CN102803290A - 用于增加蛋白质产生的芽孢杆菌属菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供了用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

Description

用于增加蛋白质产生的芽孢杆菌属菌株

相关申请的交互参照：

本申请要求2009年6月11日递交的美国临时申请号61/186321的权益，其在此处全文引用作为参考。

本发明提供已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr和/或rap基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

发明背景

外源多肽的表达和重组产生是一项广泛使用的技术。众所周知细胞可以用编码外源目的多肽的核酸转化用于表达和产生大量想要的多肽。在一些应用中，所述方法用来产生比由起源生物天然产生量要高的多肽。实际上，外源核酸序列的表达以及内源序列的过量表达已经广泛地用于现代生物技术中。

尽管实施了用于增加蛋白酶产量的多种方法，包括筛选超高产菌株、克隆和过量表达蛋白酶、改善补料分批发酵和恒化器发酵和优化发酵技术，但是仍需要用于增强蛋白酶产生的其它手段。

发明概述

本发明提供已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr和/或rap基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

在一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。优选地，失活的rap基因是rapA基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。优选地，失活的rap基因是rapA基因，并且至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。优选地，失活的phr基因是失活的phrA或phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因和失活的phrE基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因和失活的phrE基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。优选地，失活的rap基因是rapA基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因的rap操纵子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。优选地，失活的rap基因是rapA基因，并且至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有至少一个失活phr基因和失活rap基因(例如，rapA基因)的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。优选地，失活的phr基因是失活的phrA或phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因和失活的phrE基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因和失活的phrE基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操纵子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供过量表达YmaH和包含基因组和重组核酸的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，用于以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白，其中所述基因组包含具有失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活rapA基因的rap操纵子。该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。优选地，该启动子是野生型或突变aprE启动子。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。被失活的至少一个固有phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致固有的phrA和phrE基因和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致固有的phrA和rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入过量表达YmaH的前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。通过将包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子的SigH构建体(例如，SEQ ID NO：23)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。备选地，通过将包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子的SigA构建体(例如，SEQ ID NOS：26和31)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入过量表达YmaH的前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。被失活的至少一个固有phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，失活的phr基因是失活的phrA基因，而在其他实施方案中，失活的phr基因是phrE基因。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。通过将包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子的SigH构建体(例如，SEQ ID NO：23)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。备选地，通过将包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子的SigA构建体(例如，SEQ ID NOS：26和31)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入过量表达YmaH的前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致固有的phrA和phrE基因和/或rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。通过将包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子的SigH构建体(例如，SEQ ID NO：23)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。备选地，通过将包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子的SigA构建体(例如，SEQ ID NOS：26和31)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。

在另一个实施方案中，本发明提供用于在宿主细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括将失活性DNA构建体导入过量表达YmaH的前体芽孢杆菌属宿主细胞以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其中所述的失活性DNA构建体包含导致固有的phrA和rap基因失活的失活性多核苷酸；并且在合适的条件下培育所述的修饰宿主细胞，其中与目的蛋白在所述前体宿主细胞中的产生相比时，所述目的蛋白的产生在所述修饰的宿主细胞中更大。在一些实施方案中，该方法还包括回收此目的蛋白。该目的蛋白是酶并且优选地是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。在一些实施方案中，宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。优选地，该宿主细胞包含deg(Hy)32突变。通过将包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子的SigH构建体(例如，SEQ ID NO：23)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。备选地，通过将包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子的SigA构建体(例如，SEQ ID NOS：26和31)导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH蛋白的过量表达。

所述实施方案的芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。优选地，所述实施方案的芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。在本文提供的每个本发明实施方案中，本发明提供分离的宿主细胞以及培养的细胞。

本发明提供包含rap操纵子的宿主细胞，其中所述的rap操纵子包含至少一个失活的phr和/或至少一个失活的rap基因。在一些实施方案中，该宿主细胞过量表达YmaH。在一些其他实施方案中，该宿主细胞还包含重组核酸。仍在一些其他实施方案中，该宿主细胞还包含编码目的蛋白的多核苷酸序列。在一些额外的实施方案中，该重组核酸包含与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。在一些其他实施方案中，该启动子是野生型或突变aprE启动子。在一些额外的实施方案中，该宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。仍在一些其他实施方案中，该芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌。在一些额外的实施方案中，该宿主细胞以比不包含至少一个失活phr和/或rap基因的宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白。在一些其他实施方案中，目的蛋白是酶。在一些额外的实施方案中，该酶是蛋白酶。仍在一些额外的实施方案中，至少一个失活的rap基因是rapA基因。在一些其他实施方案中，至少一个失活的phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。在一些实施方案中，至少一个失活的phr基因是phrA，而在一些备选实施方案中，至少一个失活的phr基因是phrE。在一些其他实施方案中，该宿主细胞包含至少一个失活的phr基因和至少一个失活的rap基因。在一些其他实施方案中，失活的rap基因是rapA基因。仍在一些其他实施方案中，存在至少一个失活的rap基因(例如，rapA)和至少一个选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK的失活phr基因。在一些实施方案中，至少一个失活的phr基因是phrA，而在一些备选实施方案中，至少一个失活的phr基因是phrE。仍在一些其他实施方案中，该宿主细胞包含失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活的rapA基因和编码目的蛋白的重组核酸。在一些实施方案中，目的蛋白是酶。仍在一些其他实施方案中，该酶是蛋白酶。在一些实施方案中，该宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。在一些其他实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。在一些额外的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。

本发明也提供用于产生至少一种目的蛋白的方法，其包括提供前体宿主细胞和包含使至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸的失活性核苷酸构建体；将所述的失活性核苷酸构建体导入所述前体宿主细胞以产生修饰的宿主细胞；并且在用于产生至少一种目的蛋白的合适条件下培育所述的修饰宿主细胞。在本发明方法的一些实施方案中，该目的蛋白由前体宿主细胞中存在的重组核酸编码。在本发明方法的一些实施方案中，该目的蛋白由修饰的宿主细胞中存在的重组核酸编码。在本发明方法的一些实施方案中，该目的蛋白由前体宿主细胞和/或修饰的宿主细胞中存在的重组核酸编码。在本发明方法的一些实施方案中，该重组核酸包含与编码此目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。在本发明方法的一些额外实施方案中，该目的蛋白是野生型目的蛋白。仍在本发明方法的一些额外实施方案中，前体宿主细胞天然地产生此目的蛋白。在本发明方法的一些其他实施方案中，修饰的宿主细胞的目的蛋白产生大于前体宿主细胞的目的蛋白产生。在本发明方法的一些实施方案中，所述方法还包括回收目的蛋白的步骤。在本发明方法的一些实施方案中，目的蛋白是酶。在本发明方法的一些其他实施方案中，该酶是蛋白酶。仍在本发明方法的一些其他实施方案中，修饰的宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。在本发明方法的一些实施方案中，宿主细胞包含deg(Hy)32突变。在本发明方法的一些其他实施方案中，被失活的所述至少一个固有phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。仍在本发明方法的一些其他实施方案中，失活性多核苷酸使固有phrA和phrE基因和/或rap基因失活。在本发明方法的一些实施方案中，至少一个固有的phr基因是phrA，而在一些备选实施方案中，至少一个固有的phr基因是phrE。仍在本发明方法的一些额外实施方案中，固有的rap基因失活。在本发明方法的一些其他实施方案中，固有的rap基因是rapA。在本发明方法的一些额外实施方案中，前体宿主细胞或修饰的宿主细胞过量表达YmaH。在本发明方法的一些实施方案中，通过将SigH构建体导入前体宿主细胞或修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。在本发明方法的一些其他实施方案中，SigH构建体包含SEQ ID NO：23，其包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子。在本发明方法的一些实施方案中，通过将SigA构建体导入前体宿主细胞或所述修饰的宿主细胞中实现YmaH的过量表达。在本发明方法的一些其他实施方案中，SigA构建体包含SEQ ID NO：26和/或31，其包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子。在本发明方法的一些实施方案中，该宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。在本发明方法的一些其他实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。在本发明方法的一些额外实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

附图简述

与附图一起阅读时，最佳地理解以下详细描述的某些方面。应当强调根据常规习惯，附图的各种特征不是合乎比例的。相反，为清晰起见，任意地放大或缩小多种特征的尺度。附图中包括以下各图：

图1说明枯草芽孢杆菌rap操纵子中phr和rap基因的排列。

图2示意地说明用来缺失枯草芽孢杆菌中phr基因的失活盒共有的特征。

图3显示AprE蛋白酶在包含phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK缺失的修饰的枯草芽孢杆菌菌株中的产生。

图4是显示在对照枯草芽孢杆菌亲代菌株BG2942(菱形)中和在分别含有phrA和phrE基因缺失的修饰枯草芽孢杆菌菌株CB2-1(正方形)和CB2-2(三角形)中AprE产生的图。

图5是显示在亲代枯草芽孢杆菌菌株CF471(菱形)中和在分别含有phrE和phrA基因缺失的修饰枯草芽孢杆菌菌株CB3-48(正方形)和CB3-47(三角形)中蛋白酶FNA产生的图。

图6是显示缺失phrA和phrE基因联合影响枯草芽孢杆菌中蛋白酶产生的图。

图7说明用于产生多核苷酸构建体的引物的位置，其中所述的多核苷酸构建体用来在枯草芽孢杆菌中过量表达YmaH。分图B-E显示了用来产生构建体SigH(分图B)和SigA构建体SigA1(分图C)、SigA2(分图D)和SigA3(分图E)的引物相对于枯草芽孢杆菌miaA操纵子的芽孢杆菌染色体序列(枯草芽孢杆菌菌株168的第1865428-1867019碱基对；NCBI登录号NC000964)的位置，所述的芽孢杆菌染色体序列在分图A中说明。引物对P4-P5和P6-P7是融合引物，它们在其5’端包含与直接扩增序列同源的碱基对“尾部”，并且是彼此互补的。融合引物的互补尾部允许扩增的Sigma A启动子DNA融合至扩增的YmaH编码DNA以获得含有与YmaH编码序列毗邻的Sigma A启动子序列的嵌合性多核苷酸，同时缺失大部分或全部的miaA编码序列。

图8显示枯草芽孢杆菌基因组的一部分的多核苷酸序列，其中所述的部分包含定义sigA启动子至YmaH蛋白编码性序列末端的序列(SEQ ID NO：101)。将该序列图示于图7，分图A中。将编码miaA蛋白的序列的起点标出并且完整的miaA编码序列以粗体字母显示；将编码YmaH蛋白的序列的起点标出并且完整的ymaH编码序列以加下划线的粗体字母显示。

图9显示质粒pBS19-ymaH sigH的图。

图10(A-B)分图A显示由芽孢杆菌属对照宿主细胞(42pBS)和由过量表达ymaH的枯草芽孢杆菌宿主细胞(42SigA1和42SigH)所产生枯草蛋白酶的蛋白酶解活性的示意图。分图B显示由芽孢杆菌属对照宿主细胞(42pBS)和由过量表达ymaH的枯草芽孢杆菌宿主细胞(41SigH)产生的枯草蛋白酶活性。将蛋白酶解活性度量为因水解和释放对硝基苯胺所致405nm处的吸光度增加。酶促活性的水平是表明过量表达ymaH对芽孢杆菌属宿主细胞产生枯草蛋白酶的影响。

图11显示枯草芽孢杆菌对照宿主细胞42pBS19和过量表达ymaH的芽孢杆菌属宿主细胞42SigH和42SigA1产生枯草蛋白酶的水平。

图12是显示phr缺失和YamH过量表达(使用多拷贝质粒pBS19-ymaH sigH)对AprE表达产生协同效应的图。过量表达YmaH的影响在名为YmaH的枯草芽孢杆菌菌株(正方形)中并在分别含有phrA和phrE基因缺失的修饰菌株CB2-11(三角形)和CB2-12(交叉形)中显示，并且与对照菌株42pBS19中的AprE产生比较。

图13示意地说明用来缺失rapA基因的DNA构建体。

图14显示由枯草芽孢杆菌对照宿主细胞CF471(实心菱形)、包含失活的phrA基因的修饰枯草芽孢杆菌细胞CB3-47(实心正方形)和包含失活rapA基因和失活phrA基因的修饰枯草芽孢杆菌细胞JS1121(空心三角形)产生枯草蛋白酶FNA的水平。

图15(A-B)显示缺失phrH基因(实心正方形，分图A)或rapH基因(实心正方形，分图B)基因对枯草芽孢杆菌产生AprE的影响。

发明描述

本发明提供已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及具有至少一个失活phr和/或rap基因的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。修饰的芽孢杆菌属宿主细胞的增强的目的蛋白产生在过量表达YmaH的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中进一步增加。也提供用于在修饰的宿主细胞中产生目的蛋白的方法。

虽然在本文中描述的是示例性丝氨酸蛋白酶(例如，FNA和AprE)，但本发明的组合物和方法不限于丝氨酸蛋白酶。实际上，本发明用于改善多个类型的酶以及蛋白酶(例如淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、氧化还原酶、角质酶、甘露聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、脂肪酶等)的产生。实际上，不意图使本发明限于任何具体的酶和酶类型。

除非另外说明，本发明的实施涉及在分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质与DNA测序和重组DNA中常用的常规技术，它们处于本领域技术人员的能力范围内。此类技术是本领域技术人员已知的并且在众多的标准教材和参考书中描述。本文此前和以下提到的全部专利、专利申请、文章和出版物因而通过引用的方式明确地并入本文作为参考。

除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。包含本文中所包括术语的多部科学字典是本领域技术人员熟知和可获得的。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料可以用于实施或检验本发明中，然而描述了一些优选的方法和材料。因而，通过参考作为一个整体的本说明书而更充分地描述下文立即定义的术语。应当理解本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂，因为这些内容可以根据本领域技术人员使用它们的具体情况而变化。

如本文中所用，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明并非如此。除非另外说明，分别地，核酸从左至右以5′至3′方向书写，并且氨基酸序列从左至由以氨基至羧基方向书写。

本文中所提到的全部专利、专利申请和其他出版物，包括这些参考文献内所公开的全部序列，通过引用方式以相同程度并入本文，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份单独的出版物、专利或专利申请。将所提到的全部文献在有关的部分通过引用的方式并入本文。然而，对任意文献的引用不得解释为承认该文献相对于本文发明是现有技术。

数字范围包括定义该范围的数字在内。意图在本说明书通篇范围内给出的每个最大数字界限包括每个较小的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较小的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个最小数字界限将包括每个较高的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较高的数字界限。在本说明书通篇范围内给出的每个数字范围将包括属于这种较宽泛数字范围内的每个较窄的数字界限，如同在本文中明确地写出此类较窄的数字界限。

本文中所提供的标题题目不限制可能通过参考作为一个整体的本说明书来实现的本发明的多个方面或实施方案。因此，如上文所示，通过参考作为一个整体的本说明书来更充分地定义下文立即定义的术语。

定义

如本文中所用，“修饰的宿主细胞”是含有至少一个失活的phr和/或rap基因的重组宿主细胞。修饰的宿主细胞衍生自前体宿主细胞，该前体宿主细胞可以是野生型或包含未失活的phr基因的重组前体宿主细胞。

如本文中所用，“重组宿主细胞”指已经通过导入至少一个重组/异源核酸被修饰的细胞。因而，例如，重组宿主细胞表达在该细胞的亲代形式内不以相同形式存在的基因或表达否则因人为故意干预而异常表达、不足表达或根本不表达的天然基因。

如本文中所用，“前体宿主细胞”在本文中与“亲代宿主细胞”互换地使用，以表示被遗传改变以产生修饰的宿主细胞的宿主细胞。

如本文中所用，术语“重组多核苷酸”和“重组多肽”分别指宿主细胞中不天然存在的多核苷酸和多肽。重组多核苷酸或多肽分子可以含有两个或多个以非天然存在形式连接在一起的天然存在序列。“重组”、“重组(recombining)”或产生“重组的”或“重组”核酸一般是两个或多个核酸片段的装配物，其中所述装配物产生嵌合基因。

如本文中所用，“重组体”在谈及细胞使用时意指已经通过导入异源核酸序列被修饰的细胞或意指从如此修饰的细胞衍生的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以该细胞的天然(非重组)形式中的相同形式存在的基因或表达否则因人为故意干预而异常表达、不足表达或根本不表达的天然基因。

如本文中所用，“类似序列”是一级生物学序列，如氨基酸序列或DNA序列的核苷酸，其中蛋白质或所编码蛋白质的功能与赋予本文中提到的Phr、Rap和YmaH蛋白的功能基本上相同。额外地，类似的蛋白质与本文中提到的Phr、Rap和YmaH蛋白的变体的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性。类似序列通过已知的序列比对方法确定。通常使用的比对方法是BLAST，不过如上文及下文所示，也存在用于比对序列的其他方法。一个有用算法的实例是PILEUP。使用累进配对比对法，PILEUP从一组相关的序列中产生多重序列比对结果。它也可以绘制进化树，其中所述进化树显示用来产生该比对结果的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle累进比对法(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])的简化形式。该方法类似于Higgins和Sharp描述的方法(Higgins和Sharp，CABIOS 5：151-153[1989])。有用的PILEUP参数包括默认空位权重3.00、默认空位长度权重0.10和加权末端空位。另一个有用算法的实例是由Altschul等人(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，[1990]；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787[1993])描述的BLAST算法。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见，Altschul等人，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用几个检索参数，其中大部分设置成默认值。用以下值设置可调整参数：重叠覆盖区＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值并且由程序自身根据特定序列的组成和特定数据库的组成建立，其中针对所述的特定数据库检索目的序列。然而，可以调整所述值以提高灵敏度。％氨基酸序列同一性值由匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数来确定。“较长的”序列是比对区域中具有最多实际残基的序列(忽略由WU-Blast-2导入以使比对评分最大化的空位)。在重叠覆盖区和重叠分数分别设置成1和0.125的情况下，优选的方法使用设置成默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块。

如本文中所用，“序列同一性百分数(％)”或“百分数同源性”在谈及多核苷酸或多肽序列使用时定义为候选序列中与起始序列(即目的序列)的核苷酸或氨基酸残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分数。通过本领域已知的方法比对所述序列并且确定同一性，通过直接比较分子之间的序列信息确定多核苷酸序列或多肽序列共有的同一性百分数。在一些实施方案中，比对包括将空位导入待比对的序列中。此外，对于比候选多核苷酸或多肽序列含有更多或更少核苷酸或氨基酸的序列，应当理解同源性百分数将以相对于核苷酸或氨基酸总数的同源核苷酸或氨基酸的数目为基础来测定。如本文中所用，“同源性”指序列相似性或同一性，优选同一性。这种同源性使用本领域已知的标准技术(见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2444[1988]；程序如威斯康辛Genetics软件包(Genetics Computer Group，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA和Devereux等人，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984])来确定。

如本文中所用，术语“异源”指通常彼此无联系的元件。例如，如果某宿主细胞产生一种异源蛋白质，则该蛋白质是通常不由该宿主细胞产生的蛋白质。同样地，与异源编码序列有效连接的启动子是与不是野生型序列的编码序列有效连接的启动子。

如本文中所用，“目的蛋白”或“目的多肽”指由宿主细胞表达/产生的蛋白质。通常而言，目的蛋白是具有商业意义的想要的蛋白质。目的蛋白可以相对于该宿主为同源或异源的。在一些实施方案中，目的蛋白是分泌的多肽，特别是酶，包括但不限于淀粉水解酶、蛋白质水解酶、纤维素水解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。在又一些实施方案中，这些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、葡糖苷酶、异构酶、转移酶、半乳糖苷酶和壳多糖酶。仍在又一些实施方案中，表达的多肽是激素、细胞因子、生长因子、受体、疫苗、抗体等。尽管不意图使本发明限于任何具体蛋白质/多肽，在一些最优选的实施方案中，表达的目的蛋白是蛋白酶。

如本文中所用，术语“蛋白酶”和“蛋白酶解活性”指这样的蛋白质或肽，其显示水解肽或具有肽键的底物的能力。存在许多用于测量蛋白酶解活性的熟知方法(Kalisz，“Microbial Proteinases”，在：Fiechter(编著)，Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，[1988])。例如，蛋白酶解活性可以通过比较测定法确定，其中所述的比较测定法分析相应蛋白酶水解商品底物的能力。在分析蛋白酶或蛋白酶解活性中有用的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(SigmaC-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 9021111)。使用这些底物的比色测定法是本领域熟知的(见例如WO 99/34011和美国专利号6,376,450，这两份专利均通过引用的方式并入本文)。pNA测定法(见例如Del Mar等人，Anal.Biochem.，99：316-320[1979])也用于确定在梯度洗脱期间所收集的级分的活性酶浓度。该测定法测量当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上于410nm处测量从水解反应中产生黄颜色的速率并且该速率与活性酶浓度成正比。此外，280nm处的吸光度量值可以用来确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比产生该酶纯度。

