CN103966110A - 一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，该菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9092。本发明还公开了所述菌株在生产丝状真菌蛋白中的应用。实验证实利用本发明提供的工程菌在表达草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI上，分泌背景低，与用草酸青霉菌株Δ15A表达宿主相比，本发明的草酸青霉M3QΔ15A宿主表达蛋白量高，运用廉价淀粉作为碳源生产蛋白时，生产成本低，周期短，具有良好的工业开发和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种在淀粉上具有低胞外分泌蛋白背景的工程菌株，尤其涉及一种用于提高丝状真菌蛋白表达的宿主菌——草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)，属于基因工程领域。
背景技术
蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。表达蛋白的宿主即表达蛋白的生物体，可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。异源表达丝状真菌的蛋白尤其是糖苷水解酶类最常用的表达系统有原核蛋白表达系统和毕赤酵母蛋白表达系统。
原核蛋白表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠，得到具有生物活性的蛋白的几率较小。酵母蛋白表达系统以甲醇毕赤酵母为代表，具有表达量高，可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，易实现高密度发酵等优点。缺点为部分蛋白产物易降解，表达量不可控，在表达丝状真菌蛋白时过度糖基化现象常见。
目前，丝状真菌表达宿主主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)的突变株Δxyr，因其缺失了一个主要的纤维素酶正调控因子，导致纤维素酶不能被诱导产生并分泌到胞外，从而在葡萄糖上培养时形成了一个低蛋白分泌背景，利于异源表达得到较纯的目标蛋白，但是里氏木霉生长较慢，在PDA培养基上需要约7天才能完成生孢(Uzbas et al.2012.A homologousproduction system for Trichoderma reesei secreted proteins in a cellulase-free background.ApplMicrobiol Biotechnol 93(4):1601-1608)。由于丝状真菌蛋白的研究需要适合的表达宿主，而目前可供选择的表达宿主又很少，仅有的里氏木霉突变株Δxyr生长缓慢，从而限制了很多目标蛋白的表达，进而影响我们对一些蛋白的相关研究以及商业应用，因而构建一个生长快，可利用廉价底物淀粉，且具有低的胞外蛋白分泌背景的表达宿主有着重要的理论和现实意义。
发明内容
本发明要解决的问题是，针对丝状真菌蛋白表达尤其是糖苷水解酶表达中存在的上述问题，提供一种能够以较廉价底物淀粉为碳源，快速生长且产生低胞外蛋白分泌背景的用于提高丝状真菌蛋白表达的宿主菌——草酸青霉菌菌株。
本发明所述的用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于：所述菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，该菌株已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9092。
上述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株在10％的麸皮汁固体培养基上生长约四天完成生孢，孢子颜色比出发株稍浅，在淀粉上生长时胞外分泌少量蛋白。
本发明所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株的构建方法，步骤是：
(1)PGA3持续性激活菌株构建：
以pUC-Mpga3为模板，在突变的pga3编码区设计特异引物MG3-F:和MG3-R:进行PCR扩增出核苷酸序列如SEQ ID No.28所示的突变后的pga3(具体是将氨基酸序列第208位的谷氨酰氨突变成亮氨酸：Q208L；也即碱基序列上的CAG突变成CTA)；然后从GenBank:KC695878所示全基因克隆pga3基因编码区的下游区，以及筛选标记ptrA基因序列(硫胺吡啶抗性基因)，利用Double-joint PCR方法融合成pga3持续性激活型重组片段，然后通过制备原生质体转化的方法，将pga3持续性激活型重组片段转入到草酸青霉菌株CGMCCNo.5302；pga3持续性激活型重组片段两端的同源臂与基因组上的原目的基因pga3相对应的同源序列发生双交换重组，使突变的pga3基因将本源的基因的编码区置换下来，得到pga3持续性激活型重组菌株草酸青霉，命名为草酸青霉M3Q，其基因型为：pga3(p)::pga3Q208L::ptrA；
(2)Amy15A基因的敲除：
