KR20100097885A - 글루타치온 고발현 사카로마이세스 세레비지애 54-8 야생형및 이의 용도 - Google Patents

글루타치온 고발현 사카로마이세스 세레비지애 54-8 야생형및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루타치온 고발현용 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 54-8 야생형, 이의 배양 방법, 이를 이용한 글루타치온 생산 방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 글루타치온을 고농도로 발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 이를 배양하는 방법, 이를 이용한 글루타치온 생산 방법 및 이를 이용한 가축사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
글루타치온, Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 가축의 스트레스 저감물질, 사료 첨가제

Description

글루타치온 고발현 사카로마이세스 세레비지애 54-8 야생형 및 이의 용도 {Highly-Expressed Glutathione from Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type and use thereof}
본 발명은 글루타치온 고발현 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 이를 이용한 글루타치온 대량 생산방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 막걸리로부터 분리한, 글루타치온(glutathione)을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 상기 균주를 배지에서 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법, 상기 균주의 배양물 또는 그로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
효모는 균류 중 단세포 형태로 fission이나 budding의 방법으로 무성생식 할 수 있는 종류를 지칭하는 일반적인 용어로서 분류학적으로 효모를 명확하게 구분할 수는 없다. 효모는 자낭균류와 담자균류에서 발견되며, 크게 5개의 분류군으로 나누어 볼 수 있다. 자낭균류에 포함된 효모는 Schizosaccharomyces pompe를 포함한 Archaeascomycetes, Saccharomyces cerevisiae를 포함한 Hemiascomycetes로 크게 나누어 볼 수 있으며, 담자균류의 경우 Urediniomycetes, Ustilagomycetes 그리고 Hymenomycetes로 나누어 질 수 있다.
글루타치온 (L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 세포내 존재하는 생리활성물질로서 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine) 의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1~10mM의 농도로 존재하며, 세포의 총 비단백질성 활성분의 90% 이상을 차지하고 있다. 그것의 다양한 기능은 농업 분야뿐 아니라 효소학, 수송, 약물학, 치료, 독물학, 내분비학 및 미생물학을 포함하는 많은 의학 분야에서 중요하다.
생체 내에서 글루타치온(glutathione)은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, GST (glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 콘쥬게이션되어 해독 작용에 중요한 역할을 한다. 이러한 작용들 중 세포내에서 중요한 항산화 기능을 하는 성분으로서 환원형 글루타치온(reduced glutathione)이 널리 알려져 있다.
글루타치온은 세포 방어에서 뿐만 아니라 다양한 대사 과정에서 결정적인 역할을 한다. 그것은 단백질과 다른 분자들과의 이황화물 결합의 환원, DNA의 옥시리보뉴클레오타이드 전구물질의 합성, 대사작용의 다양한 단계에서 형성되는 많은 활성 산소 매개체 (예를 들면, 과산화물) 및 자유 라디칼(free radical)의 해로운 효과로부터 세포 보호를 수행한다(Meister 'Selective Modification Of Glutathione Metabolism', Science, volume 220, No.4596,472-477 (1983)).
글루타치온은 1888년 Baker's yeast의 효모 추출물에서 처음 발견된 이래로 동물, 식물을 포함하는 거의 모든 생물에서 발견되지만, 세포내에서 그 함량이 매우 낮고 최종 산물이 고가여서 산업적으로 적용하는 데에는 많은 문제점을 내포하고 있다. 약 70년 전에 글루타치온이 화학적으로 합성되었지만 D-및 L-형의 광학이성질체의 혼합물로 합성되어 실제적으로 생물학적으로 활성이 있는 L-글루타치온만을 얻을 수 없어 이들 광학이성질체를 분리해야 하는 추가 공정이 필요하여 이 역시 비용에 비하여 생산량이 적어 산업적으로 경제성이 문제되고 있다.
그러나 최근 효모나 재조합 미생물을 이용한 생물공학적 기법에 의해 글루타치온을 대량으로 생산하는 방법이 활발하게 이루어지고 있다. 효모를 이용한 글루타치온의 생산에는 전구체들(글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine))과 에탄올 및 젖산 등을 배지에 첨가하는 방법, 글루타치온 생산균주를 고정화시켜 생산하는 방법, 유전공학 기술을 활용하여 재조합된 미생물에서 글루타치온 생합성 효소를 이용하여 글루타치온을 생산하는 공정이 개발되었다. 이들 방법 중에서 미생물인 효모를 이용하여 합성 전구물질인 글루타메이트, 시스테인 및 글라이신과 탄소원으로서 포도당 및 당밀 등을 배지에 첨가하여 글루타치온을 생산하는 방법이 현재 많이 활용되고 있다.
