KR20150054056A

KR20150054056A - 갈조류 부산물을 유효성분으로 포함하는 발효사료

Info

Publication number: KR20150054056A
Application number: KR1020130135869A
Authority: KR
Inventors: 이상석; 최연재; 김선호
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2013-11-08
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2015-05-20

Abstract

본 발명은 갈조류 부산물을 포함하는 사료에 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)의 혼합균주를 혼합하고 발효한 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갈조류 부산물 발효사료는 발효시 염 저항성을 가지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 사용함으로서 대장균의 번식을 억제하여 저장성이 향상되고, 인체나 동물에 부작용이 적고 안전하다. 아울러, 상기 갈조류 부산물 발효사료를 가축에 제공하는 경우 사료 이용 효율을 증가시켜 부가적인 경제적 이득을 취할 수 있다.

Description

갈조류 부산물을 유효성분으로 포함하는 발효사료{Fermentation feed comprising brown algae by-products}

본 발명은 갈조류 부산물을 유효성분으로 포함하는 발효사료에 관한 것으로, 구체적으로 갈조류 부산물에 염 저항성 발효균을 혼합하여 갈조류 부산물의 알긴산을 비롯한 다당류 및 유용성분을 풍부하게 포함하면서 사료의 저장성 및 이용 효율이 향상된 발효사료에 관한 것이다.

국내 축산업은 과거와는 달리 그 사육호수가 점점 감소하는 반면에 사육 규모는 대형화되었다. 또한 사료원료의 90% 이상을 외국 수입에 의존하고 있어 농가 경영수지의 대부분을 사료비에 지출하고 있어 농가의 부담이 상당히 가중된 상태로, 이는 축산물의 가격불안정의 큰 요인으로 작용하고 있다. 따라서 국내에서는 저비용의 고품질 축산물을 생산하기 위해 각종 부산물을 사료자원으로 재활용하기 위한 시도가 활발히 이루어지고 있는데, 이는 사료자원 확보뿐만 아니라 환경오염 감소 등 다양한 측면에서 바람직한 것으로 보고되고 있다(조석진 2011, 곽완섭 2003). 하나의 예로, 곡류부산물, 버섯배지, 주정박, 식료품 및 해조류 부산물 등이 사료자원으로 다양하게 이용되고 있다.

상기 사료자원으로 사용되는 부산물 중 해조류, 특히 갈조류는 해조류의 약 45%를 차지하는 해조류로, 영양학적으로 열량은 매우 낮으면서 비타민, 무기질, 식이 섬유소가 풍부하고, 육지 식물에는 없는 비소화성 점질성 다당류인 알긴산을 다량 함유하고 있으며, 채소류와 비교해서 필수 아미노산과 불포화지방산을 많이 함유하고 있어, 항산화효과, 중금속 및 방사능 물질의 체외배출, 콜레스테롤의 흡수 억제, 면역시스템 활성화 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 갈조류의 비가식부는 가식부와 동일한 성분을 함유하고 있어, 가축에 대한 급여효과로 착유우의 경우 반추위 내 pH 안정, 산유량 증대, 우유 내 CLA 함량 증가 및 Ca 함량증가에 대한 보고가 있고, 산란계의 경우 체내 단백질 합성 증가, 계란 생산성 및 품질 향상에 효과가 있는 것으로 보고되어 기능성 축산 사료나 사료 보조제로의 효과가 검증되었다(홍중산 2010, 백인규 2004 및 최도열 2005).

그러나, 이러한 갈조류 비가식부를 사료로 이용하기 위해서는 건조 후 분말형태로 제조해야 하는데, 이 경우 미역 채취시기가 2~4월에 집중되어 있기 때문에 일시에 많은 양을 건조할 수 있는 시설이 필요하며, 생초 형태로 저장한다 하더라도 저장에 필요한 냉장시설과 전기료 등으로 인한 생산원가의 상승 등의 문제로 실제 축산농가에서 활용하기 어려우므로 갈조류의 비가식부 및 부산물을 사료원료로 사용하기 위해 원료 처리 가공, 저장성 향상 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