设计带有amy15A基因序列(GenBank:EPS34453)同源臂的和筛选标记bar(草胺磷抗性基因)的重组片段；然后通过制备原生质体转化的方法，将该amy15A敲除盒重组片段转入到草酸青霉重组菌株M3Q中，amy15A敲除盒两端的同源臂与基因组上的目的基因amy15A相对应的同源序列发生双交换重组，使抗性基因bar将原有的基因的编码区置换下来，得到在草酸青霉M3Q中敲除amy15A基因同时pga3持续性激活的重组菌株，该菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，其基因型为：Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA。
本发明所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株在生产丝状真菌蛋白中的应用。
其中，上述的应用中优选是将草酸青霉纤维素外切酶CBHI基因在所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A中过表达获得名为草酸青霉M3QΔ15A-Pamy-CBHI菌株，以实现高效表达丝状真菌蛋白。其具体方法是：
(1)以草酸青霉CGMCC No.5302基因组为模板，克隆amy15A(GenBank:EPS34453)编码区上游启动子序列以及cbh1(GenBank:ACV95805)基因的编码区与终止子区，以及筛选标记hph基因序列(潮霉素抗性基因)利用Double-joint PCR方法融合成cbh1过表达盒重组片段，将cbh1过表达盒转入到草酸青霉菌株M3QΔ15A以及只敲除amy15A基因的草酸青霉菌株Δ15A中，获得转化子CBHI的过表达菌株，命名为草酸青霉M3QΔ15A-Pamy-CBHI以及Δ15A-Pamy-CBHI，其基因型为(amy15A(p)::cbh1::hph-Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA)以及(amy15A(p)::cbh1::hph-Δamy15A::bar)。
(2)菌种选择：选工程菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A(CGMCC No.9092)；M3QΔ15A-Pamy-CBHI。
(3)平板培养：将上述工程菌草酸青霉M3QΔ15A和M3QΔ15A-Pamy-CBHI菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0％的琼脂的固体基本培养基平板上，30℃条件下，静置培养48h；
(4)种子培养：将步骤(3)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环分生孢子于100毫升并加有2％(质量百分比)葡萄糖为碳源的液体基本培养基中，30℃条件下，150～250转/分钟，pH5.0～5.8，摇床振荡培养16～24小时，制得种子液；
(5)产酶培养：以质量体积比为10％的接种量，将步骤(4)的种子液接种于100毫升并加有终浓度2％淀粉为碳源的液体产酶培养基中，pH5.0～5.8，30℃条件下，150～250转/分钟振荡培养24～96h，制得发酵培养菌液；
(6)收集发酵培养菌液：发酵结束后，将发酵液在8,000转/分钟的转速下离心10分钟，收集上清液，分别取上清液跑蛋白电泳胶(SDS-PAGE)分析蛋白条带；
上述的应用中，步骤(4)、(5)中所述振荡培养，优选220转/分钟。
上述的应用中，步骤(5)所述的振荡培养，优选培养时间为48小时。
上述的应用中，步骤(5)所述的pH优选为pH5.6。
本发明应用生物工程技术获得并公开了草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A(Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA)工程菌株(CGMCC No.9092)，实验证实利用本发明提供的工程菌在表达草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI上，分泌背景低，与用草酸青霉菌株Δ15A表达宿主相比，M3QΔ15A宿主表达蛋白量高，运用廉价淀粉作为碳源生产蛋白时，生产成本低，本发明提供的工程菌生产目标蛋白周期较短，具有良好的工业开发和应用前景。
附图说明
本发明提供的菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，已于2014年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.9092。
图1使用本发明宿主菌以及在本宿主中表达蛋白CBHI在淀粉上的发酵液上清25μl进行蛋白电泳胶分析(SDS-PAGE)电泳图
其中：(A)草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI在114Δ15A(在草酸青霉114-2中缺失了淀粉酶Amy15A的菌株)上过表达后胞外蛋白电泳条带；(B)草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI在宿主菌(M3QΔ15A)过表达后胞外蛋白电泳条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一般性说明：
