CN111004815B - 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法 - Google Patents

通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111004815B
CN111004815B CN201911313407.9A CN201911313407A CN111004815B CN 111004815 B CN111004815 B CN 111004815B CN 201911313407 A CN201911313407 A CN 201911313407A CN 111004815 B CN111004815 B CN 111004815B
Authority
CN
China
Prior art keywords
degu
gene
strain
bacillus subtilis
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911313407.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111004815A (zh
Inventor
乔俊卿
刘邮洲
刘永锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Academy of Agricultural Sciences filed Critical Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201911313407.9A priority Critical patent/CN111004815B/zh
Publication of CN111004815A publication Critical patent/CN111004815A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111004815B publication Critical patent/CN111004815B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及通过突变degU基因提高枯草杆菌表面活性素(Surfactin)产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌Bs916(CGMCC No.0808)为出发菌株，以大肠杆菌T/A克隆载体pMD19‑T Simple为骨架构建一个突变载体pT‑degU‑cm，利用同源重组原理，通过双交换过程突变枯草芽孢杆菌Bs916基因组中degU基因的策略构建了一株高产表面活性素的菌株B9ΔdegU。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产表面活性素的能力显著提高。随后，以菌株B9ΔdegU为出发菌株，利用Surfactin具有排油活性的能力作为指示标准，筛选影响B9ΔdegU发酵产生Surfactin的培养基成分；通过Plackett‑Burman实验设计、中心组合实验设计(CCD)和响应曲面法(RSM)，优化了B9ΔdegU高产Surfactin的发酵培养基成分。

Description

通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法
技术领域
本发明涉及通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
芽孢杆菌是一类好氧革兰氏阳性细菌，在自然界分布极其广泛，对多种植物病原菌具有拮抗性，且无毒、无污染、无残留，不易使病原菌产生抗药性，目前已被广泛应用于生物农药的创制和开发。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能产生丰富多样的抗菌代谢产物，尤其是脂肽类抗菌物质，其中主要包括表面活性素(Surfactin)、范革素(Fengycin)和伊枯草菌素(Iturin)三大家族。脂肽类物质是一类由亲水性环状短肽头部和长链疏水性脂肪酸尾部组成的双亲性次生代谢产物，不仅具有广谱抗菌活性和溶血性能，而且还具有生物表面活性剂的功能，因此，不仅可以在农业上用于进行生物防治，而且在医药、工业和环境保护上也有着广泛的应用。
枯草芽胞杆菌分泌的脂肽类物质是通过非核糖体合成途径合成。表面活性素(Surfactin)由7个氨基酸组成的肽链通过酯键与含有13～15个碳原子的β-羟基脂肪酸交联形成内酯环状结构的极性化合物。Surfactin作为一种生物表面活性剂，其易于被生物降解，低毒，具有较强溶血活性、排油活性、抑制细菌和病毒的活性。随着对研究的深入，其应用于环境保护，石油开采和医药方面潜力将会越来越大。但其在医药、石油工业以及环境保护中并未被广泛应用，主要是因为它生产成本巨大。目前，只有Sigma试剂公司已经获得了Surfactin A的纯品，但其销售价格昂贵，达2000元人民币/10mg，因其具有巨大的市场需求，我们迫切需要通过提高其产量以便降低其生产成本。
