CN105524849A - 一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用 - Google Patents

一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用 Download PDF

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CN105524849A CN201610069350.2A CN201610069350A CN105524849A CN 105524849 A CN105524849 A CN 105524849A CN 201610069350 A CN201610069350 A CN 201610069350A CN 105524849 A CN105524849 A CN 105524849A
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Abstract

本发明公开了一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用。本发明提供了重组顶头孢霉菌，为将顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因替换为标记基因，得到的重组菌；本发明的实验证明了，本发明敲除顶头孢霉菌的Acppm1基因得到Acppm1基因敲除重组菌；该重组菌在去掉甲硫氨酸CPC的发酵水平反而较出发菌株提高了3倍。可以看出，敲除Acppm1基因可以使重组菌不仅在发酵过程中省去了甲硫氨酸的添加，而且提高了现有菌株的CPC发酵水平。

Description

一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用
技术领域
本发明属于应用工业微生物领域，尤其涉及一株不依赖于甲硫氨酸的头孢菌素高产基因工程菌株的构建及其应用。
背景技术
头孢菌素C(CephalosporinC，CPC)是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的主要原料。目前，工业上主要利用顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)来发酵获得CPC。头孢菌素C在顶头孢霉菌中的生物合成途径已经基本研究清楚，且顶头孢霉菌的遗传操作系统相对成熟，这为利用基因工程手段定向改造这一重要的工业真菌奠定了良好基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组顶头孢霉菌。
本发明提供的重组顶头孢霉菌，为抑制顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白活性，得到的重组菌；
所述Acppm1蛋白是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
上述重组菌中，所述抑制顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白活性为敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因。
上述重组菌中，所述敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因为将顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因替换为标记基因；
所述Acppm1蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
上述重组菌中，所述标记基因为潮霉素B编码基因；
所述潮霉素B编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列6。
上述重组菌的保藏编号为CGMCCNO.12103。
本发明的另一个目的是提供一种产生头孢菌素的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：在甲硫氨酸缺失体系中发酵上述的重组菌，得到头孢菌素。
本发明第三个目的是提供一种蛋白。
本发明提供的蛋白，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
为了使(1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
编码上述蛋白质的DNA分子具体是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
抑制上述蛋白基因表达的物质，其为用于同源重组的DNA分子或含有该DNA分子的重组载体，包括上述蛋白基因上游同源臂、标记基因和上述蛋白基因下游同源臂；
所述上述蛋白基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述上述蛋白基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4。