그러나 산업적으로 경제성을 가지기 위하여서는 쉽고 단순한 공정을 통하여 고효율의 글루타치온을 생산하는 것이 필수적이다. 또한 농축산, 식품, 의약 분야 에서 주로 사용될 글루타치온의 안전성 확보를 위하여 자연발생적이며 이미 식품분야에 응용되고 있는 미생물을 이용한 생산 방법에 대한 개발이 요구된다.
본 발명자는 글루타치온을 고발현하는 효모를 한국인의 대표적인 발효식품인 생막걸리 제조를 위하여 제공되는 효모 균주에서 찾고자 연구를 거듭하던 중 경북군위 부계면 팔공산 주조장에서 주조된 팔공산 생막걸리에서 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형이 포함되어 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 및 이의 배양물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양하는 배양 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하여 글루타치온을 생산하는 생산 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형의 배양물 또는 이로부터 분리한 균주 자체 또는 이들로부터 분리한 글루타치온을 포함하는 가축사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 및 이의 배양물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양하는 배양 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하여 글루타치온을 생산하는 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 또는 이의 배양물을 함유하는 가축사료 첨가용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 글루타치온을 고발현하는 특징이 있으며 그 배양물은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의하여 생성된 것을 특징으로 한다.
일반적으로 사카로마이세스 세레비지애 또는 그 배양물은 통상적인 배양조건에서 균체 g 당 10~40mg의 글루타치온을 함유하나 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 또는 그 배양물은 균체 g당 최대 52mg의 글루타치온을 함유하여 그 생산 효율이 월등한 것으로 나타났다.
상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 또는 글루타치온의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.
또한 본 발명의 배양 방법은 통상의 배양 방법에 있어 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명에 따른 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 통상적인 미생물의 배양에 이용되는 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지는 탄소원, 질소원으로 구성된 배지를 사용 할 수 있으며 미네랄 및 비타민을 첨가하여도 된다.
예컨대, 글루타치온의 대량 생산을 위하여 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 0.3 내지 0.5% 암모늄 설페이트, 0.3 내지 0.5% 디포타슘 포스페이트, 0.3 내지 0.5% 모노포타슘 포스페이트, 1.5 내지 2% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 내지 2.5% 폴리펩톤, 1.0 내지 1.5% 수크로오스, 1.0 내지 1.5% 글루코오스, 0.02 내지 0.025% 미오-이노시톨, 0.2 내지 0.25mM ZnSO4 및 0.15 내지 0.2% L-시스테인을 함유한 배지에서 배양할 수 있다.
보다 바람직하게는 0.5% 암모늄 설페이트, 0.5% 디포타슘 포스페이트, 0.5% 모노포타슘 포스페이트, 2.0% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.5% 폴리펩톤, 1.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4 및 0.2% L-시스테인을 함유한 배지에서 배양할 수 있다.
배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
또한 본 발명의 글루타치온 생산 방법은 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의해 생성된 배양물을 이용하는 것을 그 특징으로 한다.
한편, 글루타치온은 세포내 비단백질이므로 배양물 또는 균주로부터 글루타치온을 분리하기 전에 균주를 용균시키는 것이 바람직하다. 균주의 용균은 이에 한정되는 것은 아니지만, 용균용 완충용액, 소니케이터, 열 처리 등에 의해 달성 가능하다.
Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형균주의 배양물 또는 이의 균주로부터 글루타치온을 분리하는 방법은 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함한 전통적인 방법에 의하여 분리할 수 있다. 더 나아가, 크로마토그래피(예, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, SDS-PAGE를 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 분리 가능하다.
또한 본 발명의 가축사료 첨가용 조성물은 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의해 생성된 배양물 또는 이로부터 분리된 균주 자체 또는 이들로부터 분리된 글루타치온을 포함하는 것을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 사료첨가용 조성물은 이를 첨가하여 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형과 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 사료 첨가용 조성물을 사료에 배합하여 첨가하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
사료에는 일반 볏짚, 야초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다.