综合前人研究结果表明，目前提高Surfactin产量的方法主要是通过筛选优良菌株，以及优化发酵工艺；随着研究的深入，通过改造其合成分泌途径或其中的调节信号通路等方法来提高其自身合成分泌Surfactin的能力具有可行性，正成为研究的热点。目前，已有科学家尝试通过分子生物学技术对菌种进行改良，进而提高其产表面活性素的产量。如2019年天津大学的Congya Wang等利用CRISPR技术筛选抑制氨基酸代谢的相关基因来提高Surfactin的产量(Congya Wang，Yingxiu Cao，Yongping Wang，Liming Sun&HaoSong.Enhancing surfactin production by using systematic CRISPRi repression toscreen amino acid biosynthesis genes in Bacillus subtilis[J].Microbial CellFactories.2019，18：90-102.)。江南大学的Qun Wu等在2019年利用基因工程技术来增加枯草芽孢杆菌168中Surfactin的产量，该研究中通过对已经报道的Surfactin脂肪链代谢途径、Surfactin合成基因簇及调控因子和Surfactin外泌及耐受基因进行了突变或者增强表达，最终将Surfactin的产量显著提高(Qun Wu，Yan Zhi，Yan Xu.Systematicallyengineering the biosynthesis of a green biosurfactant surfactin by Bacillussubtilis 168[J].Metabolic Engineering.2019，52：87-97.)。此外，在2011年，南京农业大学的陆兆新等，通过对已报到的影响芽孢杆菌脂肽类抗生素的相关基因进行突变(abrB，phrC)或超表达(comA，yerP)来实现脂肽类抗生素的产量提升(CN201110071211.0、CN201110105407.7、CN201110105392.4、CN201110105395.8)。2016年，南京农业大学别小妹等，利用在Bacillus subtilis pB2的amy位点插入P43-sfp-degQ表达元件的方法，构建重组菌株Bacillus subtilis pB2-L，实现了同时联产Surfactin和Plipastatin的效果(CN201610032668.3)。
江苏省农科院植物保护研究所先后研发了生物农药“纹曲宁”、“叶斑宁”等生物农药。枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis Bs916是生物农药“纹曲宁”的活性成分，该菌株于2002年09月30日在中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.0808。已有研究表明Bs916能分泌表面活性素、伊枯草素家簇的杆菌霉素L和泛革素三类脂肽抗生素。本专利发明人，通过前期的随机突变体库的筛选发现并鉴定了能够大幅提升Surfactin产量的调控基因degU，国内外尚无degU基因调控Surfactin产量的研究报道，本专利主要以此为创新基础，以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株，以T/A克隆载体pMD19-T Simple为骨架构建一个突变载体pT-degU-cm，利用同源重组原理，通过双交换过程突变枯草芽孢杆菌Bs916基因组中degU基因的策略构建了一株高产表面活性素的菌株B9ΔdegU。随后，通过Plackett-Burman实验设计、中心组合实验设计(CCD)和响应曲面法，优化了B9ΔdegU高产Surfactin的发酵培养基成分。
发明内容
技术问题
本发明的目的是利用分子生物学技术，构建degU基因的突变载体，经过化学转化同源重组将枯草芽孢杆菌Bs916基因组中degU基因突变，从而构建一株高产表面活性素的菌株B9ΔdegU。此外，通过Plackett-Burman实验设计、中心组合实验设计(CCD)和响应曲面法，提供一种由上述重组的菌株高产Surfactin的发酵工艺技术。
技术方案
本发明目的通过如下技术方案实现：
1.通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌Surfactin产量的方法，其特征在于：
