CN110484455B

CN110484455B - 一种稳定高产植酸酶的木霉突变菌株

Info

Publication number: CN110484455B
Application number: CN201910494545.5A
Authority: CN
Inventors: 李�瑞; 刘士成; 宋清清; 黄亦钧
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Weilan Biological Group Co Ltd; Weifang Kdn Biotech Co ltd
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2039-06-10
Also published as: CN110484455A

Abstract

本发明提供了一种高产植酸酶的木霉突变菌株及其应用。所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019405，其摇瓶发酵上清液中植酸酶的酶活达3580u/mL，比出发菌提高了56.0%；20L罐发酵上清液中植酸酶酶活高达40345u/mL，比出发菌株提高了52.1％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株的应用可进一步降低植酸酶的生产成本，有利于加快植酸酶在饲料领域中的广泛应用。

Description

一种稳定高产植酸酶的木霉突变菌株

技术领域

本发明属于微生物工程改造技术领域，具体涉及一种稳定高产植酸酶的木霉突变菌株及其应用。

背景技术

植酸（phytic acid），又称为肌醇六磷酸（myo-inositol（1，2，3，4，5，6）hexakisphosphate），为植物中储存磷的主要形式，在种子中含量尤其丰富，而种子如谷类及豆类是动物饲料的主要原料。虽然种子中的植酸可成为饲养动物所需磷的重要来源，但只有反刍动物才能代谢植酸以利用其中的磷；对于非反刍动物，不能被消化代谢的植酸反而被视为抗营养物质。而植酸被视为抗营养物质的原因是植酸带有丰富的负电，易与带有正电的离子，如钙离子、镁离子、锌离子、锰离子、铜离子、铁离子螯合，再进一步与蛋白质及淀粉形成复合物，此复合物不仅阻碍金属离子的消化吸收，也影响消化酶作用而阻碍营养物质吸收。

植酸酶（Phytase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸盐降解为无机磷和肌醇，同时释放出植酸盐结合的其他营养物质。目前，利用植酸酶饲喂单胃动物的效果已经得到了验证。饲料中添加植酸酶后，可以减少5-70%无机磷的用量，粪便中磷的排放量减少了30-40%以上，不仅大大降低了植酸盐的抗营养作用，增加生产效益，还能有效的降低环境污染。植酸酶作为饲料添加剂已经被广泛应用于畜禽养殖领域。

由于自然菌株中植酸酶的产量较低，加之自然菌株产的植酸酶在热稳定性、蛋白酶抗性等酶学性质方面不能完全满足饲料加工和植酸酶应用的要求。因此，本领域技术人员普遍采用基因工程技术手段对野生型植酸酶进行改造以获得性能优良的突变体蛋白，构建毕赤酵母，黑曲霉，米曲霉等基因工程菌株用于植酸酶的发酵生产，能大幅度提高植酸酶的酶活水平，有利于促进植酸酶的广泛应用。目前，提高植酸酶生产菌株的单位表达量，进一步降低其生产成本仍然是最重要的植酸酶产业目标之一。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株稳定高产植酸酶的里氏木霉菌株及其应用。所述菌株能大幅度提高植酸酶的表达量，有利于植酸酶的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一种里氏木霉工程菌，其携带有表达植酸酶基因的重组载体。

所述的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码基因的序列为SEQ ID NO:2。

本发明还提供了一种突变菌株里氏木霉UEphy-6（Trichoderma reesei UEphy-6），已于2019年5月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019405。

本发明还提供了所述突变菌株在植酸酶生产中的应用。

申请人通过多轮诱变筛选获得的突变菌株里氏木霉UEphy-6，其植酸酶产量得到显著提升。里氏木霉UEphy-6摇瓶发酵上清液中植酸酶的酶活达3580u/ml，比出发菌提高了56.0%；20L罐发酵上清液中植酸酶酶活高达40345u/ml，比出发菌株提高了52.1％，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株的应用可进一步降低植酸酶的生产成本，有利于加快植酸酶在饲料领域中的广泛应用。

附图说明

图1为20L发酵罐发酵曲线；

图2为SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为里氏木霉UEphy-P2、里氏木霉UEphy-6发酵上清液，箭头所指处即为植酸酶Phy。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。

