试验方案网站(Cold Spring Harbor Protocols website))、ELISA、或者(如果标记为GFP)全细胞荧光或FACS来检测经标记的蛋白质。
例如,6-组氨酸标签可以被包含以造成与靶蛋白的融合物,并且蛋白质印迹可以用于检测该标签。此外,如果靶蛋白以足够高的水平表达,可以进行与考马斯/银染色结合的SDS-PAGE以充分检测与野生型相比,突变体表达的增加,并且在这种情况下,任何分子都不需要标记。
在其他实施例中,经修饰的(宿主)细胞相对于未经修饰的(亲本)细胞中POI的表达与mRNA转录物水平相关。例如,某些实施例涉及编码POI的基因或ORF的分子表征,其通常包括对RNA表达的时间和空间分布的彻底分析。存在许多广泛使用的程序,并且这些程序在本领域中已知用于检测和确定总RNA或聚(A)RNA样品中具体mRNA的丰度。非限制性实例包括例如Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交、和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法。
可以采用其他方法来确认目的蛋白的改善水平,包括例如,检测蛋白质活性或每个细胞中的量、蛋白质活性或每毫升培养基中的量的增加,从而允许培养或发酵有效地继续更长时间段,或通过这些方法的组合。
比生产力的检测是用于评估蛋白质生产的另一种适合的方法。比生产力(Qp)可以使用以下公式确定:
Qp=gP/gDCW·hr
在此,“gP”是在罐中生产的蛋白质的克数,“gDCW”是在罐中的干细胞重量(DCW)的克数,并且“hr”是从接种时间开始的几小时内的发酵时间,其包括生产时间连同生长时间。
在某些实施例中,本公开的经修饰的细菌细胞如与其未经修饰的(亲本)细胞相比,产生至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、或至少约10%或更高的量的POI。
IV.培养用于产生目的蛋白质的经修饰的细胞
在其他实施例中,本公开提供了与未经修饰的(亲本)细胞相比(即,相对于,用于提高经修饰的细菌细胞的蛋白质生产力的方法。更具体地,在某些实施例中,用于提高经修饰的细菌细胞的蛋白质生产力的方法包括在适合的发酵条件下培养经修饰的细菌细胞,其中经修饰的细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
因此,可以在常规营养培养基中培养宿主细胞和转化细胞。用于转化的宿主细胞的培养基可以适当地修饰以适于激活启动子并选择转化体。特定培养条件(如温度、pH等)可以是用于选择用于表达的宿主细胞的那些条件,并且对于本领域技术人员将是显而易见的。此外,培养条件可以在科学文献中找到,例如Sambrook(1982;2001),Harwood等人(1990),和来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
因此,在某些实施例中,本公开内容针对产生POI的方法,这些方法包括发酵经修饰的细菌细胞,其中经修饰的细胞将POI分泌到培养基中。本领域熟知的发酵方法可用于发酵经修饰的和未经修饰的细菌细胞。
在一些实施例中,细菌细胞在分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵是封闭的系统,其中在发酵开始时设定培养基的组成,并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时,用一种或多种所希望的生物体接种培养基。在这种方法中,允许发酵发生而不向系统添加任何组分。通常,分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格,并且经常对控制因素(例如pH和氧浓度)进行尝试。分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止时。在典型分批培养中,细胞可以通过静态停滞期进展到高生长对数期,最后进入生长速率减少或停止的稳定期。如果不经处理,处于稳定期的细胞最终死亡。通常,在对数期的细胞负责产物的大量生产。
标准分批系统的适合的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中,随着发酵的进展,将底物以增量添加。当分解代谢物抑制可能抑制细胞的代谢时并且在培养基中希望具有有限量的底物的情况下,补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的,并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO2)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是常用的并且在本领域中是已知的。
连续发酵是一个开放的系统,在该系统中,将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中,同时去除等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的高密度,其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如,在一个实施例中,将限制营养素(例如碳源或氮源)维持在固定的速率,并且允许调节所有其他参数。在其他系统中,影响生长的许多因素可以不断改变,而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳定态的生长条件。因此,由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。
这样说,在某些实施例中,可以通过常规方法从培养基中回收由转化的(经修饰的)宿主细胞产生的POI,包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞,或者如果需要,破坏细胞并从细胞部分和碎片中去除上清液。通常经过澄清后,上清液或滤液的蛋白质性组分通过盐(例如硫酸铵)沉淀。然后沉淀的蛋白质被溶解,并且可以通过各种色谱法进行纯化,例如离子交换色谱法、凝胶过滤。
V.转化
可以构建包含编码本公开的RasP多肽或POI的核酸的多核苷酸构建体,使得其由宿主细胞表达。由于遗传密码中已知的简并性,编码相同氨基酸序列的不同多核苷酸可以用本领域常规技术进行设计和制备。例如,可以应用密码子优化来优化具体宿主细胞中的生产。
可以将编码目的蛋白质的核酸掺入载体中,其中可以使用熟知的转化技术(例如本文所公开的那些技术),将所述载体转移至宿主细胞中。
载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如,包含编码POI的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到表达宿主中,使得编码蛋白质的核酸(即,ORF)可以被表达为功能性蛋白质。充当表达宿主(即,经修饰的细菌“宿主”细胞)的细菌细胞包括芽孢杆菌科的成员和芽孢杆菌属的成员。
可用常规技术修饰以包含并且表达编码POI的核酸的代表性载体是载体p2JM103BBI(参见Vogtentanz,2007)。
如上简要陈述,编码RasP多肽或POI的多核苷酸可以有效地连接至适合的启动子,其允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列,并且可以来源于编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。例如,在某些实施例中,增加rasP基因表达的修饰包括用具有比天然rasP启动子具有更高活性的任何启动子取代的天然rasP基因启动子。评估启动子活性/强度的手段对于本领域技术人员是常规的。
(尤其是在细菌宿主细胞中)用于指导编码本公开的RasP多肽或POI的多核苷酸序列的转录的适合的启动子的实例包括大肠杆菌(E.coli)的乳糖操纵子的启动子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。
在某些实施例中,用于指导编码POI或RasP多肽的多核苷酸序列的转录的启动子是PCT国际公开WO 2001/51643中所阐述的野生型aprE启动子、突变体aprE启动子或共有aprE启动子。在某些其他实施例中,用于指导编码POI或RasP多肽的多核苷酸序列的转录的启动子是野生型spoVG启动子、突变体spoVG启动子或共有spoVG启动子(Frisby和Zuber,1991)。
在某些实施例中,所述aprE启动子包含与SEQ ID NO:4具有约90%-95%序列同一性的核酸序列。
在其他实施例中,spoVG启动子包含与SEQ ID NO:3具有约90%-95%序列同一性的核酸序列。
在其他实施例中,用于指导编码RasP多肽或POI的多核苷酸序列转录的启动子是核糖体启动子,例如核糖体RNA启动子或核糖体蛋白质启动子。更具体地,在某些实施例中,核糖体RNA启动子是来源于枯草芽孢杆菌的rrn启动子,更具体地,rrn启动子是来自枯草芽孢杆菌rrnB、rrnI或rrnE核糖体启动子。在某些实施例中,核糖体RNA启动子是来自PCT国际公开号WO 2013/086219中阐述的来自枯草芽孢杆菌的P2rrnI启动子。
RasP或POI编码序列可以有效地连接至信号序列。编码信号序列的核酸序列可以是与待表达的rasP基因或GOI(编码POI)天然相关的DNA序列,或者可以来自不同的属或种。可以将包含多核苷酸构建体或载体的信号序列和启动子序列引入细菌宿主细胞,并且那些序列可以源自相同的来源或不同的来源。例如,在某些实施例中,信号序列是有效地连接至PCT国际公开WO 2001/51643中阐述的aprE启动子的aprE信号序列(参见例如,Vogtentanz等人,2007;Wang等人,1988)。