(1)degU基因突变载体pT-degU-cm的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916中degU基因上游左侧基因序列设计引物degUL-F和degUL-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分degU基因及其上游左侧基因序列，获得680bp基因片段；以枯草芽孢杆菌Bs916中degU基因下游右侧基因序列设计引物degUR-F和degUR-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分degU基因及其下游右侧基因序列，获得793bp基因片段；以pAD43-25质粒的氯霉素抗性基因序列设计引物Cm-F和Cm-R，该对引物的5’分别含有重组酶Cre/lox系统中的lox序列位点，可用于将抗生素基因重组消除，以pAD43-25质粒为模板，扩增氯霉素表达基因框，扩增获得1060bp基因片段。将上述扩增得到的三个核酸序列片段分别切胶回收，采用重叠(SOE)PCR方法，将三个片段进行融合，获得degUL-cm-degUR基因片段，并将该片段进行T/A克隆，连接到pMD19-T Simple载体，转化大肠杆菌DH5a，通过对大肠杆菌转化子验证，最终成功构建degU基因突变载体pT-degU-cm，保存于-20℃备用。该载体用于芽孢杆菌的转化。
(2)B9ΔdegU突变菌株的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916为出发菌株制备感受态细胞，采用化学转化方法，将构建的degU基因突变载体pT-degU-cm转化入枯草芽孢杆菌Bs916，在基因组degU基因位点发生双交换，Cm抗性平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，经过验证后，获得正确的突变菌株，命名为B9ΔdegU；该菌株的degU基因100bp处插入氯霉素抗性基因，成为突变了degU基因的突变菌株，即为所得到的菌株。
所述突变degU基因的枯草芽孢杆菌菌株B9ΔdegU可以在生产脂肽类抗生素Surfactin中应用，生产枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。
2.上述重组的菌株B9ΔdegU高产Surfactin的发酵工艺技术。
通过Plackett-Burman试验设计、中心组合试验设计(CCD)和响应曲面法，优化了B9ΔdegU菌株高产脂肽类抗生素Surfactin的发酵培养基成分和发酵条件。结果表明：B9ΔdegU菌株高产脂肽类抗生素Surfactin的最佳培养基为：葡萄糖20.37g·L-1，蛋白胨10.99g·L-1，L-亮氨酸0.17g·L-1，牛肉膏3.30g·L-1，KH2PO4 1.10g·L-1，NaCl 3.30g·L-1，MgSO4 0.02g·L-1，MnSO4 0.05g·L-1，NH4NO3 0.5g·L-1，基于最佳摇瓶发酵培养基，B9ΔdegU产生的脂肽类抗生素Surfactin排油活性是LB发酵产生Surfactin排油活性的8.51倍。
有益效果：
本发明利用同源重组的方法，成功构建了一株提高脂肽类抗生素Surfactin产量的菌株B9ΔdegU，并进行了菌株B9ΔdegU高产Surfactin的发酵培养基优化。与原始菌株Bs916相比，经过菌种改良的菌株B9ΔdegU产生脂肽类抗生素Surfactin的能力显著提高。Surfactin排油活性检测结果表明，改良菌株在LB中产surfactin的活性是野生型的3.90倍；菌株B9ΔdegU在优化后发酵工艺下产生Surfactin的活性是野生型LB培养基的8.51倍。
此外，本发明还揭示了degU基因对脂肽类抗生素Surfactin的产生有阻抑作用，利用pT-degU-em载体对任何可遗传转化的枯草芽孢杆菌进行基因改良，以获得相应的改良菌种，达到提高Surfactin产量的目的。
本发明所用的枯草芽孢杆菌Bs916是被我国农业部列为可在农业领域广泛应用的安全菌株，其产生的抗菌脂肽Surfactin属于微生物天然脂肽类抗生素，对人类健康和食品安全性高，可用于生物防治，食品加工、农产品贮藏保鲜和石油开采等，以菌株Bs916为活性成分的生物农药“纹曲宁”已经在2002年开始进入市场销售。
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
附图说明：
图1 degU基因突变载体的构建流程图
图2 degU基因芽孢杆菌突变菌株的PCR验证电泳图
图3菌株B9ΔdegU产Surfactin高效液相色谱检测(LB培养基)
图4不同培养基对枯草芽胞杆菌B9ΔdegU发酵液排油活性的影响
图5添加不同氨基酸对枯草芽胞杆菌B9ΔdegU发酵液排油活性的影响
图6菌株B9ΔdegU高产Surfactin发酵工艺响应曲面优化交互三维图
实施例1 degU基因突变载体pT-degU-cm的构建
以枯草芽孢杆菌Bs916 degU基因上游左侧基因序列设计引物degUL-F和degUL-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分degU基因及其上游左侧基因序列，获得680bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：95℃ 2min；30×(95℃20s；60℃ 30s；72℃ 1min；72℃ 5min。扩增片段经过切胶回收后，保存备用。
