CN105779317B - 一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株Pichia sp.MP‑1及其在单细胞甲醇蛋白制备过程中的应用，该菌株可以同化多种糖类及常见氮源化合物，能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖，根据生理生化特性及26S rDNA序列将其鉴定为毕赤酵母属，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016172。利用本发明的甲醇营养型菌株和工艺能够实现高密度发酵，最终菌体湿重达到350‑400 g/L，甲醇蛋白干重达到110‑120 g/L，蛋白质含量达到65%，甲醇蛋白单耗甲醇比在1.9‑2.2:1，本发明对动物饲料蛋白添加剂的发展具有重大的现实意义和经济价值。

Description

一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株及应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别是一株高产甲醇蛋白的毕赤酵母菌株及其在甲醇蛋白制备过程中的应用。
背景技术
甲醇蛋白是以甲醇为碳源生产的单细胞蛋白，以甲醇、氨、硫酸和磷酸等为原料作为培养基，通过微生物发酵在甲醇基体中生长、消耗甲醇，生长成许多单细胞菌体，成为菌体单细胞蛋白，简称SCP。甲醇蛋白的主要成分为粗蛋白、脂肪、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、矿物质和维生素，其中，粗蛋白质量分数平均在70%以上。甲醇蛋白被成为第二代单细胞蛋白，营养价值高，其粗蛋白含量比鱼粉和大豆等饲料高得多。因此，国外已将甲醇蛋白广泛应用于仔猪、肉鸡、小牛和鱼的饲料，目前正在研究将甲醇蛋白用作人类食品的蛋白质添加剂和调味品原料。
我国蛋白饲料供需缺口每年达几千万吨，随着人民生活水平的提高及养殖业的快速发展，饲料蛋白的供需矛盾进一步加剧。基于这种原料短缺的严重形势，必须尽快改变我国蛋白质饲料严重紧缺的国情，维护我国农业的基础地位。单细胞甲醇蛋白中的粗蛋白可替代植物蛋白用于饲料行业，是一个十分重要且极具发展前景的产品。目前，甲醇蛋白生产中存在菌种单一，发酵工艺陈旧，成本高而效率低等难题。如能分离蛋白质含量较高、必须氨基酸组成协调的甲醇营养型菌株，可以降低原料消耗，节约能源使用，提高甲醇蛋白营养价值。
发明内容
本发明的目的是针对单细胞甲醇蛋白的制备，提供一株甲醇营养型菌株，该菌株能够高产甲醇蛋白。
本发明的另一目的是构建含有该甲醇营养型菌株26S rDNA序列的克隆载体以及含有该载体的工程菌株，在分子水平上对该甲醇营养型菌株进行鉴定。
本发明的又一目的是提供该甲醇营养型菌株在单细胞甲醇蛋白制备过程中的应用。
所述甲醇营养型菌株为毕赤酵母，其分类命名为Pichia sp. MP-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016172，保藏日期为：2016年4月5日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。
本发明所述的Pichia sp. MP-1筛选方法：用含有微量元素溶液的无机盐培养基，调整pH值至4.8-5.0，以甲醇作为唯一碳源，对葡萄自然发酵过程中的甲醇营养型菌株进行分离纯化。
具体地，以葡萄自然发酵菌群作为筛选目标，利用1%甲醇的无机盐培养基作为介质，连续富集培养甲醇营养型菌株，将富集培养基稀释涂布至含有1%甲醇的无机盐固体培养基，30℃培养2 d，挑去形态不同的甲醇营养型菌株进行划线培养获得纯培养，命名为Pichia sp. MP-1，再次验证纯种微生物Pichia sp. MP-1在无机盐培养基中的甲醇利用能力，利用气相色谱检测甲醇含量。
具体地，所述的无机盐培养基是由85%磷酸26.7 mL、二水合硫酸钙0.93 g、硫酸钾18.4 g、硫酸亚铁0.38 g，七水合硫酸镁7.12 g、氢氧化钾4.13 g 加水至1.0 L配制，用氨水调pH值至4.8-5.0，琼脂20.0 g、121℃灭菌20 min，使用前添加1%过滤除菌的甲醇作为碳源；
具体地，所述的微量元素溶液是由无水硫酸铜2.2 g、碘化钾0.08 g、一水合硫酸锰4.5 g、二水合钼酸钠0.3 g、硼酸0.02 g、六水合氯化钴0.1 g、氯化锌8.0 g、七水合硫酸亚铁32.0 g、质量浓度98%的浓硫酸 3 mL、生物素0.2 g加水至1.0 L配制，过滤除菌，每升无机盐培养基添加4 mL微量元素溶液。