在某些实施例中,所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。在另一个实施例中,天然rasP染色体5'-UTR被与SEQID NO:5的aprE 5'-UTR具有约90%-95%序列同一性的5'-UTR置换。
表达载体还可以包含适合的转录终止子,以及在真核生物中,包含有效地连接至编码目的蛋白质的DNA序列的某些聚腺苷酸化序列。终止和聚腺苷酸化序列可以适合地源自与启动子相同的来源,但是在其他实施例中,终止和聚腺苷酸化序列可以很好地源自彼此不同的来源和/或作为启动子。
适合的载体可以进一步包含使得该载体能够在宿主细胞中复制的核酸序列。此类使能够序列的实例包括质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pIJ702等的复制起点。
适合的载体还可以包含可选择标记,例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因,例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四环素抗性等)的基因。
适合的表达载体典型地包括克隆载体的组分,例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体典型地还包含控制核苷酸序列,例如像启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因、一个或多个激活子基因序列、或类似序列。
此外,适合的表达载体可以进一步包含编码氨基酸序列的序列,该氨基酸序列能够将目的蛋白质靶向宿主细胞细胞器(例如过氧物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列可以是例如氨基酸序列“SKL”。对于在控制序列的指导下进行表达,将目的蛋白质的核酸序列以适合的方式有效地连接至控制序列,使得表达发生。
如本文描述的用于连接编码目的蛋白质的DNA构建体、启动子、终止子和/或其他元件,并将它们插入到包含复制必需信息的适合载体中的方案是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等人,1989和第3版,2001)。
包含多核苷酸构建体抑或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生POI的宿主细胞。所述细胞可以用编码POI的DNA构建体转化,方便地通过将构建体(按一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中。整合通常被认为是有利的,因为如此引入的DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。DNA构建体整合到宿主染色体中可以应用常规方法进行,例如通过同源或异源重组。可替代地,可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。
在其他实施例中,从表达宿主中缺失基因是有利的,其中基因缺陷可以通过表达载体治愈。已知的方法可用于获得具有一个或多个失活基因的细菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失,通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得该基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。
用于转化细菌和培养细菌的技术是本领域中标准和熟知的。它们可以用于转化本公开的改良宿主以生产目的重组蛋白。将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括如下技术如:转化;电穿孔;核显微注射;转导;转染,例如脂质介导的转染和DEAE-糊精介导的转染;用磷酸钙DNA沉淀孵育;用DNA包被的微粒高速轰击;基因枪(gene gun)或生物射弹转化和原生质体融合、等。Brigidi等人还公开了细菌的转化和表达方法(1990)。在Ferrari等人的美国专利号5,264,366中提供了用于蛋白酶缺失的芽孢杆菌菌株的优选的一般转化和表达方案。
VI.通过经修饰的细胞产生目的蛋白质
在另一个实施例中,本公开提供了用于产生增加的POI水平的方法,该方法包括获得经修饰的表达增加的量POI的革兰氏阳性细菌细胞,其中经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因(或其ORF)表达的修饰,以及在使得表达POI的条件下培养所述经修饰的细胞,其中所述表达的增加的量POI的经修饰的细菌细胞是相对于在未经修饰的革兰氏阳性细菌细胞中POI的表达而言的。
POI可以是任何内源或异源蛋白质,并且它可以是这种POI的变体。蛋白质可以包含一个或多个二硫键,或者是其功能形式是单体或多聚体的蛋白质,即蛋白质具有四级结构并且由多个相同(同源的)或不相同的(异源的)亚基构成,其中POI或其变体POI优选是具有目的特性的POI。
在某些实施例中,所述POI或其变体POI选自下组,该组由以下组成:乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、碳酸酐酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、糖苷水解酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
所述POI或其变体POI还可以是肽、肽激素、生长因子、凝固因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如,HBV表面抗原、HPV E7等)及其变体或其片段。
其他类型的感兴趣的蛋白质(或变体)可以是能够为食品或作物提供营养价值的蛋白质或变体。非限制性实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白质(例如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)。
VII.蛋白质性组合物的用途
在另一个实施例中,本公开提供了包含一种或多种目的蛋白质的蛋白质性组合物。蛋白质性组合物使用本文提供的方法适合地生产。蛋白质性组合物包含由目的基因编码、使用本文所述的方法表达的目的蛋白。该组合物可用于各种有用的工业应用中,例如像用于生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理、个人护理产品等中。
例如,由此产生的蛋白质性组合物可以用于清洁应用中。酶促清洁组分是受欢迎的,因为它们能够分解常规化学洗涤剂不容易分解的土壤、污渍和其他杂物。可用于清洁的众所周知的酶包括蛋白酶和淀粉酶,连同其他酶例如脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶,甚至是某些纤维素酶,这些酶各自提供一组不同的功能。蛋白酶与基于蛋白质的污渍相抗衡;淀粉酶对碳水化合物和淀粉起作用;并且脂肪酶分解例如脂质或脂肪。本公开为在清洁应用中的这样的用途提供了经修饰的细菌细胞,该细菌细胞已经被证明具有改善的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是适合和有利的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质性组合物可以用于谷物加工中。淀粉是植物中最常见的储存碳水化合物,由植物本身以及由微生物和由高等生物使用。多种酶能够催化淀粉水解。来自所有植物来源的淀粉以颗粒的形式发生,但是取决于植物来源的种类,淀粉呈现明显不同的大小和物理特征。淀粉的酸水解在过去被广泛使用,然而这一过程现在已经在很大程度上被酶促加工所替换,已知所述酶促加工要求更少的耐腐蚀材料和其他益处,需要更少的加热能量,并且比酸处理相对更容易控制。本公开为在淀粉降解和谷物加工中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌的细胞,该真菌细胞已经被证明具有改善的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是适合和有利的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质性组合物可以用于食品应用中。由细菌、酵母和霉菌产生的酶数千年以来已经用于食品应用,以制作食品例如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒。今天,酶被用于面包店、奶酪制作、淀粉加工、以及果汁和其他饮料的生产中,提供各种益处,例如改善的质地、外观和营养价值,产生理想的香味和香气等。食品酶典型地来源于动物和植物(例如淀粉消化酶,即淀粉酶,可以从大麦种子发芽获得)以及来自一系列有益微生物。酶被认为是传统基于化学的技术的可行和理想的替代品,在许多工艺中替代合成的化学药品。酶可以帮助改善食品生产过程的环境性能,降低能源消耗并改善废物或副产品的生物降解性。就其作用而言,酶比合成的化学药品更具特异性,因此,酶促加工常常提供更少的副反应和废物或副产物,因此生产更高质量的产品并降低污染的可能性。酶促加工通常也是唯一可行的加工。这方面的一个实例是浓缩苹果清汁的生产,其依赖于酶(果胶酶)的使用。大多数食品酶由微生物例如芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属或克鲁维酵母属生产。本公开为在食品应用中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌的细胞,该真菌细胞已经被证明具有改善的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是适合和有利的。