以枯草芽孢杆菌Bs916degU基因下游右侧基因序列设计引物degUR-F和degUR-R，以枯草芽孢杆菌Bs916基因组为模板，扩增部分degU基因及其下游右侧基因序列，获得793bp基因片段；采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：95℃ 2min；30×(95℃ 20s；60℃ 30s；72℃ 1min；72℃5min。扩增片段经过切胶回收后，保存备用。
以pAD43-25质粒的氯霉素抗性基因序列设计引物Cm-F和Cm-R，该对引物的5’分别含有重组酶Cre/lox系统中的lox序列位点，可用于将抗生素基因重组消除，以pAD43-25质粒为模板，扩增氯霉素表达基因框，扩增获得1060bp基因片段。采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，PCR程序为：95℃ 2min；30×(95℃ 20s；60℃ 30s；72℃ 1min；72℃5min。扩增片段经过切胶回收后，保存备用。
采用重叠(SOE)PCR方法，将上述三个片段进行融合，采用Taq DNA聚合酶Mix(擎科生物技术有限公司)，重叠PCR采用两步法，即首先将融合片段混合，不加任何引物，程序为：95℃ 2min；10×(95℃ 20s；60℃ 45s；72℃ 3min；72℃ 5mi；随后将PCR引物degUL-F和degUR-R加入扩增体系，按照程序95℃ 2min；30×(95℃ 20s；60℃ 45s；72℃ 3min；72℃8min进行扩增，获得degUL-cm-degUR基因片段，并将该片段进行T/A克隆，连接到pMD19-TSimple载体，转化大肠杆菌DH5a，通过对大肠杆菌转化子验证，最终成功构建degU基因突变载体pT-degU-cm(附图1)，保存于-20℃备用。该载体可用于芽孢杆菌的转化。
实施例2 degU基因突变芽孢杆菌B9ΔdegU的构建
将构建好的突变载体pT-degU-cm转化枯草芽孢杆菌Bs916，通过同源重组的方式整合到枯草芽孢杆菌Bs916基因组上，转化方法参考以下文献进行(ElSorra E.Idris，Domingo J.Iglesias，Manuel Talon，and Rainer Borriss.Tryptophan-DependentProduction of Indole-3-Acetic Acid(IAA)Affects Level of Plant GrowthPromotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42[J].Molecular plant MicrobeInteractions.2007，20(6)：619-626.)。在Bs916基因组degU位点发生双交换，Cm抗性平板上筛选得到氯霉素抗性菌株，并进行PCR验证，正确的转化子命名为B9ΔdegU(附图2)。该菌株的degU基因被氯霉素抗性基因所插入突变，成为突变了degU基因的突变菌株，即我们所改良的菌株。
实施例3突变菌株B9ΔdegU产Surfactin的含量及活性检测。
活化芽孢杆菌野生株Bs916、突变株B9ΔdegU，用无菌牙签分别挑取单菌落至20mLLB液体培养基中30℃、200r/min培养12-15h，制备种子液，按照1％接种量将种子液接入含有100ml LB培养液的500mL摇瓶中，30℃，180rpm培养48h，菌液6000r/min离心10min后，获得发酵上清液。1)依据Surfactin具有强的排油活性特点，取10μL进行排油活性检测，具体步骤如下：将9cm培养皿，加入2/3体积蒸馏水，取800μL的石蜡油滴于表面，待石蜡油在水表均匀散开，分别取适量(10μL)芽孢杆菌培养菌液滴在平板中央，待形成排油圈后，测量排油直径(mm)。2)此外，将上述离心获得上清液转移至干净的250mL三角瓶中，加入盐酸调pH至2.0，4℃静置过夜后，8000r/min、离心10min，弃上清，将沉淀置于室温晾干。加2mL 100％甲醇溶解沉淀，并用直径0.22μm的滤膜过滤，随后进行高效液相色谱检测(HPLC)，色谱柱为25mm×5mm C18柱(安捷伦3.5μm，4.6×250mm)，流动相为乙腈和水(0.1％TFA)，比例为40％：60％，流速0.8mL/min。
实验结果显示：野生株Bs916的排油圈直径为43.67±0.58mm，而突变体B9ΔdegU的排油圈直径为86.33±4.16mm，依据排油圈面积估算，突变体B9ΔdegU所产Surfactin的排油活性是野生型的3.90倍；高效液相色谱结果进一步显示，突变体B9ΔdegU的峰面积比野生型显著增加，其面积是野生型的3.11倍，即其产量比野生型提高了2.11倍(附图3)。综上所述，突变体B9ΔdegU的Surfactin产量较野生型提高了2.11倍，其产物的排油活性较野生型提高了2.90倍。