따라서, 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 종래 균주에 비하여 고효율의 글루타치온을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 이에 의한 배양물은 적은 비용으로 가축의 생장을 매우 증진시켜 가축농가의 경제성 및 생산성을 월등히 증 대시킬 수 있어 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
본 발명의 균주 스크리닝
<1-1> 시료의 준비
하기 표 1에 나열된 전국 각지로부터 시료를 채취하였다. 채취한 샘플을 멸균수에 희석하여 yeast용 평판 배지 플래이트에 접종한 후, 유리막대로 도말 하였다. 이후, 플래이트를 37℃ 항온배양기에서 하룻밤동안 배양한 후 각 플레이트에서 활성화된 콜로니 중 10개를 선택하여 10ml의 yeast용 액체 배지에 각각 접종하여 32℃, 200rpm에서 진탕배양하고, 배양한 후 24시간, 48시간, 72시간에서 각각 시료를 채취하여 다음의 방법으로 글루타치온 활성도 측정을 수행하였다.
<1-2> 글루타치온 활성도 측정
배양액 1.8ml를 원심분리하여 cell를 포집하고 동결건조를 실시하였다. 이를 0.8% SDS 0.6ml에 완전히 현탁한 후 직경 4mm의 글래스 비드 10개를 넣고 진탕 배양기(32℃, 250rpm)에서 2시간 동안 파쇄하였다. 이어서, 원심분리 후 96-well plate에 상층액 10㎕와 50mM의 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.5) 100㎕ 및 10mM의 DTNB(5,5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid) 10㎕를 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 412nm에서의 흡광도를 측정하여 글루타치온의 농도를 측정하였다.
<1-3> 글루타치온 고발현 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 선별
총 65개의 시료를 상기의 방법으로 배양하여 글루타치온의 농도를 측정하여 비교하였다. 그 결과 54번으로 표기된 경북 군위 부계면 막걸리로부터 유래된 사카로마이세스 세레비지애에서 글루타치온의 발현이 가장 많은 것을 확인하였다.
시료를 채취한 막걸리의 명칭 및 소재지
No 이름 지역 양조장 글루타치온 함량
1 안중 김선달 경기도 안중 +
2 아산 쌀막걸리 아산 영인면 +
3 신선도 쌀막걸리 아산 신창면 +
4 예산 스가올 생막걸리 예산 신례원 +
5 백제 쌀막걸리 공주 신풍면 +
6 동동주 (음식점) 유구 마곡사 +
7 공주 알밤 인삼주 공주 시곡면 +
8 칠갑산 장곡사 동동주 (음식점) 청양 장곡면 +
9 양촌 순수 생막걸리 논산 양촌면 +
10 신비로 생막걸리 부여 조천면 두배주조 +
11 가야골 뻑뻑주 논산 가야골면 +
12 원광 생막걸리 익산시 원광주조 +
13 함라 생막걸리 익산 함라면 +
14 한내 생막걸리 완주 한내면 천둥소리 +
15 부안 생막걸리 부안 부안협동 양조장 +
16 줄포 생막걸리 부안 동진면 +
17 순곡 생막걸리 고창 흥덕면 +
18 선운사 생동동주 고창 아산면 +
19 생한방 막걸리 영광대마면 +
20 함평 나비막걸리 함평 월야면 해보 +
21 무안 봉탄 생막걸리 무안 몽탄면 +
22 생쌀막걸리 나주 봉황면 +
23 청계 생막걸리 무안 +
24 살아있는 효모생막걸리 목포 용해동 목포탁주 +
25 도갓집 동동주 영암 삼호면 ++
26 다산촌 생막걸리 강진 도암면 +
27 안양 생막걸리 장흥 안양면 +
28 겸백 생막걸리 보성 겸백면 +
29 향토주 참막걸리 보성 조성면 +
30 녹차 생막걸리 보성 벌교면 벌교주조 +
31 승주 생막걸리 순천 승주 +
32 지리산 생막걸리 구례 복동리 산동생수 +
33 순곡 생막걸리 곡성 오지리 +
34 곡성 생막걸리 곡성곡성읍 +
35 지리산 생막걸리 남원 서남합동 주조장 +
36 남원 춘향골 생막걸리 남원 산곡동 +
37 남원 산동 막걸리 남원 산동면 태릉리 +
38 번암 막걸리 장수 번암면 +
39 장수 향토 참막걸리 장수 장수읍 +
40 무주 민속주 무주 무주군 읍내리 무주 민속탁주장 +
41 금산 인삼 막걸리 (길거리) 금산 금산읍 +
42 금산 생막걸리 금산 제원면 +
43 이원 막걸리 옥천 이원면 강천리 +
44 영동 생막걸리 영동 심천면 심천리 +
45 영동 황간 막걸리 (개인) 영동 황간면 +
46 영동 황간 매곡생막걸리 영동 매곡면 노천리 +