微生物来源
实施例中的出发菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)CGMCC No.5302是申请人课题组先前专利申请时保藏的菌株，该菌株已于2011年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。申请人课题组于2013年公布了草酸青霉基因组序列(Liu,G.,et al.2013.Genomic and secretomic analyses reveal unique features of the lignocellulolyticenzyme system of Penicillium decumbens.PLoS One,8(2),e55185.)。
培养基
所述基本培养基(Vogel’s)盐组分(1L)：Na3Citrate·2H20，125g，KH2PO4，250g，NH4NO3，100g，MgSO4·7H20，10g，CaCl2·2H20，5g，微量元素溶液5ml，生物素溶液2.5ml，121℃灭菌30min。
所述微量元素溶液(100ml)：Citric acid·H20，5g,ZnSO4·7H205g，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O1g，CuSO4·5H2O 0.25g，MnSO4·H2O 0.05g，H3BO3 0.05g，Na2MoO4·2H2O 0.05g。
所述生物素溶液：5.0mg溶于50ml无菌水中。
所述转化培养基：基本培养基中加2％的葡萄糖为碳源，1M D-山梨醇为原生质体的渗透压稳定剂。基本培养基中根据转化外源片段遗传筛选标记基因的不同，分别加入终浓度200ug/ml的潮霉素B(EMRESCO，产品编号2012C098，抗性基因hph)、终浓度300ng/ml的硫胺吡啶(Sigma，产品编号P0256，抗性基因ptra)或终浓度1.6mg/ml的草胺磷(PESTANAL，产品编号278-636-5，抗性基因bar)，115℃灭菌30min，pH5.6。
所述分单孢培养基：基本培养基中加2％的葡萄糖为碳源，根据转化外源片段中遗传筛选标记基因的不同，分别加入终浓度200μg/ml的潮霉素B(hph)、终浓度300ng/ml的硫胺吡啶(ptra)或终浓度1.6mg/ml的草胺磷(bar)，115℃灭菌30min，pH5.6。
所述发酵产酶培养基：基本培养基盐组分中，添加2％的淀粉为碳源，pH5.6。
硫胺吡啶溶液配制：用无菌水配制100μg/ml的硫胺吡啶母液。
草胺磷溶液：用无菌水配制10％的草胺磷母液。
洗分生孢子生理盐水：0.9％的NaCl和0.05％的吐温-80水溶液，121℃灭菌30min。
pUC-Mpga3质粒由中国上海生工生物有限公司合成。含有突变的pga3编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。
pME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备(Krappmann,S et al.2005.Deletion andallelic exchange of the Aspergillus fumigatus veA locus via a novel recyclable marker module.Eukaryot Cell,4(7),1298-307.)。
pSilent-1质粒采用如下论文中记载的方法制备(Nakayashiki,H et al.2005.RNA silencingas a tool for exploring gene function in ascomycete fungi.Fungal Genetics and Biology,42(4),275-283.)。
pUC-bar质粒采用如下论文中记载的方法制备(Luo,Z.et al.2013.Ablation of the creAregulator results in amino acid toxicity,temperature sensitivity,pleiotropic effects on cellulardevelopment and loss of virulence in the filamentous fungus Beauveria bassiana.EnvironMicrobiol.)。
草酸青霉染色体DNA大量提取：
(1)将草酸青霉1×106数量的分生孢子接种于100ml的Vogel’s盐基本培养基中，碳源为2％的葡萄糖，200rpm，30℃培养48h。
(2)将菌悬液用真空抽滤泵除去培养基，并用0.09M NaCl溶液洗涤一次，转移抽干的菌丝体至研钵中，加液氮冷冻并将菌丝体研磨至粉末状。
(3)把菌丝体粉末以质量体积比1∶5(菌丝重∶抽提液)加入到抽提液缓冲液(200mMTris-HCl、pH8.5，250mM NaCl，25mM EDTA，2％ SDS)中，混匀，65℃保温30min。
(4)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液至样品中，颠倒混匀，12,000rpm室温离心10min。
