KR950009199B1 - 2-케토-l-굴론산의 제조방법 - Google Patents

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KR950009199B1 KR1019860008822A KR860008822A KR950009199B1 KR 950009199 B1 KR950009199 B1 KR 950009199B1 KR 1019860008822 A KR1019860008822 A KR 1019860008822A KR 860008822 A KR860008822 A KR 860008822A KR 950009199 B1 KR950009199 B1 KR 950009199B1
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Abstract

내용 없음.

Description

2-케토-L-굴론산의 제조방법
본 발명은 L-아스코르브산의 합성용 중간체로 가치있는 2-케토-L-굴론산의 제조방법 및 이 제조방법에 사용되는 슈도글루코노박터(Pseudogluconobacter)속의 균주에 관한 것이다.
L-아스코르브산의 합성용 중간체로 유용한 2-케토-L-굴론산은 지금까지 상업적으로 알려진 라이크스타인의 방법[Helvetica Chimica Acta 17, 311(1934)]에 의해 제조되었다. 그러나, 이 방법은 많은 단계를 포함하며 대량의 용매를 필요로 하므로 현대 기술로는 만족스럽지 못한 것이다. 이 라이크스타인의 방법이외에도 주로 미생물을 이용하는 몇가지 방법이 제안되었다.
예를 들어, 미생물을 이용하여 글루코오즈를 5-케토-D-글루콘산으로 산화하고, 이를 화학적으로 또는 미생물학적으로 L-이돈산으로 환원시킨 후, 이를 미생물학적으로 2-케토-L-굴론산으로 더 산화하는 방법이 있다[미합중국 특허 제2,421,611호]. 공지된 또 다른 방법으로는 미생물을 이용하여 글루코오즈를 2,5-디케토-D-글루콘산으로 산화시키고, 이를 미생물학적으로 또는 화학적으로 2-케토-L-굴론산으로 전환시키는 방법이 있다[일본국 특허 공고 제39-14493, 53-25033,, 56-15877 및 59-35920호].
그러나, 이들 공지방법에서 화학적 환원단계, 즉 전자의 방법에서 5-케토-D-글루콘산을 L-이돈산으로 환원시키는 단계 및 후자의 방법에서 2,5-디케토-D-글루콘산을 2-케토-L-굴론산으로 환원시키는 단계는 전자의 경우 D-글루콘산 및 후자의 경우 2-케토-D-글루콘산의 부산물이 생성되어 목적 화합물의 수율을 감소시키므로 입체특이성의 관점에서 단점을 갖는다. 더우기, 상기의 환원이 미생물을 이용하여 수행될 때 조차도 미생물의 환원에너지 원으로 과량의 글루코오즈(출발물질)을 요구하기 때문에 전체 생성물의 수율은 떨어지게 된다. 이러한 시점에서, 출발물질로 L-소르보즈를 사용하는 2-케토-L-굴론산의 제조는 단지 산화방법을 포함한다. 사실, 글루코노박터(Gluconobactor)속, 슈도모나스(Pscudomonas)속, 세라티아(Serratia)속, 아크로모박터(Achromoacter)속 및 알칼리게네스(Alcaligenes)속의 박테리아를 사용하는 시도가 이 분야에서 이미 이루어졌다. 그러므로, 이에 대해서는 문헌[Biotechnology and Bioengineering 14, 799(1972), Acta Microbiologica Sinica, 20, 246(1980), and 21, 185(1981), 일본국 특허 공보 제41-159 및 41-160호, 미합중국 특허 제3,043,749호 및 일본국 특허 공보 제49-39838호]을 참고로 한다.
그러나, 상기 문헌에 기재된 균주로 얻어진 결과는 불만족스러우며, 수율이 너무 낮아 상업적 이용 가치가 없다.
이러한 상황하에서, 본 발명자들은 2-케토-L-굴론산을 제조하는 상업적으로 유용한 방법을 연구하여, 와까야마껭에서 수거된 토양시료로부터 분리된 박테리아 균주 K59s 및 시가껭에서 수거된 토양시료로부터 분리된 박테리아 균주 12-5, 12-15, 12, 4 및 22-3이 L-소르보즈를 지금까지의 결과보다 훨씬 나은 수율로 2-케토-L-굴론산으로 전환시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 더우기, 분류학적인 연구의 결과, 본 발명자들은 이들 박테리아가 문헌에 기재되어 있지 않은 새로운 박테리아라는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 발견을 기초로 완성되었다.