本发明所述的甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1菌落呈乳白色、边缘整齐、表面有光泽，细胞形态较小，呈卵圆形，无性繁殖为出芽生殖，且无假菌丝形成；能够同化鼠李糖、乳糖、D-木糖、D-半乳糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-核糖等10种糖以及蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素4种氮源；能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖；菌株Pichia sp. MP-1生理生化鉴定的结果与酵母鉴定手册的标准数据进行比对后，与毕赤酵母属的特征最为接近。
一种含有本发明所述的甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1 26S rDNA序列的克隆载体。
所述的重组克隆载体，优选出发载体为 pMD19T。
含所述的甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1 26S rDNA序列的基因工程菌Escherich coli DH5α （pMD19T-26S）。
所述的基因工程菌 Escherich coli DH5α构建方法：利用引物NL-1：5`-GCATATCAATAAGCGGAAGGAAAAG-3`和NL-4：5`-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3`扩增菌株MP-1的26SrDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-26S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物Escherich coli DH5α （pMD19T-26S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1 的26S rDNA序列，在分子水平上将其鉴定至毕赤酵母属。
一株甲醇营养型毕赤酵母Pichia sp. MP-1在单细胞甲醇蛋白制备过程中的应用，具体步骤如下：
（1）种子液培养：一级种子培养基采用YPD复合培养基，取试管斜面保藏的菌株MP-1，用接种环挑去菌落接入含有200 mL YPD液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养24小时，摇床转速200 rpm，获得的菌体作为下级发酵种子；
（2）高密度发酵培养：高密度发酵培养采用含有3%甘油的无机盐培养基；将种子液以10%的接种量接种于装有2 L无机盐培养基的发酵罐中，同时加入4 mL/L微量元素，100 %氨水调pH 5.0, 温度30 ℃, 通气量 3 L/min,调整转速使DO>20%；待培养基中甘油耗尽，DO陡然上升，在细胞饥饿2 h后开始流加甲醇溶液（含12 mL/L微量元素），甲醇流加速度应使溶氧量大于20%且控制发酵液中甲醇含量< 3%，避免DO急速下降或甲醇浓度过高对细胞造成毒性，影响细胞生长；
（3）发酵液pH及菌体浓度测定：发酵开始后每隔2 h，采用无菌操作方法，利用精密pH计（精度为0.01），快速测定PH值；发酵液摇匀吸取2 mL，用去离子水定容至50 mL，用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值；
（4）甲醇单细胞蛋白的获得：将发酵液4500 r/min 离心10 min收集单细胞甲醇蛋白菌体，用清水洗涤菌体后称量其湿重；将收集的菌体于55℃烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白；
所述的甲醇蛋白其特征在于，其蛋白质含量达到65%，其中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等动物所需要的必需氨基酸种类齐全，且比例均衡。
本发明的有益效果在于：
本发明以甲醇作为唯一碳源，富集筛选了一株甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1，根据菌株的生理生化特性以及26S rDNA序列将其鉴定为毕赤酵母属，Pichia sp. MP-1可以同化多种糖类化合物以及蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素4种氮源，可以发酵能葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖；本发明生产工艺特殊，发酵过程中采用饥饿培养和变温发酵控制工艺，以无机盐和甲醇作为主要营养物质，原来来源广泛且价格较低廉；利用本发明的甲醇营养型菌株和工艺能够实现高密度发酵，生产效率高，最终菌体湿重达到350-400 g/L,干重达到110-120 g/L，质量收率达到60%，甲醇蛋白单耗甲醇在1.9-2.2:1；本发明所获得的单细胞甲醇蛋白中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸等动物所需要的必需氨基酸种类齐全，且比例均衡，将该单细胞甲醇蛋白作为动物饲料蛋白添加剂具有重大的现实意义和经济价值。