下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1：植酸酶基因的克隆及表达载体的构建

根据木霉（Trichoderma sp.）的密码子偏好性，将大肠杆菌（Escherichia coli）来源的植酸酶Phy基因的氨基酸序列SED ID NO：1进行了密码子优化，由通用生物系统（安徽）有限公司合成其编码核苷酸序列SED ID NO：2。

根据合成的核苷酸序列设计上下游引物Phy-F和Phy-R，序列如下：

Phy-F：GGCTCTAGACAGTCGGAGCCCGAGCTGAAGC；

Phy-R：ATAACGCGTTTAGAGCGAGCAGGCGGGAATT。

以合成的核苷酸序列为模板，利用上下游引物Phy-F和Phy-R进行扩增，利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将上述PCR扩增产物用限制性内切酶XbaI和MluI进行双酶切，同时用XbaI和MluI双酶切表达载体pC2G和pC1G，将PCR扩增产物双酶切片段与表达载体pC2G双酶切产物连接过夜，导入大肠杆菌DH5a，经测序验证后，获得重组表达载体pC2G-Phy，将PCR扩增产物双酶切片段与表达载体pC1G双酶切产物连接过夜，导入大肠杆菌DH5a，经测序验证后，获得重组表达载体pC1G-Phy。

实施例2：一次转化植酸酶基因的里氏木霉工程菌UEphy的构建

1、原生质体制备

取里氏木霉（Trichoderma reesei）UE菌株孢子悬液，接种于PDA平板上，30℃培养6 天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120 mL YEG+U（0.5%酵母粉、1%葡萄糖、0.1%尿苷）的液体培养基中，30℃，220 rpm振荡培养14~16 h；

用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20 mL10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412）的三角瓶中，30℃，90 rpm作用1-2 h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；

将预冷的20 mL 1.2 M山梨醇（1.2 M山梨醇，50 mM Tris-Cl，50 mM CaCl₂）加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入预冷的5 mL 1.2 M山梨醇溶液悬浮菌体，3000 rpm，4℃离心10 min；弃上清，加入适量预冷的1.2 M山梨醇悬浮分装（200 μL/管，原生质体浓度为10⁸个/mL）。

2、表达载体转化

以下操作均在冰上进行，取10 μg重组质粒pC2G-Phy加入到含有200 μL原生质体溶液的7 mL无菌离心管中，然后加入50 μL 25% PEG（25% PEG，50 mM Tris-Cl，50 mMCaCl₂），轻弹管底混匀，冰上放置20 min；加入2 mL 25% PEG，混匀后室温放置5 min；加入4mL 1.2 M山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在55℃的上层培养基中（0.1%MgSO₄, 1%KH₂PO₄, 0.6%(NH₄)₂SO₄, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖）；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上（2%葡萄糖，0.5%(NH₄)₂SO₄，1.5%KH₂PO₄，0.06%MgSO₄，0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），30℃培养5~7 d至有转化子长出，将生长出的转化子挑至下层培养基平板复筛，菌落边缘形态较光滑的菌株为阳性转化子。

3、发酵验证和酶活测定

将上述复筛得到的阳性转化子接种至PDA固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250mL三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行植酸酶酶活力测试。

（1）酶活测定方法

酶活定义：在温度37℃、pH5.5条件下，每分钟从浓度5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol/L无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

测定方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液（5.2）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax+b）。

反应后的试样在水浴中静置10min，在离心机（6.7）上以4000r/min离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm波长处测定样品空白（A₀）和样品溶液（A）的吸光值，A-A₀为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

植酸酶活性按下式计算：

U=F×C/(m×30)

式中：

U--试样中植酸酶的活性，U/g；

C--根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；

F--试样溶液反应前的总稀释倍数；

m--试样质量，g；

30--反应时间，min。

结果显示，本发明构建得到的里氏木霉工程菌摇瓶发酵上清液酶活最高能达到1970U/ml。申请人将发酵酶活最高的这株里氏木霉工程菌命名为里氏木霉UEphy（Trichoderma reesei UEphy）。