그러므로, 본 발명은 (1) L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시킬 수 있는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 그대로 또는 가공한 후 L-소르보즈와 접촉시켜 2-케토-L-굴론산을 생성 및 축적하고, 이를 회수함을 특징으로 하는 2-케토-L-굴론산의 제조방법; (2) L-소르보즈를 2-케토-L-글루콘산으로 산화시킬 수 있는 슈도글로코노막터 속의 미생물을 바실루스 속, 슈도모나스 속, 프로테우스 속, 시트로박터 속, 엔테로박터 속, 에르위니아 속, 크산토모나스 속 또는 플라보박테리움 속에 속하는 미생물 일종 이상의 존재하에 L-소르보즈와 접촉시킴을 특징으로 하는 2-케토-L-굴론산의 제조방법; 및 (3) 호기성이며 보효소 A의 존재하에 성장하는 슈도글루코노박터 산 카로케토게네스(Pseudogluconobactor Saccharoketogenes)에 관한 것이다.
상술한 5박테리아 균주중에서, 균주 K591s 및 12-5는 하기의 분류학적 특성을 갖는다.
(a) 형태학
(1) 막대형, 0.3∼0.5×0.7∼1.4㎛
(2) 세포의 다형이 없음
(3) 2∼4 극성 편모로 운동
(4) 포자 형성 없음
(5) 그램-음성
(6) 항산성이 없음
(b) 배양특성
(1) 영양 한천 평판 : 실제로 성장하지 않음
이스트 추출물 영양 한천 : 둥굴고, 완전한 가장자리, 부드러운 표면, 젖빛
(2) 이스트 추출물 영양 한천 사면 : 적당한 실모양으로 성장, 부드러움, 젖빛
(3) 이스트 추출물 영양 액체 배양 : 적당한 성장, 배지를 통해 균일한 혼탁도
(4) 영양 젤라틴 천자 : 희박한 표면 성장; 젤라틴이 액화되지 않음
(5) 리트머스 밀크 : 산성화 및 응고됨
(c) 생리적 특성
(1) 질산염의 환원 : 약한 양성
(2) 탈질화 반응 : 음성
(3) 메틸레드(MR) 시험 : 양성
(4) 보게스-프로스카우어(VP) 시험 : 음성
(5) 인돌 : 생성하지 않음
(6) 황화수소 : 생성하지 않음
(7) 녹말 : 가수분해하지 않음
(8) 시트르산 : 이용하지 않음
(9) 암모늄염 : 이용함
(10) 색소 : 생성하지 않음
(11) 우레아제 : 생성함
(12) 옥시다제 : 양성
(13) 카탈라제 : 양성
(14) 성장온도범위 : 16∼36℃ : 최적 성장 온도 범위 : 24∼34℃
성장 pH범위 : 5.5∼8.7 ; 최적 pH범위 : 6.0∼7.5
(15) 호기성
(16) 휴-레이프슨의 OF 시험 : 산화
(17) L-아라비노즈, D-크실로즈, D-글루코즈, D-프럭토즈, D-갈락토즈, D-만노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토즈, 트레할로즈, D-만니톨, 및 글리세롤로부터 산을 생성하나 기체는 생성하지 않음, D-소르비톨, 이노시톨 또는 녹말로부터는 산 및 기체를 모두 생성하지 않음
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 아세트산을 약간 생성함
(2) 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 보호소 A(CoA)가 성장에 필요함
(3) 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생성함
(4) DNA의 구아닌+시토닌 함량 : 67±1몰%
(5) 10 이소프렌단위(CoQ10)을 함유하는 유비퀴논이 존재
(6) L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산을 많이 생성함
(7) 스트렙토마이신 내성
균주 12-15의 분류학적 특성을 하기에 나타낸다.