如本文中所用，术语“枯草蛋白酶”指属于通过活性部位处丝氨酸残基对肽键发动亲核攻击的丝氨酸蛋白酶类的蛋白酶(丝氨酸内肽酶)。枯草蛋白酶以大的量从许多芽孢杆菌属物种中分泌。例如，FNA，其为含有Y217L置换的枯草蛋白酶BPN’，是从解淀粉芽孢杆菌获得的枯草蛋白酶，并且AprE是从枯草芽孢杆菌获得的枯草蛋白酶。

如本文中所用，基因的“缺失”指完整编码序列的缺失、编码序列的部分的缺失或包括侧翼区的编码序列的缺失。所述缺失可以是部分的，只要染色体中剩下的序列引起想要的该基因生物学功能丧失。编码序列的侧翼区可以在5’和3’端包括约1bp至约500bp。侧翼区可以大于500bp，但是将优选地不包括该区域内根据本发明可以失活或缺失的其他基因。最终结果是缺失的基因有效地失去功能。简而言之，“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列的变化，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基已经分别移去(即，不存在)。因而，“缺失突变体”具有比相应亲代宿主细胞少的核苷酸或氨基酸。在一些实施方案中，phr基因的缺失提供增强的目的蛋白(例如，蛋白酶)表达。

在一些实施方案中，缺失一个或多个选自由phrA、phrC、phrE、phrF、phrI和phrK组成的组中的基因提供了增强蛋白酶产生的改良菌株。

如本文中所用，“相应的未修饰芽孢杆菌属菌株”或“亲代”或“前体”芽孢杆菌属宿主细胞是从中失活固有染色体区(例如，phrA和/或phrE基因)并且从中衍生变异/重组菌株的源头宿主菌株。

如果一种多肽在某重组宿主细胞中以比它在前体细胞中表达高的水平表达，则该多肽在此重组宿主细胞中“过量表达”。

如本文中所用，术语“同源”在谈及多核苷酸或蛋白质使用时指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文中所用，术语“多肽”指由肽键连接的氨基酸组成的化合物。如本文中所用术语“蛋白质”可以同义于术语“多肽”或可以另外地指两个或多个多肽的复合物。因而，术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”互换地使用。

如本文中所用，术语“嵌合多肽”和“融合多肽”互换地用来指包含可以源自或可以不源自相同蛋白质的至少两个分开的且不同区域的蛋白质。例如，与目的蛋白连接的下述信号肽称作嵌合多肽或嵌合蛋白，其中所述的信号肽正常不与目的蛋白接合。

如本文中所用，“信号序列”是存在于蛋白质氨基端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的该蛋白质分泌于细胞外部。信号序列的定义是功能性定义。成熟形式的胞外蛋白缺少信号序列，所述信号序列在分泌过程期间被切除。“前序列(prosequence)”是在信号序列与成熟蛋白酶之间对该蛋白酶分泌为必需的氨基酸序列。该前序列的切除产生成熟的活性蛋白酶。

术语“信号序列”或“信号肽”指可以参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任意核苷酸序列和/或氨基酸序列。信号序列的这种定义是一种功能性定义，其意图包括由该蛋白质基因的氨基端部分编码的参与实现该蛋白质分泌的全部那些氨基酸序列。它们往往但并非普遍地与蛋白质的氨基端部分或与前体蛋白的N端部分结合。信号序列可以是内源或外源的。信号序列可以是通常与该蛋白质(例如，蛋白酶)接合的那种信号序列，或可以来自编码另一种分泌性蛋白的基因。一个示例性外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌枯草蛋白酶信号序列的头7个氨基酸残基，其中这七个氨基酸残基与来自迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)的枯草蛋白酶的信号序列的剩余部分融合。

术语“aprE启动子”在本文中指天然驱动枯草蛋白酶在枯草芽孢杆菌中表达的多核苷酸启动子序列(Ferrari等人，J Bacteriol.170：289-295[1988])。在aprE启动子的语境下，“aprE启动子”在本文中指野生型aprE启动子和其突变体。在一些实施方案中，aprE启动子包括对该启动子的DegU、ScoC、AbrB和任何其他调节物所产生的转录调节作用为必需的核苷酸序列物和/或aprE转录前导序列(Hambraeus等人，Microbiology 148：1795-1803[2002])。在一些备选的实施方案中，aprE启动子不包括对DegU、ScoC、AbrB和其他调节物所产生的转录调节作用为必需的全部核苷酸序列，和/或不包括aprE转录前导序列。

如本文中所用，“失活的基因”是基因组的基因座，其中所述的基因座在其失活之前能够产生蛋白质(即，能够转录成可以翻译以产生全长多肽的RNA)。当编码多肽的基因不转录且不翻译成具有生物学活性(在酶的情况下，所述生物学活性例如是催化活性)的全长蛋白时，该基因失活。某基因可以因改变其转录过程所要求的序列，例如因改变RNA加工过程(例如，添加聚腺苷酸尾)所要求的序列、因改变翻译过程所要求的序列或因改变所编码多肽的氨基酸序列(例如，因核苷酸置换等)失活。失活基因的实例包括但不限于缺失的基因、含有缺失区的基因、含有重排区的基因、具有失活性点突变或移码的基因和含有插入的基因。某基因也可以因改变或缺失操纵子中毗邻基因的序列失活。此外，某基因也可以使用反义法或取消该基因表达的任何其他方法来失活。

如本文中所用，术语“核酸”包括DNA、RNA(无论为单链或双链)，并且包括化学修饰的DNA或RNA。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文互换地使用。

术语“失活”包括阻止一种或多种phr基因(phrA、phrC、phrE、phrF、phrI和phrK)功能性表达的任何方法，其中所述的基因或基因产物(即，编码的Phr蛋白)不能够产生它的已知功能。失活借助任何合适的手段发生，所述的手段包括在核酸基因序列中缺失、置换(例如，突变)、中断和/或插入。在一些实施方案中，改变/重组的芽孢杆菌属菌株包含一个或多个基因的失活，其中所述的失活优选地导致稳定和不可逆的失活。在一些实施方案中，通过缺失实现失活。在一些优选的实施方案中，通过同源重组缺失基因。例如，在phrA是待缺失基因时的一些实施方案中，使用包含外来序列(incoming sequence)的失活性DNA构建体，其中所述的外来序列具有在每一侧分布有同源盒的选择标记。该同源盒包含与染色体phrA基因的核酸侧翼区同源的核苷酸序列。失活性DNA构建体与芽孢杆菌属宿主染色体的同源序列对齐并且phrA基因在一个双交换事件中从宿主染色体切下。

在某些实施方案中，改变/重组的细胞是包含两个失活基因(例如，phrA和phrE)的芽孢杆菌属宿主细胞。在其他实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含3个失活基因、4个失活基因、5个失活基因、6个失活基因或更多个失活基因。因而，不意图使失活基因的数目限于任何具体的基因数。在一些实施方案中，失活的基因是彼此连续的，而在其他实施方案中，它们位于芽孢杆菌染色体的分立区域内。在一些实施方案中，失活的染色体基因具有某些条件下的必需功能，但是该基因对于实验室条件下芽孢杆菌属菌株活力不是必需的。优选的实验室条件包括但不限于条件，如在适于微生物生长的发酵罐、摇瓶、平板培养基等中生长。

如本文中所用，术语“失活性DNA构建体”、“失活性多核苷酸”和“缺失盒”互换地用来指DNA构建体，其包含可以插入某基因以干扰该基因功能的无功能序列。在一些实施方案中，失活性DNA构建体包含编码选择标记的序列。失活性DNA构建体也可以包括两个同源盒。

如本文中所用，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成地产生的核酸构建体，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段。一般而言，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子，以及其他序列。在优选的实施方案中，表达载体具有将异源DNA片段掺入宿主细胞中和表达的能力。众多原核和真核表达载体是市售的。适宜表达载体的选择处于本领域技术人员的知识范围内。术语“表达盒”在本文中与“DNA构建体”及其语法等同物互换地使用。合适表达载体的选择处于本领域技术人员的知识范围内。

如本文中所用，术语“DNA构建体”和“转化性DNA”互换地用来指将序列导入宿主细胞或生物中所使用的DNA。该DNA可以通过PCR或本领域技术人员已知的任意其他合适技术在体外(in vitro)产生。在特别优选的实施方案中，DNA构建体包含目的序列(例如，作为外来序列)。在一些实施方案中，该序列与额外元件如调控元件(例如，启动子等)有效连接。该DNA构建体还可以包含选择标记。它还可以包含侧翼分布有同源盒的外来序列。在又一个实施方案中，转化性DNA包含添加至末端的其他非同源序列(例如，填充序列或侧翼序列)。在一些实施方案中，外来序列的末端被闭合，从而这种转化性DNA形成闭合环。所述转化性序列可以是野生型、突变或修饰的。在一些实施方案中，该DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，该DNA构建体包含非同源序列。一旦在体外装配出DNA构建体，则它可以用来：1)将异源序列插入宿主细胞的预期靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)，3)缺失靶基因；和/或将复制型质粒导入宿主中。

如本文中所用，术语“异源DNA序列”指不天然存在于宿主细胞中的DNA序列。在一些实施方案中，异源DNA序列是由不同基因的部分(包括调节元件)组成的嵌合DNA序列。

如本文中所用，术语“异源蛋白”指不天然存在于宿主细胞中的蛋白质或多肽(即，它由异源序列编码)。

如本文中所用，“同源蛋白”指细胞中固有或天然存在的蛋白质或多肽。

术语“YmaH蛋白”与“Hfq蛋白”互换地使用并且指增强目的蛋白表达的蛋白质。在YmaH的语境中，“YmaH蛋白”在本文中指野生型YmaH蛋白及其变体，包括直向同源物。

如本文中所用，术语“载体”指设计旨在将核酸导入一种或多种宿主细胞的多核苷酸。在优选的实施方案中，载体在不同的宿主细胞中自主复制。本术语意图包括但不限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒(cassettes)等。

如本文中所用的“表达载体”指包含与合适的调控序列有效连接的蛋白质编码区的DNA构建体，其中所述的合适调控序列能够实现该蛋白质在合适宿主细胞中的表达。在一些实施方案中，此类调控序列包括实现转录的启动子、控制转录产生mRNA的任选操纵基因序列、编码mRNA中合适核糖体结合位点的序列、和增强子、以及控制转录和翻译终止的序列。

如本文中所用，术语“启动子”指启动下游核酸转录的调节序列。

如本文中所用，术语“有效连接”指元件的排列，其中所述的排列使得所述元件功能地联系。例如，如果某启动子控制某编码序列的转录，则该启动子与此序列有效连接。

如本文中所用，术语“衍生”包括术语“源自”、“获得”、“从......可获得”和“从......分离”。

如本文中所用，“非致病性”生物是对人和/或其他动物无致病性的生物。

如本文中所用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从与其天然结合的至少一种组分中取出的蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文中将某核酸序列导入细胞的情况下所用，术语“导入”指任何适于将此核酸序列转移至该细胞中的方法。用于导入的此类方法包括但不限于原生质体融合法、转染法、转化法、接合法和转导法(见例如，Ferrari等人，“Genetics，”在Hardwood等人(编著)，Bacillus.Plenum Publishing Corp.，第57-72页[1989]中)。

如本文中所用，术语“转化的”和“稳定转化的”指这样的细胞，其具有非天然(异源)多核苷酸序列整合入其基因组中或作为维持至少两个世代的附加体质粒。

如本文中所用，术语“表达”指多肽基于基因的核酸序列被产生的过程。该过程包括转录和翻译。

如本文中所用，术语“编码选择标记的核苷酸序列”指这样的核苷酸序列，它能够在宿主细胞中表达并且其中该选择标记的表达赋予含有所表达基因的细胞在相应选择剂存在下或缺少必需养分时生长的能力。

如本文中所用，术语“选择标记“和“选择性标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸(例如基因)，所述核酸允许容易地选择含有载体的那些宿主。此类选择标记的例子包括但不限于抗微生物剂。因而，术语“选择标记”指这样的基因，它们提供了宿主细胞已经摄取外来目的DNA或一些其他反应已经发生的指示。一般而言，选择标记是这样的基因，它们赋予宿主细胞抗微生物剂抗性或代谢优势以使得含有外源DNA的细胞与转化期间没有接受任何外源序列的细胞区别。“原住性选择标记”是位于待转化微生物的染色体上的选择标记。原住性选择标记编码与转化DNA构建体上的选择标记不同的基因。选择标记是本领域技术人员熟知的。如上文所示，优选地，该标记是抗微生物剂抗性标记(例如amp^R；phleo^R；spec^R；kan^R；ery^R；tet^R；cmp^R和neo^R(见例如，Guerot-Fleury，Gene，167：335-337，1995；Palmeros等人，Gene 247：255-264，2000和Trieu-Cuot等人，Gene，23：331-341，1983)。根据本发明有用的其他标记包括但不限于营养缺陷型标记如色氨酸；和检测标记，如β-半乳糖苷酶。

如本文中所用，“培养”指在合适的条件下在液态或固态培养基中培育微生物细胞群体。在一些实施方案中，培养指外源目的蛋白或其他所希望终产物的发酵性重组产生(一般在容器或反应器中)。

如本文中所用，术语“产生”在谈及目的蛋白使用时包括转录和翻译的过程，并且根据需要，包括分泌和成熟过程，这产生活性形式的蛋白质。对于分泌至胞外培养基中的蛋白质(例如，蛋白酶)，将蛋白质产生的水平评估为分泌至胞外培养基中的活性蛋白质的量。

如本文中所用，“芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)”指“芽孢杆菌属”内部的全部物种，它们是分类为芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillale)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)成员的革兰氏阳性细菌。如本领域技术人员所致，“芽孢杆菌属”包括“芽孢杆菌属”内的全部物种，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。认识到芽孢杆菌属仍在进行分类学重新编排。因而，意图该属包括已经重新划分的物种，包括但不限于此类生物，如嗜热脂肪芽孢杆菌，它现在名叫“嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在氧存在下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的限定性特征，尽管这个特征也适用于新近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。

其他术语的定义可以在本说明书通篇范围内显而易见。

在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解本发明不限于所述的具体实施方案，因为这类实施方案当然可以变动。还应当理解本文中所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的。

在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解本发明不限于所述的具体实施方案，因为这类实施方案当然可以变动。还应当理解本文中所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的。

修饰的宿主细胞

芽孢杆菌属细胞利用双组分信号转导系统(每种系统含有传感器激酶和应答调节物)来感知和应对多种类型的胞外刺激。已知的双组分信号转导系统参与多种过程，如感受态发育(Dubnau，Microbiological Reviews 199 155，395-424)、蛋白质分泌(Kunst，Research in Microbiology 1994 145，393-402；Darmon，Journalof Bacteriology 2002 184，5661-5671)，肽抗生素和杀菌素的合成(MarahielMolecular Microbiology 1993 7，631-636；Stein，Molecular Microbiology 2002 44，403-416)和芽孢形成(Grossman，Annual Reviews Genetics 1995 29，477-508)。这些调节系统受胞内应答调节物天冬氨酰磷酸酶(Rap)及其对抗性磷酸酶调节物(Phr)控制。Rap使应答调节物去磷酸化，这改变基因表达，因而产生细胞应答。Phr肽充当细胞密度信号传导分子并且抑制Rap磷酸酶(Perego，Procedings ofthe National Acadamy of Science USA 1997 94，8612-8617；Perego，M.Trendsin Microbiology 1998 6，366-370；Perego，Cell 199479，1047-1055)。

Rap磷酸酶留在细胞质，而Phr肽含有氨基端信号肽并且作为前肽输出，最可能经Sec途径输出(Perego，Molecular Microbiology 1996 19，1151-1170；Tjalsma.Microbiological and Molecular Biology Reviews 2000 64，515-547)。另外，胞外加工产生有活性的Phr五肽。通过培养的细胞借助寡肽通透酶(Opp)系统再输入后，Phr肽特异性抑制其关联物Rap磷酸酶的活性(Solomon，Genes andDevelopment 1996 10，2014-2024；Perego，Procedings of the National Acadamyof Science USA 1997 94，8612-8617；Perego，Trends in Microbiology 1998 6，366-370)。Phr肽充当细胞密度传感蛋白(quorum sensors)，因为它们启动应答于细胞密度变化的细胞反应。Rap蛋白和抑制Rap蛋白的Phr肽在单一操纵子上编码。枯草芽孢杆菌基因组中有8个rap操纵子和3个其他rap编码基因，其中所述操纵子与之关联的phr基因转录(Kunst，Nature 1997 390，249-256)。Pottathil(Front Biosci.2003 8：d32-45)和Perego(Peptides 2001 22：1541-7)中综述了枯草芽孢杆菌rap/phr信号传导系统。

本发明提供了经修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，其是已经受到基因操作以具有增强的目的蛋白产生能力的宿主细胞。特别地，本发明涉及含有基因组的修饰芽孢杆菌属细胞，其中所述基因组包含至少一个包含失活phr基因的rap操纵子。在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞含有基因组，该基因组包含至少一个包含失活phr基因和失活rap基因的rap操纵子。与未修饰的前体芽孢杆菌细胞产生相同的蛋白质相比时，phr和/或rap基因的失活增强了修饰的芽孢杆菌细胞产生目的蛋白。因而，修饰的芽孢杆菌细胞包含至少一个失活的phr和/或rap基因和编码目的蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸是野生型多核苷酸。在其他实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸是重组多核苷酸。

几种芽孢杆菌rap操纵子的DNA序列和由所述操纵子编码的Rap和Phr蛋白已经测定并且提交至NCBI Genbank数据库中。在某些实施方案中，在主题细胞中修饰过的芽孢杆菌rap操纵子：a)可以与提交至NCBI Genbank数据库中的rap操纵子序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约98％序列同一性的序列；b)可以在严格条件下与提交至NCBIGenbank数据库中的rap操纵子序列杂交；或c)可以编码多肽，所述多肽与提交至NCBI Genbank数据库中的Rap或Phr序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约80％、至少约90％、至少约93％、至少约95％、至少约97％或至少约98％序列同一性)。NCBI Genbank数据库中提交的示例性phr蛋白和核苷酸序列包括以Genbank登录号NC_000964.2；GID：50812173(枯草芽孢杆菌)、Genbank登录号NC_009848.1；GID：157690798(短小芽孢杆菌)、Genbank登录号NC_006270.3；GID：163119169(地衣芽孢杆菌)和Genbank登录号NC_005957.1；GID 49476684(苏云金芽孢杆菌)注释的那些，以及其他的phr蛋白和核苷酸序列。Rap蛋白可以鉴定为含有所谓的三十四肽重复序列结构域(tetratricopeptide)，为pfam结构域，其通常含有34个氨基酸并且含有以下的氨基酸序列：[WLF]-X(2)-[LIM]-[GAS]-X(2)-[YLF]-X(8)-[ASE]-X(3)-[FYL]-X(2)-[ASL]-X(4)-[PKE]。上文的Genbank登录项通过引用的方式完整并入本文，包括其中的核酸和蛋白质序列和对那些序列以及本专利申请的最早申请日的注释。

在一些实施方案中，熟知的枯草芽孢杆菌菌株168用于本发明中。实际上，该菌株的基因组已经充分表征(见，Kunst等人，Nature 390：249-256[1997]；和Henner等人，Microbiol.Rev.，44：57-82[1980])。该基因组包含一条4215kb染色体。尽管本文中所用的坐标指168菌株，但是本发明包括来自非枯草芽孢杆菌168的芽孢杆菌属菌株中的类似序列。

在一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含单个失活的phr基因(例如，含有一个无活性phrA基因的rapA操纵子、含有一个无活性phrC基因的rapC操纵子、含有一个无活性phrE基因的rapE操纵子、含有一个无活性phrF基因的rapF操纵子、含有一个无活性phrI基因的rapI操纵子或含有一个无活性phrK基因的rapK操纵子)。

在一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含失活的phrA基因(例如，含有无活性phrA基因的rapA操纵子)。在一些实施方案中，失活因缺失编码PhrA蛋白的完整内源性DNA序列所致。在一些实施方案中，使用失活性DNA缺失构建体SEQ ID NO：17缺失枯草芽孢杆菌phrA基因的完整内源性DNA序列。在枯草芽孢杆菌168中，编码phrA蛋白MKSKWMSGLL LVAVGFSFTQVMVHAGETAN TEGKTFHIAA RNQT；SEQ ID NO：42(Swiss-Prot：Q00829)的DNA序列是Atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaaca；SEQ ID NO：41(NP_389126)。备选地，phrA基因的失活因缺失phrA基因片段而阻止PhrA蛋白的功能性表达。phrA基因位于枯草芽孢杆菌168染色体(登录号NC_000964)约1316305-1316439bp处。根据一个实施方案，通过插入中断phrA基因的选择标记失活phrA基因。