所述标记基因为潮霉素编码基因，核苷酸序列为6。
含有用于同源重组的DNA分子的重组载体将Acppm1上游同源重组臂(序列3)插入pAg1-H3载体的ApaI和ApaI酶切位点，且将Acppm1下游同源重组臂(序列4)插入pAg1-H3载体的AscI和PacI酶切位点，且将博莱霉素抗性表达框(ble)(序列5)插入pAg1-H3载体的SwaI和SwaI酶切位点，得到的重组载体为pAg1-Acppm1DM，使Acppm1上游同源重组臂、Acppm1下游同源重组臂和位于二者之间的且为pAg1-H3载体上的潮霉素编码基因(序列6)组成同源重组的DNA片段。
上述蛋白或上述DNA分子或上述的物质在调控顶头孢霉菌在甲硫氨酸缺失条件下产生头孢菌素的量中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述调控为提高。
或抑制上述蛋白在提高顶头孢霉菌在甲硫氨酸缺失条件下产生头孢菌素的量中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的重组菌在生产头孢菌素或提高头孢菌素中的应用也是本发明保护的范围。
所述顶头孢霉菌为顶头孢霉菌CGMCC3.3795。
顶头孢霉菌Acppm1DM已于2016年01月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.12103，分类命名为顶头孢霉Acremoniumchrysogenum。
本发明的实验证明，本发明敲除顶头孢霉菌的Acppm1基因得到Acppm1基因敲除重组菌；该重组菌在去掉甲硫氨酸CPC的发酵水平反而较出发菌株提高了3倍。可以看出，敲除Acppm1基因可以使重组菌不仅在发酵过程中省去了甲硫氨酸的添加，而且提高了现有菌株的CPC发酵水平。
附图说明
图1为基因敲除质粒pAg1-Acppm1DM构建示意图。
图2为顶头孢霉菌Acppm1基因敲除菌株的构建示意图(A)与PCR验证(B)。
图3为甲硫氨酸对顶头孢霉菌野生型菌株WT与定向遗传改造基因工程菌菌株Acppm1DM生长的影响。
图4为发酵条件下顶头孢霉菌野生型菌株WT与基因工程菌株Acppm1DM的CPC产量比较。
图5为在顶头孢霉菌野生型菌株WT与基因工程菌株Acppm1DM发酵过程中CPC生物合成基因pcbC和cefEF的转录水平比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用部分培养基配方见表2：
表2为MM、IM和CM培养基配方
注：葡萄糖、FeSO4、MES和硫酸卡那霉素储存液分别进行过滤除菌，并-20℃储存、备用。
实施例1、Acppm1基因的扩增
通过分析顶头孢霉菌(A.chrysogenum)CGMCCNO.3.3795的全基因组序列，获得一个可能的甲基转移酶编码基因Acppm1。
采用Trizol试剂提取顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795的总RNA，反转录获得cDNA作为模板，以引物Ppm1-F1/Ppm1-R1和高保真酶(KOD-Plus)进行PCR扩增，得到1230bpPCR扩增产物。
Ppm1-F1：CACACCATCGTCGTTCGAGT
Ppm1-R1：CGGAGAATCCAAAGAGCGAC
经过测序，PCR扩增产物所示的基因命名为Acppm1，其核苷酸序列为序列表中序列1，编码的蛋白为序列表中序列2，蛋白命名为Acppm1。
实施例2、顶头孢霉菌Acppm1基因敲除菌株的构建
1、用于Acppm1基因敲除的质粒pAg1-Acppm1DM
1)Acppm1上下游同源重组臂的扩增
以顶头孢霉菌CGMCC3.3795基因组DNA为模板，在高保真酶(KOD-Plus)作用下，分别以引物Acppm1UF/Acppm1UR和Acppm1DF/Acppm1DR扩增Acppm1基因的上游区域和下游区域，分别得到2246bp(记为LB，又名Acppm1上游同源重组臂)的DNA片段(序列3)和2014bp(记为RB，又名Acppm1下游同源重组臂)的DNA片段(序列4)。
引物序列(5′-3′)：
Acppm1U-F：TGGGCCCGGTCGTCGTCGGTGTTGA
Acppm1U-R：ccccgggCGAGCGTGAGGAGTTCTTG
Acppm1D-F：ATTAATTAACCCGTAGCAAATGTATTGTATG
Acppm1D-R：gggcgcgccTGAGGGTTGGTTGTGGTGT
2)、博莱霉素抗性表达框(ble)的获得
以质粒pUC43为模板，用引物ble-F/ble-R扩增得到1.1kb的博莱霉素抗性表达框(ble)(序列5)。
引物序列(5′-3′)：
ble-F：GATTTAAATCGAGGTCGACATGGATACCCT
ble-R：GATTTAAATGTCGGTCAGTCCTGCTCCTC
3)、重组载体pAg1-Acppm1DM
