JPH10500002A

JPH10500002A - 微生物におけるｌ−アスコルビン酸の生成

Info

Publication number: JPH10500002A
Application number: JP7521305A
Authority: JP
Inventors: ジョンハス、ロナルド; エー．ラニング、ジェフリー; ジェイ．スカートラド、トーマス
Original assignee: バイオテクニカルリソーシスエル．ピー．
Priority date: 1994-02-10
Filing date: 1995-02-10
Publication date: 1998-01-06
Also published as: DK0759088T3; EP0759088B1; EP0759088A1; DE69520829D1; PT759088E; CA2183034A1; ES2156206T3; GR3036276T3; CN1058055C; CN1150459A; DE69520829T2; ATE200913T1; WO1995021933A1; AU1839795A

Abstract

(57)【要約】微生物を用いたＬ−アスコルビン酸の生産方法を開示する。本発明の方法はプロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択された生物を約６．０未満のｐＨを有する発酵培養基中において培養することを含む。更に、本発明の方法はＬ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収することを含む。本発明の方法の主な効果としては、高い濃度の細胞外Ｌ−アスコルビン酸を生産し得ることと、本発明のプロセスのｐＨにおいて酸化による細胞外Ｌ−アスコルビン酸の顕著な分解が生じないことが挙げられる。Ｌ−アスコルビン酸にはビタミン補助剤等の多くの周知の用途がある。

Description

【発明の詳細な説明】微生物におけるＬ−アスコルビン酸の生成発明の分野本発明は微小藻類を用いたＬ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）の生産、より詳細には、低いｐＨ（２．５〜６．０）において微小藻類を用いてＬ−アスコルビン酸を生産する方法に関する。発明の背景Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）は動植物界に広く分布する水溶性ビタミンである。Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）はパプリカ、グラジオラスの葉、バラの実、柿及び柑橘類等の植物から抽出するか、またはＬ−キシロース、Ｌ−ガラクトース及びＤ−グルコースのいづれか１つから合成し得る。ニューヨーク州に所在するアカデミック・プレス（Academicpress）から１９８０年に出版された植物生化学第３版（The Biochemistry of Plants，Vol.3）の７７〜９９頁に記載されているエフ．エイ．ルースによる記述“Ｌ−アスコルビン酸：その代謝、生合成及び作用”にはＬ−アスコルビン酸の生合成及び供給源が開示されている。殆どの種の動物がＬ−アスコルビン酸を生成するにもかかわらず、人及び他の霊長類、テンジクネズミ、オオコウモリ、数種類の鳥、並びにギンザケ、ニジマス及び鯉等の魚はＬ−アスコルビン酸を生成できない。これらの動物は壊血病を予防するためにＬ−アスコルビン酸の摂取源を必要とする。魚類におけるＬ−アスコルビン酸の不足は脊柱側弯症、脊柱前湾症、体重増加の鈍化、細菌に対する感染の増加、皮膚の黒色化、ヒレの腐食及び軟骨生成量低下等の各種障害を引き起こす。Ｌ−アスコルビン酸は経済的及び効果的な生産方法を要する大量消費化学物質である。各種の藻類がＬ−アスコルビン酸を生成する（１９７７年に発行された古生微生物学（Arch．Microbiol.）第１１２刊の５７〜５９頁に記載されているアーロンソンの記述と、１９８２／１９８３年に発行された植物科学通信（plan t sci．Letters）第２８刊の２９９〜３０５頁に記載されているレンストロームの記述とを参照）。微小藻類は炭素源利用効率が低く、かつ低い濃度のＬ−アスコルビン酸を生成する。このため、微小藻類を用いたＬ−アスコルビン酸の生産は大量生産には不適切とされていた。スカットラッドによる米国特許第５，００１，０５９号はＬ−アスコルビン酸を大量生産すべく微小藻類のうちのクロレラ・ピレノイドサ種（speciesChlorel la pyrenoidosa）を利用した方法を開示している。この方法はＬ−アスコルビン酸の濃度及び炭素源の利用効率を大きく改善した点において、微小藻類を用いたＬ−アスコルビン酸の生産における大きな進歩といえる。しかし、Ｌ−アスコルビン酸の連続生産に必要とされる比較的高いｐＨ（６．５〜７）では、細胞外Ｌ −アスコルビン酸は細胞の新陳代謝及びＬ−アスコルビン酸生成に必要な空気により容易に酸化される。従って、微小藻類を用いて低いｐＨ（６．５未満）でＬ −アスコルビン酸を生産する効果的な方法が必要である。発明の概要本発明はＬ−アスコルビン酸の生産方法に関する。本発明の生産方法はプロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種（species Chlorellaprotothec oides）の生物からなるグループから選択された生物を約６．０未満のｐＨを有する発酵培養基中で培養することを含む。更に、本発明の生産方法はＬ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収することを含む。別の実施の形態は利用可能な酸素源及び細胞外Ｌ−アスコルビン酸を有する発酵培養基中において前記の生物を培養することによりＬ−アスコルビン酸を生成し、次いで同Ｌ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収する方法を含む。好ましい生物はプロトセカ属の生物であり、特に好ましい生物としてはプロトセカ・モリフォーミス種（species Protot heca moriformis）及びプロトセカ・ゾフィ種（species prototheca zopfii）の生物が挙げられる。本発明の方法は高濃度の細胞外Ｌ− アスコルビン酸を生産可能である。この結果、殆どのＬ−アスコルビン酸を細胞内において分離する方法と比較して更に簡単にＬ−アスコルビン酸の回収が可能である。この意味において本発明の方法は特に効果的である。本発明の方法のｐＨでは、生成された細胞外Ｌ−アスコルビン酸は顕著な分解を示さない。このため、本発明の方法は利用可能な酸素源が存在する場合にも実施可能である。細胞外Ｌ−アスコルビン酸の回収は、イオン交換、クロマトログラフィー、抽出、膜による分離、逆浸透、蒸留、化学誘導プロセス及び結晶化を含む各種の方法を用いて実施し得る。更に、本発明の方法は細胞内Ｌ−アスコルビン酸の回収を含み得る。１つの実施の形態では、細胞を発酵培養基から取出し、次いで細胞外Ｌ−アスコルビン酸を細胞を含まない発酵培養基から回収することにより、Ｌ −アスコルビン酸を分離された細胞から独立して回収する。本発明の別の実施の形態はＬ−アスコルビン酸を生成する微小藻類（以下、Ｌ −アスコルビン酸生成微小藻類と称する）と、発酵培養基とを有する発酵カルチャーを含む。本実施の形態において、発酵培養基は細胞外Ｌ−アスコルビン酸及び利用可能な酸素源を有する。発酵カルチャーの好ましい実施の形態において、微小藻類はプロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択し得る。更に、発酵カルチャーの好ましい実施の形態は約６未満、好ましくは約５．５未満、更に好ましくは約５．０未満のｐＨを有する発酵カルチャーを含む。発明の詳細な説明微生物低いｐＨにおけるＬ−アスコルビン酸の生産に好ましい微生物はプロトセカ属の微小藻類、特にプロトセカ・ゾフィ種及びプロトセカ・モリフォーミス種の微小藻類と、クロレラ・プロトセコイデス種の微小藻類とが挙げられる。本発明の方法はプロトセカ・ゾフィの菌株であるＢＴＲ１２５４と、プロトセカ・モリフォーミスの菌株であるＢＴＲ１３８５（ＡＴＣＣ７５６６９）と、クロレラ・プロトセコイデスの菌株であるＢＴＲ９０２（ＡＴＣＣ７５６６７）とを使用して立証された。プロトセカ・ゾフィの菌株であるＵＴＥＸ１４３８は高いｐＨにおいてＬ−アスコルビン酸を生成可能であり、さらには低いｐＨにおいてもＬ−アスコルビン酸を生成する。プロトセカ・ゾフィの菌株であるＵＴＥＸ１４３８はアメリカ合衆国、７８７１３−７６４０テキサス州、オースチンに所在するテキサス大学オースチン校植物学部の藻類カルチャー・コレクションから入手した。現在、カルチャーは１つ当たり２５．００米ドルで一般に分け与えられている。プロトセカ・ゾフィの菌株であるＢＴＲ１２５４と、プロトセカ・モリフォーミスの菌株であるＢＴＲ１３８５と、クロレラ・プロトセコイデスの菌株であるＢＴＲ９０２とは自然から採取した。プロトセカ・モリフォーミスＢＴＲ１３８５（ＡＴＣＣ７５６６９）と、クロレラ・プロトセコイデスＢＴＲ９０２（ＡＴＣＣ７５６６７）とはアメリカ合衆国、２０８５２メリーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ（American Type Culture Collection; 略してＡＴＣＣ）１９９４年２月９日に預けられた。培養基培養基は炭素源、各種の塩類、及び一般的に微量金属を含む。炭素源は本発明の微生物の発酵に適する任意の炭素源であり得る。特に、炭素源はエタノール、グリセロール及びグルコースから選択可能である。このうちグルコースが炭素源として好ましい。グルコース源はグルコースと、糖密及びコーン・シロップ等、グルコースへ変換し得る任意の炭化水素とのうちのいづれか一方であり得る。細胞成長を阻害または制限することなく同細胞成長を最適に促進すべく、細胞成長を抑制及び制限しない量のグルコース源を発酵槽内に使用する必要がある。グルコース源の最適濃度は微生物間で異なり得る一方、同最適濃度は試験によって容易に決定し得る。グルコース源の濃度を５〜３０ｇ／リットルの範囲内に維持する適切なグルコース添加はグルコースによる細胞成長の阻害を回避する一方で同細胞成長を促進するのに常には十分である。他の添加物がグルコース源とともに最初に存在し、かつ同添加物をその濃度を維持すべく培養基中へ連続的に添加し得ることが望ましい。これらの添加物は燐酸ナトリウム及び燐酸カリウム等のアルカリ金属燐酸塩、特に第２燐酸ナトリウム及び第１燐酸カリウムを含む。第２燐酸ナトリウムの総量は一般的に約１〜２ｇ／リットル、好ましくは約１〜１．５ｇ／リットル、より好ましくは約１．３ｇ／リットルである。発酵槽内に最初に存在する第２燐酸ナトリウムの量は添加する第２燐酸ナトリウムの総量の一般的には約３５〜５０％、より一般的には約４０〜４５％である。第１燐酸カリウムの総量は一般的には約１．５〜３ｇ／リットル、より一般的には約２〜２．５ｇ／リットルである。発酵槽内に最初に存在する第１燐酸カリウムの量は総量の一般的に約４０〜５０％、より一般的には約４５〜５０％である。クエン酸三ナトリウム等の生物学的に許容可能なキレート剤の添加総量は約０．８〜１．２ｇ／リットル、一般的には約１．０ｇ／リットルが効果的である。生物学的に許容可能な鉱酸は微量金属を溶液中に維持し、かつ窒素源として一般的に使用されるアンモニアを中和するために添加される。従来、濃硫酸は約１〜２ｍｌ／リットル、一般的には約１．２〜１．５ｍｌ／リットルにて使用される。マグネシウムは硫酸塩等の生理学的に許容可能な塩として約０．１〜０．２ｇ／リットル、好ましくは約０．１〜０．１５ｇ／リットル添加される。鉄及び銅は細胞外Ｌ−アスコルビン酸の分解を促進し、これにより培養基中への細胞外Ｌ −アスコルビン酸の蓄積を防止する。このため、これらの金属の使用量は制限されている。鉄（＋２）は最初に約２〜５ｍｇ／リットル、好ましくは約３〜４ｍｇ／リットル存在し、同鉄（＋２）はその後の添加物には含まれない。銅は一般的に比較的微量、即ちグルコース１ｇ当たり１〜５０ｇ存在する。微量金属溶液（表３参照）の添加総量は約１０〜１５ｍｌ／リットル、一般的には約１２〜１４ｍｌ／リットルである。微量金属溶液はグルコース１ｇに対して０．１〜０．２ｍｌ添加される。表１に示す溶液は発酵中に添加することが効果的である（溶液の準備は表５に示す）。多数の塩類は一塩基または二塩基として示しているが、これは便宜上のものであり、塩類の種類はこれらに限定されない。これらの化合物は緩衝剤であるため、プロトネーション範囲、即ち陽子の付加の範囲は培養基のｐＨにともなって変化する。外来微生物の侵入を防止すべく無菌添加（Asep tic addition）を実施する。発酵接種前、培養基は所望の温度、一般的には３０〜４０℃、好ましくは約３５℃まで加熱される。適切な成長期の後で高い細胞密度を形成するために十分な量の所望の微生物の活発に成長するカルチャーを培養基へ接種する。一般的な初期細胞密度は細胞の乾燥重量として０．１〜０．５ｇ／リットル、より一般的には０．１５〜０．４ｇ／リットルである。細胞を少なくとも約５ｇ／リットル、好ましくは約１０〜８０ｇ／リットル、更に好ましくは４０〜６０ｇ／リットルの細胞密度まで成長させる。これは一般的に１０〜４０時間、より一般的には１５〜２５時間を要する。グルコース総量の約１５〜３０％、一般的には２０〜２５％が最初に添加される。グルコース濃度が低下した場合、グルコースの総濃度を３０ｇ／リットル未満に維持しながらグルコース及び塩類の濃縮液（表１参照）の約２０％アリコートを添加することによりグルコースを必要に応じて補充する。上澄み液、即ち培養基のうちの細胞をふくまない成分中に含まれるグルコースの濃度を監視すべくグルコース酸化酵素試験及び高圧液体クロマトグラフィー等の従来の技術を使用し得る。少量の泡形成防止剤を発酵中に添加し得る。窒素源として利用するとともに、ｐＨを制御するためにアンモニアを添加する。この結果、培養基中の窒素量は培養基の酸性度及び緩衝能力に基づいて決定される。アンモニアは発酵槽内へ案内する空気または他の酸素源の流れに気体アンモニアの流れを混合することにより効果的に培養基へ添加される。培養基のｐＨはアンモニアまたは無機塩基を必要に応じて添加することにより所望の限界内で制御し得る。ｐＨは酸化による細胞外Ｌ−アスコルビン酸の顕著な分解を引き起こすｐＨより更に低く維持することが望ましい。本明細書中において、顕著な分解とは生成された細胞外Ｌ−アスコルビン酸の約２０％を越す分解、より詳細には約１０％を越す分解、さらに詳細には約５％を越す分解を指す。好ましい実施の形態では、培養基のｐＨは約ｐＨ６．０未満、より好ましくは約ｐＨ５．５未満、最も好ましくは約ｐＨ５．０未満に維持される。発酵培養基のｐＨを前記のパラメータ内に維持することにより、Ｌ−アスコルビン酸の生産に関する大きな効果を実現し得る。低いｐＨでは、生成された細胞外Ｌ−アスコルビン酸の分解量は低減する。従って、Ｌ−アスコルビン酸の高い生産性を実現し得る。当業者は細胞外Ｌ−アスコルビン酸が細胞内Ｌ−アスコルビン酸より容易に回収し得ることを認識可能である。更に、Ｌ−アスコルビン酸の商業的な生産方法は、代謝によるＬ−アスコルビン酸の生成に対してフィードバック阻害を引き起こし得る非常に高い細胞内Ｌ−アスコルビン酸濃度を要することなく開発し得る。このため、Ｌ−アスコルビン酸の細胞外生成は更に高い生産性を提供する方法の開発を可能にする。本発明の１つの実施の形態では、初期の細胞成長期において、ｐＨは約３．０〜６．０、好ましくは約３．５〜５．０、更に好ましくは約３．５〜４．５に制御される。細胞密度が約１０ｇ／リットルを越えた際（一般的には約１０〜２５時間後）、ｐＨは２．５〜５．０、好ましくは２．５〜４．０まで下げられる。これはアンモニアの添加を一時的に停止することにより効果的に行われる。培養基のｐＨは細胞が生成した酸によって低下する。培養基のｐＨが所望のｐＨに到達した際、アンモニアの添加を再開する。ｐＨを前記のパラメータ内へ維持する本発明の発酵プロセスにより、細胞外アスコルビン酸は酸化によって分解されることなく発酵培養基中に存在可能である。更に、酸化によるＬ−アスコルビン酸の顕著な分解をともなうことなく高い濃度の細胞外Ｌ−アスコルビン酸を形成すべく同Ｌ−アスコルビン酸を発酵培養基中に蓄積可能である。この結果、発酵プロセスは以下に更に詳述するように酸素の存在を必要とする一方、同発酵プロセスは効果的な実施が可能であり、利用可能な酸素源が存在する場合にも大量の細胞外アスコルビン酸を生産し得る。利用可能な酸素源は空気または酸素ガスに限定されるものではなく、発酵環境下において酸素へ変換し得る他の化学物質を含む。初期の細胞成長期における細胞成長と、新陳代謝及びＬ−アスコルビン酸生成とを維持すべく十分な酸素を発酵中に培養基へ添加する必要がある。酸素は培養基を攪拌し、かつ曝気することにより同培養基に対して効果的に供給される。培養基の攪拌及び曝気を実施すべく掻混ぜまたは振揺等の従来の方法を使用し得る。培養基中の酸素濃度は飽和値（即ち、大気圧下において約３０〜４０℃に維持された培養基中における酸素の溶解度）の２０〜１００％であることが好ましい。しかし、培養基中の酸素濃度は発酵に対する悪影響を生じない場合、更に低い濃度へ変更してもよい。培養基の酸素濃度は酸素探針電極（oxyqen probeelectr ode）等を使用した従来の方法で監視し得る。純粋酸素ガスと、窒素ガス以外の不活性ガスによって希釈された酸素ガスとに代表される他の酸素源を使用し得る。発酵はＬ−アスコルビン酸の生成が実質的に停止するまで継続され、同Ｌ−アスコルビン酸の生成は細胞外Ｌ−アスコルビン酸の蓄積によって検証される。発酵総時間は一般的に２４〜１２０時間である。一般的に、本発明の方法において生成されたＬ−アスコルビン酸の殆どは細胞外Ｌ−アスコルビン酸である。細胞は濾過または遠心分離等の従来の方法により培養基から取出され、Ｌ−アスコルビン酸は細胞を含まない上澄み液からイオン交換、クロマトログラフィー、抽出、結晶化、膜による分離、逆浸透、蒸留及び化学誘導プロセス等の従来の方法を用いて回収される。化学誘導プロセスとは、回収が容易であることと、Ｌ−アスコルビン酸より更に安定していることのうちの少なくともいづれか一方の特性を有する別の化学物質に対して、生成されたＬ −アスコルビン酸を反応させる工程を含む方法を指す。例えば、ケーリーによる米国特許第４，５９５，６５９号は従来のイオン交換樹脂による吸着及び溶離を行った後、脱色、蒸発及び結晶化を行うことによりＬ−アスコルビン酸を水性発酵培養基から分離することを開示している。１９６７年に発行された農業生化学第３１刊（Aqr．Biol．Chem．31）の３４６〜３５３頁に記載されたケイ．シミズの記述は陰イオン交換樹脂からなる連続するマルチベッドを用いた抽出システムにより、構造的に類似するイソアスコルビン酸を発酵培養基から分離することを開示している。本発明の方法に基づくＬ−アスコルビン酸の回収は、連続プロセス、半連続プロセス及びバッチ・プロセスのうちのいづれか１つを含み得る。連続プロセス及び半連続プロセスでは、細胞外Ｌ−アスコルビン酸は発酵中に発酵容器から取り除かれるため、細胞外Ｌ−アスコルビン酸の濃度はバッチ回収プロセスにおける細胞外Ｌ−アスコルビン酸の濃度ほど高くない。事実、連続プロセスまたは半連続プロセスは、Ｌ−アスコルビン酸の細胞外濃度を非常に低い濃度、即ち検出不能に近い濃度に維持した状態で行われ得る。前記のように、本発明の方法は大量の細胞外Ｌ−アスコルビン酸の生産を可能にする。特に、本発明の方法はＬ−アスコルビン酸の総量のうちの少なくとも約２％、より好ましくは少なくとも約１０％、最も好ましくは少なくとも約２０％を細胞外Ｌ−アスコルビン酸とすべく細胞外Ｌ−アスコルビン酸を生産する。本発明により、１ｍｇ／リットル、より好ましくは約１０ｍｇ／リットル、更に好ましくは約２０ｍｇ／リットルを越す量の細胞外Ｌ−アスコルビン酸濃度の形成が可能である。本発明の別の実施の形態はＬ−アスコルビン酸生成微小藻類及び発酵培養基を有する発酵カルチャーを含む。この実施の形態において、発酵培養基は細胞外Ｌ −アスコルビン酸及び利用可能な酸素源を含む。Ｌ−アスコルビン酸生成藻類は前記の藻類と同一である。同様に、細胞外Ｌ−アスコルビン酸を含む発酵培養基の成分は前記の成分と同じであり得る。工業的用途本発明の方法は低いｐＨを有する発酵培養基（２．５〜６．０）中での発酵によりＬ−アスコルビン酸を生産する。このｐＨにおいて、Ｌ−アスコルビン酸は空気によって容易に酸化されない。この結果、生成されたＬ−アスコルビン酸が細胞内Ｌ−アスコルビン酸である必要はない。培養基中に蓄積されるＬ−アスコルビン酸は培養基中の酸素によって容易に酸化されることがない。Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）は壊血病を予防すべく栄養補助品として使用し得る。Ｌ− アスコルビン酸と、アスコルビル・パルミテート（Ascorbyl palmitate）等のＬ −アスコルビン酸の幾つかの誘導体とは酸化防止剤として食品に使用し得る。例１この例はプロトセカが高いｐＨにおいてＬ−アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）を生成し得ることを示す。生成されたＬ−アスコルビン酸の殆どは細胞内Ｌ−アスコルビン酸である。培養基準備純水６００ｍｌ中に０．２７ｇの第１燐酸カリウム及び０．２３ｇの第２燐酸ナトリウムを溶解した溶液は１リットルのガラス製発酵槽内において加熱滅菌され、同ガラス製発酵槽は培養基を攪拌し、かつ同培養基中へ栄養成分を供給する手段と、酸素源と、以下に詳述する他の要素とを有する。培養基の冷却後、１．９ｇ／リットルの濃度の硫酸第一鉄七水和物溶液５ｍｌを０．２マイクロメータの無菌フィルタを通じて培養基へ添加した。グルコース及び塩類の濃縮物表２に示す成分は滅菌し、次いで冷却後に混合されて６００ｍｌの最終容量へ調製した。微量金属溶液表３に示す成分及び濃塩酸２０ｍｌは純水を用いて１リットルに調製した。培養基グルコース及び塩類の濃縮液２０ｍｌを発酵槽内の燐酸塩培養基に対して添加した。細胞成長及びＬ−アスコルビン酸生成培養基を加熱して３５℃に維持した。攪拌は３００ｒｐｍで開始した。空気は０．１リットル／分の割合で培養基中へ分散され、ｐＨは空気の流れに混合したアンモニアを用いて６．９に調整した。乾燥重量にて約０．３ｇ／リットルの初期細胞密度を形成すべく培養基に対して活発に成長するカルチャーを接種した。細胞は約２０〜５０ｇ／リットル（乾燥ベース）の細胞密度まで成長した。ｐＨは気体アンモニアを添加することにより６．５〜７．０に制御した。発酵中における余剰溶存酸素量を空気飽和値の２０〜９０％に維持すべく、攪拌は４５０ｒｐｍにて開始し、次いで８００ｒｐｍまで増加させた。曝気は０．２リットル／分にて開始し、次いで０．６リットル／分まで増加させた。上澄み液中の利用可能なグルコース量はグルコース酸化酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーによって監視した。グルコース濃度が低下した際、グルコースの総濃度を３０ｇ／リットル未満に維持しながらグルコース及び塩類の濃縮溶液の約２０％アリコートを添加することによりグルコースの補充を行った。全てのグルコース及び塩類の濃縮物を添加し、かつ同濃縮物を消耗した際、培養基をＬ−アスコルビン酸について分析した。Ｌ−アスコルビン酸（Ｌ−ＡＡ）を確定すべく使用した方法は１９８３年に発行された分析生化学（Analytical Biochemistry）第１３０刊の１９１〜１９８頁においてグラン及びルースが開示している。同方法は７．８ｘ３００ｍｍ有機酸分析カラムであるＨＰＸ−８７（カリフォルニア州リッチモンドに所在するバイオ−ラド研究所（Bio-Rad Laboratories）から入手）を使用するイオン交換処理である。条件としては、移動相としての０．０１３Ｍの硝酸、０．８ｍｌ／分の流量、１５００ｐｓｉｇ（１．０４ｘ１０⁸／ダイン／ｃｍ²）の圧力、及び２４５ｎｍにおける吸光度の測定による検出を使用した。このシステムはアスコルビン酸のＬ−異性体及びＤ−異性体を識別する。細胞密度の乾燥重量を決定すべく、カルチャーから培養基サンプル全体を取り出し、このうち５ｍｌを4000 ｘｇにて５分間遠心分離した。次いで、遠心分離によって得られたペレットを純水で一度洗浄し、風袋を計量したアルミニウム計量皿内へ流し込んだ。細胞は６０℃において８〜２４時間乾燥させ、さらに１０５℃にて１時間乾燥させた。細胞重量は差から求めた。結果を表４に示す。例２この例は低いｐＨ（３．５〜５．０）におけるプロトセカ・ゾフィによるＬ− アスコルビン酸の生成を示す。測定可能な溶存酸素が培養基中に存在したにもかかわらず大量のＬ−アスコルビン酸が細胞外培養基中において生成された。以下に示す点を除いて例１に示す手順を実行した。発酵は１リットル発酵槽と同じ構造をなす１４リットルの発酵槽内において１リットル発酵槽の場合と同様の制御のもとで実施した。使用した濃縮物を表５に示す。培養基準備純水７．２リットル中に第１燐酸カリウム３．９ｇ及び第２燐酸ナトリウム３．３ｇを溶解した溶液は１４リットルのガラス製発酵槽内において加熱滅菌された。培養基の冷却後、６．０ｇ／リットルの濃度の硫酸第１鉄七水和物２７ｍｌを０．２マイクロメータの無菌フィルタを通じて培養基へ添加した。細胞成長及びＬ−アスコルビン酸生成培養基は表６に示す成分の他に２ｍｇ／リットルのチアミン塩酸塩を含み、同チアミン塩酸塩は発酵槽を加熱滅菌して冷却した後で培養基に無菌状態で添加した。温度は３０℃であった。乾燥重量にて約０．３ｇ／リットルの初期細胞密度を形成すべく培養基に対してプロトセカ・ゾフィの菌株であるＢＴＲ１２５４の活発に成長するカルチャーを接種した。細胞は乾燥重量にて５６ｇ／リットルの細胞密度まで成長した（この際の成長速度は０．２０ｈ^-1）。ｐＨは気体アンモニアの添加により約３．５〜５．０に維持した。攪拌は１００ｒｐｍにおいて開始し、次いで８００ｒｐｍまで増加させた。曝気は空気を開始時に２．０リットル／分で加え、その後６．０リットル／分まで増加させることにより実施した。条件及び分析結果を表６に示す。例３この例は低いｐＨ（４．０〜５．０）におけるプロトセカ・モリフォーミスによるＬ−アスコルビン酸の生成を示す。培養基中に測定可能な酸素が存在したにもかかわらず大量のＬ−アスコルビン酸が細胞外培養基中において生成された。以下に示す点を除いて例２の手順を実行した。細胞成長及びＬ−アスコルビン酸生成培養基は表１に示す成分の他に２ｍｇ／リットルのチアミン塩酸塩を含み、同チアミン塩酸塩は発酵槽を加熱滅菌して冷却した後で培養基に無菌状態で添加した。温度は３０℃であった。乾燥重量にて約０．３ｇ／リットルの初期細胞密度を形成すべく培養基に対してプロトセカ・モリフォーミスの菌株であるＡＴＣＣ７５６６９の活発に成長するカルチャーを接種した。細胞は乾燥重量にて４２ｇ／リットルの細胞密度まで成長した（この際の成長速度は０．２３ｈ^-1）。ｐＨは気体無水アンモニアを添加することにより最初の２２時間の間は約５．０に維持した。次いで、アンモニア添加を中止した。ｐＨが４．０まで低下した際、アンモニア添加を再開した。ｐＨは残りの発酵時間中、４．０に維持した。結果を表７に示す。例４この例は低いｐＨ（３．５〜５．０）におけるクロレラ・プロトセコイデスによるＬ−アスコルビン酸の生成を示す。培養基中に測定可能な酸素が存在したにもかかわらず大量のＬ−アスコルビン酸が細胞外培養基中において生成された。以下に示す点を除いて例３の手順を実行した。細胞成長及びＬ−アスコルビン酸生成乾燥重量にて約０．３ｇ／リットルの初期細胞密度を形成すべく培養基に対してクロレラ・プロトセコイデスの菌株であるＡＴＣＣ７５６６７の活発に成長するカルチャーを接種した。細胞は乾燥重量にて３７ｇ／リットルの細胞密度まで成長した（この際の成長速度は０．１６ｈ^-1）。ｐＨは気体無水アンモニアを添加することにより最初の１８時間の間は約５．０に維持された。次いで、アンモニア添加を中止した。ｐＨが３．５まで低下した際、アンモニア添加を再開した。ｐＨは残りの発酵時間中、３．５に維持された。結果を表８に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラニング、ジェフリーエー. アメリカ合衆国 54220 ウィスコンシン州マニトウォクサウスセブンスストリート 1035 (72)発明者スカートラド、トーマスジェイ. アメリカ合衆国 54220 ウィスコンシン州マニトウォクサウスセブンスストリート 1035

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｌ−アスコルビン酸の生産方法であって、（ａ）プロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択された生物を約６．０未満のｐＨを有する発酵培養基中にて培養する工程と、（ｂ）Ｌ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収する工程とを含む方法。２．前記生物はプロトセカ属の生物である請求項１に記載の方法。３．前記生物はプロトセカ・モリフォーミス及びプロトセカ・ゾフィからなるグループから選択される請求項１に記載の方法。４．前記発酵培養基は約５．５未満のｐＨを有する請求項１に記載の方法。５．前記発酵培養基は約５．０未満のｐＨを有する請求項１に記載の方法。６．利用可能な酸素源の存在下において実施される請求項１に記載の方法。７．細胞外Ｌ−アスコルビン酸は発酵培養基中に蓄積される請求項１に記載の方法。８．細胞外Ｌ−アスコルビン酸は発酵培養基中に存在する請求項１に記載の方法。９．前記回収工程はＬ−アスコルビン酸を細胞外発酵培養基から回収する工程を含む請求項１に記載の方法。１０．前記Ｌ−アスコルビン酸を細胞外発酵培養基から回収する工程はイオン交換、クロマトグラフィー、抽出、膜による分離、逆浸透、蒸留、化学誘導プロセス及び結晶化からなるグループから選択された方法によって行われる請求項９に記載の方法。１１．前記回収工程は細胞内Ｌ−アスコルビン酸を回収する工程を含む請求項９に記載の方法。１２．前記発酵培養基中のＬ−アスコルビン酸の少なくとも約２％は細胞外Ｌ− アスコルビン酸である請求項１に記載の方法。１３．前記発酵培養基中のＬ−アスコルビン酸の少なくとも約１０％は細胞外Ｌ −アスコルビン酸である請求項１に記載の方法。１４．前記発酵培養基中のＬ−アスコルビン酸の少なくとも約２０％は細胞外Ｌ −アスコルビン酸である請求項１に記載の方法。１５．前記生物の細胞密度は少なくとも約５ｇ／リットルである請求項１に記載の方法。１６．Ｌ−アスコルビン酸の顕著な分解が生じない請求項１に記載の方法。１７．Ｌ−アスコルビン酸生成微小藻類及び発酵培養基を含み、前記発酵培養基が細胞外Ｌ−アスコルビン酸及び利用可能な酸素源を含む発酵カルチャー。１８．前記発酵培養基は少なくとも約１ｍｇ／リットルの細胞外Ｌ−アスコルビン酸を含む請求項１７に記載の発酵カルチャー。１９．前記微小藻類はプロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択された生物である請求項１７に記載の発酵カルチャー。２０．前記発酵カルチャーのｐＨは約６．０未満である請求項１７に記載の発酵カルチャー。２１．Ｌ−アスコルビン酸の生産方法であって、（ａ）プロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択された生物を約６．０未満のｐＨ及び利用可能な酸素源を有する発酵培養基中にて培養する工程と、前記発酵培養基が約１ｍｇ／リットルを越す細胞外Ｌ−アスコルビン酸の濃度を有することと、（ｂ）細胞外Ｌ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収する工程とを含む方法。２２．Ｌ−アスコルビン酸の生産方法であって、（ａ）プロトセカ属の生物及びクロレラ・プロトセコイデス種の生物からなるグループから選択された生物を、利用可能な酸素源を有する発酵培養基中にて培養する工程と、前記発酵培養基が細胞外Ｌ−アスコルビン酸を有することと、（ｂ）Ｌ−アスコルビン酸を発酵培養基から回収する工程とを含む方法。