在另一个实例中,由此制得的蛋白质性组合物可以用于动物饲料添加剂中。纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶和其他目的碳水化合物酶已经广泛用于动物饲料工业。由于许多基于植物的饲料包含具有减少动物生长的抗营养因子的物质,所以添加到此类饲料中的酶通过降解纤维、蛋白质、淀粉和植酸来改善这些抗营养因子的可消化性,使它们更易被动物消化,并且使得能够使用更便宜和通常在本地生产的饲料,同时使肉、蛋或奶的生产力最大化。同时,添加到此类饲料中的酶还可以提供支持肠道健康和增强的动物性能的益处。本公开为在动物饲料应用中的这样的用途提供了工程化的、转化的或衍生的真细菌的细胞,该真菌细胞已经被证明具有改善的蛋白质生产,作为目的工业酶、变体和混合物的生产者是适合和有利的。
在又另外的实例中,由此制得的蛋白质性组合物可以用于纺织品应用中。酶已经成为纺织品加工的一个不可分割的部分。在纺织品工业中存在两个已确立起来的酶应用。首先,酶(例如淀粉酶)通常用于预精整区域以用于退浆。第二,酶(例如纤维素酶)通常用于精整区域以用于软化、生物石化和减少棉制品的起球倾向。
其他酶例如像果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶等也用于织物品加工。此外,有各种需要酶的应用,包括牛仔布和非牛仔布的褪色、生物洗擦、生物磨光、羊毛精整、过氧化物去除、染料的脱色等。因此,在某些实施例中,本公开为在纺织品应用中的这样的用途提供了经修饰的革兰氏阳性细菌细胞(其在本文证明为具有改善的蛋白质生产),作为目的工业酶、变体和混合物的生产者。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例如下:
1.一种经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其相对于未经修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞产生增加的量的目的蛋白质(POI),其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
2.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP基因表达的修饰是对内源染色体rasP基因的修饰。
3.如实施方案2所述的经修饰的细胞,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被具有比天然rasP启动子更高活性的任何启动子取代。
4.如实施方案2所述的经修饰的细胞,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被spoVG启动子或aprE启动子取代。
5.如实施方案4所述的经修饰的细胞,其中所述spoVG启动子包含与SEQ ID NO:3具有95%序列同一性的核苷酸序列。
6.如实施方案4所述的经修饰的细胞,其中所述aprE启动子包含与SEQ ID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
7.如实施方案2所述的经修饰的细胞,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。
8.如实施方案7所述的经修饰的细胞,其中所述天然rasP染色体5'-UTR被包含与SEQ ID NO:5的aprE 5'-UTR具有95%序列同一性的5'-UTR置换。
9.如实施方案2所述的经修饰的细胞,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然启动子和天然5'-UTR二者的修饰。
10.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP基因表达的修饰是包含rasP基因的外源多核苷酸。
11.如实施方案10所述的经修饰的细胞,其中所述包含rasP基因的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
12.如实施方案11所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是表达盒。
13.如实施方案11所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是整合质粒。
14.如实施方案13所述的经修饰的细胞,其中所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
15.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP表达的遗传修饰是包含外源rasP可读框(ORF)的多核苷酸,其中所述ORF有效地连接并处于组成型启动子、诱导型启动子或条件型启动子(conditional promoter)的控制下。
16.如实施方案15所述的经修饰的细胞,其中包含rasP ORF的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
17.如实施方案16所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是表达盒。
18.如实施方案16所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是整合质粒。
19.如实施方案18所述的经修饰的细胞,其中所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
20.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因包含与SEQ ID NO:1的可读框(ORF)核酸序列具有至少60%序列同一性的核酸序列。
21.如实施方案20所述的经修饰的细胞,其中SEQ ID NO:1的ORF编码RasP多肽,其中所述RasP多肽被进一步定义为具有位点-2蛋白酶(S2P)活性的Zn2+金属蛋白酶。
22.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有60%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:6的活性位点共有序列,该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基16至26对齐。
23.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有80%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列(HEXXH),该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基20至24对齐。
24.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的量的增加为至少5%的增加。
25.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的增加的量为至少10%的增加。
26.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌(Bacillus)属的成员。
27.如实施方案26所述的经修饰的细胞,其中该芽孢杆菌属选自:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、B.marmarensis和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
28.如实施方案27所述的经修饰的细胞,其中该芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
29.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。
30.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中该POI是细胞外分泌或转运的。
31.如实施方案30所述的经修饰的细胞,其中细胞外分泌或转运的POI被进一步分离和纯化。
32.如实施方案1所述的经修饰的细胞,其中所述POI是酶。
33.如实施方案32所述的经修饰的细胞,其中所述酶选自下组,该组由以下组成:乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
34.一种由如实施方案1所述的经修饰的细胞产生的分离的POI。
35.一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加POI的产生的方法,该方法包括:
(a)获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰,以及
(b)在使POI表达的条件下培养所述经修饰的细胞,其中所述产生增加的量的POI的经修饰的细菌细胞是相对于在未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的产生而言的。
36.如实施方案35所述的方法,其中所述增加rasP基因表达的修饰是对内源染色体rasP基因的修饰。
37.如实施方案36所述的方法,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被具有比天然rasP启动子更高活性的任何启动子取代。
38.如实施方案35所述的方法,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被spoVG启动子或aprE启动子取代。
39.如实施方案38所述的方法,其中所述spoVG启动子包含与SEQ ID NO:3具有95%序列同一性的核苷酸序列。
