CN102978181A - 一种脂肪酶及其重组表达工程菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组表达脂肪酶的工程菌株。本发明将从黑曲霉中克隆得到的脂肪酶基因转入里氏木霉中，构建了里氏木霉工程菌，保藏号为CCTCC NO:M2012483。经重组表达的脂肪酶最适作用pH为5.0，最适作用温度30℃，且对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性增强。本发明的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质的利用率，从而能够显著减少饲料中油脂的添加，从而降低饲料成本。

Description

一种脂肪酶及其重组表达工程菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶基因及其重组表达工程菌株。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid 等, 1998）。

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。脂肪酶的制备方法有提取法和微生物发酵法（王海燕等，2007，饲料工业）。但是提取法工艺复杂，成本高、效率低。因此，绝大多数脂肪酶均是通过微生物发酵而制备的。现有工业化生产脂肪酶的方法主要有二种：一是诱变选育高产的脂肪酶的自然菌株，如解脂亚罗酵母（李珍等，2011，菌物学报；徐宇丽等，2011，微生物学报）；二是构建高产的工程菌（王小峰等，2011，生物工程杂志）。

构建基因工程菌是获得高产、高酶活菌株的有效方法之一。目前国内市场上脂肪酶产品多由毕赤酵母异源表达而生产，其优点是发酵工艺成熟；缺点是甲醇诱导存在的安全隐患，还有毕赤酵母表达水平不高，表达水平一般低于7g/l。

木霉最常用的工业酶生产菌株之一，其中市场上的纤维素酶绝大多数是由木霉生产的。木霉属于真核生物，具有翻译后修饰系统，如内含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表达真核来源的DNA序列、无需删除内含子序列，简化了分子操作。木霉规模化发酵系统优点是：（1）分泌表达，便于发酵后处理；（2）深层液体发酵，便于规模化工业发酵；（3）高密度发酵，生产成本低，其最高表达水平可达40g/l。

因此，通过构建木霉工程菌，高效重组表达脂肪酶，有望大大降低发酵成本，从而降低脂肪酶对使用成本，促进脂肪酶在饲料添加剂领域的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶及其重组表达工程菌株，即一种从黑曲霉中筛选的新的脂肪酶，以及用于重组表达该脂肪酶的里氏木霉工程菌，经里氏木霉表达后，该酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性增强，可将其广泛用作饲料添加剂，提高饲料利用率。

本发明首先提供一种新型的脂肪酶，其特征在于：

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。

用于编码上述脂肪酶的基因，其中一种核苷酸序列是SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种里氏木霉工程菌，用于表达上述的脂肪酶。

所述里氏木霉工程菌ZQ-1（Trichoderma reesei ZQ-1），已于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号是：CCTCC NO:M 2012483。

本发明的脂肪酶作为饲料添加剂的应用。

本发明的里氏木霉工程菌能高效表达黑曲霉来源的脂肪酶，20L罐发酵酶活高达20000U/ml，表达水平超过10g/L。经里氏木霉宿主细胞的修饰，本发明的里氏木霉工程菌重组表达的脂肪酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性很强，适合作为饲料添加剂使用。

附图说明

图1 ：本发明的里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图。

图2 ：本发明重组表达脂肪酶的耐受性实验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 黑曲霉脂肪酶基因表达载体的构建

1.1 提取黑曲霉总基因组DNA

将黑曲霉（Aspergillus niger）接种摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM TrisHCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠、在珠打仪剧烈振荡2 min左右；水浴锅65℃水浴20 min后加入200μl 10M NH4AC冰浴10 min；13000rpm离心10 min取上清，然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30 min；13000 rpm离心10 min弃上清，用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解于-20℃保存。

1.2 基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用引物anl-F和anl-R（AAAGGTACCATGTTCTCTGGACGGTTTG和AGCTCTAGACTATAGCAGA CACTCTGAAATTGC）进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S，59℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

1.3测序分析

将1.2中回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-ANL质粒并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果，扩增产物的基因序列为SEQ ID NO: 2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。

1.4构建载体

提取质粒pMD-ANL，用NcoI和KpnI进行双酶切，回收ANL片段；取2μl回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-ANL，测序结果证实插入的片段能够编码序列为SEQ ID NO: 1的脂肪酶

实施例2 转化与筛选

1.1原生质体制备

接种里氏木霉（Trichoderma reesei）菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3 cm的菌落置于约60 mlYEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃、200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂）悬浮，3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，10⁸个/ml）。

1.2转化与验证

取2μg pKDN-ANL DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO4, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。

按照实施例1所述方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物Hcds531-s和Hcds531-a（Hcds531-s：ACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT；和Hcds531-a：AGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATT）扩增潮霉素基因验证转化子。利用实施例1所述引物anl-F和anl-R进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；59℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，即经过上述两个PCR反应选育和验证阳性转化子。将其中一株阳性转化子命名为Trichoderma reesei ZQ-1，并于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号CCTCC NO:M 2012483。

实施例3 发酵验证和酶学性质测定

将阳性转化子Trichoderma reesei ZQ-1和出发菌株（阴性对照）分别接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000）培养，28℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，其中箭头所指处为重组表达的脂肪酶，说明本发明构建的里氏木霉工程菌能重组表达黑曲霉的脂肪酶。

最适作用pH分析：用pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液进行稀释测结果表明构建的工程菌重组表达的脂肪酶的最适作用pH为5.0。

最适作用温度分析：分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，pH7.5条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明，本发明构建的工程菌重组表达的脂肪酶的最适作用温度为30℃。