이와 관련된 기술로, 대한민국 공개특허 제2005-0045782호는 가축에 무해한 유기산들을 미역 무게의 1~2% 혼합하여 미역의 미네랄 손실 없이 저장성이 향상되고, 미역의 기호성을 향상시킨 사료 첨가제에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2003-0021877호는 미역 폐기물에 감마-프로테오박테리아를 투여하여 발효시켜 육질개선, 유량증가, 번식장애 개선, 면역력 증강 등에 효과를 가지는 기능성 사료첨가제에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제2002-0070029호는 해조류에 해양미생물을 첨가하여 소화흡수력을 높인 기능성 해조 발효사료의 제조방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나 상기 일부 특허문헌의 해조류 발효사료는 해조류에 포함되어 있는 염 또는 기호성 향상을 위해 첨가된 염이 미생물을 사멸시켜 발효가 제대로 이루어지지 않아 해조류의 다당류 및 유용성분이 충분히 추출되기 어렵고, 체내의 흡수도 어렵다는 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 염 저항성을 가지는 발효균을 이용하여 제조공정이 간단하고, 갈조류 부산물의 알긴산을 비롯한 고분자 다당류 및 유용성분의 함량을 증대시키면서, 저장기간 연장 및 사료의 이용 효율이 향상된 갈조류 부산물 발효사료를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 염 저항성 발효균을 이용하여 다당류 및 유용성분의 함량 및 저장성이 증대된 갈조류 부산물 발효사료를 제공하는 것이다.

본 발명은 갈조류 부산물을 포함하는 사료에 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)의 혼합균주를 혼합하고 발효한 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 갈조류는 다당류인 알긴산(Alginic acid), 후코이단(Fucodian), 한천(Agar), 포피란(porpharan) 등이 풍부하여 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 중금속을 흡착하여 배출시키며 동맥경화, 항균, 치매예방, 면역증간 및 보습성 등의 다양한 기능을 하며, 산성 수용성 다당류인 후코이단은 항혈액 응고 작용, 항종양 항암활성, 항산화 효과 등이 있는 것으로 판명되었고, 요오드, 칼슘, 비타민 12는 생장 및 조혈작용에 관여한다. 그러나 갈조류에는 17 내지 30%의 염분을 포함하고 있어 발효균, 저장성을 유지시키는 미생물 등을 사멸시키므로 이를 발효사료의 원료로 사용하기 위해서는 염분을 제거하는 공정이 필요하다.

따라서, 본 발명의 상기 발효균은 0.01 내지 20%의 염에 대한 저항성을 가지는 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 혼합한 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 혼합한 혼합균주를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 자낭균류에 속하는 대표적인 효모균으로, 비병원성이고, 염, 이온, 열 등의 스트레스 환경에서도 다당류나 단당류를 발효하여 알코올과 이산화탄소를 생성할 수 있어 식품 발효에 오래전부터 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 락토바실러스(Lactobacillus)속에 속하는 젖산균 중 하나로, 습열, 건조, 강산성 등에 대한 저항성을 가지며, 항염작용, 헬리코박터균으로 인한 항위염, 면역기능 개선 등의 효능을 가지고 있다. 상기와 같은 특성으로 락토바실러스 브레비스의 사용에 따라 갈조류 부산물의 염분을 제거하는 공정 없이 발효가 가능하므로 갈조류 부산물의 다당류 및 유용성분을 단시간에 추출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)은 류코노스톡(Leuconostoc)에 속하는 젖산균 중 하나로, 다당류 또는 단당류를 발효하여 덱스트란(dextran)을 생성하며, 유해균의 생장을 억제하는 효능을 가지고 있다. 상기와 같은 특성으로 류코노스톡 시트레움의 사용에 따라 염분 또는 인공 방부제를 별도 사용하지 않고도 저장성이 향상되는 효과를 가져온다.

본 발명에 있어서, 갈조류는 미역, 다시마, 구멍쇠미역, 톳, 녹미채 또는 대황 등이 있으며, 바람직하게는 미역 또는 다시마이다.

본 발명에 있어서, 상기 갈조류 부산물은 갈조류의 뿌리, 줄기, 어린잎, 포자엽 또는 갈조류 엽체의 가식부 중 어느 하나 이상의 부위를 통상의 방법에 의하여 절단, 건조 또는 분쇄하여 분말화한 물질을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 분말화한 물질이다.