实施例4突变菌株B9ΔdegU高产Surfactin的发酵培养基优化。
试验材料及方法：枯草芽胞杆菌突变体B9ΔdegU的常规活化和发酵种子液的制备都采用LB培养基(胰蛋白胨10.0g·L-1，酵母粉5.0g·L-1，NaCl 10.0g·L-1)。取-70℃冰箱保存的B9ΔdegU菌种于LB平板活化，28℃静置培养24h后，挑取单胞接种于含有20mL LB液体的100mL三角瓶中，30℃、180r·min-1振荡培养12h，即为发酵种子液。枯草芽胞杆菌突变体B9ΔdegU发酵产Surfactin的活性检测采用排油圈直径测量方法，具体细节同实施例3。
发酵培养基组分初筛选：(1)培养基成分的筛选在含100mL培养基的500mL三角瓶中，接种1％的种子液，于30℃、150r·min-1培养，48h后，分别测定发酵液的排油活性，比较表1中各常用发酵培养基对B9ΔdegU菌株发酵液排油活性的影响，筛选合适的培养基成分。在上述筛选合适的培养基中分别加入不同的氨基酸，具体如下：DL(D-亮氨酸)(1g/L)、LL(L-亮氨酸)(1g/L)、LV(L-缬氨酸)(1g/L)，按照正常条件进行发酵并测定发酵液的排油活性，筛选出对B9ΔdegU脂肽类物质(Surfactin)生产具有促进作用氨基酸。(2)培养基组分关键因子筛选根据培养基筛选的试验结果，确定以5、8号综合后的培养基组分和筛选获得的L-亮氨酸为基础培养基成分，采用Design-expert软件进行Plackett-Burman摇瓶发酵试验设计，从葡萄糖(A：2～10g·L-1)、蛋白胨(B：2.5～5g·L-1)、牛肉膏(C：1.1～3.3g·L-1)、NaCl(D：1.1～3.3g·L-1)、MnSO4(E：0.05～0.1g·L-1)、KH2PO4(F：1.1～3.3g·L-1)、L-亮氨酸(G：0.25～1.0g·L-1)、MgSO4(H：0.02～0.1g·L-1)和NH4NO3(J：0.5～2.0g·L-1)9个因素中筛选关键因子。试验中每因素取2水平：即高水平“1”(范围区间最大值)和低水平“-1”(范围区间最小值)，每组试验3次重复。本研究采用的9种常用基础发酵培养基列于表1。
表1培养基的种类与组成
培养基关键因子中心组合试验(CCD)：根据培养基成分的Plackett-Burman试验结果，综合选出3个对发酵液排油活性产生显著影响的培养基成分关键因素(葡萄糖；蛋白胨；L-亮氨酸)，并确定中心点数值。然后利用中心组合试验进行3因素试验，根据其设计原理，分别按照轴向点α值为1.681 79，角点值为1，设计5水平试验，共设20组，每组3个重复。
表2关键培养基成分中心组合实验设计各因素水平
数据分析：Plackett-Burman试验、中心组合试验及响应曲面分析均利用Design-expert.v.8.0.6.1软件进行设计和分析。
实验结果显示：
B9ΔdegU发酵最佳培养基组成成分筛选：由附图4显示：在9种培养基中，菌株B9ΔdegU在培养基5和8号中生长产生脂肽类抗生素的排油活性最高，分别为75.33±0.58mm和72.67±2.52mm。随后，以5号培养基为基础分别加入了不同的氨基酸，发酵后，测定了发酵液排油活性，结果显示加入L-亮氨酸的培养基排油活性最好，表明L-亮氨酸有助于B9ΔdegU中表面活性素的产生(附图5)。基于以上结果，初步确定5、8号培养基中的组分及L-亮氨酸是影响B9ΔdegU发酵产表面活性素(Surfactin)的主要成分，以此为基础进行培养基成分的Plackett-Burman关键因素筛选。
Plackett-Burman筛选培养基关键因素：对培养基成分的9因素2水平的Plackett-Burman试验数据进行回归分析，所得主要因子回归方程为：Y＝47.61+11.89A+3.17B+0.11C+2.39D-0.39E-1.39F-2.67G-0.17H-0.0017J，校正系数R2＝0.9762，公式中：Y为排油活性的预测值。由校正系数可知Y的变化中97.62％能被回归方程解释。Design-expert对回归模型的方差分析显示(表2)：首先，回归模型是显著的(P＝0.0193)；此外，葡萄糖、蛋白胨和L-亮氨酸对B9ΔdegU菌株产脂肽类抗生素Surfactin的排油活性有显著性影响(P＜0.05)。在下一步的中心组合试验设计中主要以培养基成分(葡萄糖、蛋白胨和L-亮氨酸)作为研究对象进行优化。
表3培养基成分的Plackett-Burman试验设计方差分析
Table 3 Univariate analysis of variance of Plackett-Burman design ofmedia composition
*表示该因子在0.05水平差异显著。*indicated the factor is significantdifference at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test.