附图说明
图1 甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1 26S rDNA序列聚类分析。
图2甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1制备甲醇蛋白的工艺流程图。
本发明所述的生物材料，其分类命名为Pichia sp. MP-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2016172，保藏日期为：2016年4月5日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。
具体实施方式
下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。
述的实施例中所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。
实施例一
本实施例说明甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1的筛选方法，具体方法如下：
以葡萄自然发酵菌群作为筛选目标，利用1%甲醇的无机盐培养基作为介质，连续传代富集培养甲醇营养型菌株，将富集培养基稀释涂布至含有1%甲醇的无机盐固体培养基，30℃培养2 d，挑去形态不同的甲醇营养型菌株进行划线培养获得纯培养，命名为MP-1，再次验证纯种微生物Pichia sp. MP-1在无机盐培养基中的甲醇利用能力，利用气相色谱检测甲醇含量。
其中，无机盐培养基是由85%磷酸26.7 mL、二水合硫酸钙0.93 g、硫酸钾18.4 g、硫酸亚铁0.38 g，七水合硫酸镁7.12 g、氢氧化钾4.13 g 加水至1.0 L配制，用氨水调pH值至4.8-5.0，琼脂20.0 g、121℃灭菌20 min，使用前添加1%过滤除菌的甲醇作为碳源；
微量元素溶液是由无水硫酸铜2.2 g、碘化钾0.08 g、一水合硫酸锰4.5 g、二水合钼酸钠0.3 g、硼酸0.02 g、六水合氯化钴0.1 g、氯化锌8.0 g、七水合硫酸亚铁32.0 g、质量浓度98%的浓硫酸 3 mL、生物素0.2 g加水至1.0 L配制，过滤除菌，每升无机盐培养基添加4.0 mL微量元素溶液。
甲醇含量的测定，参照GB/T 9722-2006《化学试剂气相色谱法通则》。
将上述筛选获得的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016172，保藏日期为：2016年4月5日，保藏地址为：中国. 武汉.武汉大学。
实施例二
本实施例说明甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1的鉴定方法，具体方法如下：
1. 形态观察：在PDA液体或固体斜面上，28℃培养2 d，观察细胞形状、大小，记录增殖方式是芽殖还是裂殖；用平底培养皿倒一薄层马铃薯琼脂培养基，凝固后倒置1 h使表面稍干，用新培养的酵母菌体在培养基表面以划线法接种，每条上盖以无菌盖玻片，28℃恒温静置培养4-5 d后观察，注意划线两旁是否形成假菌丝，或仅有原始型的短链或延长的细胞，如假菌丝很发达可进一步注意是哪一种类型；观察菌株在WL培养基的生长状态；
所述的WL培养基是由酵母粉4.0 g、胰蛋白胨5.0 g、葡萄糖50.0 g、磷酸二氢钾0.55 g、氯化钾0.425 g、氯化钙0.125 g，硫酸镁0.125 g、氯化铁0.0025 g、硫酸锰0.0025g、琼脂20.0 g、溴甲酚绿0.022 g、pH至6.5、定容至1.0 L；
所述的YPD复合培养基含1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖；
2. 生理生化鉴定：参照《酵母菌的特征与鉴定手册》中的糖发酵测试、碳源同化、氮源同化测试、产类淀粉化合物测定、耐高渗透压测试和尿素分解试验等酵母生理生化鉴定方法；生长曲线测定：250 mL三角瓶装液量为50 mL PDA液体培养基，接种0.5 mL种子液，28℃，180 rpm摇床培养，每3 h测定600 nm处吸光度值，记录结果，绘制生长曲线；