将Acppm1上游同源重组臂(序列3)插入pAg1-H3载体(KhangCH,ParkSY,RhoHS,LeeYH,KangS(2006)Filamentousfungi(MagnaporthegriseaandFusariumoxysporum).MethodsMolBiol344:403–420.Agrobacteriumprotocols,2/e,volume2.)的ApaI和ApaI酶切位点，且将Acppm1下游同源重组臂(序列4)插入pAg1-H3载体的AscI和PacI酶切位点，且将博莱霉素抗性表达框(ble)(序列5)插入pAg1-H3载体的SwaI和SwaI酶切位点，得到的重组载体为pAg1-Acppm1DM，使Acppm1上游同源重组臂、Acppm1下游同源重组臂和位于二者之间的且为pAg1-H3载体上的潮霉素编码基因(序列6)组成同源重组的DNA片段，构建流程如图1所示。
2、重组农杆菌的制备
将1μg的上述1制备的重组载体pAg1-Acppm1DM加入到根瘤农杆菌AgrobacteriumtumefaciensAGL-1(KhangCH,ParkSY,RhoHS,LeeYH,KangS(2006)Filamentousfungi(MagnaporthegriseaandFusariumoxysporum).MethodsMolBiol344:403–420.Agrobacteriumprotocols,2/e,volume2)感受态细胞中并混匀，然后放入液氮中静置5分钟。取出后立即在42℃热激2分钟，然后加入700μLLB液体培养基，在28℃摇床振荡培养2小时。将菌液均匀涂布在含有75μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，28℃倒置培养2天，得到含有pAg1-Acppm1DM的根瘤农杆菌。
3、构建敲除Acppm1基因的顶头孢霉菌基因工程菌株Acppm1DM
将上述2获得的含有重组质粒pAg1-Acppm1DM的根瘤农杆菌单菌落接种于5mLMM液体培养基中，在28℃摇床振荡培养2天，用IM培养基将菌体稀释到OD600＝0.15，28℃振荡培养6小时，至OD600＝0.6，得到侵染用菌液。
取100μL侵染用菌液与等体积顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795孢子悬液混合(悬液浓度＝1x107个孢子/mL)，均匀涂布在CM琼脂平板(铺有玻璃纸)上，在25℃温箱中正置共培养3天。将共培养菌体转接至含有50μg/mL的潮霉素B和200μg/mL噻孢霉素钠的TSA固体培养基上，在28℃温箱倒置培养7天，直至转化子长出。将获得的转化子进行编号，并分别接到含10μg/mL博莱霉素的TSA平板上，筛选对博莱霉素敏感而具有潮霉素B抗性的转化子，即为重组顶头孢霉菌Acppm1DM。
经过测序，重组顶头孢霉菌Acppm1DM为将顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795基因组上的Acppm1基因替换为序列表中序列6位所示的潮霉素编码基因，得到的重组菌。
顶头孢霉菌Acppm1DM已于2016年01月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.12103，分类命名为顶头孢霉Acremoniumchrysogenum。
使用引物Ppm1E-F/Ppm1E-R和Ppm1I-F/Ppm1I-R分别对上述重组顶头孢霉菌Acppm1DM进行PCR扩增。
引物序列(5′-3′)：
Ppm1E-F：CCTCCGTGGATAGTCTCCGT
Ppm1E-R：CAACAAGCGGTCAAGTTGGTTC
Ppm1I-F：AAGTCCCTTCAACAGTCGGC
Ppm1I-R：CCACGGGTCACTCACATCC
结果如图2所示，A为通过同源重组构建Acppm1DM策略示意图(PAGHUD是一个构建的中间质粒)，B为PCR验证Acppm1DM图，WT为顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795，NC为水，△Acppm1为重组顶头孢霉菌Acppm1DM，可以看出，获得顶头孢霉菌Acppm1基因敲除菌株Acppm1DM。
上述TSA培养基组成(1000mL)：Tryptone17g、Soytone3g、Glucose2.5g、NaCl5g、K2HPO3·3H2O2.5g、Agar15g和水，pH7.0。
实施例3、顶头孢霉菌Acppm1基因敲除菌株Acppm1DM的功能验证
1、敲除Acppm1是否影响菌株生长
以LPE平板培养获得顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795和重组顶头孢霉菌Acppm1DM的分生孢子，分别配制成1×107个/mL的孢子悬液。制备化学合成培养基TSA平板，以及平板添加终浓度3.2g/L的DL型甲硫氨酸(DL-Met)的TSA平板。分别取1μL的孢子悬液点接到各种平板上，28℃培养5d，观察菌落生长情况。
结果如图3所示，顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795(WT)和重组顶头孢霉菌Acppm1DM均可以正常生长，说明基因Acppm1的敲除并没有影响菌体的生长。