实施例3二次转化植酸酶基因的里氏木霉工程菌UEphy-P2的构建

1、尿嘧啶缺陷型宿主菌的制备

1.1原理：

5-氟乳清酸可以诱导菌体缺失尿嘧啶核苷酸合成途径中的乳清核苷酸转移酶或乳清苷单磷酸脱羧酶，从而使5-氟乳清酸无法形成有毒的物质 5-氟尿嘧啶核苷酸，从而产生了对5-氟乳清酸的抗性，其嘧啶核苷酸营养可以通过向培养基中添加尿嘧啶进行补充，因此利用5-氟乳清酸诱导形成的尿嘧啶营养缺陷型菌株可以在含有5-氟乳清酸和尿嘧啶的培养基中生长；而野生型菌株因不具备对5-氟乳清酸的抗性，无法在含有5-氟乳清酸的培养条件下生长。因此常用5-氟乳清酸来筛选尿嘧啶缺陷型的突变株。

1.2筛选方法：

将新鲜收集的里氏木霉UEphy（Trichoderma reesei UEphy）的孢子以0.1%的吐温-20溶液稀释至约1×10⁷个/ml，涂布于含1.5g/ml 5-氟乳清酸和1.87g/ml Uridine（尿嘧啶核苷）的基本固体培养基（2%葡萄糖，0.5%(NH₄)₂SO₄, 1.5%KH₂PO₄, 0.06%MgSO₄, 0.06%CaCl₂，1.5%琼脂）平板，每一平板涂布约1×10⁶个孢子，避光30℃培养4d；将上述平板中生长出的菌株分别接入基本培养基平板和含有1.87mg/ml Uridine的基本培养基平板，仅在含Uridine的平板上生长而在不含Uridine的基本培养基平板不生长的菌株为尿嘧啶缺陷型突变株，命名为里氏木霉UEphy-P（Trichoderma reesei UEphy-P）。

2、原生质体制备

方法如同实施例2。

3、表达载体转化

以下操作均在冰上进行，取10μg 重组质粒 pC1G-Phy加入到含有 200μL 原生质体溶液的7mL无菌离心管中，然后加入50μL 25％ PEG(25％ PEG，50mM Tris-Cl，50mMCaCl2)，轻弹管底混匀，冰上放置 20min ；加入 2mL 25％ PEG，混匀后室温放置 5min ；加入4mL 1.2M 山梨醇，轻轻混匀后倒入熔化并保持在 55℃的上层培养基中 (0.1％ MgSO4,1％ KH2PO4,0.6％ (NH4)2SO4,1％葡萄糖 ,18.3％山梨醇 ,0.35％琼脂糖 ) ；轻轻混匀后铺在制备好的下层培养基平板上 (2％葡萄糖，0.5％ (NH4)2SO4，1.5％ KH2PO4，0.06％MgSO4，0.06％ CaCl2，1.5％琼脂 )，30℃培养 5~7d 至有转化子长出。

将生长出的转化子挑至下层培养基平板再次筛选，选取菌落边缘形态较光滑的菌株转接至PDA平板进行培养。

4、发酵验证和酶活测定

将上述复筛得到的阳性转化子接种至PDA固体平板，在30℃恒温培养箱倒置培养6-7天，待孢子丰富后，分别取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素）的250mL三角瓶中，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵上清液进行酶活测定，酶活测定方法见实施例2。

结果显示，本发明二次转化获得的里氏木霉工程菌株发酵酶活最高能达到2295U/ml，申请人将发酵酶活最高的这株里氏木霉工程菌命名为里氏木霉UEphy-P2（Trichoderma reesei UEphy-P2）。

实施例4 紫外诱变及筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以里氏木霉UEphy-P2为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其植酸酶的产量。

1、确定致死率：

将里氏木霉工程菌UEphy-P2接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、45s、60s、75s、90s、105s、120s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射90s时，致死率为95％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

2、第一轮诱变筛选：

取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×10⁷)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射90s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布200块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出30-50个菌落，先通过菌落形态，筛选出短分枝的突变体。申请人挑取出菌落形态较小、菌丝致密、菌落周围绒毛较短的突变菌共85个分别到PDA平板，30℃培养5-7d。每个转化子割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基中发酵，28℃培养5d。培养5d后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行植酸酶活力检测，同时以出发菌株里氏木霉工程菌UEphy-P2作为对照组。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的85株突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液酶中植酸酶的酶活高于出发菌；其中，62株突变菌的酶活与出发菌基本相当，其余23株突变菌的酶活甚至比出发菌普遍降低了8-13%。

申请人按照上述方法继续进行了9轮诱变筛选，最终获得3株植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，分别命名为里氏木霉UEphy-3，UEphy-4，UEphy-6。其中，里氏木霉UEphy-6摇瓶发酵上清液中植酸酶的酶活最高，达3580u/ml，比出发菌提高了56.0%。