3. 26S rDNA序列分子生物学鉴定：利用引物NL-1：5`-GCATATCAATAAGCGGAAGGAAAAG-3`和NL-4：5`-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3`扩增所获得酵母菌株26S rDNA，从分子水平精确鉴定至属；26S rDNA PCR扩增体系：总DNA 1 uL、NL-1 1 uL、NL-4 1 uL、Taq DNA聚合酶0.5 uL、dNTP 1 uL、MgCl2 4 uL、Buffer 5 uL、ddH2O 36.5 uL；PCR反应程序为：94℃预变性3 min、94℃变性1 min、58℃退火1 min、72℃延伸1.5 min、30个循环、72℃延伸5 min，1.0%的琼脂糖凝胶电泳确认扩增的26S rDNA片段并进行测序；将测得的26S rDNA序列通过NCBI数据库中的BLAST程序与GenBank数据库中已登录的序列进行在线同源性分析，在此基础上通过Clastal X 2.0软件进行多重比较后，利用MEGA 4.0软件以距离矩阵法中的邻接法构建系统发育树，并进行Bootstrap分析，重复次数为1000次，如图1所示。
实施例三
本实施例说明甲醇营养型菌株Pichia sp. MP-1在单细胞甲醇蛋白制备过程中的方法，具体方法如下（图2）：
（1）种子液培养：一级种子培养基采用YPD复合培养基，取试管斜面保藏的菌株MP-1，用接种环挑去菌落接入含有200 mL YPD液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养24小时，摇床转速200 rpm，获得的菌体作为下级发酵种子；
（2）高密度发酵培养：高密度发酵培养采用含有3%甘油的无机盐培养基；将种子液以10%的接种量接种于装有2 L无机盐培养基的发酵罐中，同时加入4 mL/L微量元素，100 %氨水调pH 5.0，温度30 ℃，通气量 3 L/min， 调整转速使DO>20%；待培养基中甘油耗尽，DO陡然上升，在细胞饥饿2 h后开始流加甲醇溶液（含12 mL/L微量元素），甲醇流加速度应使溶氧量大于20%且控制发酵液中甲醇含量< 3%，避免DO急速下降或甲醇浓度过高对细胞造成毒性，影响细胞生长；
（3）发酵液pH及菌体浓度测定：发酵开始后每隔2 h，采用无菌操作方法，利用精密pH计（精度为0.01），快速测定PH值；发酵液摇匀吸取2 mL，用去离子水定容至50 mL，用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值；
（4）甲醇单细胞蛋白的获得：将发酵液4500 r/min 离心10 min收集单细胞甲醇蛋白菌体，用清水洗涤菌体后称量其湿重；将收集的菌体于55℃烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白。

Claims (2)

1.毕赤酵母菌株在单细胞甲醇蛋白制备中的应用，其特征在于，所述毕赤酵母菌株分类命名为Pichiasp. MP-1，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016172，具体步骤如下：
（1）种子液培养：一级种子培养基采用YPD复合培养基，取试管斜面保藏的Pichiasp.MP-1，用接种环挑去菌落接入含有200 mL YPD液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养24小时，摇床转速200 rpm，获得的菌体作为下级发酵种子；
所述的YPD复合培养基含1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖；
（2）高密度发酵培养：高密度发酵培养采用含有3%甘油的无机盐培养基；将种子液以10%的接种量接种于装有2 L无机盐培养基的发酵罐中，同时加入4 mL/L微量元素，100 %氨水调pH 5.0, 温度30 ℃, 通气量 3 L/min, 调整转速使DO>20%；待培养基中甘油耗尽，DO陡然上升，在细胞饥饿2 h后开始流加含12 mL/L微量元素的甲醇溶液，甲醇流加速度使溶氧量大于20%且控制发酵液中甲醇含量< 3%；
（3）发酵液pH及菌体浓度测定：发酵开始后每隔2 h，采用无菌操作方法，利用精度为0.01的精密pH计，快速测定PH值；发酵液摇匀吸取2 mL，用去离子水定容至50 mL，用分光光度计测定其在波长600 nm处的吸光度值；
（4）甲醇单细胞蛋白的获得：将发酵液4500 r/min 离心10 min收集单细胞甲醇蛋白菌体，用清水洗涤菌体后称量其湿重；将收集的菌体于55℃烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母菌株在单细胞甲醇蛋白制备中的应用，其特征在于，所述甲醇蛋白中蛋白质含量达到65%，其中动物所需要的必需氨基酸种类齐全且比例均衡。
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