CN103898126B - 来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用。所述的泛应急蛋白FaUSPA基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO1所示，通过构建包含还基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，经试验表明，该基因能够在梭菌中稳定高效表达，有效提高了梭菌对丁醇的耐受性。同时，利用厌氧发酵，还表明该基因能够大幅度提高梭菌产丁醇能力。

Description

来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用

技术领域

本发明涉及一种来源于极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因、包含该基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建方法，以及它们在提高梭菌丁醇耐受性，促使梭菌提高产高含量丁醇中的应用。

背景技术

生物丁醇是是一种极具潜力的第二代新型生物燃料，与乙醇相比，丁醇作为生物燃料具有以下众多优势：1）能量含量高，与乙醇相比可多走30%的路程；2）丁醇的挥发性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，与汽油混合对水的宽容度大，对潮湿和低水蒸气压力有更好的适应能力；3）丁醇可在现有燃料供应和分销系统中使用，而乙醇则需要通过铁路、船舶或货车运输；4）与其他生物燃料相比，腐蚀性较小，比乙醇、汽油安全；5）与现有的生物燃料相比，生物丁醇与汽油的混合比更高，无需对车辆进行改造，就可以使用几乎100%浓度的丁醇，而且混合燃料的经济性更高；6）丁醇可以通过不消耗粮食、不占用耕地、不增加环境压力为前提进行发酵生产。如果丁醇占生物燃料市场的20%，全球市场将超过200亿美元。

由于丁醇具有毒性，影响细菌的生长和原料转化。目前生产中，丁醇的终浓度维持在13-14g/L，当超过这个浓度时，由于丁醇的毒性，细胞代谢就终止了（Zheng2009JIndMicrobiolBiotechnol）。经研究发现丁醇的毒性主要是破坏细胞膜的磷脂成分，从而进一步影响糖和氨基酸的吸收。目前普遍认为若细胞对丁醇的抗性得以提高，丁醇的产量也将相应提高。

泛应激蛋白（Universalstressprotein，Usp）是一类在细胞质中普遍存在的小分子蛋白，通常由111-167个氨基酸残基组成。Usp最早在大肠杆菌中发现，其表达受多种胁迫影响（Nystrom1993，JBacterio）。此后，USP蛋白在多种古生菌、细菌、植物中均被发现。USPA蛋白在埃希氏菌属大肠杆菌细胞生长受到限制，DNA被损坏时诱导表达；该蛋白在化学毒素，渗透胁迫，UV照射条件下调节细胞中的营养物质；被认为外界压力的生物传感器。研究表明该类蛋白在碳、氮、磷、硫酸盐、氨基酸等缺乏时，以及在高温、氧化、紫外线、环丝氨酸、抗生素等刺激下能积累表达（Liu2007，MicroPathog）。Freestone等（1997，JMolBiol）的研究结果显示，UspA作用于丝氨酸、苏氨酸的蛋白磷酸化，对细胞稳定期的生长有重要作用。在埃希氏菌属大肠杆菌细胞中发现，USPA与细胞分裂蛋白有协同作用，同时可激活RecA的表达，RecA蛋白是细菌中参与DNA同源重组修复的重要蛋白，增强细胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物参与DNA同源重组修复的重要蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用，以弥补现有技术存在的缺陷。

本发明按照梭菌的偏爱密码合成源于端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因（GenbankZP_05570298.1），设计引物，采用PTDS方法（Xiong2004，NucleicAcidsRes）人工合成并克隆该基因，对获得的阳性克隆进行序列测定，其碱基序列如SEQIDNO1所示，即为本发明的泛应急蛋白FaUSPA基因，命名为FaUSPAI。

进一步，本发明通过构建包含上述合成的泛应急蛋白FaUSPAI基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，使其能够在梭菌中高效表达。

所述的表达载体是以pSOS94载体为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因启动子、上述合成的FaUSPAI基因的阅读框单元和枯草杆菌pyruvatekinase基因终止子定向连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元构建而成的。

其中，从pXYP251载体中扩增氯霉素表达单元。引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’；扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。

从梭菌C.acetobutylicumATCC824中扩增CAC3645基因启动子，引物为c3645z:5’-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3’，c3645f:5’-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3’。扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。所得的梭菌CAC3645基因启动子的碱基序列如SEQIDNO2所示。

从枯草杆菌Bacillussubtilis168中扩增PYK基因终止子，引物为pyk1:5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’，pyk2:5’-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG-3’；扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

利用电击法将上述含有FaUSPAI基因表达单元的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体导入梭菌中，通过红霉素筛选转化子。试验表明，该FaUSPAI基因可以在梭菌中高效表达，有效提高了梭菌对丁醇的耐受性。并在厌氧发酵中，大幅度提高了梭菌产丁醇能力，较原始菌株824提高了18%。