(5)缓慢吸取上层水相至另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，12,000rpm，4℃，10min，收集沉淀。
(6)以70％乙醇洗涤沉淀一次，12,000rpm，2min，然后，真空干燥，用适量ddH2O完全溶解沉淀。
(7)加入终浓度0.1μg/μl的RNAase，37℃温育1h。
(8)再加入等体积苯酚/氯仿抽提一次，12,000rpm，20min。
(9)将上清转移至另一离心管中，加0.1倍体积3M NaAc(pH4.8)和0.6倍体积异丙醇，于-20℃放置20min，12,000rpm，4℃，10min，收集沉淀。
(10)加70％乙醇，洗涤一次，待乙醇挥发完全，用适量ddH2O溶解，制得草酸青霉基因组DNA。
实施例1、草酸青霉PGA3基因持续性激活菌株的构建
(1)草酸青霉pga3突变编码区片段的克隆
以pUC-Mpga3为模板，在突变的pga3编码区设计特异引物MG3-F:和MG3-R:进行PCR扩增，获得片段1，引物序列如下：
上游引物
MG3-F:
5’-CTCATCTTCATCGCATCCCAA-3’
下游引物
MG3-R:
5’-AATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCTCGGGAGGAAGACAAGAAGG-3’。
(2)草酸青霉pga3下游同源臂的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计引物MG3-3F和MG3-3R进行PCR扩增，获得片段2，引物序列如下：
上游引物
MG3-3F
5’-CAAGAGCGGCTCATCGTCACCCCATTCCTCTTCCGCACGATGATT-3’
下游引物:MG3-3R:
5’-GAAGACGGGAGGGACCATAGT-3’。
(3)PGA3基因持续性激活表达盒筛选标记ptra序列的扩增
筛选标记表达盒的构建以质粒pME2892为模板，设计引物PtraF1和PtraR1，PCR扩增制得片段3，引物序列如下：
上游引物PtraF1:5’-GGGCAATTGATTACGGGATC-3’
下游引物PtraR1:5’-ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3’。
(4)PGA3基因持续性激活表达盒pga3(p)::pga3Q208L::ptrA的扩增
将上述(1)、(2)和(3)步骤中PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比1∶2∶1混合并作为融合PCR反应的模板(50μl融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng)，获得融合PCR产物4。融合PCR条件为：94℃，90s，12个循环(94℃，30s，58℃，10min，72℃ 3min)，72℃ 10min，然后将上述PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物MG3-NF和MG3-NR进行PCR扩增，获得PGA3基因持续性激活表达盒片段(其核苷酸序列如SEQ IDNo.25所示)，引物序列如下：
上游引物：MG3-NF:5’-TTCCTAACACAGTGAAGGCTGCGGC-3’
下游引物：MG3-NR:5’-CATCAATCACTCCTGTCTATCCCAT-3’
(5)PGA3基因持续性激活表达盒转化草酸青霉菌株
(I)草酸青霉菌株(菌种保藏号：CGMCC No.5302)原生质体的制备
①取新鲜生孢的草酸青霉平板或斜面，用无菌的生理盐水(0.9％ NaCl,0.05％ Tween)，将分生孢子洗下，制备草酸青霉分生孢子悬液。
②在Vogel’s基本培养基(2％葡萄糖为碳源)平板上盖一层玻璃纸，并用玻璃棒铺平，在玻璃纸上加入50-100μl孢子悬液，涂布均匀。做8-10个同样处理，30℃培养约12-15h。
③加0.1g裂解酶(Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum，Sigma产品编号L1412)到20ml溶液1中(1.2M sorbitol，0.1M KH2PO4，pH5.6)，轻轻摇均，并用0.2μm滤器过滤除菌到培养皿或试管中。
④吸取2-3ml裂解酶溶液到无菌培养皿中，在溶液表面覆盖一层长有草酸青霉菌体的玻璃纸，然后再加2-3ml裂解酶液，按此顺序依次叠放6-7层，在两层玻璃纸之间不能留存大的气泡。放置培养皿于30℃培养箱中，为使酶液在培养皿中分布均匀，酶解期间可轻轻晃动培养皿1-2次。
⑤酶解约90min后，用镊子挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，大的菌丝团块可用移液枪(枪尖剪掉)缓慢吹打。
⑥准备带有玻璃棉的漏斗，并滴加数滴溶液1到玻璃棉使其紧贴漏斗内壁。用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到50ml离心管中，并置于冰上，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，过滤液的总体积不超过35ml。利用水平转子2000rpm，4℃离心10min后，小心弃掉上清液，并用4ml冰冷的溶液2(1M sorbitol 18.22g；50mmol/L CaCl2；10mM/L TrisHCl，pH7.5)重悬原生质体，然后离心4℃，2000rpm，离心10min，小心弃掉上清液，并用0.5-1.0ml冰冷的溶液2重悬原生质体，置原生质体悬液于冰上。
