CN112779166B

CN112779166B - 一种高产脂肪酶的里氏木霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN112779166B
Application number: CN201911084730.3A
Authority: CN
Inventors: 李�瑞; 宋清清; 徐晓东; 张金祥; 黄亦钧
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2039-11-08
Also published as: CN112779166A

Abstract

本发明属于微生物工程改造技术领域，提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉菌株及其应用。所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019894，能高效表达脂肪酶，有利于促进脂肪酶的广泛应用。

Description

一种高产脂肪酶的里氏木霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物工程改造技术领域，具体涉及一种高产脂肪酶的里氏木霉菌株及其应用。

背景技术

脂肪酶（Lipase）全称甘油三酰酯水解酶（Triacylglycerol acylhydrolase），是最早研究的酶类之一。此类酶主要作用于甘油酰酯键，该酶可以催化水解底物分解为脂肪酸和甘油酯（三酰甘油酯、二酰甘油酯、单酰甘油酯）。同时，脂肪酶还具有催化酯水解、酯合成、转酯化、氨解、醇解、药物合成等作用。

脂肪酶的主要来源有植物、动物和微生物。微生物种类多、繁殖快、易变异，其分泌的脂肪酶具有底物广谱性大，可适应不同的pH值与温度范围的特点，有些极端环境获取的菌株其酶学特性更加突出。因此，微生物脂肪酶适合于工业酶的制备生产和获得高纯度样品。

产脂肪酶的微生物分布广泛，已达60余个属，其中酵母菌有10个属、其它真菌有23个属、放线菌有4个属、细菌有28个属。其中，产脂肪酶真菌由于其菌丝体易从培养基液中分离且来源广泛，被认为是最具生产潜力的微生物脂肪酶菌种。高产脂肪酶的真菌菌株多来源于根酶（Rhizopus）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）、毛霉（Mucor）、地霉（Geotrichum）。

天然微生物筛选的经典方法已经建立得十分完备，这套方法起源于1945年发现抗生素后的十年中。它已用于检测成千上万的土壤、植物材料等样品，以及随机分离和筛选菌群。对于产脂肪酶菌株的分离方法一般为：从土壤或者水域中收集样品，之后利用三角烧瓶富集培养，对富集培养物进行选择性平板分离，其分离结果通过观察透明圈或变色圈大小判断，最后进行摇瓶复筛并测定酶活大小。其中主要通过脂肪底物中释放的脂肪酸造成pH的降低，从而改变指示剂颜色，借此对其活性进行监测。利用这套筛选方法，霉菌、细菌、酵母各种不同生长性状的产脂肪酶微生物被人们筛选获得。目前应用定向进化技术，可以根据不同的研究目的，更为有效的直接获取产脂肪酶菌种或脂肪酶

对微生物脂肪酶的研究，不仅可以为物种多样性补充基础研究内容，还可以利用微生物脂肪酶的特殊性质，应用于生物炼制和工业化生产等重要方面。由于其特殊的界面反应特性，已在食品与营养品加工工业、油脂化工工业、日用化工产业、医药与农业、生物活性剂合成等许多领域得到广泛应用。

与国外相比，我国对脂肪酶的研究和开发较晚，而且工业化的微生物脂肪酶制剂种类有限，因此，筛选具有新特性的活力高、产量高及成本低的脂肪酶菌种是十分必要的。本发明提供了一株高产的脂肪酶生产菌株，对推动脂肪酶工业化生产起积极作用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产脂肪酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株。申请人首先构建得到重组表达脂肪酶的里氏木霉工程菌株，然后通过紫外诱变的方法筛选获得一株脂肪酶产量得到显著提高的突变菌株，可广泛应用于脂肪酶的生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，所述菌株携带有表达脂肪酶基因的重组载体。

本发明一方面提供了一种突变菌株里氏木霉UE-M8（Trichoderma reesei UE-M8），已于2019年11月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2019894。

本发明还提供了所述里氏木霉突变菌株在生产脂肪酶中的应用。

本发明所述突变菌株里氏木霉UE-M8摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活达2767U/ml，比出发菌提高了62.7%；20L罐发酵上清液中脂肪酶酶活高达33564U/ml，比出发菌株提高了57.3%,取得了意料不到的技术效果。所述突变菌重组表达的脂肪酶最适作用pH为6.5，最适作用温度为50℃。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于脂肪酶的生产，从而有利于降低脂肪酶的生产成本，促进其在食品和饲料加工等领域中的推广与应用。

附图说明

图1为pH-相对酶活曲线；

图2为温度-相对酶活曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1 脂肪酶重组表达菌株的构建

申请人根据里氏木霉密码子偏好性对来源于米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）的脂肪酶基因进行密码子优化，获得优化后的核苷酸序列。

以合成的核苷酸序列为模板，设计引物，扩增出脂肪酶基因片段。反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸70s，30个循环后，72℃保温10min。