본 발명의 발효균은 균주 자체 또는 계대 배양용 배지에 각각의 균주를 접종하여 균수가 증식된 배양액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 계대 배양용 배지에 각각의 균주를 접종하여 균수가 증식된 배양액이다. 하나의 예로서, 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 혼합한 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 혼합한 혼합균주를 고압 멸균된 MRS 액체배지(MRS broth; peptone 10g/L, beef extract 10g/L, yest extract 5g/L, dextrose 10g/L, diammonium-citrate 3g/L, sodium acetate 5g/L, tween 80 1ml, K₂HPO₄ 2g/L, MgSO₄·7H2O 0.2g/L, MnSO₄·7H₂O 0.2g/L, pH 6.2-6.6) 10㎖에 접종하여 20 내지 40℃의 온도에서 48시간 동안 교반 배양한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 갈조류 부산물은 사료의 총 중량에 대하여 37 내지 48중량%, 바람직하게는 40 내지 45중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 갈조류 부산물의 함량이 37중량% 미만인 경우 갈조류의 맛과 향이 나지 않고, 갈조류의 효능과 관련된 성분이 너무 낮아 이를 섭취할 경우 충분한 효과를 볼 수 없으며, 갈조류 부산물의 함량이 48중량%를 초과하는 경우에는 그 이하의 양을 사용하는 것에 비하여 성분의 함량 및 효과가 증가하지 않아 비경제적이다.

본 발명에 있어서, 상기 발효균은 사료의 총 중량에 대하여 5 내지 12중량%, 바람직하게는 6 내지 10중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 발효균의 중량이 5중량% 미만일 경우에는 갈조류 부산물의 알긴산을 비롯한 다당류를 분해시키지 못하거나 유용성분이 충분히 용출되지 못하며, 12중량%를 초과하는 경우 그 이하일 경우와 비교하여 다당류 분해 효율 및 용출된 유용성분의 함량의 증가가 미비하여 비경제적인 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 상기 발효는 20 내지 30℃, 바람직하게는 23 내지 26℃의 온도에서 10 내지 30일, 바람직하게는 10 내지 15일 동안 이루어질 수 있다. 발효온도가 20℃ 미만이거나 발효시간이 10일 미만인 경우 갈조류 부산물의 다당류인 알긴산의 분해가 제대로 이루어지지 않으며, 발효온도가 30℃를 초과하거나 발효시간이 30일을 초과하는 경우 그 이하의 조건에 비하여 발효효율의 증가가 미비하여 비경제적인 문제가 있다.

본 발명에 있어서, 갈조류 부산물을 포함하는 발효사료는 가축의 사료 이용 효율을 향상시키는 효과를 나타낸다.

하나의 구체적 실시에서, 일반 배합사료에 미역 부산물을 혼합하고, 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 혼합한 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 혼합한 혼합균주를 첨가하여 발효시킨 발효사료를 한우의 반추위액에 접종하고 39℃ 배양기에서 12, 24 및 48시간 동안 배양한 후 총 가스발생량, pH, 총 휘발성 지방산 발생량 및 암모니아성 질소 발생량을 측정한 결과, 상기 미역 부산물 발효사료의 pH 값은 발효하지 않은 미역 부산물 사료와 유사한 값을 나타내었고, 암모니아성 질소 발생량 및 총 휘발성 지방산 발생량은 발효하지 않은 미역 부산물 사료에 비하여 증가하였다.

또한, 일반 배합사료에 미역 부산물을 혼합하고, 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 혼합한 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 혼합한 혼합균주를 첨가하여 발효시킨 발효사료를 한우의 반추위 내에 투입하여 0, 12, 24 및 48시간 동안 배양한 후 in situ 건물소화율을 측정한 결과, 배양시간이 증가함에 따라 건물소화율도 증가하였으며, 상기 혼합균주를 첨가하여 사용한 사료는 배양 24시간째 발효하지 않은 미역 부산물 사료에 비하여 높은 건물소화율을 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 사료는 가축의 사육에 사용되는 것이면 어느 것이나 사용 가능하나, 바람직하게는 옥수수, 수수, 밀, 보리 등의 어느 하나 또는 이들로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상의 혼합물을 분쇄하여 얻어지는 분쇄물과 이들을 가공하는 과정에서 얻어지는 쌀겨, 밀겨, 보릿겨 등과 같은 가공 부산물을 일정한 비율로 혼합한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 갈조류 부산물 발효사료는 발효시 염 저항성을 가지는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 또는 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)을 사용함으로서 대장균의 번식을 억제하여 저장성이 향상되고, 인체나 동물에 부작용이 적고 안전하다. 아울러, 상기 갈조류 부산물 발효사료를 가축에 제공하는 경우 사료 이용 효율을 증가시켜 부가적인 경제적 이득을 취할 수 있다.