培养基关键因素中心组合设计试验及响应曲面分析：根据PB试验结果，获得培养基成分的3个关键因素(葡萄糖、蛋白胨和L-亮氨酸)，然后进行3因素5水平的中心组合设计，进一步优化影响B9ΔdegU摇瓶发酵产表面活性素的培养基成分最优组合。对中心组合试验数据进行回归分析，获得主要因子回归方程为：Y＝115.11+2.84A+1.84B+0.79C+0.50AB+1.79AC-1.25BC-3.06A2-2.81B2-2.00C2，校正系数R2＝0.9263，公式中：Y为排油圈直径的预测值。回归方程的方差分析显示(表3)，模型的P值小于0.0001，表明该模型正确，B9ΔdegU发酵产生的脂肽类抗生素的排油圈直径实际测定值与方程预测值存在显著相关性。该模型变异系数CV为1.19％，小于10％，属于弱变异，这进一步表明试验数据的可靠性。缺失拟合项值为11.38(P＞0.05)，说明该回归方程的失拟不显著，被认为所建立的回归方程拟合度高。以上结果表明该模型可以用于描述发酵培养基成分对B9ΔdegU菌株所产生表面活性素的排油活性的影响。
表4培养基关键因素中心组合试验(CCD)回归方程方差分析
Table 4 Variance analysis of regression equation of media composition
*表示该模型在0.05水平差异显著。*indicated the model is significantdifference at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test.
图6为葡萄糖、蛋白胨和L-亮氨酸3因素对B9ΔdegU摇瓶发酵产表面活性素排油活性影响的响应曲面三维图。附图6a、b和c都有凸起的最高点，可以确定3个变量的优化值范围。根据2.3节得到的二阶多元方程求得3个因素的最优值，分别是葡萄糖20.37g·L-1、蛋白胨为10.99g·L-1、L-亮氨酸0.17g·L-1，在此条件下，脂肽类抗生素表面活性素的排油直径预测值可达116.45mm。基于此，我们得到最佳发酵培养基为：葡萄糖20.37g·L-1，蛋白胨10.99g·L-1，L-亮氨酸0.17g·L-1，牛肉膏3.30g·L-1，KH2PO4 1.10g·L-1，NaCl 3.30g·L-1，MgSO4 0.02g·L-1，MnSO4 0.05g·L-1，NH4NO3 0.5g·L-1。
发酵优化工艺的验验证：基于筛选的最优发酵培养基配方(葡萄糖20.37g·L-1，蛋白胨10.99g·L-1，L-亮氨酸0.17g·L-1，牛肉膏3.30g·L-1，KH2PO4 1.10g·L-1，NaCl3.30g·L-1，MgSO4 0.02g·L-1，MnSO4 0.05g·L-1，NH4NO3 0.5g·L-1)进行摇瓶发酵培养实验(30℃、150rpm、48h、装液量100mL/500mL摇瓶、1％接种量)，菌株B9ΔdegU发酵产生的脂肽类抗生素(主要是表面活性素)排油圈直径为为119.67±2.52mm，与预测值116.45mm无显著性差异。野生型菌株Bs916在LB培养基发酵液排油圈直径为43.67±0.58mm，发酵优化后的对排油活性(排油圈面积)提高了7.51倍。

Claims (2)

1.一种提高表面活性素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)degU基因突变载体pT-degU-cm的构建
设计引物degUL-F和degUL-R：
degUL-F：5’TTGCCATAACAGGCAAGTCTTC 3’
degUL-R：5’GCTATACGAACGGTATTCCGTGAGGGTGTAAAA 3’
以保藏编号为CGMCC No.0808的枯草芽孢杆菌Bs916基因组DNA为模板PCR扩增部分degU基因及其上游左侧基因序列，获得680bp基因片段；
设计引物degUR-F和degUR-R：
degUR-F：5’ATTATACGAACGGTAGTTGATGGTCGTCGATAA 3’
degUR-R：5’GCGCAGGCTAAACAAGATTTC 3’
以保藏编号为CGMCC No.0808的枯草芽孢杆菌Bs916基因组DNA为模板PCR扩增部分degU基因及其下游右侧基因序列，获得793bp基因片段；
设计引物Cm-F和Cm-R：
Cm-F：5’TACACCCTCACGGAATACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTTGATACACA 3’
Cm-R：5’TCGACGACCATCAACTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTTTTCACCG 3’
以pAD43-25质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的氯霉素抗性基因表达框，获得1060bp基因片段；
将上述扩增得到的三个核酸序列片段分别切胶回收，采用重叠(SOE)PCR方法，将三个片段进行融合，获得degUL-cm-degUR基因片段，并将该片段进行T/A克隆，连接到pMD19-TSimple载体，转化大肠杆菌DH5a，通过对大肠杆菌转化子验证，最终成功构建degU突变载体pT-degU-cm；该载体用于芽孢杆菌的转化；
(2)B9ΔdegU突变菌株的构建