47 김천 숯 막걸리 김천 김천 탁주 협동 제조 +
48 남면 옥산 생막걸리 김천 남면 옥산탁주 +
49 왜관 생막걸리 칠곡 왜관읍 왜관탁주 +
50 대구 불로 막걸리 대구 불로동 대구탁주 +
51 대구 막걸리 달성군 천어동 +
52 효령 막걸리 군위 효령면 중구리 +
53 군위 동동주 (음식점) 군위 부계면 남산1리
(삼존석불)		 군위 부계면 남산1리
(삼존석불)		 +
54 팔공산 생막걸리 군위 부계면 팔공산 주조장 +++
55 춘산 쌀막걸리 의성 춘산면 옥정리 +
56 빙계 생막걸리 의성 가음면 장리 +
57 단촌 생막걸리 의성 단촌면 세천리 +
58 안동 쌀막걸리 안동 황석동 안동탁주 제1 공장 +
59 풍산 생막걸리 안동 풍산읍 상리 풍산탁주 +
60 하회민속주 안동 풍천읍 갈전리 풍천양조장 +
61 예천 생막걸리 예천 +
62 용궁 생막걸리 예천 용궁면 용궁주조장 +
63 얼음골 생막걸리 상주 내서면 송암리 능암양조장 +
64 조껍데기술 상주 화북면 입석리 막걸리나라 +
65 마성 생막걸리 문경 마성면 신현리 +
<1-4> 선발 균주의 동정
균주의 동정은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 의뢰하여, 26S rRNA유전자의 D1/D2 영역 염기서열과 ITS 영역을 분석하였다. 그 결과. 상기 균주의 26S rRNA gene의 D1/D2 영역에서 조사된 572개의 염기서열을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisiae 표준균주인 NRRL Y-12632NT(SCU44806)의 염기서열과 100% 동일함을 확인할 수 있었다. 그리고 상기 균주의 ITS 영역에서 조사된 731개의 염기서열을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisiae 표준균주인 NBRC 10217T(D89886)와 99% 유사도를 확인할 수 있었다(결과 미도시). 그러므로 상기균주는 Saccharomyces cerevisiae 균주로 동정되었다.
본 발명자들은 상기 균주를 "Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형"으로 명명하였고, 이를 한국농업 미생물자원센터(Korean Agricultural culture collection)에 2009년 02월 11일자로 기탁하였다(기탁번호: KACC 93069P).
<실시예 2>
본 발명의 글루타치온 고발현용 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주의 배양 배지.
<2-1> 본 발명의 포스페이트 종류 및 농도에 의한 글루타치온의 생산효율
2% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.5% 폴리펩톤, 1.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 0.5% 암모늄 설페이트로 이루어지고, 여기에 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트(1번 배지), 디포타슘 포스페이트와 모노나트륨 포스페이트(2번 배지), 모노포타슘 포스페이트와 디나트륨 포스페이트(3번 배지), 디포타슘 포스페이트와 디나트륨 포스페이트(4번 배지) 또는 모노포타슘 포스페이트와 모노나트륨 포스페이트(5번 배지)를 첨가한 배지를 각각 제조하였다. 상기 각각의 배지에 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 접종하여 배양하였다. 이때, 배양시간은 72시간, 온도 32℃ 및 진탕배양 회전수는 200rpm 으로 조절하고 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.
포스페이트 이온의 종류에 따른 글루타치온 생산량 측정 결과
배지번호 포스페이트 이온의 종류(농도:0.5%) 24시간 GSH% 48시간 GSH% 72시간 GSH%
1 Kpi di, Kpi mono 1.6 3.6 4.4
2 Kpi di, Napi mono 1.2 2.8 3.2
3 Kpi mono, Napi di 0.8 0.8 0.8
4 Kpi di, Napi di 1.2 2.4 2.8
5 Kpi mono, Napi mono 1.2 2.8 3.2
* GSH% 는 측정된 글루타치온 농도를 말한다.
상기 표 2에서 보는 바와 같이 1번 배지, 즉 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트를 이용한 경우에 배양 효율이 높은 것을 확인하였다.