도 1은 본 발명의 0 내지 20% 염화나트륨을 가지는 배지에서 생장하는 미생물의 균수를 측정한 결과이다.

본 발명은 이하 실시예를 통하여 좀 더 구체적으로 설명될 것이다. 이러한 실시예는 단지 본 발명이 좀 더 이해될 수 있도록 예시적으로 제시되는 것이므로, 이들 실시예로서 본 발명의 범위를 한정해서는 안 될 것이다.

실시예 1 : 염 저항성 균주 분류

1-1. 균주 분리 및 배양

MRS 액체배지, TS(tryptic soy) 액체배지 및 PD(potato dextrose) 액체배지에 염화나트륨을 0, 5, 10, 15, 및 20% 첨가하여 121℃의 온도에서 15분 동안 멸균 시켜 각 배지를 제조하였다. 그 다음 상기 배지에 미역김치, 복분자주정박, 막걸리박으로부터 분리한 균주 중 유산균으로 추정되는 균주는 MRS 액체배지에, 바실러스 균으로 추정되는 균주는 TS 액체배지에, 효모로 추정되는 균주는 PD 액체배지에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양한 후 상기 배양된 균주를 0.85% 생리식염수에 10배 희석한 다음 MRS 고체배지, TS 고체배지 또는 PD 고체배지에 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하여 콜로니형태, pH, 현미경상 형태 등을 측정하여 유산균으로 추정되는 균주 6종, 바실러스로 추정되는 균주 2종 및 효모로 추정되는 2종을 분리하였으며, 유산균으로 추정되는 균주는 A1, A2, F1, C20, M9 및 M1으로, 바실러스로 추정되는 균주는 BS1 및 BS2 및 효모로 추정되는 균주는 Y1 및 Y2로 명명하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실험결과, 염화나트륨 농도별로 배양한 처리구에서 A1, C20, M9 및 M1 균주가 6.0 × 10³ cfu/ml 이상으로 생장하였다.

1-2. 유산균, 바실러스 또는 효모 관련 유전자 검출

상기 실시예 1-1에서 분리 배양한 균주를 50ml 튜브에 담고 세포용해용액(500mM EDTA, pH 9.4) 75㎕를 첨가하여 1분 동안 액체 질소에 담근 후 바로 60℃의 온도에서 녹이는 과정을 4번 반복하였다. 그 다음 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 용출기법을 이용하여 총 게놈성 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 상기 분리한 총 게놈성 DNA(genomic DNA, 50ng)를 주형으로 유산균 및 바실러스균으로 추정되는 균주는 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 프라이머와 1492R(5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 프라이머를 사용하여 94℃의 온도에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃의 온도에서 45초, 55℃의 온도에서 1분 및 72℃의 온도에서 1분 주기로 35회 동안 반응시키는 조건으로, 효모로 추정되는 균주는 ITS 1(5'-CAT TTA GAG GAA CTA AAA GTC G-3') 프라이머와 ITS 4(CCTCCGCTTATTGATATGC) 프라이머를 사용하여 94℃의 온도에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃의 온도에서 1분, 55℃의 온도에서 1분 및 72℃의 온도에서 2분 주기로 35회 동안 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응(Polymerrase chain reaction, PCR)을 통해 16S rDNA를 증폭시켰다.

1-3. 유산균, 바실러스 또는 효모의 계통수 작성

상기 실시예 1-2에서 선별한 균주의 계통학적 소속을 결정하기 위해 BLAST 프로그램 및 EzTaxon을 이용하여 NCBI의 Gene Bank에 있는 16s rRNA 유전자의 염기서열과 비교하였다. 염기서열 정렬은 DLUSTAL W version 1.6을 이용하여 수행하였으며, Kimura two-parameter model에 따라 계산된 distance matrix를 사용하고, NJ(neighbor-joining) 방법에 의해 계통수를 작성하였으며, 부트스트랩(bootstrap) 값은 1,000회 반복하여 계산하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