附图说明

图1为本发明的含有FaUSPAI基因表达单元的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建图谱。

图2至图5为FaUSPAI梭菌转化子和原始菌种在不同浓度对丁醇的耐受性。

图6至图7为FaUSPAI转化子和原始菌种发酵后产物和生长情况。

具体实施方式

实施例1来源于极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因的合成

在不改变氨基酸序列的前提下，根据梭菌特有的密码子特点，合成源极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因（GenbankZP_05570298.1），设计引物，并人工合成。引物序列如下，引物长度为60bp左右。

1.N1100=FAUSPAI-1:Tm=54,60mer

GGA,TCC,ATG,AAG,GTC,CTC,GTC,TCC,TAT,GAT,GGT,TCT,GAA,GGT,GCT,AGA,GAA,GCT,CTC,AAG

2.N1100=FAUSPAI-2:Tm=54,60mer

TGT,AGT,ACT,CGT,CAA,CAG,TGC,ACT,TGA,GTT,CAA,GAG,CAT,ACT,TGA,GAG,CTT,CTC,TAG,CAC

3.N1100=FAUSPAI-3:Tm=54,60mer

CAC,TGT,TGA,CGA,GTA,CTA,CAT,CGT,CTA,CGT,CAT,TCC,AAC,TAT,CGT,TGG,TAT,CTC,TGC,TTC

4.N1100=FAUSPAI-4:Tm=54,60mer

CTG,ACC,TTC,ATA,GAC,AGA,CTG,TGG,AAT,GTA,GGA,GTC,GAA,GGA,AGC,AGA,GAT,ACC,AAC,GAT

5.N1100=FAUSPAI-5:Tm=54,60mer

AGT,CTG,TCT,ATG,AAG,GTC,AGG,ACA,AGA,CTG,CTG,ATC,AGA,TCC,TGG,AGA,AGG,CTA,AGA,AGG

6.N1100=FAUSPAI-6:Tm=54,60mer

ATT,TTG,ATC,AGT,TCG,TAC,TTG,GCT,TCT,TCC,TTG,TCC,AGA,ACC,TTC,TTA,GCC,TTC,TCC,AGG

7.N1100=FAUSPAI-7:Tm=54,60mer

AAG,TAC,GAA,CTG,ATC,AAA,ATC,TCC,TCT,AAT,GGT,GAA,GAG,ATT,CCT,AAG,ATC,ATC,CTG,AAG

8.N1100=FAUSPAI-8:Tm=54,60mer

TGC,CAG,TAA,CGA,TGA,GGT,TGA,TAC,CCT,TCT,CTT,CAG,CAG,TCT,TCA,GGA,TGA,TCT,TAG,GAA

9.N1100=FAUSPAI-9:Tm=54,60mer

CAA,CCT,CAT,CGT,TAC,TGG,CAC,CAG,AAA,GCT,GCA,TGG,CTT,CTC,CAA,GCT,CAT,TCT,TGG,TTC

10.N1100=FAUSPAI-10:Tm＝54,60mer

GAC,TGG,GAT,GTT,GGA,GTG,AGC,GAT,GAT,ACC,AGA,AGA,GAC,AGA,ACC,AAG,AAT,GAG,CTT,GGA

11.N1100=FAUSPAI-11:Tm＝54,50mer

GAG,CTC,TTA,CTC,CTT,TGG,TGG,AAC,AAC,AGT,GAC,TGG,GAT,GTT,GGA,GTG,AG

利用PCR进行强烈FaUSPA基因扩增，在100μl反应体系中，FAUSPAI-2~FAUSPAI-10共9个引物的添加量为2ng，外侧引物FAUSPAI-1和FAUSPAI-11添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，使用的TaqDNA聚合酶为KODFXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25个循环。

PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10μl直接与pUC18SmaI酶切平端克隆载体相连。16℃连接1h，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，即为本发明的泛应急蛋白FaUSPA基因，命名为FaUSPAI基因。经序列测定，该基因的碱基序列如SEQIDNo1所示。

实施例2含有FaUSPAI基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体的构建

以pSOS94载体（Desai1999，ApplEnvironMicrobiol）为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因（NC_003030）启动子、FaUSPAI基因的阅读框表达单元和枯草杆菌pyruvatekinase（PYK，NC_000964）基因终止子（PYK）定向连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元，构建由强启动子控制本发明的泛应急蛋白FaUSPAI基因表达的梭菌-大肠杆菌穿梭载体pFaUSPA（参看图1），该载体约为6670bp。具体构建步骤如下：

从pXYP251（GenBank登录号AY178046，含有中等强度原核PGm启动子和终止子为T1T2）载体中扩增氯霉素表达单元。引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’；cm2:5’-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’。扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。