2、基因工程菌株Acppm1DM的发酵及CPC产量的测定
1)种子液培养
在LPE平板上分别接种顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795和重组顶头孢霉菌Acppm1DM，28℃培养7天，收集真菌分生孢子。分别取3×107个孢子并接入40mlMDFA发酵培养基中(250ml三角瓶)，培养48h，得到顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795种子液和重组顶头孢霉菌Acppm1DM种子液。
2)发酵
将顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795种子液和重组顶头孢霉菌Acppm1DM种子液分别转接于MDFA发酵培养基和不添加甲硫氨酸的MDFA发酵培养基中(250ml三角瓶)，接种量为体积百分含量为10％。在28℃、220rpm连续培养5d，得到MDFA发酵培养基获得的顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵液、MDFA发酵培养基获得的重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵液、不添加甲硫氨酸的MDFA发酵培养基获得的顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵液、不添加甲硫氨酸的MDFA发酵培养基获得的重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵液。
上述发酵液12000g离心10分钟时间，收集上清液，分别得到MDFA发酵培养基获得的顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵上清液、MDFA发酵培养基获得的重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵上清液、不添加甲硫氨酸的MDFA发酵培养基获得的顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵上清液、不添加甲硫氨酸的MDFA发酵培养基获得的重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵上清液；收集沉淀，干燥后称重，即为不同菌体的生物量(干重)。
3)头孢菌素CPC产量的测定
以LB液体培养基预先培养枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.1630(记载在如下文献：LongL,YangJ,AnY,LiuG(2012)DisruptionofaglutathionereductaseencodinggeneinAcremoniumchrysogenumleadstoreductionofitsgrowth,cephalosporinproductionandantioxidativeabilitywhichisrecoveredbyexogenousmethionine.FungalGenetBiol49:114–122)(37℃、220rpm)3h，并用LB将菌液稀释至OD600＝0.2。按1:100比例添加菌液及青霉素酶(Penicillinase)到融化的LB软琼脂中，充分混匀后制备抗生素检测平板。
待琼脂完全凝固后，用打孔器(直径6mm)打孔，并分别取40μl上述2)获得的顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵上清液和重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵上清液加到孔中。37℃培养8小时，测量抑菌圈大小。同时以系列稀释的CPC-Zn(25-150μg/ml，Sigma,C3270,5G)作为标准品，测定计算顶头孢霉菌CGMCCNO.3.3795发酵上清液和重组顶头孢霉菌Acppm1DM发酵上清液的CPC产生水平。
CPC-Zn效价测定的标准曲线方程为：y＝1.0184x+0.5；其中y＝log[CPC-Zn,ug/ml]，x＝抑菌圈直径-孔直径(cm)。
发酵结果如表3和图4。
表3为WT和Acppm1DM在发酵5天的生物量和CPC产量的比较
上述MDFA培养基组成(1000mL)：
蔗糖36g,DL-甲硫氨酸3.2g,L-天门冬酰胺7.5g,Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O0.16g,溶液I20ml,溶液II40ml,溶液III144ml,溶液IV8ml,pH7.4.
溶液I:50％葡萄糖
溶液II:50％甘油
溶液III(1000ml):K2HPO4·3H2O128.61g,,KH2PO4·H2O102g,NaSO4·10H2O11.5g,MgSO4·7H2O2.4g,ZnSO4·7H2O0.2g,MnSO4·4H2O0.2g,CuSO4·5H2O0.05g,CaCl2·2H2O0.5g.