균주	균주분리한 재료	계통학적 소속	유사성(%)
A1	복분자주정박	Lactobacillus brevis	99.66
A2	복분자주정박	Lactobacillus paracasei	99.24
F1	복분자주정박	Lactobacillus fermentum	99.46
C20	미역김치	Staphylococcus epidermidis	99.86
M9	미역김치	Staphylococcus epidermidis	99.93
M1	미역김치	Leuconostoc citreum	99.77
BS1	막걸리박	Bacillus subtilis	100.00
BS2	막걸리박	Bacillus subtilis	100.00
Y1	막걸리박	Saccharomycess cerevisiae	99.00
Y2	막걸리박	Pichia kudriavzevii	99.00

실험결과, 염화나트륨이 농도별로 포함된 배지에서 6.0 × 10³ cfu/ml 이상으로 생장하는 균주인 A1은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 16 rRNA의 염기서열과 99.66% 일치, C20 및 M9는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 16 rRNA의 염기서열과 99.86% 및 99.93% 일치 및 M1은 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum) 16 rRNA의 염기서열과 99.77% 일치하는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에서는 염 저항성을 가지는 유산균인 A1 및 M1을 미역 부산물 발효사료 제조에 이용하였다.

실시예 2 : 미역 부산물 발효사료 제조

2-1. 균주 준비

물 60L에 효모 추출물 10g, 덱스트린 10g 및 염화나트륨 5g을 첨가한 후 121℃에서 15분 동안 멸균하여 제조한 배지에 A1과 발효 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomycess cerevisiae)를 혼합한 균주 및 M1과 발효 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomycess cerevisiae)를 혼합한 균주를 접종하여 37℃의 온도에서 48시간 동안 배양하였다.

2-2. 미역 부산물 발효사료 제조

분쇄한 미역 부산물, 소맥피, 당밀 및 상기 실시예 3-1에서 유산균 A1 또는 M1과 발효 효모를 1 : 1의 비율로 혼합하여 배양한 배양액을 혼합하고 TMR 믹서기에 넣고 30분 동안 균질화하였다. 그 다음 상기 균질화된 사료를 50L 비닐백에 넣고 24 내지 26℃가 유지되는 상온에서 10일 동안 발효시켰다. 미역 부산물 발효사료의 원료함량 및 성분비율은 하기 표 2에 나타내었다.

원료명	유산균 균주
원료명	대조군	A1	M1
미역부산물	500kg	500kg	500kg
소맥분	500kg	500kg	500kg
당밀	22kg	22kg	22kg
유산균	-	50L	50L
효모배양액	-	50L	50L
물	100	-	-

실시예 3 : 미역부산물 발효사료의 일반성분 분석 및 저장성 평가

3-1. 미역부산물 발효사료의 일반성분 분석

상기 실시예 2-2에서 제조한 미역부산물 발효사료를 AOAC 일반성분 분석법 및 원자흡광광도법을 이용하여 발효사료의 일반성분을 분석하였다. 대조군으로 발효하지 않은 미역부산물 사료를 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

일반성분(%DM)	대조군	실시예 3(A1)	실시예 3(M1)
조단백질	19.38	19.12	19.03
산성세제불용성 섬유소(ADF)	16.01	14.37	18.74
중성세제불용성 섬유소(NDF)	39.54	36.27	40.71
탄수화물	26.36	29.94	26.38
에테르 추출물	3.80	3.48	3.54
조섬유소	10.92	8.80	9.89
조회분	10.92	11.19	10.34
칼슘	0.20	0.28	0.18
인	11.21	1.11	1.13
총 영양분	50.23	53.06	52.76

실험결과, 미역부산물 발효사료 및 대조군의 영양성분 함량은 커다란 변화를 나타내지 않았다.

3-2. 미역부산물 발효사료의 저장성 평가

상기 실시예 2-2에서 제조한 미역부산물 발효사료를 건냉암소에서 10일 및 30일 동안 보관하였다. 그 다음 상기 보관한 사료 3g을 멸균된 생리식염수 27ml에 희석한 후 30분 동안 방치한 후 10진 희석하고, 각 희석액을 PCA(plate count agar), MCN(MRS+cycloheximide+NaN₃+bremocresol green), YGC(yeast glucose chloramphenicol agar) 및 Petrifilm(E.coli/Colifomr count plates) 배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후 각 배지의 콜로니 수를 파악하여 평균을 낸 뒤 희석배수를 감안하여 미생물 개수를 계산하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