在另一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含失活的phrE基因(例如，含有无活性phrE基因的rapE操纵子)。在一些实施方案中，失活因缺失编码PhrE蛋白的完整内源性DNA序列所致。

在一些实施方案中，使用失活性DNA缺失构建体SEQ ID NO：18缺失枯草芽孢杆菌phrE基因的完整内源性DNA序列。在枯草芽孢杆菌168中，编码PhrE蛋白MKSKLFISLS AVLIGLAFFG SMYNGEMKEA SRNVTLAPTH EFLV；SEQ ID NO：44(Swiss-Prot：032025)的DNA序列是atgaaatctaaattgtttatcagtttatccgccgttttaattggacttgcctttttcggatctatgtataatggcgaaatgaaggaagcatcccggaatgtaactctcgcacctactcatgaattccttgtt；SEQ ID NO：43(NP_390461)。备选地，phrE基因的失活因缺失phrE基因片段而阻止PhrE蛋白的功能性表达。phrE基因位于枯草芽孢杆菌168染色体(登录号NC_000964)约2659557-2659691bp处。根据一个实施方案，通过插入中断phrE基因的选择标记而失活phrE基因。

又在其他实施方案中，使用SEQ ID NOS：17和18中分别所述的phrA和phrE缺失构建体从枯草芽孢杆菌染色体中缺失phrA和phrE基因。

在一些其他实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含至少两个失活的phr基因(例如，两个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)、至少三个失活的phr基因(例如，三个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)、至少四个失活的phr基因(例如，四个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)、至少五个失活的phr基因(例如，五个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)、至少六个失活的phr基因(例如，六个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)、至少七个失活的phr基因(例如，七个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)或至少八个失活的phr基因(例如，八个rap操纵子，各自含有失活的phr基因)。在一个示例性实施方案中，主题宿主细胞可以含有a)含无活性phrA基因的rapA操纵子和b)含无活性phrE基因的rapE操纵子。在一些实施方案中，失活因缺失分别编码PhrA蛋白和PhrE蛋白的完整内源性DNA序列所致。备选地，phrA和phrE基因的失活因缺失phrA和phrE基因片段而阻止PhrA蛋白和PhrE蛋白的功能性表达。因而，在一些实施方案中，从该染色体中缺失phrA基因的节段和缺失phrE基因的节段。类似地，phrA和phrE基因的失活因缺失编码PhrA的完整内源性DNA序列和缺失编码PhrE蛋白片段的DNA序列所致。备选地，phrA和phrE基因的失活因缺失编码PhrE的完整内源性DNA序列和缺失编码PhrA蛋白片段的DNA序列所致。phr基因(例如phrA和/或phrE)的片段包含范围约1％至约99％的编码phrA和/或phrE蛋白的固有染色体区。在其他实施方案中，片段包含范围约5％至约95％的所述固有染色体区。还在额外的实施方案中，片段包含至少约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约90％、约88％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约50％、约40％、约30％、约25％、约20％和约10％的所述固有染色体区。

在一些实施方案中，通过因同源重组所致的缺失实现phrA和/或phrE基因的失活。例如，在phr是待缺失基因时的一些实施方案中，使用包含选择标记的失活性DNA构建体，其中所述的选择标记在每一侧分布有同源盒。该同源盒包含与染色体phr基因的核酸侧翼区同源的核苷酸序列。该DNA构建体与芽孢杆菌属宿主染色体的同源序列对齐并且phr基因在双交换事件中从宿主染色体切下。失活性DNA构建体在体外装配出来，随后直接克隆该构建至感受态芽孢杆菌属宿主中，从而该DNA构建体整合入芽孢杆菌染色体。例如，PCR融合和/或连接法可以用来在体外装配DNA构建体。在一些实施方案中，该DNA构建体是非质粒构建体，而在其他实施方案中，它掺入载体(例如，质粒)中。

在其他实施方案中，失活性DNA构建体包含基因序列片段和在5′和3′末端侧翼分布有选择标记。在一些实施方案中，当包含选择标记和基因、基因片段或其同源序列的DNA构建体转化入宿主细胞时，选择标记的位置使得该基因无法履行其预期功能。在一些实施方案中，失活性DNA构建体包含位于该基因的启动子区内的选择标记。在其他实施方案中，失活性DNA构建体包含位于该基因的启动子区3’处的选择标记。还在其他实施方案中，失活性DNA构建体包含位于该基因编码区内的选择标记。在又一些实施方案中，失活性DNA构建体包含在两端侧翼分布有同源盒的选择标记。仍在又一些实施方案中，失活性DNA构建体包括中断编码序列转录和/或翻译的序列。还在额外的实施方案中，失活性DNA构建体包括在该构建体上游和下游末端处工程化设计的限制性位点。

在另一个实施方案中，通过插入以单个交换事件中断phrA和/或phrE基因的选择标记来失活phrA和/或phrE基因。在一些实施方案中，该选择标记位于基因编码序列内部或位于质粒上的与该基因分开的部分上。该载体整合入芽孢杆菌染色体，并且该基因因载体插在编码序列中而失活。

用于失活phr基因的其他合适手段包括导入产生氨基酸置换和截短的突变，这伴随phr蛋白生物学活性的相应丧失。在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含一个或多个phr基因的失活，其中所述的失活优选地导致稳定和不可逆的失活。使基因突变的方法是本领域熟知的并且包括但是不限于位点定向突变法、随机突变生成法和空位-双链体(gapped-duplex)法(见例如，美国专利号4,760,025；Moring等人，Biotech.2：646[1984]；和Kramer等人，Nucleic AcidsRes.，12：9441[1984])。

无论失活性DNA构建体是掺入载体还是在质粒DNA不存在的情况下使用，该构建体均用来转化微生物。构思了用于转化的任何合适方法将随本发明使用。在一些实施方案中，至少一个拷贝的失活性DNA构建体整合入宿主芽孢杆菌染色体。在一些实施方案中，本发明的一个或多个失活性DNA构建体用来转化宿主细胞。例如，一个失活性DNA构建体可以用来失活phrA基因并且另一个构建体可以用来失活phrE基因。当然，本发明构思和提供了额外的组合。

在一些实施方案中，phrA和/或phrE基因在已经缺失一个或多个编码内源性蛋白酶的基因的前体重组枯草芽孢杆菌菌株中缺失。在一些实施方案中，该芽孢杆菌属宿主细胞包含两个或多个失活的蛋白酶基因。在一些实施方案中，该芽孢杆菌属宿主细胞含有两个失活的蛋白酶基因(见例如，美国专利5,387,521)而在其他实施方案中，该芽孢杆菌属宿主细胞含有5个失活的蛋白酶基因：nprE、aprE、epr、ispA和bpr基因(见例如，US20050202535)。由于完整枯草芽孢杆菌基因组的序列是公开可获得的并且被注释(见例如，Moszer，FEBS Lett.，430：28-36[1998])，已经鉴定并详细综述了枯草芽孢杆菌的蛋白酶(见例如，He等人，Res.Microbiol.，142：797-803[1991])。此外，用于芽孢杆菌属细胞的基因破坏方法是本领域通常熟知的(见例如，Lee等人，Appl.Environ.Microbiol.，66：476-480[2000]；Ye等人，Proc.Internatl.Symp.Rec.Adv.Bioindustry，Seoul，Korea：The Korean Society for Applied Microbiology，第160-169页[1996]；Wu等人，J.Bacteriol.，173：4952-4958[1991]；和Sloma等人，J.Bacteriol.，173：6889-6895[1991])。因而，此类菌株的构建体完全处于本领域技术人员的能力范围内。

如上文所示，在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属宿主细胞包含失活的phr基因和失活的rap基因。在一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含了含有失活phr基因和失活rap基因的单个rap操纵子(例如，含有无活性phrA基因和失活rapA基因的rapA操纵子、含有无活性phrC基因和失活rapC基因的rapC操纵子、含有无活性phrE基因和失活rapE基因的rapE操纵子、含有无活性phrF基因和失活rapF基因的rapF操纵子、含有无活性phrI基因和失活rapI基因的rapI操纵子或者含有无活性phrK基因和失活rapK基因的rapK操纵子)。在其他实施方案中，修饰的芽孢杆菌细胞含有至少两个这样的rap操纵子，每一操纵子含有失活的phr基因和失活的rap基因。在一些实施方案中，失活因缺失分别编码Phr蛋白和Rap蛋白的完整内源性DNA序列所致。

在一些实施方案中，使用失活性DNA缺失构建体SEQ ID NO：17缺失枯草芽孢杆菌phrA基因的完整内源性DNA序列。在枯草芽孢杆菌168中，编码PhrA蛋白MKSKWMSGLL LVAVGFSFTQ VMVHAGETAN TEGKTFHIAA RNQT；SEQ ID NO：42(Swiss-Prot：Q00829)的DNA序列是atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaaca；SEQ ID NO：41(NP_389126)。

备选地，phrA基因的失活因缺失phrA基因片段来阻止PhrA蛋白的功能性表达。phrA基因位于枯草芽孢杆菌168染色体(登录号NC_000964)约1316305-1316439bp处。根据一个实施方案，通过插入中断phrA基因的选择标记失活phrA基因。备选地，phrA基因的失活因通过导入在rapA基因中包含终止子序列的选择标记，因而阻止rapA和PhrA蛋白功能性表达来失活rapA基因所致。根据一个实施方案，通过插入中断rapA基因的选择标记来失活rapA基因。

在一个实施方案中，使用失活性DNA缺失构建体SEQ ID NO：52缺失枯草芽孢杆菌rapA基因的内源性DNA序列。在枯草芽孢杆菌168中，编码rapA蛋白：MRMKQTIPSSYVGLKINEWYTHIRQFHVAEAERVKLEVEREIEDMEEDQDLLLYYSLMEFRHRVMLDYIKPFGEDTSQLEFSELLEDIEGNQYKLTGLLEYYFNFFRGMYEFKQKMFVSAMMYYKRAEKNLALVSDDIEKAEFAFKMAEIFYNLKQTYVSMSYAVQALETYQMYETYTVRRIQCEFVIAGNYDDMQYPERALPHLELALDLAKKEGNPRLISSALYNLGNCYEKMGELQKAAEYFGKSVSICKSEKFDNLPHSIYSLTQVLYKQKNDAEAQKKYREGLEIARQYSDELFVELFQFLHALYGKNIDTESVSHTFQFLEEHMLYPYIEELAHDAAQFYIENGQPEKALSFYEKMVHAQKQIQRGDCLYEI；SEQ ID NO：54(Swiss-Prot：Q00828)的DNA序列是ttgaggatgaagcagacgattccgtcctcttatgtcgggcttaaaattaatgaatggtatactcatatccggcagttccacgtcgctgaagccgaacgggtcaagctcgaagtagaaagagaaattgaggatatggaagaagaccaagatttgctgctgtattattctttaatggagttcaggcaccgtgtcatgctggattacattaagccttttggagaggacacgtcgcagctagagttttcagaattgttagaagacatcgaagggaatcagtacaagctgacagggcttctcgaatattactttaatttttttcgaggaatgtatgaatttaagcagaagatgtttgtcagtgccatgatgtattataaacgggcagaaaagaatcttgccctcgtctcggatgatattgagaaagcagagtttgcttttaaaatggctgagattttttacaatttaaaacaaacctatgtttcgatgagctacgccgttcaggcattagaaacataccaaatgtatgaaacgtacaccgtccgcagaatccaatgtgaattcgttattgcaggtaattatgatgatatgcagtatccagaaagagcattgccccacttagaactggctttagatcttgcaaagaaagaaggcaatccccgcctgatcagttctgccctatataatctcggaaactgctatgagaaaatgggtgaactgcaaaaggcagccgaatactttgggaaatctgtttctatttgcaagtcggaaaagttcgataatcttccgcattctatctactctttaacacaagttctgtataaacaaaaaaatgacgccgaagcgcaaaaaaagtatcgtgaaggattggaaatcgcccgtcaatacagtgatgaattatttgtggagctttttcaatttttacatgcgttatacggaaaaaacattgacacagaatcagtctcacacacctttcaatttcttgaagaacatatgctgtatccttatattgaagagctggcgcatgatgctgcccaattctatatagaaaacggacagcccgaaaaagcactttcattttatgagaaaatggtgcacgcacaaaaacaaatccagagaggagattgtttatatgaaatc；SEQ ID NO：53(NP_389125)。

在某些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含了含有无活性phr基因的rap操纵子，所述细胞可以包含有活性或无活性的rap基因。如果rap基因是有活性的，它可以具有野生型序列(例如，可以相对于该细胞为内源性)或可以被修饰，从而它功能地等同于相同物种的野生型蛋白。

在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属宿主细胞包含失活的rap基因。在一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含了含有失活rap基因的单个rap操纵子(例如，含有无活性的失活rapA基因的rapA操纵子、含有无活性的失活rapB基因的rapB操纵子、含有失活rapC基因的rapC操纵子、含有失活rapD基因的rapD操纵子、含有失活rapE基因的rapE操纵子、含有失活rapF基因的rapF操纵子、含有失活rapG基因的rapG操纵子、含有失活rapI基因的rapI操纵子、含有失活rapJ基因的rapJ操纵子、含有失活rapK基因的rapK操纵子)。在其他实施方案中，修饰的芽孢杆菌细胞含有至少两个这样的rap操纵子，每一操纵子含有失活的rap基因。在一些实施方案中，失活因缺失编码Rap蛋白的完整内源性DNA序列所致。

修饰的芽孢杆菌属细胞衍生自属于芽孢杆菌属菌株的前体宿主细胞，包括嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株。在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞衍生自嗜碱性芽孢杆菌属细胞。众多嗜碱性芽孢杆菌物种是已知的(见例如，美国专利号5,217,878；和Aunstrup等人，Proc IV IFS：Ferment.Technol.Today，299-305[1972])。在一些具体的实施方案中，芽孢杆菌属前体宿主细胞是工业用芽孢杆菌属宿主细胞。工业用芽孢杆菌属宿主细胞的实例包括不限于地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌宿主细胞。在额外的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞选自由迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌以及如上文所讨论的芽孢杆菌属内部其他生物组成的组。在一些特别优选的实施方案中，使用枯草芽孢杆菌。例如，美国专利号5,264,366和4,760,025(RE 34,606)描述用于本发明中的多个芽孢杆菌属宿主菌株，不过也构思了其他合适的菌株(例如，工业用菌株)用于本发明中。

工业用菌株可以是芽孢杆菌属物种的非重组菌株、天然存在菌株的突变体或重组菌株。优选地，宿主菌株是其中编码目的多肽的重组多核苷酸已经导入该宿主中的重组宿主菌株。在一些实施方案中，目的多肽是酶(例如，蛋白酶)。又一个优选的宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，并且特别地是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。众多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于1A6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B637、PB1753至PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211菌株(见例如，Hoch等人，Genetics、73：215-228[1973]；美国专利号4,450,235；美国专利号4,302,544；和EP 0134048)。枯草芽孢杆菌作为表达宿主的用途还由Palva等人和其他人(见，Palva等人，Gene 19：81-87[1982]；还见，Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol.，165：796-804[1986]；和Wang等人，Gene 69：39-47[1988])描述。

产生工业用蛋白酶的芽孢杆菌属宿主细胞提供特别优选的宿主细胞。在一些优选的实施方案中，本发明中这些宿主细胞的使用增强了蛋白酶产生。一般而言，两种常见类型的蛋白酶由芽孢杆菌属物种分泌，即中性(或“金属蛋白酶”)和碱性(或“丝氨酸”)蛋白酶。丝氨酸蛋白酶是在活性部位催化存在的必需丝氨酸残基的肽键水解的酶。丝氨酸蛋白酶具有25,000至30,000范围的分子量(见，Priest，Bacteriol.Rev.，41：711-753[1977])。枯草蛋白酶是由本发明的经修饰芽孢杆菌属宿主细胞产生的优选丝氨酸蛋白酶。已经鉴定并测序种类多样的芽孢杆菌枯草蛋白酶，例如，GG36、枯草蛋白酶168、枯草蛋白酶BPN′、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶309(见例如，EP 414279B；WO 89/06279；和Stahl等人，J.Bacteriol.，159：811-818[1984])。在本发明的一些实施方案中，芽孢杆菌属宿主菌株产生突变体(例如，变体)蛋白酶。众多的参考文献提供变体蛋白酶和参比物的实例(见例如，WO 99/20770；WO99/20726；WO 99/20769；WO 89/06279；RE 34,606；美国专利号4,914,031；美国专利号4,980,288；美国专利号5,208,158；美国专利号5,310,675；美国专利号5,336,611；美国专利号5,399,283；美国专利号5,441,882；美国专利号5,482,849；美国专利号5,631,217；美国专利号5,665,587；美国专利号5,700,676；美国专利号5,741,694；美国专利号5,858,757；美国专利号5,880,080；美国专利号6,197,567；和美国专利号6,218,165)。

在另一个实施方案中，优选的芽孢杆菌宿主是在以下基因degU、degS、degR和degQ至少一者中包括突变或缺失的芽孢杆菌。优选地，该突变位于degU基因中，并且更优选地，该突变是degU(Hy)32(见例如，Msadek等人，J.Bacteriol.，172：824-834[1990]；和Olmos等人，Mol.Gen.Genet.，253：562-567[1997])。在一个实施方案中，该宿主细胞是携带degU32(Hy)突变的枯草芽孢杆菌宿主细胞。在又一个实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞包含在scoC4中的突变或缺失(见例如，Caldwell等人，J.Bacteriol.，183：7329-7340[2001])；spoIIE中的突变或缺失(见例如，Arigoni等人，Mol.Microbiol.，31：1407-1415[1999])；opp操纵子的oppA或其他基因中的突变或缺失(见例如，Perego等人，Mol.Microbiol.，5：173-185[1991])。实际上，构思了opp操纵子中的任何突变将用于本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞的一些实施方案中，其中所述的任何突变造成与oppA基因中的突变相同的表型。在一些实施方案中，这些突变单独地存在，而在其他实施方案中，存在突变的组合。在一些实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞衍生自已经包括对一个或多个上文所提及基因的突变的芽孢杆菌属宿主细胞。在备选实施方案中，进一步工程化本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞以包括对一个或多个上文所提及基因的突变。

目的蛋白

本发明提供了修饰的芽孢杆菌属细胞，它们用来以比未修饰的前体宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白。通常而言，目的蛋白是具有商业意义的想要的蛋白质。目的蛋白可以相对于该宿主为同源或异源的。在一些实施方案中，目的蛋白是分泌的多肽，特别是酶，包括但不限于淀粉水解酶、蛋白质水解酶、纤维素水解酶、氧化还原酶和植物细胞壁降解酶。在又一些实施方案中，这些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角质酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果胶酶、葡糖苷酶、异构酶、转移酶、半乳糖苷酶和壳多糖酶。仍在又一些实施方案中，表达的多肽是激素、细胞因子、生长因子、受体、疫苗、抗体等。虽然不意图使本发明限于任何具体蛋白质/多肽，但在一些最优选的实施方案中，表达的目的蛋白是蛋白酶。

如上文指出，在某些实施方案中，宿主细胞含有重组表达盒，其包含编码目的蛋白的多核苷酸序列(即，用于产生对该宿主细胞而言并非天然的蛋白质的表达盒)。在一些实施方案中，该宿主细胞包含了含有表达盒(即，启动子、编码目的蛋白的多核苷酸和转录终止子)的重组核酸，其中该表达盒足以通过芽孢杆菌属宿主细胞产生蛋白质。在一些实施方案中，重组核酸整合入宿主细胞的基因组中，而在其他实施方案中，该重组核酸存在于从基因组自主复制的载体中。在一些实施方案中，编码目的蛋白的多核苷酸是进行了密码子优化的，用于该蛋白质在芽孢杆菌属宿主细胞中的表达。虽然任何启动子可以用于主题表达盒中，但受rap/phr系统调节的启动子(例如，aprE和nprE启动子)可以用于一些实施方案中。