⑦原生质体的质量控制(显微镜观察)：a、在载玻片上滴加3μl原生质体悬液，在盖玻片旁滴加3μl无菌水，原生质体细胞内因渗透压高于细胞外水的渗透压吸水胀裂，而分生孢子则不受影响；b、通过血球计数板小室计算原生质体数量(几个小格即可)。原生质体终浓度应大于108，如果原生质体数量太高，可用溶液2稀释到5×108。z＝n×(400/f)×105，n＝原生质体计数数量，f＝计数的小格数量。
(II)草酸青霉原生质体的转化
①在200μl草酸青霉原生质体悬液中加入不超过10μl的质粒PTClrB和50μl PEG溶液(25％PEG6000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisHCl，pH7.5)，混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用DNA片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温(55℃)的上层转化培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层转化培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化培养基的上、下层均加有终浓度300ng/ml的硫胺吡啶作为筛选转化子的抗性试剂。
④在转化培养基上培养3-4天后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度300ng/ml的硫胺吡啶作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得PGA3持续性激活的重组草酸青霉，命名为草酸青霉M3Q(pga3(p)::pga3Q208L::ptrA)。
实施例2、草酸青霉amy15A启动子及编码基因的敲除
(1)草酸青霉⊿amy15A::bar敲除盒上游同源臂片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物amy15A-F和amy15Abar-R进行PCR扩增amy15A启动子上游同源臂片段1，引物序列如下：
上游引物amy15A-F:5’-CAGCATCCAATGGACGTTCA-3’
下游引物
amy15Abar-R:5’-GCCTGTAAGCGAATTAGCAAGCGTCCAAAGTTTCCTTGGCAGCGT-3’。
(2)草酸青霉⊿amy15A::bar敲除盒下游同源臂片段的克隆
以上述一般性说明中的方法提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物amy15Abar-F和amy15A-R进行PCR扩增amy15A编码基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下：
上游引物
amy15Abar-F:5’-GCAAGAGAGGGCAGCAAGCCAGTGCTCTCGGCTCGTCCTTTCG-3’
下游引物amy15A-R:5’-AATCGTGTTCGCACCCTCT-3’。
(3)⊿amy15A::bar敲除盒遗传转化筛选标记表达盒bar序列的扩增
以质粒pUC-bar为模板，设计引物Bar-F和Bar-R进行PCR扩增，获得筛选标记表达盒片段3，引物序列如下：
上游引物Bar-F:5’-GACGCTTGCTAATTCGCTTAC-3’
下游引物Bar-R:5’-GCACTGGCTTGCTGCCCTC-3’。
(4)amy15A敲除盒序列的扩增
将实施例2中上述(1)、(2)和(3)步骤PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比1∶2∶1混合并作为融合PCR反应的模板(50ul融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng)，获得融合PCR产物4，将PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物amy15A-NF和amy15A-NR进行特异性扩增，获得⊿amy15A::bar敲除盒片段(其核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示)，引物序列如下：
上游引物：amy15A-NF:5’-TTGTTGGTGAATGCCCGAGGAGAT-3’
下游引物：amy15A-NR:5’-TCCCGTGAAAAGTCTAACGAAGC-3’。
(5)草酸青霉重组菌株M3Q原生质体的制备
amy15A的敲除以实施例1中构建的重组草酸青霉菌株M3Q为出发菌株，该菌株原生质体的制备方法根据实施例1中草酸青霉出发菌株(CGMCC No.5302)原生质体的制备方法执行。
(6)⊿amy15A::bar敲除盒片段的原生质体转化