40.如实施方案38所述的方法,其中所述aprE启动子包含与SEQ ID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
41.如实施方案35所述的方法,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。
42.如实施方案41所述的方法,其中所述天然rasP染色体5'-UTR被包含与SEQ IDNO:5的aprE 5'-UTR具有95%序列同一性的5'-UTR置换。
43.如实施方案35所述的方法,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然启动子和天然5'-UTR二者的修饰。
44.如实施方案35所述的方法,其中所述增加rasP基因表达的修饰是包含rasP基因的外源多核苷酸。
45.如实施方案44所述的方法,其中所述包含rasP基因的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
46.如实施方案45所述的方法,其中所述染色体外质粒是表达盒。
47.如实施方案45所述的方法,其中所述染色体外质粒是整合质粒。
48.如实施方案47所述的方法,其中所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
49.如实施方案35所述的方法,其中所述增加rasP表达的遗传修饰是包含外源rasP可读框(ORF)的多核苷酸,其中所述ORF有效地连接并处于组成型启动子、诱导型启动子或条件型启动子(conditional promoter)的控制下。
50.如实施方案49所述的方法,其中包含rasP ORF的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
51.如实施方案50所述的方法,其中所述染色体外质粒是表达盒。
52.如实施方案50所述的方法,其中所述染色体外质粒是整合质粒。
53.如实施方案52所述的方法,其中所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
54.如实施方案35所述的方法,其中所述rasP基因包含与SEQ ID NO:1的可读框(ORF)核酸序列具有至少60%序列同一性的核酸序列。
55.如实施方案54所述的方法,其中SEQ ID NO:1的ORF编码RasP多肽,其中所述RasP多肽被进一步定义为具有位点-2蛋白酶(S2P)活性的Zn2+金属蛋白酶。
56.如实施方案35所述的方法,其中所述rasP基因编码与SEQ IDNO:2的RasP多肽具有60%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列,该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基16至26对齐。
57.如实施方案35所述的方法,其中所述rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有80%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列,该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基20至24对齐。
58.如实施方案35所述的方法,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的量的增加为至少5%的增加。
59.如实施方案35所述的方法,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的增加的量为至少10%的增加。
60.如实施方案35所述的方法,其中所述革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌(Bacillus)属的成员。
61.如实施方案60所述的方法,其中该芽孢杆菌属选自:枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(B.sonorensis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、饲料芽孢杆菌(B.pabuli)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、黏琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、秋叶氏芽孢杆菌(B akibai)、库拉奇芽孢杆菌(B.clarkii)、假坚强芽孢杆菌(B.pseudofirmus)、列城芽孢杆菌(B.lehensis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、吉氏芽孢杆菌(B.gibsonii)、B.marmarensis和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。
62.如实施方案61所述的方法,其中该芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。
63.如实施方案35所述的方法,其中所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。
64.如实施方案35所述的方法,其中该POI是细胞外分泌或转运的。
65.如实施方案64所述的方法,其中细胞外分泌或转运的POI被进一步分离和纯化。
66.如实施方案35所述的方法,其中所述POI是酶。
67.如实施方案66所述的方法,其中所述酶选自下组,该组由以下组成:乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
68.一种由如实施方案35所述的方法产生的分离的POI。
69.一种用于获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的方法,该方法包括:
(a)将增加rasP基因表达的至少一个基因修饰引入亲本革兰氏阳性细菌细胞,以及
(b)选择表达增加的量的POI的一个或多个子细胞,
其中针对产生增加的量的POI选择的一个或多个子细胞被定义为经修饰的(子)革兰氏阳性细菌细胞。
实例
根据以下实例可以进一步理解本公开的某些方面,所述实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。
实例1
经修饰的枯草杆菌宿主细胞的构建
Taq聚合酶、dNTP和缓冲液购自宝生物工程株式会社(Takara Bio Inc.)(克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories,Inc.);山景城,加利福尼亚州)并用于构建如下所述的突变体枯草芽孢杆菌细胞。使用Phusion高保真DNA聚合酶(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs);伊普斯威奇,马萨诸塞州)来构建载体。引物从欧洲正达公司(Eurogentec)(列日市,比利时)获得。
A.包含缺失的rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌宿主的构建。
使用由Fabret等人(2002)描述的经修饰的突变递送方法进行枯草芽孢杆菌细胞中rasP缺失突变体(“ΔrasP”)的构建,其中所述亲本枯草芽孢杆菌细胞包含缺失的upp基因(“Δupp”),如在Fabret等人.(2002)中所阐述的。为了枯草芽孢杆菌(Δupp)细胞中rasP基因的完全替代(缺失),使用SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的PCR引物对扩增rasP基因的5'和3'侧翼区。
扩增的rasP片段与包含upp基因和cI基因的腐草霉素抗性盒融合(参见,Fabret等人,2002)。所得融合产物用于转化感受态枯草芽孢杆菌Δupp::neoR(亲本)细胞,其中用0.3%木糖诱导感受态。这导致腐草霉素抗性和新霉素敏感(子)细胞缺乏靶标rasP基因。使用SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:9的寡核苷酸对和SEQ ID NO:10/SEQ ID NO:11的寡核苷酸引物进行PCR反应,以验证靶标rasP基因的正确缺失。
B.包含缺失的tepA基因的经修饰的枯草芽孢杆菌宿主的构建
Fabret等人(2002)的经修饰的突变递送方法进一步用于在枯草芽孢杆菌(Δupp)细胞中构建tepA基因(“ΔtepA”)的缺失突变体。因此,为完全替代tepA基因,使用PCR引物对SEQ ID NO:12/SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14/SEQ ID NO:15扩增这些基因的5'和3'侧翼区。然后将扩增的片段与包含upp和cI基因的腐草霉素抗性盒融合(参见Fabret等人,2002)。然后将所得融合产物用于转化感受态枯草芽孢杆菌Δupp::neoR(亲本)细胞,其中用0.3%木糖诱导感受态。这导致腐草霉素抗性和新霉素敏感菌株缺乏靶标tepA基因。使用SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16/SEQ ID NO:11的引物组合进行PCR反应以验证tepA基因的正确缺失。
C.过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞的构建
1.整合载体pRS-spoIIIAA~AG的构建。