从梭菌C.acetobutylicumATCC824（（美国典型培养物保藏中心，US7432090））中扩增CAC3645基因启动子。引物为c3645z:5’-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3’；c3645f：5’-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3’。扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。该PCR片段克隆经测序，其碱基序列如SEQIDNO2所示。

从枯草杆菌Bacillussubtilis168（ATCC）中扩增PYK基因终止子。引物为pyk1:5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’；pyk2:5’-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG-3’。扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

将上述三个PCR扩增片断回收后，平端连接，克隆并测序。获得测序正确的基因，将氯霉素表达单元用HindIII和XbaI双酶切；CAC3645基因启动子BamHI和XbaI双酶切；实施1的FaUSPAI基因BamHI和SacI双酶切；枯草杆菌Bacillussubtilis168中PYK基因终止子NdeI和SacI双酶切后依次克隆到pCAMBIA1301载体（http://www.cambia.org）。

克隆后将获得的氯霉素表达单元、CAC3645基因启动子、泛应急蛋白FaUSPAI基因和枯草杆菌PYK基因终止子整体替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元，即获得本发明的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pFaUSPA。

实施例3转化质粒处理及转化方法

上述构建的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pFaUSPA含有氨苄青霉素和红霉素抗性，可以在大肠杆菌中复制，又可以通过红霉素筛选转化的梭菌。将该穿梭表达载体利用pAN1质粒上（Mermelstein1993，ApplEnvironMicrobiol）的甲基化酶甲基化，该质粒含有来自枯草杆菌的δ3T甲基转移酶基因，可以实现梭菌表达载体的甲基化保护，从而避免其在梭菌中被Cac824I限制性内切酶切段，因为该酶切位点在梭菌中广泛存在。

用于表达载体pFaUSPA扩增的大肠杆菌必须要采用甲基化酶缺失的菌种，因为当将某些胞嘧啶甲基化的DNA转化到常见的E.coli菌株中时，转化效率会明显降低。原因可能来自于E.coli自身的限制系统。本发明利用甲基化酶mcrBC缺失的菌种（TOP10，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）作为质粒扩增的大肠杆菌菌种。

将pAN1和上述构建的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体pFaUSPA共同转化到TOP10菌种中，利用抗氯霉素（CM）和抗氨苄青霉素（AP）双抗生素筛选两个质粒同时转化成功的转化子。碱法小量抽提质粒DNA。

转化方法如下：梭菌C.acetobutylicum824利用60mLCGM培养基培养至OD₆₀₀=0.5，冰置10分钟，7000g4℃离心10分钟；用预冷的电击缓冲液（270mM葡萄糖和686mMNaH₂PO₄，pH=7.4）洗三次；最后一次用1mL预冷的电击缓冲液悬浮沉淀；分装制备的梭菌感受态细胞，每80ul感受态加入1ug的质粒DNA；混匀后转入4mm的电击杯中；电击条件：2.5kV，无穷大电阻，25uF；电击结束后立即加入1mL预冷的2YTG培养基（16g/L蛋白胨，10g/L酵母，4g/LNaCl，和5g/L葡萄糖）；混匀转入1.5mLeppendorf管，放置厌氧环境中37℃培养4h；将转化细胞涂布在含有40ug/mL红霉素的2YTG固体平板上进行转化子筛选。厌氧培养2天后，获得大量转化子，转化效率为5×10⁵/ugDNA。

实施例4转化子丁醇耐性检测

在平板上挑取梭菌C.acetobutylicum824及pFaUSPA转化子，分别接种到10mL液体RCM培养基中，并在75℃水浴中热激10min，然后37℃厌氧培养；当菌体生长至OD₆₀₀=0.8时，将菌体转接至40mL液体CGM培养基中，37℃厌氧培养；当菌体生长至指数生长期OD₆₀₀=1.0±0.05时（大约12h）；培养物被均分成4等份（10mL/份），分别用0、6、12和18g/L丁醇进行胁迫处理；对梭菌在不同丁醇浓度胁迫下的生长状态进行监测。

结果参看图2~图5（824为原始菌株，USP为本发明的FaUSPA转化菌种），从生长曲线可以看出原始菌株--梭菌C.acetobutylicum824和FaUSPA转化菌种在没有丁醇胁迫环境下生长没有显著性差异。原始菌株C.acetobutylicum824能在6g/L和12g/L丁醇中缓慢生长，转化FaUSPA的梭菌在含6g/L和12g/L的丁醇培养基中的生长势较原始菌种好，达到较高的菌种密度，当丁醇浓度提高到18g/L后，原始梭菌不但不能生长，在后期还出现大量菌体死亡现象，转化FaUSPA梭菌虽能生长也受到了很大抑制，但是总体生长情况明显优于原始菌种，菌种浓度高于原始菌种，而且能保持一段较长时间的稳定期，此时菌种浓度虽然不高，但是菌体保持活动状态。这些结果表明FaUSPA转化到梭菌后能够使梭菌耐受更高浓度的丁醇，有效地提高菌种在丁醇胁迫下的生长表现。