利用化学感受态制备法，以枯草芽孢杆菌Bs916制备感受态细胞，采用化学转化方法，将获得的degU基因突变载体pT-degU-cm转化入枯草芽孢杆菌Bs916，在基因组degU基因侧翼位点发生同源重组双交换，Cm抗性平板上筛选得到氯霉素抗性转化子，经过PCR验证转化子，最终获得突变菌株，并命名为B9ΔdegU；该菌株的degU基因中100bp位置被氯霉素抗性基因插入，成为插入突变degU基因的突变菌株，即为所得到的菌株；
所述突变菌株B9ΔdegU是在配方为葡萄糖20.37g·L-1，蛋白胨10.99g·L-1，L-亮氨酸0.17g·L-1，牛肉膏3.30g·L-1，KH2PO41.10g·L-1，NaCl 3.30g·L-1，MgSO40.02g·L-1，MnSO40.05g·L-1，NH4NO30.5g·L-1的培养基中进行发酵。
2.权利要求1所述方法在生产枯草芽孢杆菌表面活性素中的应用。
CN201911313407.9A 2019-12-18 2019-12-18 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法 Active CN111004815B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911313407.9A CN111004815B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911313407.9A CN111004815B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111004815A CN111004815A (zh) 2020-04-14
CN111004815B true CN111004815B (zh) 2023-07-21

Family

ID=70116896

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911313407.9A Active CN111004815B (zh) 2019-12-18 2019-12-18 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111004815B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112795587B (zh) * 2021-02-01 2023-08-29 华南农业大学 一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用
CN113512519B (zh) * 2021-06-29 2024-05-14 江苏省农业科学院 枯草芽胞杆菌表面活性素（Surfactin）产量的提升及其应用
CN114292864B (zh) * 2021-12-31 2023-08-08 淮阴工学院 高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876987A (en) * 1996-02-07 1999-03-02 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method, DNA and bacteria for hyperproduction of an antibiotic due to disruption of an AbsA gene
WO2010144283A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-16 Danisco Us Inc. Bacillus strain for increased protein production
CN102242142A (zh) * 2011-04-27 2011-11-16 南京农业大学 通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
CN107205403A (zh) * 2014-09-30 2017-09-26 奥本大学 果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(pgpr)菌株促进植物和动物生长和健康的效力的用途
CN109097316A (zh) * 2018-09-04 2018-12-28 南京农业大学 通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法
WO2019221988A1 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 Bayer Cropscience Lp Mutants of paenibacillus and methods for their use

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5876987A (en) * 1996-02-07 1999-03-02 Board Of Trustees Operating Michigan State University Method, DNA and bacteria for hyperproduction of an antibiotic due to disruption of an AbsA gene
WO2010144283A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-16 Danisco Us Inc. Bacillus strain for increased protein production