(a) 형태학
(1) 막대형 : 세포크기 0.3∼0.5×0.7∼1.4㎛
(2) 세포의 다형이 없음
(3) 2∼4 극성 편모로 운동
(4) 포자 형성 없음
(5) 그램-음성
(6) 항산성이 없음
(b) 배양특성
(1) 영양한천평판 : 실제로 성장하지 않음
이스트 추출물 영양한천 : 둥굴고, 완전한 가장자리, 부드러운 표면, 젖빛
(2) 이스트 추출물 영양 한천 사면 : 적당하고 실모양으로 성장, 부드러움, 젖빛
(3) 이스트 추출물 영양 약체 배양 : 적당한 성장, 배지를 통해 균일한 혼탁도
(4) 영양 젤라틴 천자 : 탑 부분에서만 희박한 성장; 젤라틴이 액화되지 않음
(5) 리트머스 밀크 : 산성화되나, 응고되지 않음
(c) 생리적 특성
(1) 질산염 환원 : 음성
(2) 탈질화 반응 : 음성
(3) 메틸 레드(MR)시험 : 양성
(4) 보게스-프로스카우어(VP)시험 : 음성
(5) 인돌 : 생성하지 않음
(6) 황화수소 : 생성하지 않음
(7) 녹말 : 가수분해하지 않음
(8) 스트레이트 : 이용하지 않음
(9) 암모늄염 : 이용함
(10) 색소 생성 없음
(11) 우레아제 : 생성함
(12) 옥시다제 : 양성
(13) 카탈라제 : 양성
(14) 23∼32℃, 최적으로는 28∼32℃에서 성장
성장 pH범위 : pH 6.0∼7.5; 최적 pH범위 : 6.5∼7.1
(15) 호기성
(16) 휴-레이프슨의 OF 시험 : 산화
(17) L-아라비노즈, D-크실로즈, D-글루코즈, D-프럭토즈, D-갈락토즈, D-만노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토즈, 트레할로즈, 및 글리세롤로부터 산을 생성하나, 기체는 생성하지 않음, D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 또는 녹말로부터는 산 및 기체를 모두 생성하지 않음
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 아세트산을 약간 생성함
(2) 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA가 성장에 필요함
(3) 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생성함
(4) DNA의 구아닌+시토닌 함량 : 67±1몰%
(5) 10 이소프렌단위(CoQ10)을 함유하는 유비퀴논이 존재함
(6) L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산을 많이 생성함
(7) 스트렙토마이신 내성
균주 12-4의 분류학적 특성을 하기에 나타낸다.
(a) 형태학
(1) 막대형, 세포크기 0.3∼0.5×0.7∼1.4㎛
(2) 세포의 다형 없음
(3) 2∼4 극성 편모로 운동
(4) 포자 형성 없음
(5) 그램 음성
(6) 항산성 없음
(b) 배양특성
(1) 영양한천평판 : 자세히 관찰해도 미세한 군락이 관찰되지 않음
이스트 추출물 브로스 한천 : 둥굴고, 완전한 가장자리, 부드러우며 젖빛
(2) 이스트 추출물 영양 한천 사면 : 적당한 실모양으로 성장, 부드러우며 젖빛
(3) 이스트 추출물 영양 액체 배양 : 적당한 성장, 배지를 통해 균일한 혼탁도
(4) 영양 젤라틴 천자 : 탑부분에서만 약간 성장, 젤라틴이 액화되지 않음
(5) 리트머스 밀크 : 산성화 되나, 응고되지 않음
(c) 생리적 특성
(1) 질산염의 환원 : 음성
(2) 탈질화 반응 : 음성
(3) 메틸레드(MR)시험 : 양성
(4) 보게스-프로스카우어(VP)시험 : 음성
(5) 인돌 : 생성하지 않음
(6) 황화수소 : 생성함
(7) 녹말 : 가수분해하지 않음
(8) 시트레이트 : 이용하지 않음
(9) 암모늄염 : 이용함
(10) 색소 : 생성 없음
(11) 우레아제 : 생성함
(12) 옥시다제 : 양성
(13) 카탈라제 : 양성
(14) 16∼36℃, 최적으로는 24∼24℃에서 성장
pH범위 : 5.5∼8.2 최적 pH범위 : 6.0∼7.5
(15) 호기성
(16) 휴-레이프슨의 OF 시험 : 산화
(17) L-아라비노즈, D-크실로즈, D-글루코즈, D-프럭토즈, D-갈락토즈, D-만노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토오즈, 트레할로즈, 및 글리세롤로부터 산을 생성하나 기체는 생성하나 기체는 생성하지 않음. D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 또는 녹말로부터는 산 및 기체를 모두 생성하지 않음
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 아세트산을 약간 생성함
(2) 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA 또는 판토텐산이 성장에 필요함
(3) 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생성함
(4) DNA의 구아닌+시토닌 함량 : 67±1몰%
(5) 10 이소프렌단위(CoQ10)을 함유하는 유비퀴논이 존재함
(6) L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산을 많이 생성함
(7) 스트렙토마이신 내성
균주 32-3의 분류학적 특성을 하기에 나타낸다.