使用SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:19的引物对扩增spoIIIAA~AB基因的1040个碱基对的DNA片段(SEQ ID NO:17)。侧接两个lox序列(即,SEQ ID NO:20)的壮观霉素抗性标记作为g-Block合成订购自IDT(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))。使用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的寡核苷酸扩增spoIIIAF~AG基因(即,SEQ ID NO:21)中的981个碱基对DNA序列。使用SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的寡核苷酸扩增可商购质粒“pRS426”。随后,使用GibsonHiFi 1步骤试剂盒(SGI)体外组装上述DNA序列(即,SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21)和pRS426扩增载体以产生整合载体“pRS-spoIIIAA~AG”。
2.质粒pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP的构建。
对于本文所述的某些rasP过表达实验,使用枯草芽孢杆菌spoVG基因的启动子驱动(过表达)rasP基因。例如,从IDT(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))订购包含spoVG启动子的序列(SEQ ID NO:3)的合成g-Block。通过PCR使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27的寡核苷酸扩增rasP编码序列。使用SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的寡核苷酸扩增指定为“pRS-spoIIIAA~AG”的质粒。质粒“pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP”是由spoVG启动子序列、rasP编码序列和质粒pRS-spoIIIAA~AG的组合件,使用GibsonHiFi 1步骤试剂盒(SGI)制成。为了进一步增加RasP多肽的表达和产生,将SEQ ID NO:5的aprE(基因)前导序列(即,5′-UTR)克隆到rasP基因的前端(5′),以产生质粒“pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-UTR-rasP”。
3.质粒pRS-spoIIIAA~AG-PaprE-rasP的构建。
为了构建本文称为“pRS-spoIIIAA~AG-PaprE-rasP”的rasP(基因)过表达质粒,将枯草芽孢杆菌aprE(基因)启动子(“PaprE”;SEQ ID NO:4)掺入载体的5′中,并且有效地连接至rasP编码序列。使用SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31的寡核苷酸通过PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增枯草芽孢杆菌aprE启动子的核苷酸序列。通过PCR使用SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的寡核苷酸扩增质粒“pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP”。将aprE启动子(PaprE)和质粒用GibsonHiFi 1步骤试剂盒(SGI)连接。
4.质粒pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-tepA的构建。
将信号肽肽酶tepA的核苷酸序列从枯草芽孢杆菌基因组DNA,使用SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:35的寡核苷酸进行扩增。通过PCR,使用SEQ ID NO:36/SEQ ID NO:37的寡核苷酸对扩增pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP的质粒主链。将tepA基因序列和经扩增的质粒用GibsonHiFi 1步骤试剂盒(SGI)连接。将所得质粒命名为pRS-spoIIIAG-PspoVG-tepA。
实例2
用异源rasP或tepA基因构建体转化枯草杆菌宿主细胞
将质粒pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-rasP(参见实例1.C.2)、pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-UTR-rasP(参见实例1.C.2)、pRS-spoIIIAA~AG-PaprE-rasP(参见实例1.C.3)和pRS-spoIIIAA~AG-PspoVG-tepA(参见实例1.C.4)各自用限制性内切酶ScaI线性化并且将各个质粒分别转化到感受态枯草芽孢杆菌细胞中。在包含100μg/ml壮观霉素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。所得的(经转化的)枯草芽孢杆菌(子)细胞在本文中称为“PspoVG-rasP”、“PspoVG-UTR-rasP”、“PaprE-rasP”和PspoVG-tepA。
实例3
用编码目的蛋白质的异源基因(表达构建体)转化经修饰的枯草芽孢杆菌(宿主)细胞
A.AmyL表达构建体
枯草芽孢杆菌aprE启动子(“PaprE”)和aprE信号序列(“aprEUTR”,下文中称为“UTR”;参见实施例1.C.2)用于驱动地衣芽孢杆菌“AmyL”淀粉酶(成熟序列SEQ ID NO:38)的表达。将本文中指定为“PaprE-AmyL-catR”(其包括氯霉素乙酰转移酶抗性(“catR”)标记物基因)的表达构建体,转化(1)至枯草芽孢杆菌的野生型(“wt”)细胞(即,亲本细胞),(2)至包含rasP缺失(ΔrasP)的经修饰的(子)枯草芽孢杆菌细胞,以及(3)至包含tepA缺失(ΔtepA)的经修饰的(子)枯草芽孢杆菌细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上选择转化体。
B.用于淀粉酶PcuAmy1-v6的表达构建体
使用枯草芽孢杆菌aprE启动子(“PaprE”)和aprE信号序列(“UTR”)驱动指定为PcuAmy1-v6的Paenibacillus curdlanolyticus淀粉酶(成熟序列SEQ ID NO:39)变体的表达。将指定为“PaprE-PcuAmy1-v6-catR”(其包括氯霉素乙酰转移酶抗性(catR)标记基因)的表达盒转化(1)至包含并且在“PspoVG”启动子的控制下表达/过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌(子)细胞(在上述实例2中描述的“PspoVG-rasP”细胞),(2)至包含并且在“PaprE”启动子的控制下表达/过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(在上述实例2中描述的“PaprE-rasP”细胞),(3)至包含并且在“PspoVG”启动子的控制下表达/过表达tepA基因的经修饰的枯草芽孢杆菌(子)细胞(在上述实例2中描述的“PspoVG-tepA”细胞),以及(4)至枯草芽孢杆菌(亲本)细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。
C.AmyE表达构建体
使用枯草芽孢杆菌aprE启动子(“PaprE”)驱动枯草芽孢杆菌“AmyE”淀粉酶(成熟序列SEQ ID NO:40)的表达。指定为“PaprE-amyE-catR”(其包括氯霉素乙酰转移酶抗性(catR)标记基因)的表达盒被引入到以下项的基因组aprE基因座中(1)包含并且在“PspoVG”启动子的控制下表达/过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(在上述实例2中描述的“PspoVG-rasP”细胞),(2)包含并且在“PspoVG”启动子和aprE UTR的控制下表达/过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(在上述实例2中描述的“PspoVG-UTR-rasP”细胞),(3)包含并且在“PaprE”启动子的控制下表达/过表达rasP基因的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(在上述实例2中描述的“PaprE-rasP”细胞),(4)包含并且在“PspoVG”启动子的控制下表达/过表达tepA基因的经修饰的枯草芽孢杆菌)细胞(在上述实例2中描述的“PspoVG-tepA”细胞),(5)包含rasP(ΔrasP)基因缺失的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(参见实例1.A)(6)包含tepA(ΔtepA)基因缺失的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(参见实例1.B),以及(7)未经修饰的(亲本)枯草芽孢杆菌对照细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。
D.BglC表达构建体