<2-2> 본 발명의 염(ZnSO 4 ) 선택에 따른 글루타치온의 생산 효율
TSB 2%, 폴리펩톤 2%, 수크로오스 1.5%, 글루코오스 1.0%, 0.5% 암모늄 설페이트로, 0.5% 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트 이루어지고, 여기에 표 3에 기재된 염을 각각 첨가한 배지를 제조하였고 상기 각각의 배지에 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 접종하여 온도 32℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다. 이때, 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.
각종 금속이온의 첨가에 따른 글루타치온 생산량 측정 결과
종류 24시간 GSH% 48시간 GSH% A600(10:1)
none 1.6 2.0 1.006
0.5mM CaCl2 1.6 1.6 1.040
0.5mM MgCl2 2.0 3.2 0.800
0.5mM MgSO4 2.8 2.4 0.833
0.5mM FeCl2 2.0 1.6 0.945
0.5mM FeCl3 2.4 1.6 0.931
0.5mM ZnCl3 2.4 2.4 0.710
0.5mM ZnSO 4 2.4 3.6 0.682
0.5mM MnCl2 2.8 2.0 1.093
0.5mM MnSO4 2.0 2.4 0.591
그 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이, ZnSO4를 이용한 경우에 글루타치온 생산량이 가장 높은 것을 확인하였다.
<2-3> 본 발명의 미오-이노시톨, ZnSO 4 , 시스테인 첨가에 따른 글루타치온 생산 효율
2% TSB, 2.5% 폴리펩톤, 수크로오스 1.5%, 글루코오스 1.0%, 0.5% 암모늄 설페이트로, 0.5% 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트 등으로 이루어진 배지(A), A 배지에 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4 를 추가한 배지(B), B배지에 0.2% 시스테인을 추가한 배지(C)를 제조하여 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 접종하여 32℃에서 진탕하면서 배양하여 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.
배지 종류에 따른 글루타치온 농도
배지 종류 및 시간 A600 DTNB 처리후 A412
0 min 2 min
A 26h 1.602 0.894 0.910
47h 1.513 0.816 0.848
B 26h 1.683 1.039 1.044
47h 1.477 0.893 0.871
C 26h 1.353 1.130 0.997
48h 1.412 1.304 1.067
그 결과, 상기의 표 4에서 나타난 바와 같이 본 발명의 균주는 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4, 0.2% L-시스테인을 모두 추가한 경우 글루타치온 생산 효율이 가장 높은 것을 확인하였다.
상기 실시예 2-1, 2-2, 2-3을 종합 해 보면 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양함에 있어서 최적화 배지는 하기 표 4와 같은 조성과 농도로 이루어진 것이라는 결론에 이르렀다.
Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양 하기위한 최적화 배지 조성
구성 성분 농도
암모늄 설페이트 0.5%
디포타슘 포스페이트 0.5%
모노포타슘 포스페이트 0.5%
Tryptic Soy Broth 2.0%
폴리펩톤 2.5%
수크로오스 1.5%
글루코오스 1.0%
미오-이노시톨 0.025%
ZnSO4 0.25mM
L-시스테인 0.2%
<2-4> 최적 조건에서의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형의 글루타치온 생산효율 비교
상기 표 5의 배양배지 조건에서 배양시간은 72시간, 온도 32℃ 및 진탕배양 회전수는 200rpm 으로 조절하여 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 배양하여 글루타치온 생산량을 측정하였다. 그 결과 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주는 건조균체중량 g당 30mg에서 최대 52mg(건조균체량 대비 3.0~5.2%)의 글루타치온을 함유하는 것을 확인하였다. 이는 박진철 등이 J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 46(4), 348-352 (2003)에서 밝힌 Saccharomyces cerevisiae FF-8 균주의 생산량인 13mg/g(건조균체량 대비 1.3%)이나 대한민국 공개특허공보 10-2004-0014360에서 공개된 Saccharomyces cerevisiae NCYC 2958의 생산량인 27mg/g 내지 39mg/g(건조 상태에서 2.7~3.9%)에 비하여 상당히 높은 수치로 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주의 글루타치온 생산효율이 공지 균주에 비하여 월등한 것을 확인하였다.
<실시예 3>
가축 사료 첨가제로서의 기능
평균 10개월령 수컷 사슴(엘크)를 14두를 선정하여 그 중 7두에는 하기 표 6과 같은 성분 및 비율의 글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물을 매일 체중 kg 당 6mg 씩 일반사료에 섞어 급여하고 7두는 대조군으로 동일한 일반사료만을 급여하여 사육하였다. 이에 따른 체중 증가량 및 녹용생산량을 분석하였다. 체중은 6개월간 사육 개시일을 포함하여 총 4회 측정하였고 녹용생산량은 길이가 30cm 정도 자랐을 때 절각하여 생녹용 상태에서 전자저울로 그 무게를 측정하였다.