溶液III:2％Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O
上述不添加甲硫氨酸的MDFA培养基为去除MDFA培养基中的甲硫氨酸得到的培养基。
实施例4、基因工程菌株Acppm1DM中CPC生物合成基因在发酵过程中的转录分析
收集实施例3中的2的2)中发酵不同时间点的菌体样品(发酵液沉淀)，并分别以Trizol试剂提取各自的总RNA。取1μg的RNA用PrimeScriptTMRT试剂盒(TaKaRa,Japan)合成cDNA。将检测引物和cDNA样品按适当比例与1×SYBRPremixExTaq(TaKaRa,Japan)混合后，采用热循环仪Mastercycler(Eppendorf，Germany)进行目标基因的qRT-PCR检测。
引物序列：
RTactin-F:AGTCCAAGCGTGGTATCC
RTactin-R:TAGAAGGCAGGGGCGTTG
RTpcbC-F：ACCAGTCCGACGTGCAGAAT
RTpcbC-R：TCGGTGATATGGGCCATGTAG
RTcefEF-F：CCGTAACCACCAAGGGTATCT
RTcefEF-R:CTCCTCGCTTCCGTTCTTGA
反应程序：95℃预变性10mins；95℃变性5s，58℃退火30s，72℃延伸15s(40个热循环)。设置不添加反转录产物的阴性对照。同时，以β-actin基因表达为内参，Pfaffl’s方法计算目标基因的相对表达强度。
结果如图5所示，在发酵前期，基因工程菌株Acppm1DM的CPC合成基因pcbC和cefEF的转录水平均明显高于出发菌株WT，从而进一步验证了基因工程菌株Acppm1DM具有较出发菌株更强的CPC合成能力。

Claims (10)

1.一种重组顶头孢霉菌，为抑制顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白活性，得到的重组菌；
所述Acppm1蛋白是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述抑制顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白活性为敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因。
3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述敲除所述顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因为将顶头孢霉菌基因组上的Acppm1蛋白编码基因替换为标记基因；
所述Acppm1蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述标记基因为潮霉素B编码基因。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的保藏编号为CGMCCNO.12103。
6.一种产生头孢菌素的方法，包括如下步骤：在甲硫氨酸缺失体系中发酵权利要求1-5任一所述的重组菌，得到头孢菌素。
7.一种蛋白，是如下1)或2)：
1)序列表中序列2所示的蛋白质；
2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
8.编码权利要求7所述蛋白质的DNA分子，是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
9.抑制权利要求7所述蛋白基因表达的物质，其为用于同源重组的DNA分子，所述用于同源重组的DNA分子包括权利要求7所述蛋白基因上游同源臂、标记基因和权利要求7所述蛋白基因下游同源臂；
所述权利要求7所述蛋白基因上游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列3；
所述权利要求7所述蛋白基因下游同源臂的核苷酸序列为序列表中序列4。
10.权利要求7所述蛋白或权利要求8所述DNA分子或权利要求9所述的物质在调控顶头孢霉菌在甲硫氨酸缺失条件下产生头孢菌素的量中的应用；
或抑制权利要求7所述蛋白在提高顶头孢霉菌在甲硫氨酸缺失条件下产生头孢菌素的量中的应用；
或权利要求1-5任一所述的重组菌在生产头孢菌素或提高头孢菌素产量中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107201318A (zh) * 2017-07-27 2017-09-26 中国科学院微生物研究所 一种生产头孢菌素c的重组菌及其应用
CN113493745A (zh) * 2020-03-18 2021-10-12 中国科学院微生物研究所 生产头孢菌素c的基因工程菌及其构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4368263A (en) * 1978-04-26 1983-01-11 Glaxo Group Limited Production of cephalosporins
CN101389635B (zh) * 2006-02-23 2013-03-06 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 改进的头孢菌素生产
CN102719473B (zh) * 2012-06-28 2013-12-04 中国科学院微生物研究所 一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4368263A (en) * 1978-04-26 1983-01-11 Glaxo Group Limited Production of cephalosporins
CN101389635B (zh) * 2006-02-23 2013-03-06 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 改进的头孢菌素生产
CN102719473B (zh) * 2012-06-28 2013-12-04 中国科学院微生物研究所 一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIANG-KUN LONG ET AL.: "Disruption of a glutathione reductase encoding gene in Acremonium chrysogenum leads to reduction of its growth, cephalosporin production and antioxidative ability which is recovered by exogenous methionine", 《FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY》 *
TERFEHR,D. ET AL.: "Leucine carboxyl methyltransferase-like protein [Acremonium chrysogenum ATCC 11550]", 《GENBANK: KFH47835.1》 *
刘佳佳，刘钢: "头孢菌素C生物合成调控研究进展", 《微生物学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107201318A (zh) * 2017-07-27 2017-09-26 中国科学院微生物研究所 一种生产头孢菌素c的重组菌及其应用
CN107201318B (zh) * 2017-07-27 2020-04-21 中国科学院微生物研究所 一种生产头孢菌素c的重组菌及其应用
CN113493745A (zh) * 2020-03-18 2021-10-12 中国科学院微生物研究所 生产头孢菌素c的基因工程菌及其构建方法
CN113493745B (zh) * 2020-03-18 2023-09-15 中国科学院微生物研究所 生产头孢菌素c的基因工程菌及其构建方法

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