实施例5梭菌的中试发酵

为了获得FaUSPA转化菌种更多的生理学特征，我们进行控制pH（pH<5.0）分批发酵实验。分别进行了两次生物学重复试验取平均作为最终结果，小规模发酵实验在BioStatB发酵罐（德国贝朗公司）中进行。首先在平板上挑取梭菌及FaUSPA转化子单克隆分别接种到10mL液体RCM培养基中，FaUSPA转化子的培养基中补加20ug/l红霉素，37℃厌氧培养；当菌体生长至OD₆₀₀=0.8时，将菌体转接至液体CGM培养基中厌氧培养作为种子液；当种子液菌体生长至OD₆₀₀=0.2时，按10%的接种量接种到含有4L液体CGM（80g/L葡萄糖）培养基的发酵罐中进行发酵实验；通过充氮气（流速50mL/min）维持发酵罐中厌氧环境；发酵起始pH大约是6.5，通过补加6mol氨水来控制菌体发酵pH维持在5.0。当葡萄糖量降至初始量一半时，添加葡萄糖至初始浓度。

实施例6发酵后代谢产物的检测

用Agilent6890气相色谱仪测定发酵后代谢产物。

色谱条件：色谱柱：phenomenZB--WAXplus：检测器：FID（220℃）进样量0.2txL；进样口压力16.92psi；柱箱温度100℃；氢气流量30mL/min。正丙醇作为内标进行定量分析。

结果参看图6和图7，FaUSPA转化菌种在发酵过程中丁醇的最高产量达到210mM，而原始菌种丁醇的产量最高为178mM，提高了18%；FaUSPA转化菌种在发酵过程中丙酮的最高产量是132mM，原始菌种丙酮的产量最高为94mM，提高了40.4%；发酵过程中FaUSPA转化菌种乙醇的最高产量是29.2mM，与原始菌种产量相当；FaUSPA转化菌种溶剂总产量达到371mM，相对于原始菌株提高了32.3%。两个菌种的丁酸最高产量也有一定的差异，FaUSPA转化菌种为97mM，高于原始菌株824的75.2mM，丁酸的产出在初始20小时后达到最高。

原始菌株824能够快速利用葡萄糖，30个小时后生长量达到最高（OD₆₀₀达到8.4），然而，随着丁醇的产生，菌种在50小时后，生长密度急剧下降（OD₆₀₀为6.2），丁醇产量慢慢减少，直到达到一定平衡，此时发酵液中的丁醇浓度对菌种的危害较小。FaUSPA转化菌种在发酵过程中，从30-60小时内菌种都处于高密度生长状态，丁醇产量在该段时间内持续增加，直到接近原始菌种最高产量水平，此后，丁醇产量维持一段低增长的时期，从80-110小时丁醇的产量又快速增长，直到最高值，后期由于丁醇产量较高，对菌种有一定的毒害作用，造成菌体生长密度急剧下降。

从发酵结果可以看出，由于FaUSPA转化菌种能够耐受更高浓度的丁醇，菌种能够保持很长时间的高密度生长，从而保证丁醇产量的不断增加。丙酮的产生规律和丁醇相似，FaUSPA转化菌种丙酮产量在110小时内均在稳定的增长。该项发明为培育稳定的丁醇生产工程菌提供了有效方法。

Claims (7)

1.一种来源于极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。

2.包含权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，所述表达载体是以pSOS94载体为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因启动子、权利要求1所述的FaUSPA基因的阅读框表达单元和枯草杆菌pyruvatekinase基因终止子定向连接后替换pSOS94载体中的ctfAB及abc表达单元构建而成的；

其中，所述梭菌CAC3645基因启动子的碱基序列如SEQIDNO2所示。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，从pXYP251载体中扩增氯霉素表达单元，引物为cm1:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’；扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃60s；25循环。

4.根据权利要求2所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，从梭菌C.acetobutylicumATCC824中扩增CAC3645基因启动子，引物为c3645z:5’-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3’，c3645f:5’-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3’。扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

5.根据权利要求2所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，从枯草杆菌Bacillussubtilis168中扩增PYK基因终止子，引物为pyk1:5’-GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’，pyk2:5’-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG-3’；扩增条件为94℃30s，60℃30s，72℃30s；25循环。

6.如权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇耐受性中的应用。

7.如权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇产量中的应用。