实施例4 重组表达脂肪酶的耐受性实验

（1）胃液、胃蛋白酶耐受性实验

用pH5.5的缓冲液稀释T. reesei ZQ-1的发酵上清液，调节pH至2.0；取上述上清液各8 ml，分别加入到2ml胃液和2ml胃蛋白酶（5%）中；37℃处理2 h，测定溶液中残余的脂肪酶酶活，以未处理的溶液中脂肪酶酶活为100%。结果显示：经上述胃液处理后，脂肪酶的残余酶活为60.4%；经上述胃蛋白酶处理后，脂肪酶的残余酶活为66.8%。

（2）pH6.8、胰蛋白酶耐受性实验

用pH5.5的缓冲液稀释T. reesei ZQ-1的发酵上清液，调节pH6.8；分别用pH6.8的缓冲液和胰蛋白酶各稀释5倍，37℃处理6 h，测定溶液中残余的脂肪酶酶活，以未处理的溶液中脂肪酶酶活为100%。结果显示：经pH6.8的缓冲液处理后，残余酶活约为62.6%；胰蛋白酶处理后的残余酶活为9.8%。

上述结果表明，本发明构建的里氏木霉工程菌重组表达的脂肪酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液具有很强的耐受性，有望开发成饲料添加剂。

实施例5 脂肪酶产品的制备

将上述工程菌T. reesei ZQ-1接种于摇瓶种子培养基（葡萄糖10-30g/L，土豆100-200g/L），30℃，200rpm摇床培养48h之后，将发酵液转入1吨种子罐（培养基为：葡萄糖20-50g/L，硫酸铵10-30g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾15-30g/L），温度控制在25±1℃，pH值5.0±0.2，在种子罐培养48h之后，将种子液转入30吨发酵罐（培养基为：葡萄糖30-50g/L，乳糖2.0-10 g/L，玉米浆20-50g/L，硫酸铵10-30g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾15-30g/L），温度控制在25±1℃，pH值控制在5.0±0.2，在发酵罐培养10h到15h之后，开始补加乳糖诱导菌体产酶，发酵时间约为200h到230h。发酵结束之后，将发酵液放入40吨储罐，按照发酵液体积加入0.5-1.0%的硅藻土和0.1-0.5%的珍珠岩。搅拌混匀之后，静置8h后，采用板框过滤。采用以下步骤分别制备液体酶制剂或固体酶制剂：（1）通过过滤获得澄清的滤液进行超滤，温度控制在15℃；最后在超滤浓缩液加入添加保护剂（16%山梨醇，3%氯化钠），防腐剂（山梨酸钾0.12%，苯甲酸钠0.17%）获得液体酶制剂成品；（2）将超滤浓缩后的滤液和载体（淀粉）混合均匀，采用喷雾干燥方法将其喷干即得到固体酶制剂产品。

实施例6 重组表达的脂肪酶对肉鸡生产性能的影响实验

1. 材料与方法

1.1 试验动物与分组

六和种鸡场提供的罗斯肉雏鸡300只，随机分为3个处理，每个处理10个重复，每个重复10只肉鸡。具体分组设计见表1。

表1  试验分组设计

组别	处理说明	样品添加
			正对照组	正常商品料	0
负对照组	-75 Kcal/kg（鸡鸭油）	0
			试验组	-75 Kcal/kg（鸡鸭油）	250g/t 脂肪酶

1.2 试验样品

本试验选用本发明实施实例5制备得到的脂肪酶产品。

1.3 测定指标

分别在肉鸡0d、7d、21d、35日龄时，对各栏试验鸡统一进行称重并记录采食量，计算日增重（ADG）、日采食量（ADFI）、料肉比（FCR）和体重（BW）等指标。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用SPSS13.0统计软件中ANOVA方法进行分析，所有指标以每个重复为试验单位，用Duncan’s多重比较进行检验。结果用均值及平均标准差表示，P < 0.05为差异显著。

2．结果与分析

本发明工程菌重组表达的脂肪酶对0-35日龄肉鸡生产性能影响

表2 重组表达脂肪酶对0-35日龄肉鸡生产性能的影响

组别	初重(g)	末重(g)	日增重(g)	日采食量(g)	料肉比
						正对照组	43.1±0.64	2164.6±141.8	63.6±2.5	103.6±8.1	1.69±0.05
负对照组	43.0±0.38	2144.1±122.4	63.1±2.0	103.9±4.0	1.71±0.04
						试验组	43.3±0.59	2208.1±152.3	63.9±4.0	105.1±5.6	1.69±0.06

注：表中数字右上角字母有相同字母或没有标注者者表示差异不显著（P＞0.05），字母不同表示差异显著（P＜0.05）

由表2肉鸡0-35d试验结果可知，全期来看试验组肉鸡日增重在正对照组基础上提高了2.72%，在负对照组基础上提高了4.30%，料肉比在负对照组基础上降低了0.02%。试验组肉鸡日增重、采食量均高于正对照组和负对照组。在此阶段负对照组即降低油脂组，在采食量、日增重和料肉比等方面均不及其它组。总体来看试验组优势较为明显。试验全期增重料肉比均较好，优于其它各组。

实验结果表明，本发明的脂肪酶能显著提高饲料中油脂类物质的利用率。日粮中降低油脂的添加量后添加脂肪酶，肉仔鸡的生产性能优于负对照，且与正对照几乎一致，因此，使用本发明的脂肪酶能够显著减少油脂的添加，从而降低饲料成本。

Claims (5)

1.一种脂肪酶，其特征在于：所述的脂肪酶

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。

2.用于编码权利要求1所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

3.一种里氏木霉工程菌，所述的工程菌用于表达权利要求1所述的脂肪酶。

4.权利要求3所述的里氏木霉工程菌，其保藏编号为CCTCC NO:M 2012483。

5.权利要求1所述的脂肪酶作为饲料添加剂的应用。

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