①在200μl草酸青霉ClrB过表达菌株M3Q原生质体悬液中加入不超过10μl的⊿amy15A::bar敲除盒和50μl PEG溶液(25％ PEG6000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisHCl，pH7.5)，混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用DNA片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温(55℃)的上层选择培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化的上、下层培养基中均加入终浓度1.6mg/ml的草胺磷作为筛选试剂。
④在转化培养基上培养3-4d后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度1.6mg/ml的草胺磷作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得PGA3过表达同时敲除amy15A基因的重组草酸青霉，命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A(基因型为Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA)。
上述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A已于2014年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.9092。
实施例3、草酸青霉纤维素外切酶CBHI基因在草酸青霉M3QΔ15A的过表达
(1)草酸青霉amy15A(p)::cbh1::hph过表达盒上游启动子片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物P15A-F和P15ACBH-R进行PCR扩增CBHI过表达盒的上游启动子片段1，引物序列如下：
上游引物P15A-F:5’-AGTCCCAGATCGCTTGTGACA-3’
下游引物P15ACBH-R:
5’-GTAGGAGATGGAACCCTTCATCTTTGGTAGACAGTTGAAAGTGTCG-3’。
(2)草酸青霉CBHI编码区及终子区片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，在CBHI编码区及终子区设计特异引物CBHI-F和CBHI-R进行PCR扩增，获得片段1，引物序列如下：
上游引物
CBHI-F:5’-ATGAAGGGTTCCATCTCCTAC-3’
下游引物
CBHI-R:5’-CCTGAGCCCTGATTGACTTTC-3’
(3)草酸青霉CBHI过表达盒遗传转化筛选标记表达盒序列的扩增
以质粒PSlient-1为模板，设计引物Hphs-cbhF和Hphs-R进行PCR扩增，获得筛选标记hph表达盒片段3，引物序列如下：
上游引物
Cbh-hphF:5’-GAAAGTCAATCAGGGCTCAGGCGACCTTAACTGATATTGAA-3’
下游引物Hphs-R:5’-CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3’。
(4)草酸青霉CBHI过表达盒序列的扩增
将实施例3中上述(1)、(2)和(3)步骤PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比1∶2∶1混合并作为融合PCR反应的模板(50ul融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng)，获得融合PCR产物4，将PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物bgl2-F2和bgl2-R2进行特异性扩增，获得amy15A(p)::cbh1::hph过表达盒片段(其核苷酸序列如SEQ IDNo.27所示)，引物序列如下：
上游引物：P15A-NF:5’-CTATCACAGTCTTCCCACATCCA-3’
下游引物：Hphs-NR:5’-CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3’。
(5)草酸青霉重组菌株M3QΔ15A原生质体的制备
bgl2的敲除以实施例2中构建的重组草酸青霉菌株M3QΔ15A为出发菌株，该菌株原生质体的制备方法根据实施例1中草酸青霉出发菌株(CGMCC No.5302)原生质体的制备方法执行。
(6)amy15A(p)::cbh1::hph过表达盒片段的原生质体转化
①在200μl重组草酸青霉菌株M3QΔ15A原生质体悬液中加入不超过10μl的amy15A(p)::cbh1::hph敲除盒片段和50μl PEG溶液(25％ PEG6000，50mmol/L CaCl2，10mmol/L TrisHCl，pH7.5)，混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用amy15A(p)::cbh1::hph敲除盒片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温(55℃)的上层转化培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层转化培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化培养基的上、下层均加有终浓度200ug/ml的潮霉素B作为筛选转化子的抗性试剂。