进一步地，申请人将出发菌株里氏木霉UEphy-P2和上述突变菌株里氏木霉UEphy-6分别在20L罐中进行发酵，发酵曲线如图1所示，发酵160h后，离心菌体获得上清液即为粗酶液，分别进行蛋白电泳检测及植酸酶活力检测。

电泳检测结果如图2所示，箭头所指处即为植酸酶，说明里氏木霉UEphy-P2和里氏木霉UEphy-6均能有效表达植酸酶Phy。酶活检测结果显示，出发菌株里氏木霉UEphy-P2发酵上清液中植酸酶酶活为26530u/ml，而突变菌株里氏木霉UEphy-6的发酵上清液中植酸酶酶活高达40345u/ml，比出发菌株提高了52.1％，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年5月29日将里氏木霉UEphy-6（Trichoderma reesei UEphy-6）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2019405。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种稳定高产植酸酶的木霉突变菌株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val

20 25 30

Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr

35 40 45

Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln

50 55 60

Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro

65 70 75 80

Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr

85 90 95

Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val

100 105 110

His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu

115 120 125

Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile

130 135 140

Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln

145 150 155 160

Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn

165 170 175

Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln

180 185 190

Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr

195 200 205

Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln

210 215 220

Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser

225 230 235 240

His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu

245 250 255

Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu

260 265 270

Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala

275 280 285

Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp

290 295 300

Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu

305 310 315 320

Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu

325 330 335

Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu

340 345 350

Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu

355 360 365

Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu

370 375 380

Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val

385 390 395 400

Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu

405 410

<210> 2

<211> 1233

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

cagtcggagc ccgagctgaa gctggagtcc gtggtcatcg tctcgcgaca cggcgtccgc 60

gcccccacca aggccacgca gctgatgcag gacgtgaccc ccgacgcctg gccgacatgg 120

cccgtcaagc tgggctggct gacgccccgc ggcggcgagc tgattgccta cctgggccac 180

taccagcgac agcgactggt ggccgacggc ctcctggcca agaagggctg cccccagccc 240

ggccaggtgg ccattattgc cgacgtggac gagcgcacgc gaaagacggg cgaggccttc 300

gccgccggcc tggcccccga ctgcgccatt accgtgcaca cgcaggccga cacgtcgtcg 360

cccgaccccc tgttcaaccc cctcaagacg ggcgtgtgcc agctcgacaa cgccaacgtg 420

acggacgcca ttctgtcgcg cgccggcggc agcattgccg acttcacggg ccaccgacag 480

accgccttcc gagagctgga gcgcgtcctg aacttccccc agtccaacct gtgcctcaac 540

cgagagaagc aggacgagtc gtgctcgctg acccaggccc tgccctcgga attgaaagtg 600

tccgccgaca acgtgtcgct cacgggcgcc gtcagcctgg cctccatgct cacggagatt 660

ttcctcctac aacaggccca gggcatgccc gagcccggct ggggccgcat tacggactcg 720

caccagtgga acaccctcct ctccctgcac aacgcccagt tctacctgtt acaacgaacg 780

cccgaggtgg cccgatcccg cgccacgccc ctcctggacc tcatcatggc cgccctcacg 840

ccccaccccc cccagaagca ggcctacggc gtgacgctcc ccacgtcggt gctcttcatt 900

gccggccacg acaccaacct cgccaacctg ggcggcgccc tagaactgaa ctggaccctc 960

cccggccagc ccgacaacac gccccccggc ggcgagctgg tcttcgagcg atggcgacga 1020

ctgtcggaca actcgcagtg gattcaggtc agcctggtgt tccagaccct ccagcagatg 1080

cgagacaaga cgcccctctc gctgaacacg ccccccggcg aggtcaagct caccctggcc 1140

ggctgcgaag agcgaaacgc ccagggcatg tgctcgctcg ccggcttcac ccagattgtg 1200

aacgaggccc gaattcccgc ctgctcgctc taa 1233

Claims

1.一种里氏木霉（ Trichoderma reesei ）突变菌株，其特征在于，所述的里氏木霉突变菌株的保藏编号为CCTCC NO: M2019405。

2.权利要求1所述的里氏木霉突变菌株在生产植酸酶中的应用。

3.一种生产植酸酶的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的菌株发酵生产植酸酶。