	대조군	실시예 3-2(A1)	실시예 3-2(M1)
저장 10일차
총 미생물(cfu/ml)	9.49	9.11	9.01
유산균(cfu/ml)	9.16	9.04	8.69
효모(cfu/ml)	6.09	4.18	4.12
대장균류(cfu/ml)	-	-	-
E.coli(cfu/ml)	-	-	2.25
저장 30일차
총 미생물(cfu/ml)	9.95	9.28	7.69
유산균(cfu/ml)	10.20	9.29	8.77
효모(cfu/ml)	6.83	5.24	6.40
대장균류(cfu/ml)	-	-	-
E.coli(cfu/ml)	-	-	-

실험결과, 발효 10일차 대조군 발효사료는 총균수 9.49×10³ cfu/g, 유산균 9.16×10³cfu/g, 효모 6.09×10³ cfu/g, 대장균 및 대장균군은 검출되지 않았다. A1을 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료는 총균수 9.11×10³ cfu/g, 유산균 9.04×10³ cfu/g, 효모 4.18×10³ cfu/g, 대장균 및 대장균군은 검출되지 않았다. M2를 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료는 총균수 9.01×10³ cfu/g, 유산균 8.69×10³ cfu/g, 효모 4.12×10³ cfu/g, 대장균 2.25×10³ cfu/g, 대장균군은 검출되지 않았다.

또한, 발효 30일차 대조군 발효사료는 총균수 9.95×10³ cfu/g, 유산균 10.20×10³cfu/g, 효모 6.83×10³ cfu/g, 대장균 및 대장균군은 검출되지 않았다. A1을 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료는 총균수 9.28×10³ cfu/g, 유산균 9.29×10³ cfu/g, 효모 5.24×10³ cfu/g, 대장균 및 대장균군은 검출되지 않았다. M2를 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료는 총균수 7.69×10³ cfu/g, 유산균 8.77×10³ cfu/g, 효모 6.40×10³ cfu/g, 대장균 및 대장균군은 검출되지 않았다.

실시예 4 : 미역부산물 발효사료가 반추위 발효성상에 미치는 영향

4-1. 반추위액 채취 및 완충용액 제조

반추위액은 반추위 누관이 장착된 650±47kg 한우(48개월령)를 사용하였다. 채취한 반추위액은 완충액과 1:3(반추위액 : 완충액) 비율로 혼합한 후 pH를 6.7로 맞춘 후 이산화탄소 가스(CO₂ gas)로 충천시켜 준비하였다. 상기 완충액의 조성은 하기 표 5에 나타내었다.

조 성	양(g/L)
K₂HPO₄	0.45
KH₂PO₄	0.45
(NH₄)₂SO₄	0.9
CaCl₂ · 2H₂O	0.12
MgSO₄ · 7H₂O	0.19
CaCl₂ · 2H₂O	0.12
MgSO₄ · 7H₂O	0.19
Trypticase	1.0
Yeast extract	1.0
Cysteine · HCl(pH 6.9)	0.6

4-2. 배양배지의 준비 및 혼합배양

상기 실시예 2-2에서 제조한 미역부산물 발효사료 1g을 160ml 혈청용기(serum bottle)에 넣은 후 상기 실시예 4-1에서 채취한 한우의 반추위액 100ml을 접종하고 부틸고무마개(Butyl-rubber stopper)와 알루미늄 뚜껑으로 막은 후 39℃ 인큐베이터에서 80rpm의 속도로 12, 24 및 48시간 동안 회전배양 하였다. 대조군으로 발효사지 않은 미역부산물 사료를 사용하였다.

4-3. pH 변화 측정

상기 실시예 4-2에서 각 시간별로 배양한 미역부산물 발효사료를 꺼내어 상온과 동일한 온도로 안정화 시킨 후 M503P meter(wrks, Medififield, MA, USA)를 이용하여 pH를 측정하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과는 표 6에 나타내었다.

배양시간(hr)	사료에 첨가된 미생물 균주			SEM	P 값
배양시간(hr)	대조군	A1	M1	SEM	P 값
0	5.61^a	5.49^b	5.61^a	0.01	0.0006
12	5.34^a	5.26^b	5.31^a	0.01	0.0044
24	5.07^a	5.06^a	5.01^b	0.01	0.0152
48	4.99	4.99	4.98	0.01	0.2188
SEM= 표준오차, n=3, ^a,b 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, A1 또는 M1이 첨가된 미역부산물 발효사료의 pH는 배양시간이 증가할수록 감소하였으나, 대조군간에 유의적 차이는 없었다.