④在转化培养基上培养3-4天后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度200ug/ml的潮霉素B作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得CBHI过表达菌株为一例提高丝状真菌蛋白表达量且低背景的草酸青霉菌株，命名为草酸青霉M3QΔ15A-Pamy-CBHI，其基因型为(amy15A(p)::cbh1::hph-Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA)。
实施例4 草酸青霉CBHI在M3QΔ15A表达的SDS-PAGE验证
(1)草酸青霉纤维素外切酶CBHI表达的验证
将草酸青霉出发菌株M3QΔ15A(CGMCC No.9092)以及草酸青霉CBH过表达菌株M3QΔ15A-Pamy-CBHI，接种于基本培养基(50ml)，碳源为2％葡萄糖，200rpm，30℃培养24h，分别制备出发菌株M3QΔ15A(CGMCC No.9092)以及草酸青霉CBH过表达菌株M3QΔ15A-Pamy-CBHI种子培养液，然后将种子液中菌丝真空抽滤，各称取0.5g的湿菌丝体转接到装有100ml2％淀粉为碳源培养基的三角瓶中，200rpm，30℃培养72h,分别取菌体培养液样品，然后将所获取的每个时间点的样品10000rpm离心5min，吸取样品上清液25ul，然后在制备好的12.5％蛋白分离胶上上样。首先以90V电压跑30min,然后140V电压直至上样buffer跑出分离胶底部。结果见图1。
本发明应用生物工程技术获得并公开了草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，其基因型为：Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA，该工程菌株保藏编号为CGMCC No.9092，上述实验证实其在产酶培养基条件下蛋白表达量明显提高，并且背景较低，且生产周期较短(缩短48～96h)，可以应用于丝状真菌蛋白的大规模生产，具有良好的工业开发和应用前景。
Claims (4)
1.一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于：所述菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，该菌株已于2014年4月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9092。
2.权利要求1所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株的构建方法，步骤是：
(1)PGA3持续性激活菌株构建：
以草酸青霉CGMCC No.5302基因组为模板，从质粒上克隆合成的核苷酸序列如SEQID No.28所示的突变后pga3；然后从GenBank:KC695878所示全基因克隆pga3基因编码区的下游区，以及筛选标记ptrA基因序列，利用Double-joint PCR方法融合成pga3持续性激活型重组片段，然后通过制备原生质体转化的方法，将pga3持续性激活型重组片段转入到草酸青霉菌株CGMCC No.5302；pga3持续性激活型重组片段两端的同源臂与基因组上的目的基因原来pga3相对应的同源序列发生双交换重组，使突变的pga3基因将本源的基因的编码区置换下来，得到pga3持续性激活型重组菌株草酸青霉，命名为草酸青霉M3Q，其基因型为：pga3(p)::pga3Q208L::ptrA；
(2)Amy15A基因的敲除：
设计带有amy15A基因序列同源臂的和筛选标记bar的重组片段，然后通过制备原生质体转化的方法，将amy15A敲除盒重组片段转入到草酸青霉重组菌株M3Q中，amy15A敲除盒两端的同源臂与基因组上的目的基因amy15A相对应的同源序列发生双交换重组，使抗性基因bar将原有的基因的编码区置换下来，得到在草酸青霉M3Q中敲除amy15A基因同时pga3持续性激活的重组菌株，该菌株命名为草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A，其基因型为：Δamy15A::bar-pga3(p)::pga3Q208L::ptrA。
3.权利要求1所述用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌菌株在生产丝状真菌蛋白中的应用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：将草酸青霉纤维素外切酶CBHI基因在所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A中过表达获得名为草酸青霉M3QΔ15A-Pamy-CBHI菌株，以实现高效表达丝状真菌蛋白。
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