(a) 형태학
(1) 막대형 ; 세포크기 0.3∼0.5×0.7∼1.4㎛
(2) 세포의 다형이 없음
(3) 2∼4 극성 편모로 운동
(4) 포자 형성 없음
(5) 그램-음성
(6) 항산성이 없음
(b) 배양특성
(1) 영양 한천 평판 : 자세히 관찰해도 미세한 군락이 관찰되지 않음
이스트 추출물 영양 한천 : 둥굴고, 완전한 가장자리, 부드러우며 젖빛
(2) 이스트 추출물 영양 한천 사면 : 적당하고 실모양으로 성장, 부드러우며 젖빛
(3) 이스트 추출물 영양 액체 배양 : 적당한 성장, 배지를 통해 적당한 혼탁도
(4) 영양 젤라틴 천자 : 탑에서만 약간 성장, 젤라틴이 액화되지 않음
(5) 리트머스 밀크 : 산성화되나, 응고되지 않음
(c) 생리적 특성
(1) 질산염 환원 : 음성(약함)
(2) 탈질화 반응 : 음성
(3) 메틸레드(MR)시험 : 양성
(4) 보게스-프로스카우어(VP)시험 : 음성
(5) 인돌 : 생성하지 않음
(6) 황화수소 : 생성하지 않음
(7) 녹말 : 가수분해하지 않음
(8) 시트레이트 : 이용하지 않음
(9) 암모늄염 : 이용함
(10) 색소 생성 없음
(11) 우레아제 : 생성함
(12) 옥시다제 : 양성
(13) 카탈라제 : 양성
(14) 16∼38℃, 최적으로는 24∼34℃에서 성장
성장 pH범위 : pH 5.5∼8.7; 최적 pH범위 : 6.0∼7.8
(15) 호기성
(16) 휴-레이프슨의 OF 시험 : 산화
(17) L-아라비노즈, D-크실로즈, D-글루코즈, D-프럭토즈, D-갈락토즈, D-만노즈, 말토즈, 슈크로즈, 락토즈, 트레할로즈, 및 글리세롤로부터 산을 생성하나 기체는 생성하지 않음, D-만니톨, D-소르비톨, 이노시톨 및 녹말로부터는 산 및 기체를 모두 생성하지 않음
(d) 기타 특성
(1) 에탄올로부터 약간의 아세트산을 생성함
(2) 비오틴, 티아민, 리보플라빈 및 CoA 또는 판토텐산이 성장에 필요함
(3) 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생성함
(4) DNA의 구아닌+시토닌 함량 : 67±1몰%
(5) 10 이소프렌단위(CoQ10)을 함유한 유비퀴논이 존재함
(6) L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산을 많이 생성함
(7) 스트렙토마이신 내성
상기의 토양 유래의 5균주의 분류학적 특성을 버기스 매뉴얼 오브 디터미네이티드 박테리올로지 8판(1974) 및 버기스 매뉴얼 오브 시스터매틱 박티리올로지 1권(1984)를 참고로 검토했다. 그 결과, K591s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3은 그램음성이며, 운동성이고, 극성편모를 갖는 막대형 박테리아라는 점에서 슈도모나스 속으로 분류된다는 것을 발견하였다. 그리고, 성장인자를 필요로 하며, DNA의 구아닌 및 시토신 함량이 67±1몰%이며, 그의 퀴논 시스템이 10 이소프렌 단위를 갖는 유비퀴논이라는 점에서 이 속의 섹션 Ⅳ의 RNA군 Ⅳ에 속하는 슈도모나스 다미누타(Pseudomonas diminuta) 및 슈도모나스 베시클라리스(Pseudomonas vesicularis)와 유사하다는 것을 발견하였다. 그러나, 에탄올로부터 약간의 아세트산을 생성하며, 글리세롤로부터 디히드록시아세톤을 생성한다는 것을 슈도모나스 속의 박테리아와는 다른 특성이다.
상기의 특성은 글루코노박터 속의 종의 특성이다. 그러나, 이들 5균주가 옥시다제 시험에서 양성 반응을 나타내고, pH4.5에서 성장할 수 없으며, 이스트 추출물 영양 배지 또는 펩톤 이스트 추출물 배지에서 탄수화물 없이 양호하게 성장하며, DNA 구아닌 및 시토신 함량이 67±1몰%라는 점에서, 글루코노박터 속의 종과는 다르다.
그러므로, K591s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3의 5균주는 공지의 속에 속할 수 없으며, 신규 속의 신규종의 박테리아로 간주되어야 한다. 따라서, 균주 K519s, 12-5, 12-15, 12-4 및 22-3은 슈도글루코노박터 시카로케토게네스(Pseudogluconobacter saccharoketogenes)라고 명명하였다.
이들 5균주의 영양 요구성을 볼때, K591s, 12-5 및 12-15는 성장을 위해 CoA를 필요로 하는 독특한 특성을 갖는다. 이들 3균주의 CoA 요구성은 판토텐산으로 바꾸어질 수 없다. 한편, 12-4 및 22-3은 CoA의 존재뿐만 아니라 판토텐산 존재하에서도 성장할 수 있다.
하기의 설명에서, 이들 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 균주는 때때로 산화적 균주로 약칭하기도 한다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 균주는 상술한 5균주 뿐만 아니라, 자외선 또는 X-선으로 조사시키거나, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(니트로소구아니딘), 메틸메탄술포네이트, 질소 기체 등과 같은 화학 변이원으로 처리함으로써 5균주로부터 유도된 변이주에 속하는 기타 균주도 포함된다. 이런 변이주의 예로는, 슈도글루코노박터 시카로케토게네스 K591s를 니트로소구아니딘으로 처리함으로써 유도된 균주 TH 14-86이 있다.
이 변이주 TH 14-18은 L-소르보즈로부터 2-케토-L-굴론산을 제조할 수 있는 능력이 증가되었다는 것을 제외하고는 모균주와 같은 분류학적 특성을 나타낸다.
상술한 슈도글루코노박터 시카로케토게네스 K591s, 12-5 및 TH 14-86은 1985년 9월 19일자로 일본국 재단법인 발효연구서(IFO)에 기탁되어 있으며, 슈도글루코노박터 시카로케토게네스 12-15, 12-4 및 22-3은 1985년 12월 16일자로 IFO에 기탁되어 있다.
더우기, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K591s, 12-5 및 TH 14-86은 1985년 10월 7일자로, 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-15, 12-4 및 22-3은 1985년 12월 20일자로 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술연구소(FRI)에 기탁되어 있다. 이 기탁은 부다페스트 협약하의 기탁으로 전환되어, 1985년 8월 9일 이래 FRI에 보관되어 있다.
또한, 이들 6균주는 1986년 9월 22일자로 한국 종균협회(KFCC)에 기탁되어 있다.
IFO, FRI 및 KFCC의 수탁번호는 다음과 같다.
Figure kpo00001
본 발명을 실시하는데 있어서, 상술한 균주들을 L-소르보즈 함유 배지에서 성장시키거나, L-소르보즈를 상기 균주의 세포로부터 유도된 제제물과 접촉시킬 수 있다.
여기서 사용된 "세포로부터 유도된 제제물" 또는 "세포 제제물"의 용어는 상기 박테리아의 배양 브로스로부터의 세척된 세포, 아세톤 건조세포, 폴리아크릴아미드겔, K-카라게닌 등과 같은 지지체에 고정된 세포, 및 기타 동등물을 의미한다.
출발물질 L-소르보즈는 배양 초기에 한꺼번에, 배양 과정에 조금씩 또는 배양 배지에 연속적으로 가할 수 있다.
L-소르보즈와 미생물 사이의 접촉 반응에서, 반응계의 L-소르보즈 농도는 배지를 기준으로 3∼30퍼센트(w/v), 바람직하게는 5∼25%(w/v)이다.
L-소르보즈와 박테리아 세포 제제물의 접촉방법의 예로는, L-소르보즈, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES) 완충액(pH6.5, 0.5M) 및 CaCO3를 세포 제제물에 가하고, 물로 희석한 후, 혼합물을 원추 플라스크에서 진탕하는 방법이 있다.