在一个实施方案中，目的蛋白可以例如是酶(例如，所谓的“工业用酶”)或具有治疗活性的蛋白质如抗体。在一个具体实施方案中，目的蛋白是枯草蛋白酶，其中术语“枯草蛋白酶”指S8肽酶家族的丝氨酸内肽酶。根据IUMBM酶命名法，枯草蛋白酶蛋白质具有描述为EC 3.4.21.62(以前称为EC 3.4.4.16)的活性。示例性枯草蛋白酶蛋白的活性通常在Philipp等人，(Mol.Cell.Biochem.1983 51：5-32)，Siezen(Protein Sci.，19976：501-523)；Bryan(Biochim.Biophys.Acta，20001543：203-222)；Maurer，2004 Curr.Op，Biotechnol.，2004 15：330-334)；和Gupta，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2002 59：15-32)中描述。

在一些实施方案中，枯草蛋白酶具有在野生型基因组中发现的氨基酸序列(即，该枯草蛋白酶是天然存在的枯草蛋白酶)，而在其他实施方案中，该枯草蛋白酶是天然存在枯草蛋白酶的变体。在一些实施方案中，变体枯草蛋白酶包含与野生型基因组所编码的枯草蛋白酶至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同一的氨基酸序列。示例性枯草蛋白酶包括但不限于：

(Novozymes)、FNA^TM(Genencor)、(Novozymes)PURAFECT^TM(Genencor)、KAP^TM(Kao)、EVERLASE^TM(Novozymes)、PURAFECT OxP^TM(Genencor)、FN4^TM(Genencor)、BLAP S^TM(Henkel)、BLAPX^TM(Henkel)、(Novozymes)、KANNASE^TM(Novozymes)和PROPERASE^TM(Genencor)。还在额外的实施方案中，枯草蛋白酶包括但不限于枯草蛋白酶BPN’、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶DY、枯草蛋白酶147或枯草蛋白酶309(见例如，WO89/06279；和Stahl等人，J.Bacteriol.，159：811-818[1984])。用于本发明中的额外枯草蛋白酶和其他蛋白酶包括但不限于在WO99/20770；WO 99/20726；WO 99/20769；WO 89/06279；RE 34,606；美国专利号4,914,031；美国专利号4,980,288；美国专利号5,208,158；美国专利号5,310,675；美国专利号5,336,611；美国专利号5,399,283；美国专利号5,441,882；美国专利号5,482,849；美国专利号5,631,217；美国专利号5,665,587；美国专利号5,700,676；美国专利号5,741,694；美国专利号5,858,757；美国专利号5,880,080；美国专利号6,197,567；和美国专利号6,218,165中描述的那些酶。

在一些实施方案中，目的蛋白在宿主细胞中的表达受aprE基因的aprE启动子驱动，从其天然转录枯草芽孢杆菌枯草蛋白酶。aprE基因由sigma A(σ^A)因子转录并且其表达高度地受几种调节物控制，如：DegU/DegS，AbrB，Hpr和SinR(Valle和Ferrari(1989)在：Smith I，Slepecky RA，Setlow P(编著)原核生物发育的调节(Regulation of Procaryotic Development).美国微生物学会(American Society for Microbiology)，Washington，DC第131-146页)，并且已经鉴定了aprE Sigma A启动子tgggtcttgacaaatattattccatctattacaataaattcacaga(SEQ ID NO：38；US 20030148461；Helman等人，1995，Nucleic Acid Research，第24卷，第2351-2360页)。在一些实施方案中，该宿主细胞包含作为野生型aprE启动子tgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacaga(SEQ ID NO：39；美国专利申请公开号20030148461)的aprE启动子。

在其他实施方案中，宿主细胞目的蛋白的表达受枯草芽孢杆菌aprE启动子的突变体驱动。在一些实施方案中，本发明提供芽孢杆菌属宿主细胞，其含有与编码目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的突变体aprE启动子。因而，本发明包括从突变体aprE启动子表达目的蛋白的宿主细胞。突变体aprE启动子的实例是具有以下序列的突变体aprE启动子：tgggtc ttgaca aatattattccatctat tacaataaattcacaga(SEQ ID NO：40)，

该启动子在美国专利申请公开号20030148461中描述。本文中所提到的任一种目的蛋白(例如，芽孢杆菌枯草蛋白酶)可以从aprE启动子转录。在一些实施方案中，本发明提供能够从aprE启动子表达目的蛋白的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施方案中，修饰的宿主细胞是受aprE启动子驱动能够表达蛋白酶的修饰的枯草芽孢杆菌宿主细胞。在一些实施方案中，该aprE启动子包括aprE启动子调节元件和/或aprE转录前导序列，而在其他实施方案中，该aprE启动子不包括aprE启动子调节元件和/或aprE转录前导序列。

除aprE启动子之外，本发明还包括用于通过宿主细胞表达目的蛋白的组合物和方法，其中所述表达受适于驱动目的基因转录的任何启动子驱动，只要该启动子包含aprE基因的转录前导序列。用于芽孢杆菌属宿主细胞中的其他合适启动子和终止子是已知的，并且包括：npr(中性蛋白酶；即NprE启动子)、amy(α-淀粉酶)和α-内酰胺酶基因以及枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽胞杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子和终止子、在WO 93/10249，WO 98/07846和WO 99/43835中所述的启动子和终止子。

在其他实施方案中，修饰的宿主细胞可以例如产生这样的目的蛋白，其是重组糖酶，如起液化和糖化作用的α-淀粉酶、碱性α-淀粉酶、α-淀粉酶、纤维素酶；糊精酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚苷酶、果胶酶或支链淀粉酶；蛋白酶如酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、肾素、凝乳酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油酯酶、磷脂酶、前胃酯酶、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亚氨酰化酶(iminoaeylase)、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素酰化酶；异构酶如葡萄糖异构酶；氧化还原酶(例如，氨基酸氧化酶)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羟类固醇脱氢酶或过氧化物酶；裂解酶如乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、延胡索酸酶或组氨酸酶；转移酶如环糊精糖基转移酶；或连接酶。在具体的实施方案中，该蛋白质可以是氨肽酶、羧肽酶、壳多糖酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、果胶分解酶、多酚氧化酶、核酸酶或转谷氨酰胺酶。

在具体实施方案中，该蛋白质可以是治疗性蛋白。可以使用主题细胞产生的合适治疗性靶蛋白的实例包括：红细胞生成素、细胞因子如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-o和粒细胞-CSF、GM-CSF、凝血因子如因子VIII、因子IX和人蛋白C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受体α-链、IgG、IgG片段、IgG融合物、IgM、IgA、白细胞介素、尿激酶、类糜乳蛋白酶和尿胰蛋白酶再用抑制蛋白(urea trypsin resume inhibitor)、IGF-结合蛋白、表皮生长因子、生长激素释放因子、膜联V融合蛋白、制管张素(angiostatin)、血管内皮生长因子-2、髓样先祖抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitory factor-1)、护骨蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-甲胎蛋白、DNA酶II、人纤溶酶原的Kringle 3、葡糖脑苷脂酶、TNF结合蛋白1、卵泡刺激素、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4-Ig、跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体、可溶性TNF受体Fc融合物、胰高血糖素样蛋白1和IL-2受体激动剂。也可以制备单克隆抗体。

在某些实施方案中，可以工程化所述细胞，从而由该细胞产生的蛋白质可以从细胞分泌至培养基中。从而，该细胞还可以进一步含有编码融合多肽的重组核酸，其中所述的融合多肽含有信号序列、蛋白酶剪切位点和此蛋白质。在一些实施方案中，信号序列可以是与待表达多肽天然连接的一种信号序列。该信号序列可以是能够指导融合蛋白进入芽孢杆菌属宿主细胞分泌途径的任意氨基酸序列。在某些情况下，可以使用的信号序列包括从野生型芽孢杆菌属细胞分泌的蛋白质的信号序列。此类信号序列包括由α-淀粉酶基因、蛋白酶基因(例如，aprE或枯草蛋白酶E)或β-内酰胺酶基因编码的信号序列。示例性信号序列包括但不限于来自任意合适芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶基因、枯草蛋白酶基因、β-内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因(例如，nprT、nprS、nprM)或prsA基因编码的信号序列，其中所述的芽孢杆菌属物种包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。在一个实施方案中，信号序列由枯草芽孢杆菌aprE基因编码(如Appl.Microbiol.Biotechnol.2003 62：369-73中所描述)。其他信号序列由Simonen和Palva(Microbiological Reviews 1993 57：109-137)及其他参考文献描述。

本发明也提供通过培养能够产生目的蛋白的修饰细胞并且在表达该目的蛋白的合适生长条件下培育该细胞，用于在修饰的芽孢杆菌属宿主细胞中产生目的蛋白的方法，其中所述修饰的芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个失活的phr基因(例如，失活的phrA和/或phrE基因)或失活的phr和失活的rap基因。所述方法提供任一种上文所述目的蛋白的产生。在优选的实施方案中，由本发明方法产生的目的蛋白是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。修饰的芽孢杆菌属细胞的目的蛋白产生大于从相应的未修饰前体宿主细胞获得的目的蛋白产生。在一些实施方案中，在修饰的细胞中如下文所述通过过量表达ymaH进行一步增强修饰的芽孢杆菌属细胞的改善水平的蛋白酶产生。

过量表达YmaH的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞

在上文所述的实施方案中，包含至少一个失活phr基因和/或失活rap基因的修饰的芽孢杆菌属细胞具有以比未修饰的前体细胞所达到水平高的水平产生目的蛋白的增强能力。在下文所述的又一些实施方案中，通过改变修饰的细胞以过量表达RNA结合蛋白ymaH进一步增加修饰的芽孢杆菌属细胞的增强的目的蛋白产生水平。因而，在一个实施方案中，本发明提供了经修饰的芽孢杆菌属细胞，其包含至少一个失活的phr基因(例如，失活的phrA和/或phrE基因)、编码目的蛋白(例如，蛋白酶)的多核苷酸和编码YmaH蛋白的异源多核苷酸。在另一个实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含至少一个失活的phr基因(例如，失活的phrA和/或phrE基因)和/或失活的rap基因、编码目的蛋白(例如，蛋白酶)的多核苷酸和编码YmaH蛋白的异源多核苷酸。

在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸表达构建体，其包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸序列有效连接的YmaH启动子。枯草芽孢杆菌YmaH，也称作HFQ_BACSU，是RNA-结合蛋白，是RNA-结合蛋白Hfq家族的成员(Sauter等人，Nucleic Acid Res31：4091-4098，[2003])。YmaH蛋白在枯草芽孢杆菌中由作为大肠杆菌hfq基因的直向同源物的ymaH基因编码(Silvaggi等人，J Bacteriol.187(19)：6641-6650，[2005])。YmaH是一种作为原核生物中多效RNA代谢调节物发挥作用的丰富和遍在性RNA-结合蛋白，并且是稳定某些转录物和降解其他转录物所需要的。YmaH偏好地与未定形的A/U丰富RNA序列结合并且在序列和结构方面均与真核Sm蛋白相似。还已知YmaH结合调节RNA转录物的稳定性或翻译效率的叫做核糖调节物的小RNA分子。

来自枯草芽孢杆菌的天然存在YmaH蛋白是一种73个氨基酸的蛋白质：MKPINIQDQFLNQIRKENTYVTVFLLNGFQLRGQVKGFDNFTVLLESEGKQQLIYKHAISTFAPQKNVQLELE(Swiss-Prot：P3756；SEQ ID NO：45)，其由219(包括终止子在内的222)个碱基对的多核苷酸(EMBL一级登录号Z99113；SEQ ID NO：46)编码。

因而，在一些实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞还包含编码ymaH的异源多核苷酸序列。在一个实施方案中，YmaH蛋白由野生型枯草芽孢杆菌菌株168的基因组中找得到的天然存在性多核苷酸序列编码(SEQ IDNO：45)。在一些实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞包含编码天然存在性ymaH的变体的异源多核苷酸序列。变体YamH蛋白包括从野生型蛋白通过在该天然蛋白中一个或多个位点处缺失(即，截短)、添加或置换一个或多个氨基酸所衍生的蛋白质。用于此类缺失、添加和置换的方法通常是本领域已知的。例如，所述多肽的氨基酸序列变体可以通过在编码天然目的蛋白的克隆DNA序列中突变来制备。用于诱变和改变核苷酸序列的方法是本领域熟知的(见例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488 492；Kunkel等人(1987)Methods Enzymol.154：367 382；美国专利号4,873,192；及其中援引的参考文献；所述文献通过引用的方式并入本文)。在构建目的蛋白的变体中，将如此进行对编码所述变体的核苷酸序列的修饰，从而变体继续拥有想要的活性。如技术人员将会理解，鉴于遗传密码的简并性，多种修饰的多核苷酸编码YmaH蛋白。在本发明的一些其他实施方案中，芽孢杆菌属细胞包含编码YmaH蛋白的多核苷酸，所述的多核苷酸包含与SEQ ID NO：46的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约75％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少约92％序列同一性、至少约95％序列同一性、至少约97％序列同一性、至少约98％序列同一性、或至少约99％序列同一性的核苷酸序列。

在其他实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸构建体，其包含与枯草芽孢杆菌菌株168的ymaH编码序列类似的ymaH编码序列。该菌株的基因组(其含于一个4215Kb的基因组中)已经充分表征(见，Kunst等人，Nature390：249-256[1997]；和Henner等人，Microbiol.Rev.，44：57-82[1980])。在一些实施方案中，编码YmaH的多核苷酸构建体编码YmaH蛋白，其中所述的YmaH蛋白与野生型形式的YmaH蛋白的氨基酸序列共有至少约65％氨基酸序列同一性、至少约70％氨基酸序列同一性、至少约75％氨基酸序列同一性、至少约80％氨基酸序列同一性、至少约85％氨基酸序列同一性、至少约90％氨基酸序列同一性、至少约92％氨基酸序列同一性、至少约95％氨基酸序列同一性、至少约97％氨基酸序列同一性、至少约98％氨基酸序列同一性和至少约99％氨基酸序列同一性，并且与野生型多肽(SEQ ID NO：45)相比时，具有可比较或改善的增强宿主细胞中目的蛋白产生的能力，并且保留了增强芽孢杆菌(例如，枯草芽孢杆菌)宿主细胞中目的蛋白产生的能力。还在其他实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞包含编码YmaH的多核苷酸构建体，其包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与具有SEQ ID NO：46的野生型芽孢杆菌属序列的基因同源、直向同源或旁系同源并且保留增强目的蛋白产生的能力。

在其他实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞也包括多核苷酸构建体，其包含编码因结构上和/或功能上相似而相关的YmaH蛋白的编码序列。在一些实施方案中，这些蛋白质从不同的属和/或物种衍生，包括生物类别之间的不同类别(例如，细菌蛋白和真菌蛋白)。在一些实施方案中，这些蛋白质衍生自不同的属和/或物种。在额外的实施方案中，从相同的物种提供相关蛋白。实际上，不意图使本发明限于来自任何具体来源的相关蛋白。此外，术语“相关蛋白”包括三级结构同源物和一级序列同源物(例如，本发明的YmaH)。例如，本发明包括此类同源物，其包括，但不限于下述YmaH蛋白，如大肠杆菌的YmaH(HFQ_ECOLI)、福氏志贺菌(Shighella flexneri)的YmaH(HFQ_SHIFL)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的YmaH(HFQ_SALTY)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)的YmaH(HFQ_YEREN)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的YmaH(HFQ_YERPE)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的YmaH(HFQ_ERWCA)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的YmaH(HFQ_HAEIN)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的YmaH(HFQ_PASMU)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的YmaH(HFQ_VIBCH)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的YmaH(HFQ_PSEAE)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)的YmaH(HFQ_XANAC)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的YmaH(HFQ_XANCP)、苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)的YmaH(GSQ_XYLFA)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的YmaH(HFQ_NEIMA)、茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的YmaH(HFQ_RALSO)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的YmaH(HFQ_AGRTS)、马耳他布氏菌(Brucella melitensis)的YmaH(HFQ_BRUME)、百脉根根瘤菌(Rhizobium loti)的YmaH(HFQ_RHILO)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)的YmaH(HFQ_AZOCA)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)的YmaH(HFQ_CAUCR)、Aquifex melitensis的YmaH(HFQ_AQUAE)、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的YmaH(HFQ_THEMA)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium  acetobutylicum)的YmaH(HFQ_CLOAB)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的YmaH(HFQ_CLOPE)、耐碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)的YmaH(HFQ_BACHD)、枯草芽孢杆菌的YmaH(HFQ_BACSU)、泉生热袍菌(Thermoanaerobactertengcongensis)的YmaH(HFQ_THETN)、金黄色葡萄球菌(S.aureaus)的YmaH(Q99UG9)和M.jannasci的YmaH(Q58830)(Sauter等人，Nucleic AcidsRes.31：4091-4098[2003])。

相关(和衍生性)蛋白包含“变体YmaH蛋白”。在一些优选的实施方案中，变体蛋白因少数氨基酸残基而不同于亲代蛋白并且彼此不同。差异性氨基酸残基的数目可以是一个或多个，优选地约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50个或更多个氨基酸残基。在一些优选的实施方案中，变体之间不同氨基酸的数目在约1和约10之间。在一些特别优选的实施方案中，相关蛋白并且特别地是变体蛋白包含至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％氨基酸序列同一性。适合产生本发明的YmaH蛋白变体的几种方法是本领域已知的，包括但不限于位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、随机诱变、位点定向诱变和定向进化以及多种其他重组方法。

对野生型和突变体蛋白的表征借助任何合适的手段实现并且优选地基于对目的特征的评估。例如，构思能够进一步增强修饰的芽孢杆菌属细胞产生目的蛋白的YmaH蛋白将会有用。

ymaH在本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞中的过量表达可以通过多种手段实现，所述的手段包括增强编码YmaH的多核苷酸的转录和/或翻译。例如，在转录水平，ymaH的过量表达可以通过增加宿主细胞中编码ymaH的多核苷酸序列的数目和/或通过提高ymaH启动子的结合强度以增强关联的RNA聚合酶的活性来实现。在转录水平，ymaH的过量表达可以通过突变核糖体结合位点(RBS)来增加核糖体对该RBS的亲和力，从而增强翻译活性来实现。本领域技术人员会认识到可以通过单独增加ymaH基因的拷贝数或联合为实现YmaH过量表达对ymaH基因做出的其他可能修饰来实施ymaH的过量表达。

在一个实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸构建体，其包含与ymaH启动子有效连接的编码ymaH的多核苷酸序列。ymaH的转录可以天然地受两个启动子驱动：存在于miaA编码区上游的SigA启动子，和紧邻枯草芽孢杆菌miaA操纵子中ymaH编码区上游的SigH启动子。ymaH启动子可以是驱动yamH表达的任意启动子(例如，SigA和/或SigH启动子)，并且可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列并且包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。启动子序列可以对宿主细胞为天然的或外来的。

在一个实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸构建体(例如，SEQ ID NO：23，如下文显示)，其包含与SigH启动子有效连接的编码YmaH的多核苷酸序列。SEQ ID NO：23也例示了包含与SigH启动子呈天然连续的YmaH编码序列的多核苷酸构建体：

ggcaccgaattcgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggagcc(SEQ ID NO：23)。

在另一个实施方案中，本发明的经修饰芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸构建体(例如，SEQ ID NO：26(SigA1)和SEQ ID NO：31(SigA2构建体))，其包含与SigA启动子有效连接的编码YmaH的多核苷酸序列。SEQ ID NOs：26和31例示了其中ymaH编码序列与SigA启动子序列呈连续以提供嵌合多核苷酸构建体的实施方案。在一些优选的实施方案中，嵌合多核苷酸构建体因而包含自然界中与ymaH编码序列不呈连续的启动子序列。例如，SEQ ID NOS：26和31例示了包含与编码YmaH的多核苷酸序列有效连接的SigA启动子的嵌合构建体，如下文所示：

gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagccccacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO：26)

gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgctcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO：31)

又在另一个实施方案中，本发明的芽孢杆菌属细胞包含多核苷酸构建体(例如，SEQ ID NO：22，如下文显示)，其包含编码YmaH的多核苷酸序列和SigA与SigH启动子。

tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagctttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgattcatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggatagagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgag(SEQ ID NO：22)

用于指导ymaH基因表达的合适启动子的实例是来自包括编码miaA基因的枯草芽孢杆菌操纵子中的SigA和SigH启动子。例如，在一个实施方案中，本发明提供了定义SigA启动子的多核苷酸序列(SEQ ID NO：47，如下文所示)。

tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacata(SEQ ID NO：47)

在另一个实施方案中，本发明提供了定义SigH启动子的多核苷酸序列(SEQID NO：48，如下文所示)。

aaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaac(SEQ ID NO：48)