编码枯草芽孢杆菌β-D-葡糖苷酶的表达构建体(以下称为“BglC”;成熟序列SEQID NO:41),其表达构建体在aprE启动子(PaprE)的控制下,被构建并指定为“PaprE-BglC-catR”。将PaprE-BglC-catR构建体引入以下项的aprE基因座中(1)野生型(未经修饰的;亲本)枯草芽孢杆菌细胞,(2)包含并表达/过表达“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,(3)包含并表达/过表达“PaprE-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,以及(4)包含并表达/过表达“PspoVG-tepA”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。
E.Properase表达构建体
编码蛋白酶Properase(成熟序列SEQ ID NO:42)的表达构建体,其表达是在aprE启动子(PaprE)的控制之下,被构建并指定为“PaprE-Properase-catR”。将PaprE-Properase-catR表达构建体引入以下项的aprE基因座中(1)包含并表达/过表达“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,(2)包含并表达/过表达“PaprE-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,(3)包含并表达/过表达“PspoVG-tepA”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,以及(4)野生型(未经修饰的;亲本)枯草芽孢杆菌细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上选择阳性菌落。在包含25μg/ml的氯霉素的Luria琼脂平板上扩增氯霉素抗性菌落。
F.BPN'-Y217L表达构建体
编码解淀粉芽孢杆菌蛋白酶BPN'-Y217L(SEQ ID NO:43)的表达构建体,其表达是在aprE启动子(PaprE)的控制下,被构建并指定为“PaprE-BPN'-Y217L-catR”。将PaprE-BPN'-Y217L-catR表达盒转化至(1)包含rasP(ΔrasP)基因缺失的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,(2)包含tepA(ΔtepA)基因缺失的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞,以及(3)野生型(未经修饰;亲本)枯草芽孢杆菌细胞。在包含5μg/ml的氯霉素的Luria的琼脂平板上选择携带PaprE-BPN'-Y217L-catR构建体的菌落。
实例4
目的蛋白质的表达和产生
A.材料和方法
细菌生长条件。枯草芽孢杆菌细胞在溶原性肉汤(LB;奥克索德有限公司(OxoidLimited))或MBU培养基中于37℃,280rpm下生长。MBU培养基类似于Vogtentanz等人,(2007)所述的MBD培养基,但缺乏大豆蛋白胨,而代替7.5%葡萄糖,它包含2.1%葡萄糖和3.5%麦芽糖糊精DE13-17。在必要时,培养基补充有15μg/ml新霉素或4μg/ml腐草霉素用于淀粉酶或蛋白酶基因选择突变,或5μg/ml或25μg/ml氯霉素用于淀粉酶或蛋白酶基因选择或扩增(分别)。在MBU培养基上的脉冲追踪标记实验中,使用2.5μg/ml氯霉素。
生长分析。枯草芽孢杆菌细胞在包含2.5μg/ml氯霉素的LB中在37℃,250rpm下生长过夜。将培养物在96孔微量滴定板中在LB中稀释50倍,并在微量滴定板培养箱(Grant-bio PHMP-4,格兰特仪器有限公司(Grant Instruments Ltd))中于37℃,800rpm下生长大约3小时。然后将培养物在MBU中稀释50倍,并在微量滴定板培养箱中在37℃,800rpm下生长3小时。在新鲜的MBU中进行最后的50倍稀释,并通过在PowerWave HT微孔板分光光度计(伯腾公司(Biotek))中通过OD600测量来监测生长。
蛋白质表达和分泌的分析。枯草芽孢杆菌培养物从包含25μg/ml氯霉素的LB平板接种,并在包含25μg/ml氯霉素的LB肉汤中生长大约8小时。将这些培养物在包含2.5μg/ml氯霉素的MBU培养基的摇瓶中稀释1000倍,并在高湿度的Multitron定轨振荡器(Infors公司)中于37℃,280rpm下孵育大约16小时。在测量并校正OD600后,通过离心从培养基中分离出等量的细胞。为了胞外蛋白质的分析,在培养基中的蛋白质用三氯乙酸沉淀(TCA;10%w/v的最终浓度),溶解在LDS缓冲液(生命技术公司(Life Technologies))中,并在95℃下加热10分钟。接下来,通过10%NuPage凝胶(生命技术公司(Life Technologies))上的LDS-PAGE分离蛋白质并用SimplyBlueTM SafeStain(生命技术公司(Life Technologies))染色。
脉冲追踪蛋白质标记实验。使用Easy tag 35S蛋氨酸(珀金埃尔默公司(PerkinElmer Inc.))进行枯草芽孢杆菌蛋白质的脉冲追踪标记。如前文所述(Van Dijl等人,1991)使用以下修改进行免疫沉淀和LDS-PAGE。如前文所述的,将细胞在MBU中用2.5μg/ml氯霉素生长16小时,并在实际标记至大约0.7的OD600之前一小时在新鲜MBU中用2.5μg/ml氯霉素稀释。在添加过量的未标记的蛋氨酸之前用25μCi 35S Met进行30秒标记(追踪;0.625mg/ml最终浓度)。在若干个时间点收集样品,随后在冰上用10%TCA直接沉淀蛋白质。沉淀物重新悬浮于裂解缓冲液(10mM Tris pH 8.0、25mM MgCl2、200mM NaCl和5mg/ml溶菌酶)中。在37℃孵育10-15分钟后,通过添加1%(w/v)SDS并在100℃加热10分钟实现裂解。
将抗AmyE或AmyL的特异性多克隆抗体用于在STD-Tris缓冲液(10mM Tris pH8.2,0.9%(w/v)NaCl,1.0%(v/v)Triton X-100,0.5%(w/v)脱氧胆酸钠)中分别标记的蛋白质的免疫沉淀中,其中在蛋白质-A亲和介质(Mabselect Sule,GE生命科学公司(GE LifeSciences))的帮助下进行。因为BPN'-Y217L的高蛋白质分解活性,其还降解抗体,所以BPN'-Y217L的免疫沉淀在特定丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下进行(4mM,Pefablock SC,罗氏公司(Roche))中。由于BPN'-Y217L抗体与枯草芽孢杆菌的未鉴定的细胞蛋白质的特异性结合,所以只进行BPN'-Y217L的免疫沉淀以测定在TCA沉淀的培养基样品中分泌的BPN'-Y217L。使用10%NuPage凝胶(生命技术公司(Life Technologies))通过LDS-PAGE分离经标记的蛋白质,并使用Cyclon Plus荧光成像仪(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))可视化。
枯草芽孢杆菌中Properase的表达和产生。为了测试枯草芽孢杆菌Properase表达,枯草芽孢杆菌细胞过表达RasP(例如参见实施例1.C)和野生型(未经修饰的;亲本)的枯草芽孢杆菌细胞在5mL LB中生长5小时。使用1.5OD的预培养物接种摇瓶中的25ml的MBU培养基,并细胞在37℃,250rpm,70%湿度下生长。分别在生长的第18小时、25小时、41小时、48小时和65小时取样。使用SpectraMax分光光度计(分子器件公司(Molecular Devices),唐宁顿,宾夕法尼亚州,美国)在OD600nm测量细胞密度,并将600nm下的吸光度作为时间的函数作图。使用如WO 2010/144283所述的N-suc-AAPF-pNA底物(本文,“AAPF”,来自西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.))监测Properase酶表达。简言之,在测定缓冲液(100mMTris,0.005%Tween80,pH 8.6)中将全发酵液稀释400倍,并且将10μl稀释的样品排列在微量滴定板中。将AAPF原液稀释,并且将测定缓冲液(DMSO中的100mg/ml AAPF原液,稀释100倍)和190μl该溶液添加到微量滴定板中,并且使用SpectraMax分光光度计在405nm下测量溶液的吸光度。将405nm下的吸光度作为时间的函数作图。
B.在野生型和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的AmyE、AmyL和BPN'-Y217L蛋白质产生分析。
所述AmyE、AmyL或BPN'-Y217L在每个缺失rasP或tepA分泌机构组分的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即,ΔrasP细胞或ΔtepA细胞)中的产生是通过LDS-PAGE在具有2.5μg/ml氯霉素的MBU中生长16小时后进行分析。为此,通过离心将细胞从生长培养基中分离,并将校正细胞密度的等量的生长培养基加载到凝胶上。每个突变体枯草芽孢杆菌细胞(即,ΔrasP细胞或ΔtepA细胞)分泌的胞外的AmyE、AmyL或BPN'-Y217L的量分别与具有整体分泌机构的枯草芽孢杆菌(野生型)对照细胞(即包含天然rasP或tepA基因的枯草芽孢杆菌细胞)分泌的这些蛋白质中每一种的量相比较。使用ImageJ分析软件进行分泌酶的定量。
如图1A和图1B所示,LDS-PAGE凝胶和直方图分别显示,AmyE、AmyL和BPN'-Y217L在ΔrasP突变体细胞的产生相对于野生型(亲本)细胞中的产生减少。图1A和图1B中呈现的ΔtepA突变体细胞表明,与野生型(亲本)的细胞相比时,tepA缺失不影响AmyE或BPN'-Y217L的产生。
C.野生型枯草芽孢杆菌细胞和用表达/过表达rasP的表达盒修饰的枯草芽孢杆菌细胞中AmyE的表达。