4-4. 총 가스 발생량 측정

상기 실시예 4-2에서 배양한 사료를 꺼내어 상온과 동일한 온도로 안정화 시킨 후 EA-6(Inc, Sun Bee instrument)압력센서 측정기를 사용하여 총 가스발생량을 측정하였다. 각 배양시간대별로 얻어진 총 가스발생량을 기초로 하여 실험식 1에 의해 가스발생량을 추정하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

[실험식 1]

y= a + b(1-e^-ct)

y: 시간"t" 경과시 반추위내 가스발생량(ml)

a: "0"시간대의 가스발생량으로 신속하게 분해 발효 생성되는 부분

b: 주어진 시간에 있어서 분해될 수 있는 메탄의 잠재적 발생량(ml)

c: "b" 부분의 시간당 분해상수

t: 반추위내 발효시간

배양시간(hr)	사료에 첨가된 미생물 균주			SEM	P 값
배양시간(hr)	대조군	A1	M1	SEM	P 값
12	19.67^b	35.33^a	38.33^a	4.08	0.0545
24	62.00	62.00	60.33	1.81	0.7751
48	77.67	77.00	74.00	0.97	0.1232
SEM= 표준오차, n=3, ^a,b 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 대조군 및 A1 또는 M1이 첨가된 미역부산물 발효사료는 배양시간이 증가함에 따라 총 가스 발생량이 증가하였으며, A1 또는 M1이 첨가된 미역부산물 발효사료의 경우 미약하지만 대조군에 비하여 총 가스 발생량이 감소하였다.

4-5. 암모니아성 질소(NH₃-N) 농도 측정

상기 실시예 4-2에서 배양한 사료를 13000rpm으로 원심분리 시킨 후 Chany와 Marbach(1962)의 방법에 따라 phenol 용액으로 위액중의 암모니아를 발색시킨 후 스펙트로포토미터(Spectronics 21D)를 이용하여 630nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

배양시간(hr)	사료에 첨가된 미생물 균주			SEM	P 값
배양시간(hr)	대조군	A1	M1	SEM	P 값
0	6.82	7.62	9.20	1.15	0.5060
12	7.43^b	9.09^ab	10.42^a	00.52	0.0216
24	13.31	15.20	13.81	0.54	0.1240
48	14.85	14.05	17.17	11.22	0.3147
SEM= 표준오차, n=3, ^a,b 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 암모니아성 질소 생성량은 A1을 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료를 제외하고 배양시간이 증가함에 따라 암모니아성 질소 생성량이 증가하였으며, 대조군에 비하여 A1 또는 M1을 첨가하여 제조된 미역부산물 발효사료의 암모니아성 질소 생성량이 더 많은 것으로 확인되었다.

4-6. 휘발성지방산 함량 측정

상기 실시예 4-2에서 배양한 사료를 1000×g 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 채취하여 0.2㎛ 필터로 정제한 후 분석하였다. 휘발산 지방산은 아세테이트(acetate), 부틸레이트(butylate), 프로피오네이트(protionate) 함량을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent technolgies 1200 series)를 이용하였으며 검출의 UV의 파장은 210nm와 220nm에서 METACARB87H(Varian, Germany) 컬럼을 사용하여 35℃에서 분석하였다. 이동상 용매는 0.0085N H₂SO₄ 으로 유속은 0.6ml/min으로 진행 하였다. 측정한 결과를 이용하여 유의수준(p value)을 나타냈으며, 사후검정으로 던컨의 다중검정(Duncan's Multiple Range Test, DMRT)을 실시하였다. 그 결과는 표 9에 나타내었다.