可以用于表达ymaH基因的启动子的其他实例包括由σA因子识别的Sigma A启动子，其包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)的启动子、迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)的启动子、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子和解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子。可以用于表达ymaH基因的启动子的实例包括由H因子识别的Sigma H启动子，其包括spo0A、spo0F、spoVG和citG(见，Helmann，J.D.和C.P.Moran.2002.RNA聚合酶和sigma因子(RNApolymerase and sigma factors)，第289-312页，在A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和R.Losick(编著)，枯草芽孢杆菌及其进化最近的亲戚：从基因至细胞(Bacillussubtilis and its closest relatives：from genes to cells).美国微生物学会(AmericanSociety for Microbiology)，Washington，D.C.)。

在一些实施方案中，共有的SigA和/或SigH启动子用于本发明中。共有启动子的构建可以通过位点定向诱变以产生下述启动子来实现，其中所述的启动子更完美地符合对枯草芽孢杆菌的“sigma A型”启动子的“-10”和“-35”区已建立的共有的序列(Voskuil等人，Mol Microbiol 17：271 279[1995])。在其他实施方案中，可以通过位点定向诱变以产生下述启动子来产生共有启动子，其中所述的启动子更完美地符合对枯草芽孢杆菌的营养期“sigma H型”启动子的“-10”和“-35”区已建立的共有序列(见，Helman和Moran在《枯草芽孢杆菌及其进化最近的亲戚》(Bacillus subtilis and its closest relatives)，第21章，第289-312页中；Sonenshein等人(2002 ASM Press，Wshington，D.C.)。sigma A型启动子的“-35”区的共有序列是TTGaca并且对于“-10”区是tgnTATaat，并且sigma H型启动子的“--35”区的共有序列是RnAGGAwWW并且对于“-10”区是RnnGAAT。大写字母表示高度保守的位置；小写字母表示较不保守的位置；缩写R可以是A或G，并且W可以是A或T。共有启动子可以获自能在芽孢杆菌宿主细胞中发挥作用的任一启动子。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO：47的SigA启动子由天然存在于miaA编码序列上游的多核苷酸序列(NP_389615；SEQ ID NO：49，下文显示)定义，而包含SEQ ID NO：48的SigH启动子由天然存在于yamH编码区上游的多核苷酸序列(SEQ ID NO：46，下文显示)定义。

ttgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagctttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgattcatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggatagagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaa(SEQ ID NO：49)

atgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatag(NP_389616；SEQ ID NO：46)

在一些实施方案中，SigA/SigH构建体包含已经被突变的启动子序列，当与相应野生型启动子的活性相比时提高了启动子活性，从而导致YmaH蛋白过量表达。因而，应当理解定义SigA和SigH启动子的序列的变体用于YmaH表达构建体中。用于在芽孢杆菌中产生启动子变体的方法是本领域熟知的(见例如，Helmann等人，2002.RNA聚合酶和sigma因子(RNA polymerase and sigmafactors)，第289-312页，在A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和R.Losick(编著)，枯草芽孢杆菌及其进化最近的亲戚：从基因至细胞(Bacillus subtilis and its closestrelatives：from genes to cells).美国微生物学会(American Society forMicrobiology)，Washington，D.C.)。不意图使本发明限于任何具体的启动子，因为本领域技术人员已知的任意合适启动子可以用于本发明中。然而，在一些实施方案中，该启动子是枯草芽孢杆菌sigH启动子，而在其他实施方案中，该启动子是枯草芽孢杆菌sigA启动子。在又一些实施方案中，sigH和sigA启动子起到实现YmaH蛋白过量表达的作用。

在一些实施方案中，本发明的SigA/SigH多核苷酸构建体还包含必要核糖体结合位点以确保ymaH RNA转录物的最佳翻译。在一些实施方案中，该多核苷酸构建体包含miaA基因的核糖体结合位点(RBS)序列(aagagag；SEQ IDNO：50)，而在其他实施方案中，多核苷酸构建体包含ymaH基因的RBS序列(ggagg；SEQ ID NO：51)。又在其他实施方案中，该多核苷酸构建体包含miaA和ymaH基因的核糖体结合位点序列。在一些实施方案中，本发明提供具有ymaH编码序列上游的启动子和核糖体结合位点序列的构建体。本发明不限于本文中所公开的核糖体结合位点序列，因为它还包括任何合适的核糖体结合位点序列，它们已经被突变以增加表达ymaH基因的水平。用于获得增加基因在芽孢杆菌中表达的突变的核糖体结合序列方法是本领域已知的。例如，Band和Henner通过修饰RBS以获得与16S rRNA的更严格碱基配对而成功地增加干扰素在枯草芽孢杆菌中表达的水平(Band，L.和D.J.Henner，DNA 3：17-21[1984])。

在修饰的细胞中产生目的蛋白

在一些实施方案中，本发明提供通过培养能够产生目的蛋白的修饰细胞并且在表达该目的蛋白的合适生长条件下培育该细胞，用于在修饰的芽孢杆菌属宿主细胞中产生目的蛋白的方法，其中所述修饰的芽孢杆菌属宿主细胞包含至少一个失活的phr基因(例如，失活的phrA和/或phrE基因)或失活的phr和/或失活的rap基因。所述方法提供任一种上文所述目的蛋白的产生。在一些实施方案中，由本发明方法产生的目的蛋白是蛋白酶(例如，枯草蛋白酶)。

在一个实施方案中，本发明的方法包括通过将失活性DNA构建体导入芽孢杆菌属宿主细胞而失活至少一个phr基因以产生修饰的芽孢杆菌属宿主细胞，并且在合适条件下培育修饰的细胞，旨在以比未修饰或前体芽孢杆菌宿主细胞所产生水平高的水平产生目的蛋白。前体宿主细胞包括如上所述的芽孢杆菌菌株的前体宿主细胞，所述的芽孢杆菌菌株包括嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌株。在一些实施方案中，该前体宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。优选地，前体宿主细胞是如上所述包含编码目的多肽的重组多核苷酸的重组细胞。在一些实施方案中，目的多肽是酶(例如，蛋白酶，如枯草蛋白酶)。失活前体芽孢杆菌属宿主细胞中至少一个phr基因(例如phrA和/或phrE)的方法产生修饰的芽孢杆菌属细胞，其以比相应未修饰的前体宿主细胞所实现水平高的水平产生目的多肽。

在一个实施方案中，该方法包括通过将用来缺失固有phrA基因的失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞中而失活phrA基因。例如，导入SEQID NO：17的失活性DNA构建体以通过同源重组缺失固有的phrA基因。在另一个实施方案中，该方法包括通过将用于缺失固有phrE基因的失活性DNA构建体导入前体芽孢杆菌属宿主细胞中而失活phrE基因。例如，导入SEQ ID NO：18的失活性DNA构建体以通过同源重组缺失固有的phrE基因。又在另一个实施方案中，使用SEQ ID NO：17和18的失活性构建体使phrA和phrE基因均失活。本发明的方法类似地用来失活其他phr基因，包括phrC、phrF、phrG、phrH、phrI和phrK，和/或rap基因，包括rapB、rapC、rapD、rapE、rapF、rapG、rapH、rapI、rapJ和rapK。

根据一个实施方案，通过插入中断phrA基因的选择标记失活phrA基因。备选地，phrA基因的失活因失活rapA基因所致，通过在rapA基因中导入包含终止子序列的选择标记，从而阻止rapA和phrA蛋白功能性表达。根据一个实施方案，通过插入中断rapA基因的选择标记来失活rapA基因。

用于失活phr和/或rap基因的方法在下文实验部分例举。

如上所述包含至少一个失活phr基因和/或rap基因的修饰芽孢杆菌属细胞的目的蛋白(例如，蛋白酶)产生大于从相应未修饰的前体细胞中获得的目的蛋白产生。

在一些实施方案中，修饰的芽孢杆菌属细胞的目的蛋白产生因表达一个或多个拷贝的包含于表达构建体中的编码YmaH的多核苷酸而进一步增强，其中所述的表达构建体存在于已经导入修饰细胞中的多拷贝/复制型质粒上。使用上述编码YmaH的多核苷酸构建体(例如，SigA；SigA1、SigA2、SigA3)或SigH构建体中任一者转化修饰的芽孢杆菌属细胞。在一些实施方案中，在修饰前体宿主细胞以在至少一个phr和/或rap基因中含有缺失之前，将复制型质粒上存在的编码YmaH的多核苷酸导入该前体宿主细胞。因而，在一些实施方案中，本发明提供包含载体的修饰的芽孢杆菌属细胞，其中所述的载体包含掺入该载体的表达构建体，该表达构建体包含与YmaH启动子有效连接的编码YmaH的多核苷酸。在一些实施方案中，通过导入包含与SigH启动子有效连接的编码YmaH的多核苷酸的SigH表达构建体(例如，SEQ ID NO：23的表达构建体)实现YmaH的过量表达。在实施方案中，通过导入包含与SigA启动子有效连接的编码YmaH的多核苷酸的SigA表达构建体来实现YmaH的过量表达。SigA构建体的实例包括SEQ ID NO：26的SigA1表达构建体、SEQ ID NO：31的SigA2表达构建体和SEQ ID NO：22的SigA3构建体。

在一些实施方案中，载体是多拷贝/复制型质粒载体，其形成在修饰的细胞中过量表达YmaH的染色体外自我复制型遗传元件。一般而言，载体是携带选择标记基因的质粒载体，所述的选择标记基因允许轻易选择含有该质粒的宿主细胞。在宿主细胞中自主复制的载体包括含有复制起点的载体，其中所述的复制起点能够使该载体在芽孢杆菌属细胞中自主复制。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pC194、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。复制起点可以是一种具有突变的复制起点，所述突变使该复制起点在芽孢杆菌属细胞中的功能是对温度敏感(见例如，Ehrlich，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433[1978])。

如上文所示，在本发明的一些实施方案中，将编码YmaH蛋白的多核苷酸借助能够在宿主细胞内部复制的表达载体导入修饰的细胞中。用于芽孢杆菌的合适复制型和整合型质粒是本领域已知的(见例如，Harwood和Cutting(编著)，芽 孢杆菌分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wilev& Sons，[1990]，特别地是第3章；用于枯草芽孢杆菌的合适复制型质粒包括第92页上所列的那些复制型质粒)。

在一些实施方案中，YmaH多肽的过量表达因表达至少一个拷贝的编码YmaH的多核苷酸所致，其中所述的多核苷酸整合入宿主细胞的基因组中。因而，在一些实施方案中，当载体导入宿主细胞时，它整合到基因组中并且随该载体已经整合于其中的基因组一起复制。YmaH基因的多个拷贝可以整合于宿主细胞中的几个位置处。备选地，携带编码YmaH的序列和选择标记(例如，抗微生物剂抗性标记，如，编码氯霉素乙酰基转移酶的基因)的可扩增表达盒可以借助单个交换事件整合入基因组中并且随后通过用增加浓度的适宜抗微生物剂(例如，氯霉素)攻击转化的宿主细胞进行扩增。

在其他实施方案中，本发明提供掺入整合型载体中的多核苷酸构建体。在一些实施方案中，将掺入整合型载体中的本发明多核苷酸构建体靶向芽孢杆菌属宿主细胞的染色体序列以产生包含多个载体拷贝的稳定串联整合的修饰宿主细胞。掺入整合载体中的多核苷酸构建体一般包含选择标记基因，所述的选择标记基因为细胞提供针对抗微生物剂的抗性并且允许扩增整合的ymaH构建体。串联整合至单个位点中以及单拷贝和两位点整合可能出现。无论该多核苷酸构建体是掺入载体还是在质粒DNA不存在的情况下使用，该构建体均用来利用本领域已知的任何合适方法转化修饰的细胞。

培养方法

本发明提供通过培养能够产生目的蛋白的修饰细胞并且在表达该目的蛋白的合适生长条件下培育该细胞，用于在修饰的芽孢杆菌属细胞中产生该目的蛋白的方法。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞和修饰的宿主细胞在常规的营养培养基中培养。合适的具体培养条件，如温度、pH等是本领域技术人员已知的。额外的优选培养条件是本领域技术人员熟知的并且在多种参考出版物中描述。

在一些实施方案中，由修饰的宿主细胞产生的目的蛋白被约束于宿主细胞的胞内环境，而在其他实施方案中，由宿主细胞产生的目的蛋白分泌至胞外空间(即，培养基)。因而，在一些实施方案中，可以从表达目的蛋白的细胞的胞内环境通过裂解宿主细胞并且通过本领域已知的方法回收目的蛋白而回收此目的蛋白。在其他实施方案中，在适于表达并从细胞培养物回收目的蛋白的条件下培养修饰的宿主细胞。由本发明过量表达ymaH的修饰的宿主细胞产生的目的蛋白分泌至培养基中。在一些实施方案中，从培养基通过传统方法回收由所述细胞产生的目蛋白(例如，蛋白酶)，所述的方法包括但不限于通过离心或过滤将宿主细胞与培养基分离、借助盐(例如，硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白性组分、层析纯化法(例如，离子交换、凝胶过滤、亲和层析)。因而，适于回收本发明蛋白酶的任何方法用于本发明中。实际上，不意图使本发明限于任何具体的纯化方法。

在一些实施方案中，其他重组构建将编码目的蛋白的异源或同源多核苷酸序列接合于编码多肽结构域的核苷酸序列，其中所述的多肽结构域促进可溶性蛋白的纯化(Kroll DJ等人，DNA Cell Biol 12：441-53[1993])。此类促进纯化的结构域包括但不限于金属螯合肽，如允许在固定的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(Porath，Protein Expr Purif 3：263-281[1992])、允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域和FLAGS延伸/亲和纯化系统中所用的结构域(Immunex Corp，Seattle WA)。在纯化结构域和异源蛋白之间包括可剪切接头序列如因子XA或肠激酶(Invitrogen，San Diego CA)也用来促进纯化。

在一些实施方案中，在合适的营养培养基中于允许目的蛋白(例如，蛋白酶)表达的条件下培养本发明的转化的宿主细胞，然后从培养物回收所得的蛋白酶。用来培养所述细胞的培养基包含适于培育所述宿主细胞的任何常规培养基，如含有适宜补充物的极限培养基或复合培养基。合适的培养基从商业供应商可获得或可以根据公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。在一些实施方案中，宿主细胞在分批、补料分批或连续发酵条件下培养。经典的分批发酵方法使用一个封闭系统，其中培养基在发酵运行开始之前制得，培养基用想要的生物接种并且发酵在后续不添加任何组分至培养基的情况下进行。在某些情况下，在分批方法期间改变生长培养基的pH和含氧量，但不改变其碳源含量。该分批系统的代谢物和细胞生物质不断变化直至发酵停止时间。在分批系统中，细胞通常经静止滞后期进展至高速生长对数期并且最终至稳定期，在此时生长速率下降或停顿。若不处理，处于稳定期的细胞最终死亡。通常，处于对数期的细胞产生大量的蛋白质。

所述标准分批培养系统的一种变例是“补料分批发酵”系统。在这个系统中，养分(例如，碳源、氮源、O₂和通常而言，其他养分)仅在它们在培养物中的浓度降至阈值以下时才添加。当分解代谢物阻抑倾向于抑制细胞代谢时并且需要在培养基中存在有限量的养分时，补料分批培养系统是有用的。测量补料分批系统中实际的养分浓度基于可度量因素如pH、溶解氧和废气(如CO₂)分压来估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域常见和熟知的。

连续发酵是开放系统，在其中连续地添加定义的培养基至生物反应器并且同时取出等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常以其中细胞主要处于对数期生长的恒定高密度维持培养物。

连续发酵允许调节影响细胞生长和/或终产物浓度的一个因素或任意数目的因素。例如，在一些实施方案中，以固定的速率维持限制性养分如碳源或氮源，并且允许调节全部其他参数。在其他系统中，连续地改变影响生长的众多因素，同时通过培养基浊度度量的细胞浓度保持恒定。连续系统尽力保持稳态生长条件。因此，因培养基抽取所致的细胞损失可以针对该发酵物中的细胞生长速率来平衡。调节用于连续发酵过程的养分和生长因子的方法以及使产物形成率最大化的技术是本领域技术人员已知的，并且用于根据本发明方法产生目的蛋白(例如，蛋白酶)。

如上文所示，本发明的经修饰芽孢杆菌以这样的水平产生目的蛋白，所述的水平大于从相应未修饰的前体芽孢杆菌属细胞中获得的水平。通过过量表达YmaH进一步增加修饰细胞的增强的蛋白质产生水平。在本发明的一些实施方案中，YmaH在芽孢杆菌属宿主细胞中过量表达导致目的蛋白的产生增加，高于不过量表达YmaH的相应的修饰前体芽孢杆菌属细胞中所获得的水平。在一些实施方案中，本发明提供过量表达YmaH的修饰的芽孢杆菌属宿主细胞。在一些实施方案中，重组芽孢杆菌属宿主细胞是这样的细胞，该细胞被改变以产生比相同条件培育时未改变的亲代/前体芽孢杆菌属细胞更高水平的蛋白酶。

本发明还包括用于以比前体宿主细胞所需要的更少时间在过量表达YmaH的修饰细胞中产生目的蛋白的方法。例如，本发明的修饰宿主细胞能够比相应未修饰的前体宿主细胞以更高水平并以更早的时间产生目的蛋白。因而，在一些实施方案中，本发明提供以比亲代宿主细胞所产生水平高的水平并且以该前体宿主细胞达到其最大表达水平所花费时间的约1/6时间产生目的蛋白(例如，蛋白酶)的方法。在其他实施方案中，修饰的宿主以比该前体宿主细胞达到其最大表达水平所花费时间的约1/5、约1/4、约1/3或约1/2时间产生目的蛋白。

产生/活性的度量

实验

以下实施例为本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制本发明人视为其发明的范围，它们也不意图表明下文的实验是所进行的全部或仅有实验。已经作出努力以确保所用数字(例如量、温度等)方面的准确度，但是应当考虑一些实验性误差和偏差。除非另外指明，份数是以重量计的份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是在大气压或接近大气压。

在以下的实验公开中，使用以下缩写：℃(摄氏度)；rpm(转/分钟)；H₂O(水)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；μg和ug(微克)；mg(毫克)；ng(纳克)；μl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；μm和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；OD₂₈₀(在280nm处的光密度)；OD₄₀₅(在405nm处的光密度)；OD₆₀₀(在600nm处的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；LAS(十二烷基磺酸钠)；SDS(十二烷基硫酸钠)；和Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。

实施例1

phr基因缺失

在枯草芽孢杆菌菌株BG2942(ΔnprE，degU(Hy)32，amyE::[PxylRA-comKeryR])中缺失phr基因：phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrH、phrI和phrK，并且使用AAPF测定法，确定所得的修饰枯草芽孢杆菌菌株中的AprE蛋白酶表达。在芽孢杆菌染色体phr基因座中插入侧翼分布有lox位点的壮观霉素选择标记来缺失phr基因，同时保持上游rap基因和下游基因完好无损。在图2中说明用来缺失phr基因的失活盒。还在携带用于表达FNA的可扩增性表达构建体PaprE-FNA(aprE启动子-FNA的核苷酸序列：SEQ ID NO：19)的枯草芽孢杆菌菌株BG3594(degU(Hy)32，oppA，ΔspoIIE，ΔaprE，ΔnprE)中进行phrA和phrE基因的缺失。

gaattcctccattttcttctgctatcaaaataacagactcgtgattttccaaacgagctttcaaaaaagcctctgccccttgcaaatcggatgcctgtctataaaattcccgatattggcttaaacagcggcgcaatggcggccgcatctgatgtctttgcttggcgaatgttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatcccttttctgtaaagtttatttttcagaatacttttatcatcatgctttgaaaaaatatcacgataatatccattgttctcacggaagcacacgcaggtcatttgaacgaattttttcgacaggaatttgccgggactcaggagcatttaacctaaaaaagcatgacatttcagcataatgaacatttactcatgtctattttcgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaaaaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcagggaaatcaaacggggaaaagaaatatattgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagatgtcatttctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagcttcagctacattaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaagatcacgtagcacatgcgtacgcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcccctgctctgcactctcaaggctacactggatcaaatgttaaagtagcggttatcgacagcggtatcgattcttctcatcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttctgaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcggctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgtaaaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgggcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgctgctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagccggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttctgtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtaggacctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaatacggcgcgttgaacggtacatcaatggcatctccgcacgttgccggagcggctgctttgattctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacaccactacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaa(SEQ IDNO：19)。

PaprE-FNA表达构建体包含与枯草芽孢杆菌aprE启动子有效连接的编码FNA蛋白酶的多核苷酸序列。FNA(PURAFECT PRIME[Genencor])是具有Y217N置换的来自解淀粉芽孢杆菌的枯草蛋白酶BPN’(SEQ ID NO：20)。

VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVDAASATLNEKAVKELKKDPSVAYVEEDHVAHAYAQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEWAIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAAAGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSSVGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ IDNO：20)。

下文阐述构建这些菌株的更详细描述内容。表1中提供引物的序列，所述引物用于产生用来缺失phr基因的构建体。

对于phrA缺失盒，含有rapA序列的phrA基因上游区用引物CB2 008-007(SEQID NO：1)和CB2 008-009(SEQ ID NO：3)扩增并且与侧翼分布有loxP序列并用寡聚物CB2 008-009R(SEQ ID NO：4)和CB2 008-010R(SEQ ID NO：6)扩增的壮观霉素盒融合。phrA基因的下游区用寡聚物CB2 008-010(SEQ ID NO：5)和CB2 008-008(SEQ ID NO：2)扩增并且与含有rapA序列和壮观霉素盒的PCR产物融合。

为产生phrC缺失盒，含有rapC序列的phrC基因上游区用引物CB2 008-015和CB2 008-016扩增并与侧翼分布有loxP序列并用寡聚物CB2 008-016R和CB2008-017R扩增的壮观霉素盒融合。phrC基因的下游区用寡聚物CB2 008-017和CB2008-018扩增并且与含有rapC序列和壮观霉素盒的PCR产物融合。

为产生phrE缺失盒，含有rapE序列的phrE基因上游区用引物CB2008-019A(SEQ ID NO：7)和CB2008-019B(SEQ ID NO：9)扩增并且与用寡聚物CB2008-019R(SEQ ID NO：10)和CB2008-020R(SEQ ID NO：12)扩增的壮观霉素盒融合。phrE基因的下游区用寡聚物CB2008-020(SEQ ID NO：11)和CB2008-021(SEQ ID NO：8)扩增并且与含有部分rapE序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

为产生phrF缺失盒，含有rapF序列的phrF基因上游区用引物CB2008-022和CB2008-023扩增并且与用寡聚物CB2008-023R和CB2008-024R扩增的壮观霉素盒融合。phrF基因下游区用寡聚物CB2008-024和CB2008-025扩增并且与含有rapF序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

为产生phrG缺失盒，含有rapG序列的phrG基因上游区用引物CB2008-026和CB2008-027R扩增并且与用寡聚物CB2008-027和CB2008-028R扩增的壮观霉素盒融合。phrG基因下游区用寡聚物CB2008-028和CB2008-029扩增并且与含有rapG序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

为产生phrH缺失盒，含有rapH序列的phrH基因上游区用引物CB2008-011和CB2008-012扩增并且与用寡聚物CB2008-012R和CB2008-013R扩增的壮观霉素盒融合。phrH基因下游区用寡聚物CB2008-013和CB2008-014扩增并且与含有rapH序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

为产生phrI缺失盒，含有rapI序列的phrI基因上游区用引物CB2008-030和CB2008-031扩增并且与用寡聚物CB2008-031R和CB2008-032R扩增的壮观霉素盒融合。phrI基因下游区用寡聚物CB2008-032和CB2008-033扩增并且与含有rapI序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

为产生phrK缺失盒，含有rapK序列的phrK基因上游区用引物CB2008-034和CB2008-035扩增并且与用寡聚物CB2008-035R和CB2008-036R扩增的壮观霉素盒融合。phrK基因下游区用寡聚物CB2008-036和CB2008-037扩增并且与含有rapK序列和该壮观霉素盒的纯化PCR产物融合。

将两个loxP位点在壮观霉素选择标记的两侧导入以促进除去该抗生素抗性。将最终的PCR产物纯化并且转化至枯草芽孢杆菌BG2942(ΔnprE，degU(Hy)32，amyE::[PxylRA-comK-eryR])中。

一旦DNA构建体经双交换稳定整合入感受态枯草芽孢杆菌BG2942菌株的染色体，则通过PCR分析证实缺失。phrA区用引物CB2008-041(SEQ ID NO：13)和CB2008-042(SEQ ID NO：14)扩增，并且phrE区用引物CB2008-051(SEQ IDNO：15)和CB2008-052(SEQ ID NO：16)扩增。将所得PCR产物测序以证实不存在PCR误差和抗生素标记插在靶phr基因中。

如公开为US2002182734的专利申请中所述进行枯草芽孢杆菌BG2942的转化，所述的枯草芽孢杆菌BG2942携带在amyE位点中的诱导型ComK构建体。

携带phrA或phrE缺失的BG2942衍生菌株随后用表达Cre重组酶的质粒转化。这是通过位点特异性重组消除壮观霉素抗生素标记的必需步骤。

表1中示出了以上实验过程中所用引物的序列和描述。

表1

phrA缺失构建体的核苷酸序列是：

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phrC缺失构建体的核苷酸序列是：

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phrI缺失构建体的核苷酸序列是：

gaattgttaaacatggaagaaaatcaagatgccctgttatattatcaactattagaatttagacatgagataatgctgagttatatgaaatctaaggaaatagaagatctcaataatgcttatgagactataaaagaaattgagaagcaagggcaattaactggcatgttggaatactatttttacttttttaagggtatgtacgagtttaggcgtaaagaattaatttcagcgataagtgcttatcgaatagctgaatcaaagttgtcagaagttgaggatgaaatagagaaagcagagttttttttcaaagtgtcctatgtatattattatatgaaacaaacatacttctccatgaattatgcaaatcgtgcactcaaaatatttagagagtatgaagaatatgctgtccagactgtgcgttgtcaatttattgtagcaggaaacttgatcgattcattggaatatgaaagagccttggaacaatttttgaagtctttggaaatttccaaggaaagtaacatagagcatttaattgcaatgtcacatatgaatattgggatttgttatgatgaattgaaagaatataagaaggcttcacaacatttaattttagcgttagaaatttttgaaaaatcaaaacatagtttcttaacaaagactttattcactctaacctatgtagaagcaaaacaacaaaattataatgttgctttgatatactttaggaaagggcgatttattgccgataaaagtgatgataaggaatactcagcgaaattcaaaatattagagggattatttttttctgatggtgagactcaattaataaagaatgcattttcatatctggcttcgagaaaaatgtttgctgatgttgaaaatttttcgattgaagtcgctgattattttcatgaacaaggaaatttaatgctctctaatgaatattatcgtatgagtattgaagcaagacgaaaaattaaaaaaggggagattattgatgaaaatcagccggattctattggcagcagtgattttaagtagtgtattggcctaggatgcatatggcggccgcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctagacatatgcaagggtttattgttttctaaaatctgattaccaattagaatgaatatttcccaaatattaaataataaaacaaaaaaattgaaaaaagtgtttccaccattttttcaatttttttataatttttttaatctgttatttaaatagtttatagttaaatttacattttcattagtccattcaatattctctccaagataactacgaactgctaacaaaattctctccctatgttctaatggagaagattcagccactgcatttcccgcaatatcttttggtatgattttacccgtgtccatagttaaaatcatacggcataaagttaatatagagttggtttcatcatcctgataattatctattaattcctctgacgaatccataatggctcttctcacatcagaaaatggaatatcaggtagtaattcctctaagtcataatttccgtatattcttttattttttcgttttgcttggtaaagcattatggttaaatctgaatttaattccttctgaggaatgtatccttgttcataaagctcttgtaaccattctccataaataaattcttgtttgggaggatgattccacggtaccatttcttgctgaataataattgttaattcaatatatcgtaagttgcttttatctcctattttttttgaaataggtctaattttttgtataagtatttctttactttgatctgtcaatggttcagatacgacgactaaaaagtcaagatcactatttggttttagtccactctcaactcctgatccaaacatgtaagtaccaataaggttattttttaaatgtttccgaagtatttttttcactttattaatttgttcgtatgtattcaaatatatcctcctcactattttgattagtacctattttatatccatagttgttaattaaataaacttaatttagtttatttatagatttcattggcttctaaattttttatctagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggatccagcttatcgataccgtcgacttagataattggaaaagaggaaaaaagcttaatcttttttcgaaggttaagctttttcttttatttataaaaagtgaactaactatcagaaagaaattatattaaattttatttttttgtttaaaaagtagattatataaaggcaagctaggtgggggaaaatatgtttaaaaaagaaaaagtcacagaatacatttggactatactaataccaacaatcatcacttttatcattagttgggttgggtcttattacaatggtacttcgacagttagtattggacaacctacaaaagtttccggtcagtatatcacgccaataaatataagtccctatcatgatattaaggaattaagaataacttttccgcaaaaactagatgtaaaacaaattagttcaaatgagcctataaatgtaaaatcagataagaacaatataggagttgaaagtaattccacttttgagattgcgaaaatcgttgaaaataatagcgttcagttgctaattacaacacaaaaaaagttaaacgataaggaaattagaattgataaaaatggaaataacatttctgtaaattatgaatctcagattgttaatcctgcaaaaaaacaattaatcaatcttataattacgtcatctatttattttataatgcttaatatactagcattgattatgaacaaaagatgggataagtattatgcaaaaatgaaaaatgaaatcaaagaatttgaggataatgcaaaagatcttgataaaaaatcaaagaagaaaagcgaggaattatcggagctgcgaaagaccttgaaccaagcgtttgaggaaactgataggataaaatatcatgagaagaaaaaacaaatcctcctcttagctaagttaaacgattataaaaaagaactaaccttttggagaaatacaataagaaaagttctttatgaacttcctgatggagataaaaaagcagataaactaatagggacag(SEQ ID NO：99)。

phrK缺失构建体的核苷酸序列是：

gatgaaatggaagaagatcaagaagttcttgcgtattatagtctattagaagaaagacataaaatgttgctgcattcttcacgaggagagcctttacaaaagcacacctattttactgaagacaatcaaaacttcataacaaaaacaaatgataaattagaatacaacttttatttatttgaagcaatgtacgaggcatacaacaaaaactatgatcgagcaattaacctatatggattagctgagaaaaagcttgcagaaattccagatgaaattgaagcagctgaattttactctaaagtctcttacttatatactcttgttaaacaaagcattgtggcacaacattatataaaaaatgcaatttcaatatataagcgacaccctgattataaatgcaaactagctacatcaacaatgattgcagctgcaaactatgctgatatgaaacgatttgaggaagcagaacaatattacttagaagcaattgatattgcaaaagaaacaaaagatgaatttttaaaagctcaattatttcacaatcttagtatcgtttattctgattggaacaaacctgataaatgcattgaatctcttgaaaaagcaataggaaatgaatcttggttacattcgatttattatataaattctttattcatgatgattaaagaactctttaaaattgacgaaaaaatgaaagccattaatttttacaataaagcacaggaaagactcatattaatggagaataaagtatacgaagccaaaatcagcatcctgtataacctttattgtggggaattaaaaaataatttcaataattgtattagtaatattgagtttttaaaacagcaaaatgaacttgaaagtgtagatgaattgtcctacatagctgcaaaaaggtttgaatcaataggtgcttttgaagaagcaacgagctttttcaatgcgaaaatttgggctgaacagaaaatgaatcaggtggagggaatcttatgaaaaaacttgtgctttgcgtatctattttagctgtgattttaatcgacggtatcgataagctggatccataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctagataaaaaatttagaagccaatgaaatctataaataaactaaattaagtttatttaattaacaactatggatataaaataggtactaatcaaaatagtgaggaggatatatttgaatacatacgaacaaattaataaagtgaaaaaaatacttcggaaacatttaaaaaataaccttattggtacttacatgtttggatcaggagttgagagtggactaaaaccaaatagtgatcttgactttttagtcgtcgtatctgaaccattgacagatcaaagtaaagaaatacttatacaaaaaattagacctatttcaaaaaaaataggagataaaagcaacttacgatatattgaattaacaattattattcagcaagaaatggtaccgtggaatcatcctcccaaacaagaatttatttatggagaatggttacaagagctttatgaacaaggatacattcctcagaaggaattaaattcagatttaaccataatgctttaccaagcaaaacgaaaaaataaaagaatatacggaaattatgacttagaggaattactacctgatattccattttctgatgtgagaagagccattatggattcgtcagaggaattaatagataattatcaggatgatgaaaccaactctatattaactttatgccgtatgattttaactatggacacgggtaaaatcataccaaaagatattgcgggaaatgcagtggctgaatcttctccattagaacatagggagagaattttgttagcagttcgtagttatcttggagagaatattgaatggactaatgaaaatgtaaatttaactataaactatttaaataacagattaaaaaaattataaaaaaattgaaaaaatggtggaaacacttttttcaatttttttgttttattatttaatatttgggaaatattcattctaattggtaatcagattttagaaaacaataaacccttgcatatgtctagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgccatatgcatcctaggccaaaaggttgattaattaatttagccctactcaaacatttgagtgggcttttattttatgatttatgtccaccggtcagccctgctctgtggagcgcagtacctgcaaacgtaactgagatacttctcactgttttttgcccgagtaaaacttattaaagaacatcaagcaacacttataaatatccatcgtgatatttgtgggaaaatcaattgttttggatcgatgaaaaccaccgccaagctcatctttactgtatccaattcctagacttattgttcgaccaactttattatatgtacgtgcccttcttgcgacttcctcacaaatctccaagagcacagctttaatctcttctctctttgtataatccctaaacaaaatctgactcttaccaaaactaatctgcccctgcatcaatggagctcctatttcagataaatcaattccgtgagcatgatagtacaactggtttcccattattccgaacttcttttcaagcagctctaaaggaaatttagctaactgacctacagttgatatacccattcgattcagatttctttccatcctccctcctatcccccacattttagacaaaggtcgaactttccagagtctatttggcacatcttcatatctccaacgtgcaataccactctttgttttcttactctccaggtcaagtgcaagcttactaagcaacatattgtcaccaattccaactgtgcacatcaaaccaaattctctccacatgctgctttggattgctttggccatttcttcaggattctcttttcctgcatctaaaaaagattaatcaattgaatacgtgtggacacatttttcaggaacaaatctgtaaaacagctttgtaatctcagttgaaactctgatgaaaagcttcatttgtggatttacaatgtatattcttggatcttcaggtatctcaaatagtctcgat(SEQ ID NO：100)

实施例2

芽孢杆菌属细胞中的蛋白酶表达

将BG2942前体宿主细胞(ΔnprE，degU(Hy)32、amyE::[PxyIRA-comK eryR]和衍生的修饰菌株BG2942phrA::spc(CB2-1)、BG2942phrE::spc(CB2-2)、BG2942 phrC:spc(CB2-3)、BG2942 phrF:spc(CB2-4)、BG2942 phrG:spc(CB2-5)、BG2942 phrI:spc(CB207)和BG2942 phrK:spc(CB2-8)划线到Luria-Bertani培养基-1.6％脱脂乳平板上用于在37℃过夜生长。对于每种菌株，将单菌落随后接种至10ml Luria-Bertani培养基中并在30℃培育过夜。预培养物用来接种250-ml烧瓶中的25ml新鲜制备的2×SNB培养基。该培养基含有以下成分(每升)：16g Difco营养培养液，50ml的10％maltrin M150和40ml的25×SNB盐(25×盐[每升]含有3.7g CaCl₂·2H₂O，9.6mg FeSO₄·7H₂O，6mg MnCl₂·4H₂O，25.0g KCl和3.26g MgSO₄·7H₂O)。将菌株培育9小时并且以小时间隔取得样品。对上清液测试AprE表达和活性。

对每种枯草芽孢杆菌培养物分析天然枯草蛋白酶AprE(Swiss-Prot：P37562)的产生：

MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSVQAAGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVEEDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVSPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPTGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMAPGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAAAQ(SEQ ID NO：21)。对所产生的酶分析对底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(AAPF)的活性。该测定法将蛋白酶的产生度量为每分钟因水解和释放对硝基苯胺所致的在405nm处吸光度的增加(Estell等人，J Biol Chem.，260：6518-6521(1985))。使用Sofmax Pro软件进行测量，并且指定的条件设定为：类型：动力学；减少：Vmax点(最佳读取15/28个点)；Lm1：405nm；时间：5分钟；并且间隔：11秒。在含有10mM Tris+0.005％

-80，pH 8.6；和25ul 100mg/ml AAPF的100ul Tris缓冲液中稀释20微升的每种枯草芽孢杆菌上清液。在微量滴定平板中进行测试法并且使用Softmax Pro软件。

测定由未修饰的前体菌株BG2942产生的和来自每种修饰菌株CB2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-7和2-8中的AprE蛋白酶的相对量和活性并且作为吸光度(A405nm)的函数作图，如图3中所示。分别携带phrA和phrE基因缺失的BG2942衍生菌株(CB2-1和CB2-2)的结果也在图4中显示。

图3和4中所示的数据表明与未修饰的亲代菌株BG2942中的产生(菱形)相比时，phrA、phrE、phrC、phrG、phrI和phrK的缺失增加修饰的CB2-1、CB2-2、CB2-3、CB2-5、CB2-7和CB2-8芽孢杆菌属细胞中的AprE表达。

实施例3

含有phrA或phrE基因缺失的芽孢杆菌属细胞中的蛋白酶表达

将phrA和phrE的失活构建体盒(分别地是SEQ ID NOS：17和18)导入枯草芽孢杆菌菌株CF471。CF471菌株是BG3594菌株，该菌株在上文描述(degU(Hy)32，oppA，ΔspoIIE，ΔaprE，ΔnprE)并且还包含编码蛋白酶FNA(SEQ ID NO：20)的PaprE-FNA表达构建体(SEQ ID NO：19)。所得的修饰菌株CB3-47(BG3594phrA::spcR，aprE：[PaprE-FNA，cat])和CB3-48(BG3594 phrE::spcR，aprE：[PaprE-FNA，cat])在高压灭菌的合适生长培养基中培育50小时。将细胞培养物的样品离心，并且根据上文所述AAPF测定法，将蛋白酶的产生量化为上清液中存在的分泌型FNA蛋白酶的活性的函数。

结果图示于图5中，并且这些结果表明携带phrA基因缺失(三角形)和phrE基因缺失(正方形)的修饰细胞以比未修饰的亲代菌株CF471(BG3594，aprE::[PaprE-FNA]；菱形)(其不含有phrA和/或phrE缺失)所产生水平高的水平产生PaprE依赖性FNA蛋白酶表达。

因此，缺失芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞)中的phrA和phrE增加蛋白酶FNA的产生水平。

实施例4

含有phrA和phrE基因缺失的芽孢杆菌属细胞中的蛋白酶表达

通过菌株CF471(BG3594，aprE::[PaprE-FNA])中的lox重组系统除去与phrA缺失关联的壮观霉素盒。所得菌株用携带phrE基因缺失的构建体转化。在除去抗生素抗性盒后，对该菌株测试PaprE依赖性蛋白酶表达。图6显示与phrA缺失菌株(CB4-46：BG3594 phrA，aprE：[PaprE-FNA，cat]；菱形，CB4-48：BG3594phrE，aprE：[PaprE-FNA，cat]；正方形)相比，phr双缺失菌株(CB4-68：BG3594phrA，phrE，aprE：[PaprE-FNA，cat]；三角形，CB4-69：BG3594 phrA，phrEaprE：[PaprE-FNA，cat]；交叉形)中蛋白酶表达的图。携带phrA和phrE基因双缺失的BG3594衍生菌株在合适的生长培养基中培育50小时，并且上清液以AAPF测定法测试。

与菌株CB4-46和CB4-48(二者仅携带phrA基因缺失)的FNA产生相比时，携带phrA和phrE基因双缺失的菌株(即，菌株CB4-68和CB4-69)显示FNA产生增加。

因此，与被修饰以仅含有phrA基因缺失的枯草芽孢杆菌细胞的FNA产生水平相比时，从芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌)缺失phrA和phrE基因增强FNA的产生水平。

实施例5

YmaH的过量表达：SigA和SigH多核苷酸构建体的产生

产生多核苷酸构建体SigH，SigA1，SigA2和SigA3以在枯草芽孢杆菌宿主细胞中过量表达YmaH。

将PCR引物设计成与枯草芽孢杆菌基因组同源(图7A)并且含有与该引物5’端相距6个碱基对存在的一个6碱基对限制性酶位点。将引物设计成在构建体的上游和下游末端工程化引入单一限制性位点。基因组序列(Kunst等人，Nature390：249-256[1997])、基因定位以及起始密码子和终止密码子信息的主要来源从NCBI数据库：完整枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(Completed Bacillus subtilissubsp.subtilis str.168)或从本领域技术人员已知的SubtiList互联网服务器(Moser，I.1998.FEBS Lett.430(1-2)：28-36)获得。将所考虑的序列报道为具有NCBI数据库中坐标1865428-1867019的SEQ ID NO：22，登录号NC000964在图7A中显示。

tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagctttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgattcatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggatagagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgag(SEQ ID NO：22)。