将上述获得的脂肪酶基因片段与表达载体pVL002分别用限制性内切酶XbaI和MluI进行双酶切，并胶回收目的片段，将胶回收得到的脂肪酶基因双酶切片段和表达载体pVL002双酶切片段用T4 DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布于LB+Amp平板，37℃培养过夜后长出单菌落，菌落PCR验证连接正确的转化子提取质粒送测序，测序正确后，即得到重组表达质粒。

原生质体制备：取宿主菌里氏木霉（Trichoderma reesei）UE菌株孢子悬液，接种于PDA+U (马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；Uridine 1％；琼脂粉1.5％)平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约2cm×2cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；将预冷的20 mL 1.2 M山梨醇（1.2 M山梨醇，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl₂）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 mL 1.2 M山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 M山梨醇悬浮分装（200 μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL）。

表达载体转化：以下操作均在冰上进行，取10 μg重组质粒加入到含有200 μL原生质体溶液的7 mL无菌离心管中，然后加入50 μL 25% PEG（25% PEG，50 mM Tris-Cl，50 mMCaCl₂），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 mL 25% PEG，混匀后室温放置5 min；加入4mL 1.2 M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中（0.1% MgSO₄, 1%KH₂PO₄, 0.6% (NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上（2%葡萄糖，0.5% (NH₄)₂SO₄，1.5% KH₂PO₄，0.06% MgSO₄，0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），30℃培养5-7 d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为即为阳性转化子。

发酵验证和酶活测定：将上述复筛得到的阳性转化子分别接种至PDA（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1 .5％）固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44% (NH₄)₂SO₄，0.09% MgSO₄，2% KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250mL三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行脂肪酶酶活力测试。

（1）酶活测定方法

酶活定义：在40℃、pH值为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。

底物溶液：秤取聚乙烯醇（PVA：聚合度1750±50）40g，加水800ml，浸泡4-6h，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，搅拌冷却后定容至1000ml，用干净的6-8层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理10min（分4次处理，间隔5min，每次处理2-3min），即得乳白色PVA乳化液。现用现配。

测定方法：取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4ml和pH 7.5磷酸缓冲液5ml，再于空白瓶（A）中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中预热5min；向空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入待测酶液1ml，立即混匀计时，准确反应15min后，使用分样移液器于样品瓶（B）中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出；将上述反应液倒入50ml烧杯中，向三角瓶中加入5ml纯水，摇匀后倒入50ml烧杯中，加入2滴酚酞指示剂；使用校正过碱性条件的pH计，在搅拌的条件下向烧杯中加入0.05mol/L的氢氧化钠溶液，滴定至pH值为9.92；滴定至pH值在20s不再变化为终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

酶活力计算公式：X=

X——碱性脂肪酶活力，u/ml；

V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，ml；

C——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；

50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1ml相当于脂肪酸50μmol；

n——酶液稀释倍数；

0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

15——时间换算系数。

结果显示，本发明构建得到的里氏木霉工程菌摇瓶发酵上清液的脂肪酶酶活最高能达到1701U/ml。申请人将酶活最高的这株里氏木霉工程菌命名为里氏木霉UE-M（Trichoderma reesei UE-M）。

实施例2诱变筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉UE-M为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其脂肪酶的产量。

1、确定致死率：

将里氏木霉UE-M接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液（浓度为1×10⁷个/mL），加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出40-60个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共123个，分别到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉工程菌UE-M作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的123株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中脂肪酶的酶活高于出发菌；其中，109株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余14株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了5-7%。

申请人按照上述方法继续进行了11轮诱变筛选，最终获得1株脂肪酶产量显著高于出发菌的突变菌株，命名为里氏木霉UE-M8。里氏木霉UE-M8摇瓶发酵上清液中脂肪酶的酶活最高，达2767U/ml，比出发菌提高了62.7%。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉UE-M和上述突变菌株里氏木霉UE-M8分别在20L罐中进行发酵。发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行脂肪酶活力检测。

结果显示，出发菌株里氏木霉UE-M8发酵上清液中脂肪酶酶活为21337U/ml，而突变菌株里氏木霉UE-M8的发酵上清液中脂肪酶酶活高达33564 U/ml，比出发菌株提高了57.3％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年11月4日将该突变菌株里氏木霉UE-M8（Trichoderma reesei UE-M8）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019894。

实施例3 酶学性质分析

1、最适作用pH

分别用pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0的磷酸盐缓冲液稀释突变菌里氏木霉UE-M8的发酵上清液，在40℃条件下测定发酵上清液中脂肪酶的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，里氏木霉UE-M8重组表达的脂肪酶最适作用pH为6.5。

2、最适作用温度

将突变菌里氏木霉UE-M8的发酵上清液用上述pH7.0的缓冲液进行稀释，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃ 条件下测定发酵上清液中脂肪酶的酶活，以最高酶活为100%，计算不同温度条件下脂肪酶的相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，里氏木霉UE- M8重组表达的脂肪酶最适作用温度为50℃。

Claims

1.一种里氏木霉突变菌，其特征在于，所述突变菌的保藏编号为CCTCC NO: M2019894。

2.权利要求1所述突变菌在生产脂肪酶中的应用。