CN102242142A (zh) * 2011-04-27 2011-11-16 南京农业大学 通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法
CN107205403A (zh) * 2014-09-30 2017-09-26 奥本大学 果胶或果胶相关糖类提高植物根际促生细菌(pgpr)菌株促进植物和动物生长和健康的效力的用途
WO2019221988A1 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 Bayer Cropscience Lp Mutants of paenibacillus and methods for their use
CN109097316A (zh) * 2018-09-04 2018-12-28 南京农业大学 通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Differential Proteomics Analysis of Bacillus amyloliquefaciens and Its Genome-Shuffled Mutant for Improving Surfactin Production;Junfeng Zhao et al.;《Int. J. Mol. Sci.》;20141031;第15卷;第19847-19869页 *
Genetic variants of the oppA gene are involved in metabolic regulation of surfactin in Bacillus subtilis;Xiaoyu Wang et al.;《Microb Cell Fact》;20190819;第18卷;第1-12页 *
芽胞杆菌表面活性素高效发酵培养基优化及其对水稻病害的防治效果研究;孙凯;《中国知网硕士电子期刊》;20210915(第9期);第1-70页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111004815A (zh) 2020-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111004815B (zh) 通过突变degU基因提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的方法
Ma et al. Development of intergeneric conjugal gene transfer system in Streptomyces diastatochromogenes 1628 and its application for improvement of toyocamycin production
CN108642041B (zh) 一种提高重组大肠杆菌发酵生产l-丙氨酸能力的方法
CN112481178B (zh) 氨基双去甲氧基姜黄素高产菌株构建及其发酵优化方法
JP2006501851A5 (zh)
CN115851569B (zh) 利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用
WO2015115520A1 (ja) 藍藻においてプラスチック原料を生産する方法
CN113512519B (zh) 枯草芽胞杆菌表面活性素（Surfactin）产量的提升及其应用
CN103667374A (zh) 一种以重组粘质沙雷氏菌为菌种生产d-乳酸的方法
CN104762242A (zh) 甲羟戊酸的生产菌以及生产甲羟戊酸的方法
CN114410631B (zh) 一种高效合成西柏三烯一醇菌株的构建方法及其应用
CN114426983B (zh) 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法
CN114736918B (zh) 一种整合表达生产红景天苷的重组大肠杆菌及其应用
CN113755349B (zh) 一种杂色曲霉(Aspergillus versicolor)D5Δstc17菌株及构建方法
CN115948402A (zh) 产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用
CN111549050B (zh) 适用于芽胞杆菌的透明颤菌血红蛋白表达框及应用
CN112646762B (zh) 生产α-熊果苷的工程菌及其构建方法和应用
CN112359007A (zh) 用于产杆菌肽的外源引入edd基因地衣芽孢杆菌及应用
CN112359004B (zh) 强化表达yvbW基因在提高解淀粉芽胞杆菌吲哚乙酸产量中的应用
CN116515724B (zh) 利用无机氮源的运动发酵单胞菌、应用及氮代谢调控基因
CN103898126B (zh) 来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用
CN111454975B (zh) 一种与多杀菌素相关的ech基因的应用
CN116064357B (zh) 一株有效提高Fcl29产量的改良菌株及改良方法
CN114381417B (zh) 一种提高谷氨酸棒杆菌对抑制物耐受性的方法
CN117106836B (zh) 磷脂酰甘油磷酸酶编码基因在发酵生产胞苷中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant