CN1058055C

CN1058055C - 微生物生产l－抗坏血酸的方法及其发酵培养物

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Publication number: CN1058055C
Application number: CN95192511A
Authority: CN
Inventors: 罗纳德·J·赫斯; 杰弗里·A·朗宁; 托马斯·J·斯卡特拉德
Original assignee: DCV Inc
Current assignee: DCV Inc
Priority date: 1994-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 2000-11-01
Anticipated expiration: 2015-02-10
Also published as: DE69520829T2; ATE200913T1; CA2183034A1; JPH10500002A; CN1150459A; DK0759088T3; DE69520829D1; PT759088E; ES2156206T3; AU1839795A; EP0759088A1; GR3036276T3; WO1995021933A1; EP0759088B1

Abstract

本发明公开了由微生物生产L-抗坏血酸的方法。此方法包括在pH低于约6.0的发酵培养基中培养选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体所组成的组中的生物体。此方法进一步包括从发酵培养基中回收L-抗坏血酸。所公开方法的最主要的优点在于产生了高浓度的胞外L-抗坏血酸，并在该公开的方法的pH下，不会发生因氧化作用所致的胞外L-抗坏血酸的显著降解。L-抗坏血酸有许多已知的用途，如可用作维生素补充剂。

Description

微生物生产L-抗坏血酸的方法及其发酵培养物

本发明涉及由微型藻类生产L-抗坏血酸(维生素C)。具体地说，本发明涉及微型藻类在低pH下(2.5-6.0)生产L-抗坏血酸的方法。

L-抗坏血酸(维生素C)是植物和动物界中广泛分布的水溶性维生素。可从如红辣椒、唐菖蒲叶、蔷薇果、柿子和柠檬果的植物源中提取L-抗坏血酸(L-AA)，也可以从L-木糖，L-半乳糖或D-葡萄糖合成L-AA。F.A.Loewus，L-Ascorbic Acid：Metabolism Biosynthesis、Function，in TheBiochemistry of plants，Vol.3，Academic Press，New York，1980，PP.77-99中提到L-抗坏血酸的生物合成和来源。

尽管大多数动物种类都可合成L-抗坏血酸，但人类和其他灵等类、豚鼠、食果蝙蝠、一些鸟类及例如Coho鲑、虹鳟和鲤鱼的鱼类却不能合成L-抗坏血酸。这些动物需要饮食来源的L-抗坏血酸以防止坏血病。鱼类的L-抗坏血酸缺乏会导致背柱侧凸、背柱前凸、增重减缓、对细菌感染的敏感性增强、皮肤颜色变黑、鳍糜烂以及软骨性骨的形成减慢。

L-抗坏血酸是大用量的化合物，它需要经济而有效的生产方法。多种藻类可生产L-抗坏血酸[例见Aaronson，Arch.Microbiol.112，57-59(1977)和Renstrom，Plant Sci.Letters，28，299-305(1982/1983)]。由于碳源的利用低，酸仅以低浓度产生，由此微型藻类生产L-抗坏血酸还不是一种有用的大量生产方法。

Skatrud在美国专利5,001,059中描述了使用Chlorella Pyrenoidosa微型藻类以高产量形成L-抗坏血酸的方法。由于L-抗坏血酸的浓度和碳源的利用已显著改善，此方法成为微型藻类的L-抗坏血酸生产中的一种显著改善的方法。然而，在持续生产L-抗坏血酸所必需的相对高的pH(6.5-7)下，胞外酸容易被细胞代谢和L-抗坏血酸生产所必需的空气氧化。对在低pH(低于6.5)下生产L-抗坏血酸的有效的微型藻类方法的需求仍存在。

本发明针对的是生产L-抗坏血酸的方法，此方法包括在pH低于约6.0的发酵液中培养选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体组成的组中的生物体。此方法进一步包括从发酵培养基中回收L-抗坏血酸。可选择的实施方案包括在含有可利用氧源的发酵培养基中培养上文所述的生物体，并从发酵培养基中回收L-抗坏血酸以生产L-抗坏血酸的方法，其中发酵培养基包括胞外L-抗坏血酸。较优选的生物体是Prototheca属的生物体，特别优选的生物体是Prototheca moriformis和Prototheca zopfii种的生物体。本发明方法特别有利的原因是它可导致生产出高浓度的胞外L-抗坏血酸，从而使得L-抗坏血酸的回收比假如大多数L-抗坏血酸被分散在细胞内的情况下的回收更加简单。本发明方法可在可利用的氧源存在下进行，因为在本发明方法的pH条件下，所生产的胞外L-抗坏血酸的降解不显著。

胞外L-抗坏血酸的回收可通过多种方法实现，包括离子交换、层析法、抽提、膜分离，反相渗透、蒸馏、化学衍生化方法和结晶作用。此方法可另外包括胞内L-抗坏血酸的回收。在一个实施方案中，从发酵液中除去细胞，从无细胞的发酵液中回收胞外L-抗坏血酸以及从分离的细胞中回收L-抗坏血酸。

本发明的另一方面包括发酵培养物，它含有生产L-抗坏血酸的微型藻类和发酵培养基。在此实施方案中，发酵培养基包括胞外L-抗坏血酸，并具有可利用的氧源。在发酵培养物的较优选的实施方案中，微型藻类选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体所组成的组。另外，发酵培养物的较优选的实施方案包括pH约低于6的发酵培养物，更优选的低于5.5，进一步优选低于约5.0。

微生物：用于在低pH下生产L-抗坏血酸的较优选的微生物是Prototheca属，尤其是Prototheca zopfii和Prototheca moriformis种的微型藻类以及Chlorella protothecoides种的微型藻类。此方法已被下列生物体阐明：Prototheca zopfii BTR 1254株，Prototheca moriformis BTR 1385株(ATCC75669)，Chlorella protothecoides BTR 902(ATCC 75667)。Prototheca zopfiiUTEX 1438株能在高pH下生产L-抗坏血酸，也能在低pH下生产L-抗坏血酸。

Prototheca zopfii UTEX 1438株得自藻类培养物保藏中心(Departmentof Botany，University of Texas at Austin，Austin，Texas 78713-7640，USA)。因目前每种仅$25.00的低廉售价，培养物对公众而言是可以使用的。Prototheca zopfii BTR 1254株，Prototheca moriformis BTR 1385株和Chlorellaprotothecoides BTR 902株选自野生型。Prototheca moriformis BTR 1385株(ATCC 75669)和Chlorella protothecoides BTR 902(ATCC 75667)于1994年2月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive Rockville，MD 20852，USA.

培养基：培养基包括碳源、多种盐和一般还包括痕量矿物质。碳源可以是适于本发明的微生物发酵的任何碳源。尤其是，碳源可选自乙醇、甘油和葡萄糖，并优选为葡萄糖。葡萄糖源可以是葡萄糖或可在原位转化为葡萄糖的任何糖类，如糖蜜、玉米糖蜜等。

为了最适地促进，而不抑制或不恰当地限制细胞生长，可在发酵罐中使用非抑制/非限制量的葡萄糖源。尽管葡萄糖源的最适浓度随生物体的不同而有所不同，但通过试验可容易地确定。维持葡萄源在5-30g/L范围的按时加入在正常情况下足以促进细胞生长而避免葡萄糖的抑制作用。

按需要，其他添加物可随葡萄糖源一起在最初加入，也可连续加入到培养基中以维持它们的浓度。它们包括碱性金属磷酸盐，例如磷酸钠和钾，尤其如磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。磷酸氢二钠的总量典型地为约1-2总g/L，优选为1-1.5总g/L，更优选的为1.3总g/L。起初加到发酵罐中的磷酸氢二钠的量典型地约为所加入磷酸氢二钠总量的35-50％，更典型地约为40-45％。磷酸二氢钾的总量通常为约1.5-3g/L，更通常地约为2-2.5g/L。起初加入的量通常为总量的40-50％，更通常地约为45-50％。

生物学可接受的螯合剂，如拧檬酸三钠最好以约为0.8-1.2g/L，通常约为1.0g/L的总量加入。生物学可接受的矿物酸被加入以维持溶液中的痕量金属并中和通常用作氮源的氨。为方便起见，可使用约为1-2mL/L，典型地约为1.2-1.5mL/L的浓硫酸。

加入约为0.1-0.2g/L，优选约为0.1-0.15g/L的镁以作为生理学上可接受的盐、如硫酸盐。由于铁和铜可加速胞外L-抗坏血酸的降解，从而抑制其在培养基中的积累，故应限制所使用的这些金属的量。最初加入的铁(+2)约为2-5mg/L，优选约为3-4mg/L，在任何随后的添加中都不包括铁。铜以相当少的量存在，通常为每g葡萄糖1-50g铜。所加入痕量金属溶液(表3)的总量约为10-15mL/L，典型地约为12-14mL/L。以葡萄糖为基础，痕量金属溶液相当于0.1-0.2mL/g葡萄糖。为方便起见，在发酵期间加入表1所示的溶液(溶液制备述于表5)。尽管大量盐类被归为一或二碱价的，应理解这是因方便起见而非必需如此。由于这些化合物是缓冲液，质子化程度会随培养基pH的变化而变化。为避免引入外源微生物，应使用无菌加入。

表1

培养基配方

成分浓度

(相对于葡萄糖)

葡萄糖 1.0

柠檬酸三钠，二水合物 0.0125

无水硫酸镁 0.0082

磷酸二氢钠 0.0116

磷酸二氢钾 0.0238

磷酸氢二钠 0.0121

98％的硫酸(w/w) 0.0329

痕量金属混合物(表3) 0.1675mL/g

发酵：接种前，将营养培养基升至所需温度，典型地为30-40℃，优选约为35℃。以足以在合理生长期之后产生高的细胞密度的量在培养基中接种所需微生物的活跃生长培养物。以细胞干重为基础，典型的最初细胞密度为0.1-0.5g/L，更典型地为0.15-0.4g/L。将细胞培养至细胞密度为至少约为5g/L，优选约为10-80g/L，更优选为40-60g/L。这典型地需要10-40小时，更典型地需要15-25小时。

最初加入的葡萄糖为其总量的约15-30％，典型地约为20-25％。当葡萄糖浓度降低时，按需要通过加入葡萄糖-盐类浓缩溶液(表1)的约20％等分试样而将总葡萄糖浓度保持在30g/L以下来补充。如葡萄糖氧化酶试验和高压液相层析的常规技术可用于监测上清液，即培养基中的无细胞成分中的葡萄糖浓度。在发酵期间可加入少量抗泡沫剂。

氨被加入以作为氮源并控制pH。结果，培养基中氮的量取决于其酸度及缓冲液容量。通过在被引入发酵罐的空气流或其它氧源中加入氨气气流可方便地加入氨。

培养基的pH可被控制在所需的限度内，如按需要通过加入氨或无机碱。优选将pH维持在因氧化而使胞外L-抗坏血酸发生显著降解的pH之下。在本申请中，显著降解是指大于约20％的所生产的L-抗坏血酸的降解，更特别地，为大于约10％的所生产的L-抗坏血酸的降解，更特别地，为大于约5％所生产的胞外L-抗坏血酸的降解。在优选的实施方案中，培养基的pH维持在约pH6.0以下，更优选约为pH5.5以下，最优选约为pH5.0以下。通过将发酵培养基的pH维持在上述参数以内，即可得到与L-抗坏血酸的产生相关的显著的优点。在较低的pH值下，所生产的胞外L-抗坏血酸的降解有所降低。因此，可得到较高的L-抗坏血酸产量。本领域技术人员应知道胞外L-抗坏血酸的回收比胞内L-抗坏血酸的回收显然较容易。另外，L-抗坏血酸的胞外生产可允许较高产率之方法的开发，因为无需可导致L-抗坏血酸代谢生产的反馈抑制的超高浓度的胞内L-抗坏血酸即可开发商用方法。

在本发明的一个实施方案中，在细胞生长初期，将pH控制为约3.0-6.0，优选约为3.5-5.0，更优选约为3.5-4.5。当细胞密度大于约10g/L，通常在约10-25小时之后，将pH降为2.5-5.0，优选为2.5-4.0。通过暂时停止加入氨，可实现此目的。由于细胞产生了酸，故液体培养基的pH有所降低。当液体培养基达到所需pH时，恢复氨的加入。

如上所述，通过将pH值维持在上述参数范围内的本发明的发酵方法的操作，胞外抗坏血酸可在发酵培养基中存在而不会被氧化作用所降解的。而且，L-抗坏血酸在发酵培养基中积累以达到高浓度的胞外抗坏血酸，且抗坏血酸不会被氧化作用显著降解也是可能的。因此，即使发酵过程需要氧的存在，(这一点将在下文详细描述)，还是可以在可利用的氧源存在下，成功地进行本发明的生产高产量的胞外抗坏血酸的发酵过程。应注意到可利用的氧源不局限于空气或氧气，也可包括在发酵环境中可转变成氧气的其他化合物种类。

在发酵过程中必需往培养基中加入足够的氧以维持细胞生长早期的细胞生长并维持代谢和L-抗坏血酸的形成。振荡培养基和往其中通气可方便地提供氧。如搅拌或振荡的常规方法可用来振荡培养基及使之通气。优选培养基中氧的浓度是饱和值(即大气压下，约30-40℃时培养基中氧的溶解度)的20-100％，尽管如果发酵未受有害影响，也可有更低的浓度。由常规方法，如用氧探针电极即可监测培养基中的氧浓度。可使用其他氧源，如未经稀释的氧气和用除氮气外的惰性气体稀释过的氧气。

持续发酵直至L-抗坏血酸形成才基本上停止，这是由胞外L-抗坏血酸的积累证实的。总发酵时间典型地为24-120小时。

典型地，本发明方法所生产的L-抗坏血酸大多数是胞外的。用诸如过滤或离心的常规方法从液体培养基中去除细胞，用诸如离子交换、层析、抽提、结晶作用、膜分离、反相渗透、蒸馏、化学衍生化方法等的常规方法可从无细胞上清液中回收L-抗坏血酸。术语“化学衍生化方法”是指其中所生产的L-抗坏血酸与另一种较易回收和/或更稳定的化合物种类反应的方法。例如，Cayle在美国专利4,595,659中公开了用常规离子交换树脂吸收和洗脱，再经脱色、蒸发和结晶从含水发酵培养基中分离L-抗坏血酸的方法。K.Shimizu.Agr.Biol.Chem.31，346-353(1967)中描述了用阴离子交换树脂的连续多床层抽提系统从发酵液中分离结构类似的异抗坏血酸的方法。

由本发明方法回收L-抗坏血酸可包括连续、半连续或分批的方法。在连续和半连续方法中，由于将在发酵过程中从发酵容器中除去胞外L-抗坏血酸，故其胞外L-抗坏血酸的浓度不会与分批回收法中的一样大。实际上，在L-抗坏血酸的胞外浓度一直很低或接近不可测的情况下可使用连续或半连续的方法。

如上文所述，本发明方法可产生大量的胞外L-抗坏血酸。具体而言，此方法产生了胞外L-抗坏血酸，以致总L-抗坏血酸的至少约2％是胞外的，更优选总L-抗坏血酸中至少约10％为胞外的，最优选总L-抗坏血酸中至少约20％为胞外的。通过使用本发明，所得胞外L-抗坏血酸浓度大于约1mg/L，更优选大于约10mg/L，更优选大于约20mL/L。

本发明的另一个实施方案包括发酵培养物，所述培养物包括生产L-抗坏血酸的微型藻类和发酵培养基。在此实施方案中，发酵培养基包括胞外L-抗坏血酸和可利用的氧源。生产L-抗坏血酸的藻类可与上述的那些相同。类似地，包括胞外L-抗坏血酸的发酵培养基组合物可以是上文概括性描述的那些。

工业实用性

此方法通过在低pH发酵液(2.5-6.0)中发酵以生产L-抗坏血酸。在此pH下，L-抗坏血酸不易被空气氧化。结果，所产生的L-抗坏血酸不必为胞内的。在培养液中积累的L-抗坏血酸不易被培养液中存在的氧氧化。将L-抗坏血酸(维生素C)用作食品添加剂以防止坏血病。L-抗坏血酸及一些它的衍生物，如ascorbyl palmitate已被用作食物中的抗氧化剂。

实施例1

此实施例阐明了Prototheca能在高pH下生产L-抗坏血酸(L-AA)，所产生的大多数L-抗坏血酸是胞内的。

培养基制备

在装配有搅拌培养基及向其中加入营养成分之装置、氧源及下述其他试剂的1升玻璃发酵罐中，将溶于600mL蒸馏水中的0.27g磷酸二氢钾和0.23g磷酸氢二钠溶液进行热灭菌。培养基冷却之后，通过0.2μm无菌滤器加入5mL 1.9g/L的七水硫酸亚铁溶液。

葡萄糖盐类浓缩物将列于表2的成分灭菌、混合、冷却后，至终体积为600mL。

表2

葡萄糖-盐类浓缩物

用量化合物/成分

组1

56g 葡萄糖，于80mL水中的食品级单水合物

(以无水为基础)

组2

0.7g 柠檬酸三钠二水合物

0.46g 无水硫酸镁

0.7mL 于10mL水中的硫酸

组3

0.65g 磷酸二氢钠

1.3g 磷酸二氢钾

0.68g 于10mL水中的磷酸氢二钠

组4

9.4mL 痕量金属溶液(见表3)

表3

痕量金属溶液

成分浓度^a(mg/L)

氯化钙，二水合物 3102

硫酸镁(II)，单水合物 400

硫酸铜(II)，单水合物 16

氯化钴(II)，五水合物 40

硼酸 160

硫酸锌(II)，七水合物 400

钼酸钠，二水合物 19

硫酸氧钒，二水合物 20

硝酸镍(II)，六水合物 8

亚硒酸钠 18

^a金属浓度

痕量金属溶液用蒸馏水将表3所列的成分和20mL浓盐酸制成1升。

营养培养基在发酵罐中的磷酸盐培养基中加入20mL葡萄糖-盐类浓缩物。

细胞生长和L-抗坏血酸的产生加热营养培养基并维持在35℃，以300rpm开始搅拌，空气以0.1L/min喷入培养基中，在气流中加入氨以将pH调到6.9。用活性生长的培养物接种培养基以使最初细胞密度约为0.3g/L干重。

将细胞培养到密度为约20-50g/L，(干重计)。加入氨气以将pH控制为6.5-7.0。为了在发酵过程中将过量的不溶性氧维持在空气饱和度的20％和90％之间，开始以450rpm搅拌，再增加至800rpm。开始以0.2L/min通气，再增加至0.6L/min。或通过葡萄糖氧化酶试验或通过高压液相层析监测上清液中葡萄糖的可利用性。当葡萄糖浓度降低时，通过加入约20％葡萄糖-盐类浓缩物溶液的等分试样，而将总葡萄糖浓度维持在30g/L以下。当所有葡萄糖-盐类浓缩物已被加入，随后又用尽后，检测培养液中的L-抗坏血酸。

Grun and Loewus，Analytical Biochemistry(1983)130：191-198中描述了用以测定L-抗坏血酸(L-AA)的方法。此方法是使用7.8×300mm有机酸分析柱，HPX-87(Bio-Rad Laboratories，Riehmond，CA)的离子交换法。条件是：固定相，0.013M硝酸；流速：0.8mL/min；压力：1500psig(1.04×10⁸/dynes/cm²)；检测：245nm处的吸光率。此系统可区分抗坏血酸的L-和D-异构体。

对细胞密度的干重测定而言，从培养物中取出全培养液样品，以4000×g将5mL培养液离心5分钟，用蒸馏水将沉淀洗一次，再洗入标出皮重的铝称重盘。在60℃下干燥细胞8-24小时，再在105℃下干燥1小时。经差异法计算细胞重量，结果示于表4。

表4

藻株温度细胞干重总L-AA

(℃) (g/L) (mg/L)

Prototheca zopfii

UTEX 1438^a 35 27.4 37.8

^a四次发酵的平均值。

实施例2

此实施例阐明Prototheca zopfii在低pH(3.5-5.0)下生产L-抗坏血酸。在胞外培养基中产生了大量的L-抗坏血酸，甚至在培养液中含可测量的溶解氧时也能如此。除了如所指明的，接着进行实施例1中的步骤。发酵在14L的发酵罐中进行，以与在1L发酵罐中相同的方式定形和控制，所使用浓缩物示于表5。

表5

葡萄糖-盐类浓缩物

用量化合物/成分

组1

800g 葡萄糖，于2.1L水中的食品级单水合物

(以无水为基础)

组2

15g 柠檬酸三钠二水合物

6.6g 无水硫酸镁

10mL 250ml水中的硫酸

组3

22g 磷酸二氢钠

22g 于250mL水中的磷酸氢二钠

组4

134mL 痕量金属溶液(见表3)

培养基制备在14L玻璃发酵罐中将溶于7.2L蒸馏水中的3.9g磷酸二氢钾和3.3g磷酸氢二钠的溶液热灭菌。培养基冷却后，通过0.2μm无菌滤器加入27mL 6.0g/L的七水硫酸亚铁溶液。

细胞生长和L-抗坏血酸的生产除加入表6所列的成分外，待发酵罐已热灭菌并冷却之后，向其中无菌加入硫胺素盐酸，使其在培养基中的浓度为2mg/L。温度为30℃。用Prototheca zopfii BTR 1254株的活性生长培养物接种培养基以达到约0.3g/L干重的最初细胞密度。

使细胞生长至细胞密度为56g/L干重(生长速率，0.20h^-1)。通过加入氨气将pH维持在约3.5-5.0。开始以100rpm搅拌，再增加至800rpm。开始以2.0L/min通入空气，再增加至6.0L/min。条件和分析结果示于表6。

表6

总上清液

时间 pH C.D. L-AA L-AA 注释

(小时) (g/L) (mg/L) (mg/L)

6 5.0 0.6

12 4.8 3.3 250rpm；220mL^a

21 350rpm；4.0L/min

22 5.0 15.9 400mL

24 3.8 24.0 34.6 11.2 6.0L/min；500mL

25 4.0 32.2 39.7 15.8 800rpm^b

27 3.9 48.6 58.6 27.0

28 4.0 53.6 71.6 71.6 所测的溶解氧为零

29 4.0 55.8 73.5 73.5

^a葡萄糖-盐类浓缩物

^b在下一个3小时内加入1050mL葡萄糖盐类浓缩物实施例3

此实施例阐明了Prototheca moriformis在低pH(4.0-5.0)下生产L-抗坏血酸。在胞外培养基中产生了大量的L-抗坏血酸，甚至在含可测量溶解氧的培养液中也是如此。按实施例2的步骤进行，除非特别指明。

细胞生长和L-抗坏血酸的生产待发酵罐已热灭菌和冷却之后，除加入表1所列成分外，还要无菌加入硫胺素盐酸，使其在培养基中的浓度为2mg/L。温度为30℃。

用Prototheca moriformis ATCC 75669的活性生长培养物接种培养基以得到约为0.3g/L干重的最初细胞密度。使细胞生长至细胞密度为42g/L干重(生长速率为0.23h^-1)。在最初的22小时，通过加入无水氨气将pH值维持在约5.0。然后停止加入氨。当pH已降至4.0时，恢复氨的加入。在发酵的剩余时间里将pH维持在4.0，结果示于表7。

表7

总上清液

时间 pH C.D. L-AA L-AA mg L-AA/ 注释

(小时) (g/L) (mg/L) (mg/L) g细胞

11 5.0 0.9

12 250rpm

17 4.8 3.9 400 rpm；3.0

L/min；200mL^a

20 5.2 8.2 400rpm

21 500mL；4L/min

22 5.2 10.8 400mL^b

24 800rpm；5L/min

26 4.3 27.7 105 109 3.8

28 4.1 34.5 132 140 3.8 850rpm

30 4.1 41.9 150 162 3.8

^a葡萄糖-盐类浓缩物

^b在下一个6时内加入1115mL实施例4

此实施例阐明了Chlorella protothecoides在低pH下(3.5-5.0)生产L-抗坏血酸。在胞外培养基中产生了大量的L-抗坏血酸，甚至在含有可测量的溶解氧的培养液中也是如此，除了如指明的，按实施例3的步骤进行。

细胞生长和L-抗坏血酸的生产用Chlorella protothecoides ATCC75667的活性生长培养物接种培养基以使最初的细胞密度约为0.3g/L干重。使细胞生长至细胞密度为37g/L干重(生长速率为0.16h^-1)。在最初的18小时内，通过加入无水氨气将pH值维持在约5.0。然后停止加入氨，pH不再增加。当pH降至3.5时，恢复氨的加入。在发酵的剩余时间里，将pH维持在3.5。结果示于表8。

表8

总上清液

时间 pH C.D. L-AA L-AA 注释

(小时) (g/L) (mg/L) (mg/L)

5 5.1 0.6 300rpm；50mL^a

18 5.0 4.8

22 -- -- 400rpm；350mL^a

24 3.4 11.9 15.2 1.8 600mL；4.0L/min

27 3.4 17.0 24.5 11.2 700rpm^b

32 3.5 23.5 64.0 21.0

35 3.5 36.7 100.4 52.0 耗尽葡萄糖

^a葡萄糖-盐类浓缩物

^b在下一个3小时内加入1800mL葡萄糖盐类浓缩物

Claims

1、生产L-抗坏血酸的方法，此方法包括：

(a)在pH2.5-6.0的发酵培养基中于有可利用的氧源存在下培养选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体组成的组中的生物体；和

(b)从所说发酵培养基中回收L-抗坏血酸。

2、如权利要求1所要求的方法，其中所说生物体是Prototheca属的生物体。

3、如权利要求1所要求的方法，其中所说生物体选自由Protothecamoriformis和Prototheca zopfii组成的组。

4、如权利要求1所要求的方法，其中所说发酵培养基的pH为2.5-5.5。

5、如权利要求1所要求的方法，其中所说发酵培养基的pH为2.5-5.0。

6、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到至少1mg/L的胞外L-抗坏血酸在所说发酵培养基中积累。

7、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到胞外L-抗坏血酸的产生在所说发酵培养基中停止。

8、如权利要求1所要求的方法，其中所说的回收步骤包括从胞外发酵培养基中回收L-抗坏血酸。

9、如权利要求8所要求的方法，其中所说的从胞外发酵培养基中回收L-抗坏血酸的步骤是使用选自由离子交换、层析、抽提、膜分离、反相渗透、蒸馏、化学衍生化方法和结晶作用所组成的组中的方法。

10、如权利要求1所要求的方法，其中所说的回收步骤进一步包括回收胞内L-抗坏血酸的步骤。

11、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到所说发酵培养基中至少2％的L-抗坏血酸是胞外的。

12、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到所说发酵培养基中至少10％的L-抗坏血酸是胞外的。

13、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到所说发酵培养基中至少20％的L-抗坏血酸是胞外的。

14、如权利要求1所要求的方法，其中实施该方法直到所说生物体的细胞密度至少为5g/L。

15、权利要求1的方法，其中实施该方法直到该发酵培养基的胞外L-抗坏血酸浓度大于10mg/L。

16、一种发酵培养物，通过包括在pH2.5-6.0间的发酵培养基和可利用的氧源中培养选自Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体的生物体的方法而生产。

17、如权利要求16所要求的发酵培养物，其中所说发酵培养基至少含有1mg/L的胞外L-抗坏血酸。

18、如权利要求16所要求的发酵培养物，其中所说的生物体选自由Prototheca moriformis ATCC保藏号75669，Prototheca zopfii ATCC保藏号16532和Chlorella protothecoides ATCC保藏号75667所组成的组中的生物体。