가축 사료 첨가제의 성분 및 비율
성분 비율
glutathione(99%) 0.042
감미제 0.020
밀겨 0.938
소계 1.000
실험결과 체중증가량 및 녹용생산량을 하기 표 8 및 9에 나타내었다.
실험대상 사슴의 출생일 및 체중변화
시 험 구 대 조 구
명호 생년월일 개시체중 1차체중 2차체중 3차체중 명호 생년월일 개시체중 1차체중 2차체중 3차체중
04월 19일 06월 05일 07월 18일 10월 04일 04월 19일 06월 05일 07월 18일 10월 04일
182 2006-06-13 156.6 178.9 196.5 203.6 163 2006-05-29 149.1 168.4 186.4 203.5
190 2006-06-30 105.8 134.4 155.3 167.2 191 2006-07-09 113.4 136.9 154.8 176.2
166 2006-06-01 145.1 173.5 198.7 225.7 189 2006-06-30 146.3 169.7 186.7 203.3
165 2006-06-01 119.2 139.8 155.1 173.1 192 2006-07-18 115.3 142.6 161.7 174.6
193 2006-08-15 143.0 169.0 189.5 205.1 184 2006-06-18 142.5 162.2 183.5 199.5
186 2006-06-22 131.0 160.5 175.3 188.0 169 2006-06-04 132.0 146.3 164.6 176.8
157 2006-05-21 133.7 159.4 177.4 185.9 171 2006-06-04 135.1 157.5 175.2 180.0
평 균 133.49 159.36 178.26 192.66 평 균 133.39 154.80 173.27 187.70
편 차 17.01 16.74 18.03 20.27 편 차 14.31 12.98 12.98 13.63
글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물 투여구와 비 투여구의 체중 측정 결과
대조구 시험구
체중(kg) 일당 증체량(kg) 체중(kg) 일당 증체량(kg)
개시시(4/19) 133.4±14.3 133.5±17.0
1.5 개월(6/05) 154.8±13.0 0.46 159.4±16.7 0.55
3개월(7/18) 173.3±13.0 0.43 178.3±18.0 0.44
5.5개월(10/04) 187.8±13.6 0.18 192.7±20.3 0.18
글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물 투여구와 비 투여구의 녹용생산량 측정 결과
구 분 대조구 시험구
녹용생산량(g) 911±256 1066±357
비율(%) 100 117
그 결과, 상기 표 8 및 표 9에서 보는 바와 같이 대조구 및 글루타치온 급여구의 체중 증가량은 두당 각각 39.8, 44.9kg으로, 글루타치온 급여구가 대조구보다 체중증가량이 2.9% 높은 것을 확인하였다. 녹용생산량에 있어서는 대조구와 글루타치온 급여구가 각각 911± 256g 및 1066± 357g으로 글루타치온 급여구가 155g 많았다. 즉, 글루타치온 급여구의 녹용이 비 급여구에 비하여 굵어지고 무거워 약 17%의 녹용생산증가 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
글루타치온 급여에 따른 경제성을 분석할 경우 글루타치온 급여구가 두당 약 38,450원 정도의 경제적 이익을 발생시킨다.
이는 글루타치온이 강력한 항산화제로서 기능하기 때문에 글루타치온이 급여된 가축의 경우 산화적 스트레스 저감을 통하여 생산성이 향상됨을 실험적으로 입증한 것이다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 종래 균주에 비하여 고효율의 글루타치온을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 이에 의한 배양물은 적은 비용으로 가축의 생장을 매우 증진시켜 가축농가의 경제성 및 생산성을 월등히 증대시킬 수 있어 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.

Claims (4)

  1. 글루타치온(glutathione)을 고발현하는 것을 특징으로 하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형(기탁번호 KACC 93069P) 또는 이의 균주 배양물.
  2. 제1항의 균주를 배양하는 배양 방법.
  3. 제1항에 따른 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 배양물로부터 글루타치온을 분리하는 단계를 포함하는 글루타치온 생산방법.
  4. 제1항의 배양물 또는 이로부터 분리한 균주 자체 또는 이들로부터 분리한 글루타치온을 포함하는 가축 사료 첨가용 조성물.
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