将枯草芽孢杆菌的野生型细胞、包含“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞和包含“PspoVG-UTR-rasP”的修饰的枯草芽孢杆菌细胞(各自包含淀粉酶的AmyE构建体(“PaprE-amyE-catR”)),在5ml包含5ppm的氯霉素的Luria肉汤中接种过夜。使用一(1)毫升的预培养物接种摇瓶中的25ml的BHI(脑-心浸液)培养基。该实验使用Infors振荡器在37℃,250rpm下进行。在生长期间取时间点,并且在600nm处测量细胞生长。
使用来自Ceralpha HR试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme),威克洛,爱尔兰)的Ceralpha试剂测量全发酵液的AmyE淀粉酶活性。首先将Ceralpha试剂混合物溶解在10ml的MilliQ水中,随后添加30ml的50mM苹果酸盐缓冲液(pH 5.6)。将培养物的上清液在MilliQ水中稀释40倍,并将10μl的样品添加到55μL的稀释的工作底物溶液中。在震荡后,将MTP板于室温下孵育4分钟。通过添加70μl的200mM硼酸盐缓冲液(pH 10.2)(终止溶液)来淬灭反应。使用SpectraMax分光光度计在400nm处测量溶液的吸光度,并且将400nm处的吸光度绘制为时间的函数。
如在图2A所阐述的,在PspoVG启动子和aprE 5’UTR的控制下包含并表达/过表达rasP基因(即,PspoVG-UTR-rasP)的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞证明改善的细胞生长,表明在测试条件下,最高水平的rasP表达正向影响细胞生长。呈现在图2B中的数据进一步证明,当与野生型枯草芽孢杆菌对照细胞相比时,经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即“PspoVG-rasP”细胞和“PspoVG-UTR-rasP”细胞)中AmyE淀粉酶的产生增加。
D.变体PcuAmy1-v6淀粉酶在野生在野生型枯草芽孢杆菌细胞和经表达/过表达rasP的表达盒修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的表达。
将枯草芽孢杆菌野生型细胞和包含“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(各自包含变体“PaprE-PcuAmy1-v6-catR”构建体)在包含25ppm的氯霉素5ml的Luria肉汤中接种经过一天。使用一(1)毫升的预培养物接种摇瓶中的25ml的适合的培养基。该实验使用Infors振荡器在37℃,250RPM下进行。在生长期间取时间点来确定淀粉酶在生长期间的活性。
使用来自Ceralpha HR试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme),威克洛,爱尔兰)的Ceralpha试剂测量全发酵液中的PcuAmy1-v6淀粉酶活性。首先将Ceralpha试剂混合物溶解在10ml的MilliQ水中,随后添加30ml的50mM苹果酸盐缓冲液(pH 5.6)。将培养物上清液在MilliQ水中稀释40倍,并将10μl的样品添加到55μL的稀释的工作底物溶液中。在震荡后,将MTP板于室温下孵育4分钟。通过添加70μl的200mM硼酸盐缓冲液(pH 10.2)(终止溶液)来淬灭反应。使用SpectraMax分光光度计在400nm处测量溶液的吸光度,并且将400nm处的吸光度绘制为时间的函数。
如图3中所阐述的,在摇瓶中的PcuAmy1-v6淀粉酶的产生(在OD600nm处校正细胞密度)证明,当与野生型枯草芽孢杆菌对照细胞相比时,在经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即,过表达rasP)中的淀粉酶的分泌增加。
E.变体PcuAmy1-v6淀粉酶在野生型枯草芽孢杆菌细胞和经表达/过表达tepA的表达盒修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的表达。
枯草芽孢杆菌野生型细胞和包含“PspoVG-tepA”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(各自包含变体“PaprE-PcuAmy1-v6-catR”构建体)也在摇瓶中测试,以确定过度表达TepA信号肽肽酶的影响。因此,野生型枯草芽孢杆菌细胞和包含“PspoVG-tepA”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞在37℃在Luria肉汤培养基中生长过夜。使用一(1)毫升的预培养物接种摇瓶中的25ml的BHI(脑-心浸液)培养基。该实验使用Infors振荡器在37℃,250RPM下进行。在600nm处测量细胞生长,并在生长期间取时间点。如上述实例5.D所述进行淀粉酶测定。
如图4A所示,野生型枯草芽孢杆菌细胞和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞的细胞密度表明,细胞具有类似的生长曲线。如图4B所示,相对于野生型枯草芽孢杆菌细胞,经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即,过表达tepA)中淀粉酶的产生略微降低。
F.β-D-葡聚糖酶(BglC)在野生型枯草芽孢杆菌细胞和经表达/过表达rasP的表达盒修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的表达。
将枯草芽孢杆菌野生型细胞和包含“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(各自包含“PaprE-BglC-catR”构建体)在5mL的Luria肉汤中生长过夜。使用一(1)ml预培养物接种在摇瓶中的25ml的BHI培养基,并将培养物在37℃,250rpm下生长,以测试分泌的β-D-葡聚糖酶的表达。使用SpectraMax分光光度计按每小时间隔在600nm处测量稀释20倍的全肉汤的细胞密度,并且将(600nm下)的吸光度作为时间的函数作图,表明野生型和经修饰的枯草芽孢杆菌细胞具有类似的细胞密度。
使用4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷底物(西格玛化学公司(SigmaChemical Co.),圣路易斯,密苏里州,美国,目录号N57590)监测β-D-葡聚糖酶表达(即活性)。将底物溶于1ml的DMSO中以产生100mg/ml的储备溶液。通过将35μl的储备溶液稀释于10ml的测定缓冲液(100mMTris、0.005%吐温80,pH 8.6)中来制备工作底物溶液。将四十(40)微升的每种培养物转移到96孔微量滴定板中,并将180μl的工作底物溶液添加到每个孔中。将微量滴定板在室温下孵育2小时,在孵育期结束时,使用SpectraMax分光光度计在405nm处测量溶液的吸光度。将405nm下的吸光度作为时间的函数作图(图5)。如图5所阐述的,经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即,包含“PspoVG-rasP”表达构建体)证明,相对于野生型枯草芽孢杆菌细胞,β-D-葡聚糖酶的产生增加。
G.Properase在野生型枯草芽孢杆菌细胞和经表达/过表达rasP的表达盒修饰的枯草芽孢杆菌细胞中的表达。
将枯草芽孢杆菌野生型细胞和包含“PspoVG-rasP”的经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(各自包含“PaprE-Properase-catR”构建体),在5mL的Luria肉汤中生长5小时。使用1.5OD的预培养物接种摇瓶中的25ml的适合的培养基,并在37℃,250rpm,70%湿度下培养细胞。分别在生长的第18小时、25小时、41小时、48小时和65小时取样。使用SpectraMax分光光度计在600nm处测量稀释40倍的全肉汤的细胞密度,并且将600nm处的吸光度绘制为时间的函数(图6A)。如图6A中所示,相对于野生型枯草芽孢杆菌细胞,经修饰的枯草芽孢杆菌细胞证明了增加的细胞密度。
使用如WO 2010/144283所述的N-suc-AAPF-pNA底物(“AAPF”;西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.))监测Properase表达(即,活性)。简言之,在测定缓冲液(100mMTris,0.005%Tween 80,pH 8.6)中将全发酵液稀释40倍,并且将10μl稀释的样品排列在微量滴定板中。将AAPF原液稀释,并且将测定缓冲液(DMSO中的100mg/ml AAPF原液,稀释100倍)和190μl该溶液添加到微量滴定板中,并且使用SpectraMax分光光度计在405nm下测量溶液的吸光度。将405nm下的吸光度作为时间的函数作图,并且示于图6B中。如图6B中所阐述的,经修饰的枯草芽孢杆菌细胞中Properase蛋白酶的产生比野生型枯草芽孢杆菌对照细胞中的Properase产生高大约5倍。
实例5
AmyAc家族α-淀粉酶在过表达rasP多肽的枯草芽孢杆菌宿主细胞中的表达
属于AmyAc家族的细菌α-淀粉酶(例如参见(www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=CARRMWTZ01N&mode=all)在枯草芽孢杆菌野生型宿主细胞(即,未经修饰的;亲本细胞)和经修饰的枯草芽孢杆菌宿主细胞(即,经修饰的子细胞)中表达,其中经修饰的细胞包含用于rasP的过表达的表达盒(spoIIIAH::PspoVG-rasP),如在上面的实例中通常所描述的。更具体地,aprE的启动子用于驱动(AmyAc家族)α-淀粉酶(例如ProaprE-α-淀粉酶)的表达,其中包含乙酰转移酶基因(catR)的表达盒在包含25μg/ml的氯霉素的LB平板上扩增。使用来自每个菌株(即野生型亲本宿主细胞和过表达rasP的经修饰的子宿主细胞)的四(4)个菌落接种八(8)个包含25μg/ml的氯霉素的LB管,并在37℃下生长四(4)小时。使用0.075OD在二十四(24)孔深微量滴定板中接种两(2)ml的5SM12培养基,其中枯草芽孢杆菌宿主细胞生长四十八(48)小时。在18小时、25小时、41小时和48小时取时间点。通过在实验中使用的培养基中稀释培养物40倍来进行OD600测量。