产生SigH构建体(图5B；SEQ ID NO：23)

ggcaccgaattcgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggagcc(SEQ ID NO：23)以包含这样的多核苷酸序列，其包括Sigma H启动子aaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaac；SEQ ID NO：48，和包含相邻序列atgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatag；SEQ IDNO：46(NP_389616)，其编码YmaH蛋白MKPINIQDQFLNQIRKENTYVTVFLLNGFQLRGQVKGFDNFTVLLESEGKQQLIYKHAISTFAPQKNVQLELE；SEQ ID NO：45(Swiss-Prot：P3756)。Sigma H启动子天然地位于编码miaA基因的多核苷酸序列内部、靠近该基因的3’末端，并紧邻ymaH基因上游。使用在5’端添加EcoRI限制性位点的正向引物P1：ggcaccgaattcgacgtggtttcgcaacaaaatgcag(SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：22的第987至1011位置)和添加BamHI限制性位点的反向引物P2：ggcaccggatccctcataaaaaaagaccgtgccttgg(SEQ ID NO：25，在SEQ ID NO：22的第1472至1496位置)，通过PCR扩增完整的Sigma H启动子和相邻的ymaH编码序列(图7B)。

在一个三步骤过程中通过1)扩增枯草芽孢杆菌染色体DNA的各个片段、2)纯化并装配所述片段；和3)通过PCR扩增装配的产物，产生SigA1和SigA2构建体。

使用两套引物，产生SigA1构建体(图7C；SEQ ID NO：26)

gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacatattgaataatacgaagcagccccacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO：26)。第一套引物：位于SEQ ID NO：22的5’端处的正向引物P3：gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagg(SEQ ID NO：27)和位于SEQ ID NO：22上第153bp至第177bp的反向引物P4：ttcgagttttcctgctatatgtgtggggctgcttcgtattattcaatatg(SEQ ID NO：28)用来扩增含有SigA启动子、核糖体结合位点、miaA基因的起始密码子和头几个密码子的第一片段：ttgaataatacgaagcagcccgttgtcattttagtcggaccgacggcagtggggaaaaccaatttaagtattcagctagccaaatccttaaacgcggaaattatcagcggagattcgatgcagatttataaagggatggatattggaacagctaaaattaccgaacaggagatggagggagtgccccatcatctgattgacattttagatccccaagactctttctctactgccgattatcaaagcttagtaagaaataaaatcagcgagattgcaaatagaggaaagcttccgatgattgacggcggtacagggctttatatacaatctgagctttacgattatacatttacggaagaggcaaatgatcccgtgtttcgagagagcatgcaaatggctgctgagcgggaaggcgctgactttcttcatgccaaacttgctgcagcagatcccgaggcagcagctgcgattcatccgaataatacaagaagagtcattcgcgcactggaaattttacatacgtccggaaaaacgatgtcccagcatttgaaggaacaaaaacgagaacttctgtacaatgcagtgttaattggcctgacaatggatagagacacgctttacgaaagaattaatcagcgggtcgatttgatgatgcagtcaggccttcttccggaagtgaaacgcttatacgacaagaacgtgagagactgtcaatcaatacaggcgataggctataaagagctgtatgcatattttgacggttttgtgacactttccgatgctgtcgaacagctaaagcagaactcgaggcggtatgcgaaacgccagctgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaa；SEQ ID NO：49。第二套引物：位于SEQ IDNO：22上第1071bp至第1095bp的正向引物P5：catattgaataatacgaagcagccccacacatatagcaggaaaactcgaa(SEQ ID NO：29)和反向引物P2(SEQ ID NO：25)用来扩增含有编码YmaH蛋白的DNA序列的第二片段。反向引物P4和正向引物P5是设计成含有以下尾部的融合引物，其中所述的尾部彼此互补，但不与被扩增的序列同源，以消除间插miaA编码序列。将这两个片段复性，并且所得的SigA1构建体含有SigA启动子(SEQ ID NO：47)tcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgatacata；(SEQ ID NO：47)、核糖体结合位点aagagag；SEQ ID NO：50和miaA基因的转录起点。SigA1构建体使用分别含有EcoRI和BamHI限制性位点的正向引物P3(SEQ ID NO：27)和反向引物P2(SEQ ID NO：25)扩增，并且连接至复制型质粒pBS19的多接头中。下文显示pBS19的多核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。pBS19质粒可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中复制，并且携带氯霉素抗性选择标记基因。

gaattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgatcctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatctggagctgtaatataaaaaccttcttcaactaacggggcaggttagtgacattagaaaaccgactgtaaaaagtacagtcggcattatctcatattataaaagccagtcattaggcctatctgacaattcctgaatagagttcataaacaatcctgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatagcggtaaatatattgaattacctttattaatgaattttcctgctgtaataatgggtagaaggtaattactattattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccatggaataatagaaagagaaaaagcattttcaggtataggtgttttgggaaacaatttccccgaaccattatatttctctacatcagaaaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaataccagagaatgttttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctctaacttatcccaataacctaactctccgtcgctattgtaaccagttctaaaagctgtatttgagtttatcacccttgtcactaagaaaataaatgcagggtaaaatttatatccttcttgttttatgtttcggtataaaacactaatatcaatttctgtggttatactaaaagtcgtttgttggttcaaataatgattaaatatctcttttctcttccaattgtctaaatcaattttattaaagttcatttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgaatttaggaggcttacttgtctgctttcttcattagaatcaatccttttttaaaagtcaatattactgtaacataaatatatattttaaaaatatcccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttgaagaataaaagaccacattaaaaaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaatccttttctttcttatcttgataataagggtaactattgccggttgtccattcatggctgaactctgcttcctctgttgacatgacacacatcatctcaatatccgaatagggcccatcagtctgacgaccaagagagccataaacaccaatagccttaacatcatccccatatttatccaatattcgttccttaatttcatgaacaatcttcattctttcttctctagtcattattattggtccattcactattctcattcccttttcagataattttagatttgcttttctaaataagaatatttggagagcaccgttcttattcagctattaataactcgtcttcctaagcatccttcaatccttttaataacaattatagcatctaatcttcaacaaactggcccgtttgttgaactactctttaataaaataatttttccgttcccaattccacattgcaataatagaaaatccatcttcatcggctttttcgtcatcatctgtatgaatcaaatcgccttcttctgtgtcatcaaggtttaattttttatgtatttcttttaacaaaccaccataggagattaaccttttacggtgtaaaccttcctccaaatcagacaaacgtttcaaattcttttcttcatcatcggtcataaaatccgtatcctttacaggatattttgcagtttcgtcaattgccgattgtatatccgatttatatttatttttcggtcgaatcatttgaacttttacatttggatcatagtctaatttcattgcctttttccaaaattgaatccattgtttttgattcacgtagttttctgtattcttaaaataagttggttccacacataccaatacatgcatgtgctgattataagaattatctttattatttattgtcacttccgttgcacgcataaaaccaacaagatttttattaatttttttatattgcatcattcggcgaaatccttgagccatatctgacaaactcttatttaattcttcgccatcataaacatttttaactgttaatgtgagaaacaaccaacgaactgttggcttttgtttaataacttcagcaacaaccttttgtgactgaatgccatgtttcattgctctcctccagttgcacattggacaaagcctggatttacaaaaccacactcgatacaactttctttcgcctgtttcacgattttgtttatactctaatatttcagcacaatcttttactctttcagcctttttaaattcaagaatatgcagaagttcaaagtaatcaacattagcgattttcttttctctccatggtctcacttttccactttttgtcttgtccactaaaacccttgatttttcatctgaataaatgctactattaggacacataatattaaaagaaacccccatctatttagttatttgtttagtcacttataactttaacagatggggtttttctgtgcaaccaattttaagggttttcaatactttaaaacacatacataccaacacttcaacgcacctttcagcaactaaaataaaaatgacgttatttctatatgtatcaagataagaaagaacaagttcaaaaccatcaaaaaaagacaccttttcaggtgctttttttattttataaactcattccctgatctcgacttcgttctttttttacctctcggttatgagttagttcaaattcgttctttttaggttctaaatcgtgtttttcttggaattgtgctgttttatcctttaccttgtctacaaaccccttaaaaacgtttttaaaggcttttaagccgtctgtacgttccttaag(SEQ ID NO：30)

使用以下引物(图7D)，根据对构建SigA1构建体所描述的方法产生SigA2构建体(图7C；SEQ ID NO：31)

gcgccgaattctcataccctgaaaggaaagacaagggaaattgtcggcaatgagccgctcggcaggtagaaggatgtttaccgatgcaaaaaaagggcaaaatggataggtggttgtccatgttgaatgctataatgggggagatttataaaagagagtgctcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgagggatccggtgcc(SEQ ID NO：31)。使用正向引物P3(SEQ ID NO：27)和位于SEQ ID NO：22上第125bp至第149bp的反向融合引物P7：catacagtttcgattaaagttcgagcactctcttttataaatctccccca(SEQ ID NO：33)，扩增含有SigA启动子的第一片段。使用位于SEQ ID NO：22上第1090bp至第1114bp的正向融合引物P6：tgggggagatttataaaagagagtgctcgaactttaatcgaaactgtatg(SEQID NO：32)和反向引物P2(SEQ ID NO：25)，扩增含有编码YmaH蛋白的DNA序列的第二片段。将这两个片段复性，并且所得的SigA2构建体含有SigA启动子、核糖体结合位点GGAGG；SEQ ID NO：51和ymaH基因的转录起点。

本发明也包括第四SigA构建体(SigA3；SEQ ID NO：22；图7E)，其通过扩增包括SigA启动子的芽孢杆菌属染色体DNA的miaA ymaH区产生，所述的miaAymaH区编码MiaA蛋白、YmaH启动子和编码YmaH蛋白的区域。

使用正向引物P8gcgcgcgaattcagggaaattgtcggcaatgagccgctcggc(SEQ IDNO：34)和反向引物P9gcgcgccatggctgattcgtctcagttctgcttcactttca(SEQ ID NO：35)产生SigA3构建体。SEQ ID NO：34将EcoRI限制性位点布置在该片段的5’端，而SEQ ID NO：35将NcoI位点布置在3’端。这允许将该片段克隆在报道为SEQ IDNO：36的下文所示pBN3载体中：

gacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggatccccgggtaccgagctcgaattccttaaggaacgtacagacggcttaaaagcctttaaaaacgtttttaaggggtttgtagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacct(SEQ ID NO：36)

全部PCR反应以50ul体积进行，所述的50ul体积含有来自菌落重悬物的1-2ul DNA、5ul 10X Pfu Ultra缓冲液(Stratagene)、1uL 10mM dNTP混合物(Roche)、0.5uL 0.2uM引物、1ul Pfu Ultra高保真聚合酶，并且该体积用水调整成具有50ul总体积。PCR条件是：95℃2分钟；30个循环：95℃30秒，62℃30秒，72℃1分钟，随后72℃10分钟1个循环。

使用Qiagen凝胶纯化试剂盒，根据制造商的说明书将获得的PCR片段进行凝胶纯化。

通过复性0.25ul等份混合在一起的纯化PCR片段并添加至新鲜PCR混合物，按照上文配方，使用引物P3和P2，获得融合构建体。PCR混合物的总体积是50μl。PCR条件与上文相同，根据引物的Tm调整复性温度。

如实施例4中所述，将想要的SigH、SigA1和SigA2构建体连接至已经用EcoRI和BamHI消化的pBS19质粒中，以产生用来转化宿主细胞的SigA和SigH表达载体。

将转化混合物涂布在LB+1.6％脱脂乳+5ug/ml cmp平板上。次日，挑取形成晕圈的菌落并涂布以获得单菌落。实施菌落纯化两次。通过aprE启动子区测序分析5个独立克隆。它们全部具有在aprE启动子-35区处的共有序列。

实施例6

宿主细胞转化和AprE蛋白酶表达

通过电穿孔法使用含有SigA1或SigH构建体的5微升连接混合物来转化大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)。将转化的细胞涂布在含有5ppm/ml氯霉素(Cm)的LB琼脂平板上，并且允许菌落在37℃生长过夜。挑取单个菌落并且将它们转移至含有5ml LB+5ppm/ml Cm的管中。培养物在37℃培育过夜，同时以250转/分钟振摇。从大肠杆菌培养物制备质粒DNA，并且将一部分的质粒DNA制备物测序(Sequetech)。使用Phrep、Phrap、Consed、Custal W软件进行自动化序列分析。

使用携带有来自每种表达载体中的正确构建体的质粒来转化枯草芽孢杆菌宿主细胞。将含有SigH(SEQ ID NO：23)和SigA1(SEQ ID NO：26)和SigA2(SEQID NO：31)构建体的表达载体命名为pBS19ymaH-H、pBS19ymaH-A1和pBS19ymaH-A2，并如下文那样转化入枯草芽孢杆菌菌株BG2941和BG2942中。使用2微升携带适宜构建体的质粒DNA来转化100μl枯草芽孢杆菌细胞BG2941(ΔnprE，amyE::PxylRA-comK-phleoR)和BG2942(ΔnprE，degU(Hy)32，amyE::PxylRA-comK-eryR)。携带SigH构建体的BG2941和BG2942转化体分别命名为41SigH和42SigH；并且携带SigA1构建体的BG2941和BG2942转化体分别命名为41SigA1和42SigA1。一些BG2941和BG2942宿主细胞也用对照(空)pBS19质粒转化，并且命名为41pBS19和42pBS19。BG2941和BG2942宿主细胞均携带nprE基因缺失，所述的nprE基因缺失消除大部分的非aprE背景蛋白酶解活性，从而促进对所产生碱性蛋白酶(AprE)的度量。BG2941和BG2942宿主细胞还携带盒amyE::PxylRA-comK-phleoR，这允许通过用木糖诱导生长培养物来产生感受态细胞(Hahn等人，Mol Microbiol.18：755-67[1995])。BG2942宿主细胞还在degU基因中携带突变(degU(Hy)32突变)，其中相对于由不携带degU(Hy)突变的宿主细胞分泌的枯草蛋白酶的水平，该突变单独增加由宿主细胞分泌的枯草蛋白酶的水平几倍(Msadek等人，J Bacteriol，172：824-834[1990])。

在实施例7中所述的测定法中定性和定量地确定在芽孢杆菌属宿主细胞中过量表达YmaH的作用。

实施例7

过量表达YmaH对蛋白酶产生的影响

酪蛋白测定法：首先通过比较晕圈大小的定性测定法确定过量表达YmaH对芽孢杆菌属宿主细胞产生内源性AprE枯草蛋白酶的影响，其中所述的晕圈由含有脱脂乳形式的酪蛋白的琼脂平板上所培育的菌落产生。由于蛋白酶被芽孢杆菌属细胞分泌，它消化脱脂乳中的酪蛋白并且在正在生长的菌落周围形成清亮或晕圈区。具有无活性蛋白酶的宿主细胞会在菌落周围显示少量晕圈或不显示晕圈。因而，晕圈的大小提供对分泌性菌落产生的蛋白酶的量的定性评估(Wells，T.A.等人，Nucleic Acids Res.，11，7911-7925：[1983])。

以SigH或SigA1表达载体转化的BG2941和BG2942枯草芽孢杆菌宿主细胞涂布到含有1.6％脱脂乳和5ppm Cm的LB琼脂平板上，并且在37℃孵育过夜。次日，源自一些转化体的菌落在具有5ppm Cm的LB琼脂平板上进行单菌落分离，并且平板在37℃孵育过夜。挑取单菌落分离株并且贴在相同类型的平板上并且在37℃再次孵育过夜。

最大晕圈由42SigH宿主细胞产生。42SigH细胞是携带degU(Hy)32突变和能够使YmaH蛋白过量表达的SigH构建体的BG2942枯草芽孢杆菌宿主细胞。特别地，42SigH细胞的晕圈大小证明过量表达ymaH进一步增强下述宿主细胞中枯草蛋白酶的产生，其中所述的宿主细胞已经产生比野生型细胞所产生酶水平高的酶水平。例如，42SigH细胞产生比42pBS19细胞所产生那些晕圈大的晕圈，其中所述的42pBS19细胞携带degU(Hy)突变，但不携带能够使ymaH过量表达的构建体，不过42pBS19细胞转而产生比41pBS19细胞所产生晕圈大的晕圈，其中所述的41pBS19细胞是不携带degU(Hy)32突变并且不携带能够使ymaH过量表达的构建体的BG2941枯草芽孢杆菌宿主细胞。由42SigH细胞产生的晕圈也比41SigH细胞所产生的圆圈大，其中所述的41SigH细胞不携带degU(Hy)突变，但携带能够使YmaH过量表达的SigH构建体。

AAPF测定法-将过量表达ymaH的转化芽孢杆菌属宿主细胞42SigH、42SigA1、41SigA2及其相应对照42pBS19和41pBS19的枯草蛋白酶产生量化为分泌的AprE蛋白酶的活性的函数。将分泌的蛋白酶的蛋白酶解活性测定为底物琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺的水解速率(AAPF来自SigmaChemical Co)。该测定法将蛋白酶的产生水平度量为每分钟因水解和释放对硝基苯胺所致的在405nm处的吸光度(Estell等人，J Biol Chem.，260：6518-6521[1985])。使用Sofmax Pro软件进行测量，并且指定的条件设定为：类型：动力学；减少：Vmax点(最佳读取15/28个点)；Lm1：405nm；时间：5分钟；并且间隔：11秒。

通过用转化细胞41SigH和42SigA1和42SigH的单菌落接种含有5pmm氯霉素(Cm)的5ml LB并且允许细胞生长同时在37℃振摇直至生长达到对数中期，获得枯草芽孢杆菌对照宿主细胞41pBS19和42pBS19和过量表达YmaH的宿主细胞的液体培养物。将每种培养物用含有5ppm Cm的新鲜复合培养基1∶100稀释并且允许其在37℃生长，同时以250转/分钟振摇。在图中所示的时间取得培养物的样品。将所述样品离心并且对上清液检测枯草蛋白酶的产生。

用含有10mM Tris+0.005％

-80，pH 8.6；和25ul 100mg/ml AAPF的100ul Tris缓冲液稀释10微升的每种枯草芽孢杆菌培养上清液。计算每种蛋白酶的活性，并且在图10A-B和图11中显示过量表达YmaH对蛋白酶生产的影响。

图10A和10B显示无论degU(Hy)突变是存在(42SigA和42SigH；图10A)还是不存在(41SigH；图10B)，与相应对照细胞41pBS19和42pBS19所产生的水平相比时，在芽孢杆菌属宿主细胞中过量表达YmaH增强AprE枯草蛋白酶生产几倍。此外，过量表达YmaH的细胞比不过量表达YmaH的细胞更早产生升高水平的AprE枯草蛋白酶。例如，图10A显示42sigH细胞在20小时生长时产生的枯草蛋白酶与亲代对照细胞在48小时产生的枯草蛋白酶几乎一样多。类似地，图10B显示41SigH细胞在25小时产生的枯草蛋白酶比41pBS对照细胞在48小时产生的枯草蛋白酶多。图11所示的图显示受SigH启动子驱动时表达YmaH的细胞(42SigH)导致这样的枯草蛋白酶产生，其大于其中YmaH表达受Sigma A启动子驱动的细胞(42SigA)所产生的枯草蛋白酶产生。图11还显示无论是受SigH还是受SigA启动子驱动，YmaH的过量表达均导致增强的AprE枯草蛋白酶产生，早至细胞仅生长1小时后。

实施例8

YmaH过量表达对含有失活phrA或phrE基因的修饰芽孢杆菌属宿主细胞中蛋白酶表达的影响

测试了过量表达YmaH蛋白对芽孢杆菌属细胞的增强的蛋白酶产生能力的影响，其中所述的芽孢杆菌属细胞缺少phrA或phrE。

使用引物ymaH 1F EcoRI(P1；SEQ ID NO：24)和ymaH 3’R BamHI(P2；SEQ ID NO：25)，通过PCR扩增包含与其天然启动子(SigH启动子)有效连接的ymaH基因的表达构建体SigH，并且使用EcoRI和BamHI限制性位点，将所述表达构建体克隆于多拷贝质粒pBS19中，以产生质粒pBS19ymaH sigH(SEQ IDNO：37)。