배양시간 (hr)	사료에 첨가된 미생물 균주			SEM	P 값
배양시간 (hr)	대조군	A1	M1	SEM	P 값
	아세트산
0	29.86	31.78	33.83	0.41	0.0035
12	35.28	36.18	38.61	0.89	0.0950
24	28.50	28.49	31.16	0.49	0.0201
48	26.69	30.19	30.23	0.88	0.0628
	프로피온산
0	6.93^a	6.57^a	5.08^b	0.14	0.0003
12	11.09	12.28	12.81	0.38	0.1495
24	15.07^b	15.23b	18.39^a	0.22	0.0001
48	15.24	16.13	14.34	0.86	0.4514
	부티르산
0	-	-	-	-	-
12	9.23	13.33	11.98	1.98	0.4093
24	17.38^b	21.00^b	33.40^a	1.10	0.0002
48	21.05	24.44	24.43	1.33	0.2933
	아세트산/프로피온 산 비율
0	4.31^c	4.90^b	6.67^a	0.08	<0.0001
12	3.21	2.95	3.06	0.12	0.5791
24	1.89^a	1.87^a	1.69^b	0.04	0.0247
48	1.76^b	1.88^ab	2.11^a	0.07	0.0437
	총 휘발성지방산
0	36.80	38.34	38.91	0.63	0.0760
12	55.61	61.79	63.48^a	1.37	0.0615
24	60.95^b	64.72^b	82.95^a	00.99	<0.0001
48	62.98	70.75	69.00	2.00	0.1314
SEM= 표준오차, n=3, ^a,b,c 위첨자를 갖는 값은 p<0.05 수준에서 던컨의 다중검정을 이용하여 상호 유의차를 검정한 것임.

실험결과, 대조군 및 A1 또는 M1을 첨가한 미역부산물 발효사료를 첨가한 반추위액의 총 휘발성 지방산의 함량은 배양시간이 증가함에 따라 증가되었다. 구체적으로, A1 또는 M1을 첨가한 미역부산물 발효사료를 첨가한 반추위액은 미약하지만 대조군에 비하여 증가하였다.

실시예 5 : in situ 소화율 실험

상기 실시예 2-2의 미역부산물 발효사료 3g을 나일론 백(5×10 cm, 기공크기 45㎛)에 담아 나일론 백 입구를 나일론 끈으로 묶었다. 나일론 백을 39 내지 40℃의 워터 베스에 담근 후 아침사료 급여 직후 한우의 누관 안쪽으로 깊게 투여하였다. 그 다음 0, 12, 24 및 48시간 동안 배양한 후 나일론 백을 꺼내어 맑은 물이 나올 때까지 세척한 후, 조섬유 분석기(Ankom 200, USA)를 이용하여 10분 동안 추가 세척하였다. 그 다음 80℃의 건조기에서 24시간 동안 건조하고, 하기 실험식 2를 이용하여 건물 소화율을 측정하였다. 그 결과는 표 10에 나타내었다.

[실험식 2]

건물 소화물(%) = [(W1 + W2 - W3)/W2] × 100

W1 = 나일론 백 무게

W2 = 반추위 내로 투입하기 전 발효사료 무게

W3 = 배양 후 나일론 백 무게

배양시간(hr)	사료에 첨가된 미생물 균주			SEM	P 값
배양시간(hr)	대조군	A1	M1	SEM	P 값
0	38.28	27.35	24.81	1.68	0.01
12	56.22	56.15	51.11	2.08	0.26
24	66.69	74.75	66.84	2.81	0.22
48	76.41	74.45	73.65	1.78	0.59
SEM= 표준오차, n=3

실험결과, 배양시간이 증가함에 따라 건물소화율은 증가하였으나 48시간 배양시킨 사료의 소화율은 대조군의 사료 소화율이 더 높았다. 한편, A1 또는 M1의 미생물을 첨가하여 제조한 사료의 소화율은 24시간 배양하였을 때 대조군에 비하여 더 높은 소화율을 보였다.

Claims

갈조류 부산물을 포함하는 사료에 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 혼합균주 또는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum)의 혼합균주를 혼합하고 발효한 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료.
제1항에 있어서, 상기 갈조류 부산물은 미역, 다시마, 구멍쇠미역, 톳, 녹미채 또는 대황의 뿌리, 줄기, 어린잎, 포자엽 또는 갈조류 엽체의 가식부 중 어느 하나 이상 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료.
제1항에 있어서, 상기 갈조류 부산물은 사료의 총 중량에 대하여 37 내지 48 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료.
제1항에 있어서, 상기 염 저항성 발효균은 사료의 총 중량에 대하여 5 내지 12중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료.
제1항에 있어서, 상기 발효는 20 내지 30℃의 온도에서 10 내지 30일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 갈조류 부산물 발효사료.