通常如下制备5SM12(5%大豆蛋白胨、12%麦芽糖糊精)培养基:1mM柠檬酸钠、0.03mM CaCl2、0.0053%柠檬酸铁铵、0.2mM MnCl2、0.5mM MgSO4、75mM K2HPO4、25mMNaH2PO4、12%麦芽糖糊精和5%Difco Bacto大豆蛋白胨。将培养基的pH调节至pH 7.4(用KOH)(对于蛋白酶),并将pH调节至pH 7.7(用KOH)(对于淀粉酶)。摇瓶条件如下:使用Thomason AirOtop增强密封(目录号899423)将培养物(32-35mL)在250mL Thomson超产量烧瓶(目录号931144)中生长。为了生长,将所述培养物使用Infors MultiTron振荡器在280rpm下,用70%的湿度(以减少蒸发)37℃下振荡,移动距离(throw)为50mm。
使用来自Ceralpha HR试剂盒(梅格泽姆公司(Megazyme),威克洛,爱尔兰)的Ceralpha试剂测量全发酵液的淀粉酶活性。首先将Ceralpha试剂混合物溶解在10ml的MilliQ水中,随后添加30ml的50mM苹果酸盐缓冲液(pH 5.6)。将培养物的上清液在MilliQ水中稀释40倍,并将10μl的样品添加到55μL的稀释的工作底物溶液中。在震荡后,将MTP板于室温下孵育四(4)分钟。通过添加70μl的200mM硼酸盐缓冲液(pH 10.2)(终止溶液)来淬灭反应。使用SpectraMax分光光度计在400nm处测量溶液的吸光度,并且将400nm处的吸光度绘制为时间的函数(图7B)。如图7B所示,相对于未经修饰的(亲本)枯草芽孢杆菌细胞,来自经修饰的枯草芽孢杆菌细胞(即,表达rasP构建体)的淀粉酶产生包含大约淀粉酶产量的2.5倍的增加。
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Claims (35)
1.一种经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其相对于未经修饰(亲本)革兰氏阳性细菌细胞产生增加的量的目的蛋白质(POI),其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP基因表达的修饰是对内源染色体rasP基因的修饰。
3.如权利要求2所述的经修饰的细胞,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被具有比天然rasP启动子更高活性的任何启动子取代。
4.如权利要求2所述的经修饰的细胞,其中所述内源染色体rasP基因的天然启动子被spoVG启动子或aprE启动子取代。
5.如权利要求4所述的经修饰的细胞,其中所述spoVG启动子包含与SEQ ID NO:3具有95%序列同一性的核苷酸序列。
6.如权利要求4所述的经修饰的细胞,其中所述aprE启动子包含与SEQ ID NO:4具有95%序列同一性的核苷酸序列。
7.如权利要求2所述的经修饰的细胞,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。
8.如权利要求7所述的经修饰的细胞,其中所述天然rasP染色体5'-UTR被包含与SEQID NO:5的aprE 5'-UTR具有95%序列同一性的5'-UTR置换。
9.如权利要求2所述的经修饰的细胞,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然启动子和天然5'-UTR二者的修饰。
10.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP基因表达的修饰是包含rasP基因的外源多核苷酸。
11.如权利要求10所述的经修饰的细胞,其中所述包含rasP基因的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
12.如权利要求11所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是表达盒。
13.如权利要求11所述的经修饰的细胞,其中所述染色体外质粒是整合质粒。
14.如权利要求13所述的经修饰的细胞,其中所述质粒稳定整合到经修饰的细胞的染色体中。
15.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述增加rasP表达的遗传修饰是包含外源rasP可读框(ORF)的多核苷酸,其中所述ORF有效地连接并处于组成型启动子、诱导型启动子或条件型启动子(conditional promoter)的控制下。
16.如权利要求15所述的经修饰的细胞,其中包含rasP ORF的外源多核苷酸包含在染色体外质粒内。
17.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因包含与SEQ ID NO:1的可读框(ORF)核酸序列具有至少60%序列同一性的核酸序列。
18.如权利要求17所述的经修饰的细胞,其中SEQ ID NO:1的ORF编码RasP多肽,其中所述RasP多肽被进一步定义为具有位点-2蛋白酶(S2P)活性的Zn2+金属蛋白酶。
19.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有60%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:6的活性位点共有序列,该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基16至26对齐(align)。
20.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述rasP基因编码与SEQ ID NO:2的RasP多肽具有80%氨基酸序列同一性的RasP多肽,并且包含SEQ ID NO:7的活性位点共有序列(HEXXH),该活性位点共有序列与SEQ ID NO:2的RasP多肽的氨基酸残基20至24对齐。
21.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的量的增加为至少5%的增加。
22.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌(Bacillus)属的成员。
23.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述POI由所述经修饰的细菌细胞的外源基因或所述经修饰的细菌细胞的内源基因编码。
24.如权利要求1所述的经修饰的细胞,其中所述POI是酶。
25.如权利要求24所述的经修饰的细胞,其中所述酶选自下组,该组由以下组成:乙酰酯酶、芳基酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯聚糖酶(arabinases)、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过水解酶、多元醇氧化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其组合。
26.一种由如权利要求1所述的经修饰的细胞产生的分离的POI。
27.一种用于在革兰氏阳性细菌细胞中增加POI的产生的方法,该方法包括:
(a)获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞,其中所述经修饰的细菌细胞包含增加rasP基因表达的修饰,以及
(b)在使POI表达的条件下培养所述经修饰的细胞,
其中所述产生增加的量的POI的经修饰的细菌细胞是相对于在未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细菌细胞中相同POI的产生而言的。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述增加rasP基因表达的修饰是对内源染色体rasP基因的修饰。
29.如权利要求27所述的方法,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然5'-非翻译区(5'-UTR)的修饰。
30.如权利要求27所述的方法,其中所述对内源性染色体rasP基因的修饰是内源性染色体rasP基因的天然启动子和天然5'-UTR二者的修饰。
31.如权利要求27所述的方法,其中所述rasP基因包含与SEQ ID NO:1的可读框(ORF)核酸序列具有至少60%序列同一性的核酸序列。
32.如权利要求27所述的方法,其中相对于未经修饰的(亲本)革兰氏阳性细胞,产生的POI的增加的量为至少5%的增加。
33.如权利要求27所述的方法,其中该革兰氏阳性细菌细胞是芽孢杆菌属的成员。
34.一种由如权利要求27所述的方法产生的分离的POI。
35.一种用于获得产生增加的量的POI的经修饰的革兰氏阳性细菌细胞的方法,该方法包括:
(a)将增加rasP基因表达的至少一个基因修饰引入亲本革兰氏阳性细菌细胞,以及
(b)选择表达增加的量的POI的一个或多个子细胞,
其中针对产生增加的量的POI选择的一个或多个子细胞被定义为经修饰的(子)革兰氏阳性细菌细胞。
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