下文描述用于该扩增的引物的序列：

图9中示出了质粒pBS19ymaH sigH的图，并且下文示出了质粒pBS19ymaHsigH的序列：

gaattcgacgtggtttcgcaacaaaatgcaggtcacatggttcgatatgacaccgcctgttgatatggagctgaaaaaaaaggaaattttcacacatatagcaggaaaactcgaactttaatcgaaactgtatgatatagagaatcaaggaggacgaaacatgaaaccgattaatattcaggatcagtttttgaatcaaatccggaaagaaaatacgtatgtcactgtttttttgctgaacggctttcagttgcggggccaggtgaaaggctttgataactttaccgtattgttggaatcggaaggtaagcagcagcttatatataaacatgcgatctcaacgtttgcgccgcaaaaaaacgtccagcttgaactcgaatagatcaaaaaatgccatgtcaagacatgaggaaaggctgtcgggggttcccggcggccatttttaacatgaatccacttttgctccaagctttttgtgtaagctgaccatgccaaggcacggtctttttttatgaggatcctctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggcgatcctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatctggagctgtaatataaaaaccttcttcaactaacggggcaggttagtgacattagaaaaccgactgtaaaaagtacagtcggcattatctcatattataaaagccagtcattaggcctatctgacaattcctgaatagagttcataaacaatcctgcatgataaccatcacaaacagaatgatgtacctgtaaagatagcggtaaatatattgaattacctttattaatgaattttcctgctgtaataatgggtagaaggtaattactattattattgatatttaagttaaacccagtaaatgaagtccatggaataatagaaagagaaaaagcattttcaggtataggtgttttgggaaacaatttccccgaaccattatatttctctacatcagaaaggtataaatcataaaactctttgaagtcattctttacaggagtccaaataccagagaatgttttagatacaccatcaaaaattgtataaagtggctctaacttatcccaataacctaactctccgtcgctattgtaaccagttctaaaagctgtatttgagtttatcacccttgtcactaagaaaataaatgcagggtaaaatttatatccttcttgttttatgtttcggtataaaacactaatatcaatttctgtggttatactaaaagtcgtttgttggttcaaataatgattaaatatctcttttctcttccaattgtctaaatcaattttattaaagttcatttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgaatttaggaggcttacttgtctgctttcttcattagaatcaatccttttttaaaagtcaatattactgtaacataaatatatattttaaaaatatcccactttatccaattttcgtttgttgaactaatgggtgctttagttgaagaataaaagaccacattaaaaaatgtggtcttttgtgtttttttaaaggatttgagcgtagcgaaaaatccttttctttcttatcttgataataagggtaactattgccggttgtccattcatggctgaactctgcttcctctgttgacatgacacacatcatctcaatatccgaatagggcccatcagtctgacgaccaagagagccataaacaccaatagccttaacatcatccccatatttatccaatattcgttccttaatttcatgaacaatcttcattctttcttctctagtcattattattggtccattcactattctcattcccttttcagataattttagatttgcttttctaaataagaatatttggagagcaccgttcttattcagctattaataactcgtcttcctaagcatccttcaatccttttaataacaattatagcatctaatcttcaacaaactggcccgtttgttgaactactctttaataaaataatttttccgttcccaattccacattgcaataatagaaaatccatcttcatcggctttttcgtcatcatctgtatgaatcaaatcgccttcttctgtgtcatcaaggtttaattttttatgtatttcttttaacaaaccaccataggagattaaccttttacggtgtaaaccttcctccaaatcagacaaacgtttcaaattcttttcttcatcatcggtcataaaatccgtatcctttacaggatattttgcagtttcgtcaattgccgattgtatatccgatttatatttatttttcggtcgaatcatttgaacttttacatttggatcatagtctaatttcattgcctttttccaaaattgaatccattgtttttgattcacgtagttttctgtattcttaaaataagttggttccacacataccaatacatgcatgtgctgattataagaattatctttattatttattgtcacttccgttgcacgcataaaaccaacaagatttttattaatttttttatattgcatcattcggcgaaatccttgagccatatctgacaaactcttatttaattcttcgccatcataaacatttttaactgttaatgtgagaaacaaccaacgaactgttggcttttgtttaataacttcagcaacaaccttttgtgactgaatgccatgtttcattgctctcctccagttgcacattggacaaagcctggatttacaaaaccacactcgatacaactttctttcgcctgtttcacgattttgtttatactctaatatttcagcacaatcttttactctttcagcctttttaaattcaagaatatgcagaagttcaaagtaatcaacattagcgattttcttttctctccatggtctcacttttccactttttgtcttgtccactaaaacccttgatttttcatctgaataaatgctactattaggacacataatattaaaagaaacccccatctatttagttatttgtttagtcacttataactttaacagatggggtttttctgtgcaaccaattttaagggttttcaatactttaaaacacatacataccaacacttcaacgcacctttcagcaactaaaataaaaatgacgttatttctatatgtatcaagataagaaagaacaagttcaaaaccatcaaaaaaagacaccttttcaggtgctttttttattttataaactcattccctgatctcgacttcgttctttttttacctctcggttatgagttagttcaaattcgttctttttaggttctaaatcgtgtttttcttggaattgtgctgttttatcctttaccttgtctacaaaccccttaaaaacgtttttaaaggcttttaagccgtctgtacgttccttaag(SEQ IDNO：37)。

缺失phrA的菌株BG2942(CB2-1)和缺失phrE基因的菌株BG2942(CB 2-2)各自用多拷贝质粒pBS19 ymaH sigH(SEQ ID NO：37)转化以分别产生菌株CB2-11(BG2942 phrA:spc，pBS19 ymaH sigH)和CB2-12(BG2942 phrE:spc，pBS19 ymaH sigH)，并且测试aprE的表达。不携带phrA或phrE基因缺失的BG2942细胞用pBS19 ymaH sigH质粒转化以产生对照菌株42SigH(BG2942pBS19 ymaH sigH)。将全部BG2942衍生菌株(42SigH、CB2-11和CB2-12)在2XSNB培养基中培育9小时并且将上清液用于使用AAPF测定法测试AprE活性。

图12显示过量表达YmaH对携带phrA或phrE基因缺失的菌株的蛋白酶生产的影响。与仅用对照pBS19质粒(42pBS19)转化的BG2942菌株相比时，携带多拷贝质粒pBS19 ymaH sigH(即，42SigH)的菌株CB2-11和CB2-12显示更高的蛋白酶表达。特别地，所述结果显示YmaH在42SigH菌株(BG2942pBS19ymaHsigH)(正方形)中的过量表达增强对照BG2942 pBS19(菱形)中获得的AprE蛋白酶产生。此外，所述结果还显示与修饰的枯草芽孢杆菌菌株CB2-2(BG2942 phrE:spc)的生产相比或与42SigH(BG2942 ymaH sigH)菌株相比，缺失phrE与过量表达ymaH组合(CB2-12；交叉形)进一步增强BG2942 pBS19 ymaH sigH菌株(42SigH；正方形)的蛋白酶产生。

因而，尽管YmaH的过量表达增强目的蛋白(例如，枯草蛋白酶)的产生，然而YmaH过量表达与phr基因缺失、特别地phrE基因缺失的组合进一步增强目的蛋白的产生。

实施例9

含有rapA/phrA基因缺失的芽孢杆菌属细胞中的蛋白酶表达

在携带PaprE-FNA表达构建体的枯草芽孢杆菌菌株BG3594(degU(Hy)32，oppA，ΔspoIIE，ΔaprE，ΔnprE)中取消rapA/phrA操纵子的转录以产生如下菌株JS1121。

rapA/phrA操纵子的缺失盒在图13中图示，并且多核苷酸序列是：

tggagggagtcagaccgcgtctttgggaaaaaagcaagcggaaagtgaccgtgtttacggatggagatggagggacttcaagagagcaggaagccattgtcagagaggttcagcggagtcaagtcatcatgaatccgctattgaaaaaagagatatacagatcaattgatcagttttttcatagtgataaatcgttttatcaaacatatgacatcccttacaagcgcggcattctgttatatggacctcctggaaacggaaagacgacgttagtgaagtcgatcgcaggcagtatcgatgcacctgttgcttattggcaaattactgaatttacgtcgagcgagacaatagaagaagtctttcaggcagcgagacgcctcgctcctgcagttctggtcatcgaggatatagattcgatgccggaagatgtgcggtccttttttctcaatacgctggacggcgcgacatcaaaagaggggctatttctcatcggtacgacaaactatcccgaagagatcgatccaggtttgatgaatcgtgcaggacgatttgaccgtgcctatgaaatcgggcttccggatgaagagctgcggctggaatatatgaaaatgagaggctttggcatctttttgagtgaaggagaaataaaaaacgccgcaaaacttacagaaggcttttcctttgcacagctgggagaattatatgtatcttcagcccttcaatggcaccaagaagggaatcaccatattgaaaccatggtgaaagacatgacaggagagcaaagaaaaagccagcggggaagctggatggaaagaaacaaagtcggttttcactaaaagaaagcacgggtgtttgaaaaacccgtgcttttttgttgcggttagccgaaattcgacaattgcggttattttgcgttcttctttttcttgtaaatatgataaaatatgacatatctcgggtaattcaaaaggggggattaattgaggatgaagcagacgctcgaggtcgacggtatcgataagctggatccataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctagataaaaaatttagaagccaatgaaatctataaataaactaaattaagtttatttaattaacaactatggatataaaataggtactaatcaaaatagtgaggaggatatatttgaatacatacgaacaaattaataaagtgaaaaaaatacttcggaaacatttaaaaaataaccttattggtacttacatgtttggatcaggagttgagagtggactaaaaccaaatagtgatcttgactttttagtcgtcgtatctgaaccattgacagatcaaagtaaagaaatacttatacaaaaaattagacctatttcaaaaaaaataggagataaaagcaacttacgatatattgaattaacaattattattcagcaagaaatggtaccgtggaatcatcctcccaaacaagaatttatttatggagaatggttacaagagctttatgaacaaggatacattcctcagaaggaattaaattcagatttaaccataatgctttaccaagcaaaacgaaaaaataaaagaatatacggaaattatgacttagaggaattactacctgatattccattttctgatgtgagaagagccattatggattcgtcagaggaattaatagataattatcaggatgatgaaaccaactctatattaactttatgccgtatgattttaactatggacacgggtaaaatcataccaaaagatattgcgggaaatgcagtggctgaatcttctccattagaacatagggagagaattttgttagcagttcgtagttatcttggagagaatattgaatggactaatgaaaatgtaaatttaactataaactatttaaataacagattaaaaaaattataaaaaaattgaaaaaatggtggaaacacttttttcaatttttttgttttattatttaatatttgggaaatattcattctaattggtaatcagattttagaaaacaataaacccttgcatatgtctagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgcggccgccacgcacaaaaacaaatccagagaggagattgtttatatgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaacatgatgcataaaaaaagacccttaggggtcttttttatttcttcagcttccattcttttatcgtcagctcagaagatccacttgccaccagcggatccgcatggccgatttccgctgcctcttccagtgaatctgcttcgatgacatacgctccgcctgtggcgtcgctgaatggcccaaacatttttaaacgtttttctgcctgtaaacgatccagaaattcatagtgcccagccacatgctcctgattaaatttctccgttctcattgtcagcattaaatatggtatacatattcagaccctccgtgaacttcagtttaacacatttatccatattacggtgatagatgatatgagcttttcgtcctacgaatgccacctatttatgaaaaaagaaaaggagagatgataggtgagcattccagtaaagaaaaatttggtttctgaggcgaaatacgcgttgaagtgtcctaatgcaatgtccgctgaatacattaccattcacaacacggcaaacgatgcatcagcggccaatgaaatcagctatatgatcgggaacacaagctcgacaagctttcattttgcggtcgatgatcaagaggtgattcaaggtctgccgcttaaccgaaacgcttggcacactggtgacggcacaaacggtccgggaaaccgcaaatcaatcggtgttgagatttgctacagcaaatcgggaggcccgaagtatgaggcagctgaagccttggcgatttcatttgttgcacagctgttgaaggagcgcggctggggcatcgatcgggtgagaaagcatcaggactggagcggaaagtattgcccgcaccgcattttatcagaggggcgctgggatcaagtgaaggcggcgattgaaaaggaattaaacgggggcgtatcagcgaaaaaagctgcagtctcttcttcggcgtctgaatatcatgtaaaaaaaggtgacacactgtcagggattgccgcatca；SEQ ID NO：52，通过PCR扩增两个部分的yjo核苷酸序列并将所扩增片段与lox-壮观霉素-lox盒连接而制得。位于rapA序列上游的所述部分的yjoB基因序列使用以下寡聚物扩增：

HindIIIUF gcgtgcaagctt ggagggagtcagaccgcgtctttgg；SEQ ID NO：56，和XhoUR agagga ctcgagcgtctgcttcatcctcaattaatc；SEQ ID NO：55，

并且位于rapA基因下游含有phrA和yjpA基因序列的序列使用以下寡聚物扩增：

NotIDF ttatgaga gcggccgc cacgcacaaaaacaaatccagagag；SEQ ID NO：57和BglIIDR ccccgtagatctcggcaatccctgacagtgtgtcacc；SEQ ID NO：58。

由于phrA基因由rapA启动子转录(McQuade等人，J.Bacteriology 2001年8月；183(16)：4905-9)，故rapA(NP_389125)和phrA(NP_389126)序列在该构建体中均不转录。

含有PaprE-FNA表达盒的芽孢杆菌菌株CF471、CB3-47、JS1121在摇瓶中合适的生长培养基内培育50小时，并且将上清液在18、24、42、48小时采样并在如上所述的AAPF测定法中测试。

结果(图14)显示携带缺失phrA的菌株(CB3-47；实心正方形)和携带rapA和phrA基因缺失的菌株(JS1121；空心三角形)与对照菌株CF471(实心菱形)相比时显示增加的FNA表达。

因此，与未修饰的前体宿主细胞的异源枯草蛋白酶FNA产生相比时，phrA和/或rapA基因的失活增加这种酶的产生。

尽管已经说明和描述了本发明的具体实施方案，但对本领域技术人员而言，显而易见可以产生多种其他的变化和修改而不脱离本发明的精神和范围。意图在后附权利要求中涵盖处于本发明范围内的全部此类变化和修改。

本说明书中提到的全部专利及出版物说明本发明所属领域的技术人员的水平。全部专利及出版物以相同的程度通过引用方式并入本文，如同专门且个别地指出通过引用的方式并入每份单独的出版物。

已经描述了本发明的优选实施方案后，对于本领域技术人员而言，显而易见可以对公开的实施方案作出各种修改，并且此类修改将意图处于本发明的范围内。

本领域技术人员轻易地认识到本发明充分地适应于实施所述目的并且获得所提及的结果和优势，以及其中固有的那些结果和优势。本文所述的组合物和方法是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不意图限制本发明的范围。对本领域技术人员而言，显而易见可以对本文公开的发明作出各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。

可以在缺少本文未具体公开的任意要素或诸要素、限制或诸限制的情况下实施本文中适当示例性描述的本发明。已经使用的术语和表述用作描述术语而非限制术语，并且在使用此类术语和表述时，不意图排除所显示或所描述特征的任何等同物或其部分，但是应当意识到多种修改在所要求保护的本发明范围内是可能的。因而，应当理解尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开，然而本领域技术人员可以求助于本文所公开构思的修改和变例，并且将此类修改和变化视为处于如后附权利要求书所定义的本发明范围内。

本发明已经在此广泛并且类属性地加以描述。落入类属性公开内容的每个更小种类组和次级类属组也形成本发明的部分。这包括用限制条款或否定性限制条件对本发明的类属性描绘，其中所述的限制条款或否定性限制条件从所述类属中排除任意主题，无论所排除的材料是否在本文具体提及。

Claims (52)

1.宿主细胞，其包含rap操纵子，所述rap操纵子包含至少一个失活的phr和/或至少一个失活的rap基因。

2.权利要求1所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞过量表达YmaH。

3.权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含重组核酸。

4.权利要求1-3任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码目的蛋白的多核苷酸序列。

5.权利要求4所述的宿主细胞，其中所述重组核酸包含与编码目的蛋白的所述多核苷酸序列有效连接的启动子。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其中所述启动子是野生型或突变的aprE启动子。

7.权利要求4-6任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞以比不包含至少一个失活phr和/或rap基因的宿主细胞所产生水平高的水平产生所述目的蛋白。

8.权利要求7所述的宿主细胞，其中所述目的蛋白是酶。

9.权利要求8所述的宿主细胞，其中所述酶是蛋白酶。

10.权利要求1-8任一项所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活rap基因是rapA基因。

11.权利要求1-10任一项所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。

12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因是phrA。

13.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因是phrE。

14.权利要求1至13任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含至少一个失活的phr基因和至少一个失活的rap基因。

15.权利要求14所述的宿主细胞，其中所述的失活rap基因是rapA基因。

16.权利要求14-15任一项所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。

17.权利要求16所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因是phrA。

18.权利要求16所述的宿主细胞，其中所述的至少一个失活phr基因是phrE。

19.权利要求1-18任一项所述的宿主细胞，其包含失活的phrA基因、失活的phrE基因、失活的rapA基因和编码目的蛋白的重组核酸。

20.权利要求19所述的宿主细胞，其中所述目的蛋白是酶。

21.权利要求20所述的宿主细胞，其中所述酶是蛋白酶。

22.权利要求1至21任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)宿主细胞。

23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述的芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。

24.权利要求22或23所述的宿主细胞，其中所述的芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。

25.用于产生至少一种目的蛋白的方法，其包括提供前体宿主细胞和包含使至少一个固有phr和/或rap基因失活的失活性多核苷酸的失活性核苷酸构建体；将所述的失活性核苷酸构建体导入所述前体宿主细胞以产生修饰的宿主细胞；和在用于产生所述至少一种目的蛋白的合适条件下生长所述的修饰宿主细胞。

26.权利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述前体宿主细胞中存在的重组核酸编码。

27.权利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述修饰的宿主细胞中存在的重组核酸编码。

28.权利要求25所述的方法，其中所述目的蛋白由所述前体宿主细胞和/或所述修饰的宿主细胞中存在的重组核酸编码。

29.权利要求26-28任一项所述的方法，其中所述重组核酸包含与编码所述目的蛋白的多核苷酸序列有效连接的启动子。

30.权利要求25-29任一项所述的方法，其中所述目的蛋白是野生型目的蛋白。

31.权利要求25-30任一项所述的方法，其中所述前体宿主细胞天然地产生所述目的蛋白。

32.权利要求25-31任一项所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞的所述目的蛋白产生大于所述前体宿主细胞的所述目的蛋白产生。

33.权利要求25-32任一项所述的方法，还包括回收所述目的蛋白的步骤。

34.权利要25至33求任一项所述的方法，其中所述目的蛋白是酶。

35.权利要求34所述的方法，其中所述酶是蛋白酶。

36.权利要求25至35任一项所述的方法，其中所述修饰的宿主细胞包含在选自degU、degQ、degS、sco4、spoIIE、degQ和degR的至少一个基因中的突变。

37.权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞包含deg(Hy)32突变。

38.权利要求25至37任一项所述的方法，其中被失活的所述至少一个固有phr基因选自phrA、phrE、phrC、phrF、phrG、phrI和phrK。

39.权利要求25-38任一项所述的方法，其中所述的失活性多核苷酸使固有phrA和phrE基因和/或rap基因失活。

40.权利要求39所述的方法，其中所述的至少一个固有phr基因是phrA。

41.权利要求39所述的方法，其中所述的至少一个固有phr基因是phrE。

42.权利要求25-41任一项所述的方法，其中失活所述的固有rap基因。

43.权利要求42所述的方法，其中所述的固有rap基因是rapA。

44.权利要求25-41任一项所述的方法，还包括使固有rap基因失活。

45.权利要求25-44任一项所述的方法，其中所述的前体宿主细胞或修饰的宿主细胞过量表达YmaH。

46.权利要求45所述的方法，其中所述的YmaH过量表达通过将SigH构建体导入所述前体或所述修饰的宿主细胞中实现。

47.权利要求46所述的方法，其中所述的SigH构建体包含SEQ ID NO：23，其包含与编码YmaH蛋白的多核苷酸有效连接的SigH启动子。

48.权利要求45所述的方法，其中所述的YmaH过量表达通过将SigA构建体导入所述前体或所述修饰的宿主细胞中实现。

49.权利要求48所述的方法，其中所述的SigA构建体包含SEQ ID NO：26和/或31，其包含与编码YmaH的多核苷酸有效连接的SigA启动子。

50.权利要求25-49任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞。

51.权利要求50所述的方法，其中所述的芽孢杆菌属宿主细胞是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌细胞。

52.权利要求50-51任一项所述的方法，其中所述的芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

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