L-소르보즈와 상기 세포 제제물 사이의 접촉을 수행하는 반응계에서 L-소르보즈의 농도는 0.1∼10%(w/v), 바람직하게는 0.3∼3%(w/v)이다. 세포 제제물의 양은 반응 전 건조세포를 기준으로 1∼30㎎/㎖이다. 반응계의 pH는 약 5.5∼7.5범위에서 조절되며, 반응 온도는 약 20∼40℃이고, 반응 시간은 약 1∼100시간이다.
슈도글루코노박터 균주는 L-소르보즈 함유 액체 배양에서 배양하여 브로스에 2-케토-L-굴론산을 생성 및 축적함으로써 본 발명을 실시하는데 있어서, 슈도글루코노박터 산화균주와 더불어 다른 박테리아가 존재할때, 산화균주만 배양하는 경우 보다 2-케토-L-굴론산의 축적 수율이 현저히 높다는 것을 알 수 있다.
수반하여 존재할 수 있는 박테리아는 예를 들면 바실루스, 슈도모나스, 프로테우스, 시트로박터, 엔테로박터, 에르위니아, 크산토모나스 및 플라보박테리움 속의 박테리아이다. 특정 종으로는 다음의 것이 있다.
바실루스 세레우스(Bacillus cereus) IFO 3131
바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) IFO 12201
바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) IFO 12108
바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus) IFO 12090
바실루스 아밀로리퀘페시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) IFO 3022
뱌실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IFO 13719
바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans) IFO 3967
슈도모나스 트리플리이(Pseudomonas trifolii) IFO 12056
슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia) IFO 12692
프로테우스 인콘스탄스(Proteus inconstans) IFO 12930
시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii) IFO 13544
엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) IFO 3320
에르위니아 헤르비콜라(Erwinia herbicola) IFO 12686
크산토모나스 피시(Xanthomonas pisi) IFO 13556
크산토모나스 시트리(Xanthomonas citri) IFO 3835
플라보박테리움 메니고셉티쿰(Flavobacterium menigosepticum) IFO 12535
이들 균주중 어떤 것은 적당한 배지에서 20∼40℃로 1∼4일 동안 배양할 수 있으며, 생성된 배양액은 상기의 수반 박테리아의 존재하에 배양을 위한 접종제로 사용된다. 접종제 크기는 일반적으로 산화균주의 1/10∼1/1000이 바람직하다. 이런 양의 수반 균주를 산화 균주와 함께 배양할 때 산화균주의 성장은 산화균주의 순수 배양액과 비교할 수 있을 정도로 배양되며, 혼합 배양액은 짧은 기간동안 L-소르보즈를 높은 농도로 2-케토-L-굴론산으로 산화할 수 있다. 수반 박테리아로 사용된 박테리아는 L-소르보즈 및 2-케토-L-굴론산을 동화할 수 없거나, 거의 조금만 동화할 수 있는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면, 산화균주의 순수 배양액과 같은 배양 조건을 이용할 수 있다. 상술한 미생물의 배양에 사용되는 배지는 상기 균주에 의해 이용될 수 있는 영양물질을 함유한 액체 또는 고체 배지일 수 있다. 그러나, 대량 생산을 위해서는 액체 배지가 바람직하다. 배지는 미생물의 배양에 일반적으로 사용되는 탄소원, 질소원, 무기염, 유기산염 및 미량 영양 물질을 함유한다. 출발물질 L-소르보즈를 탄소원으로 이용할 수 있으며, 글루코즈, 글리세린, 슈크로즈, 락토즈, 말토즈, 당밀등과 같은 기타 보조 탄소원을 이용할 수 있다.
질소원은 암모늄염(예, 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등), 옥수수침지액(CSL), 펩톤, 육류 추출물, 이스트 추출물, 건조 이스트, 대두분, 면실유, 우레아등과 같은 각종 무기 및 유기 질소-함유 화합물 또는 질소물질이 예시된다. 무기염으로는, 포타슘, 소듐, 칼슘, 마그네슘, 철, 망간, 코발트, 아연, 구리 및/또는 인산의 염이 있다.
미량 영양 물질로는, 상기 미생물의 필수적인 성장인자인 CoA, 판토텐산, 비오틴, 티아민 및 리보플라빈과 더불어, 플라빈 모노 뉴클레오티드(FMN), 플라빈, 아테닌 디뉴클레이티드(FAD), 기타 비타민, L-글루탐산, 티오황산나트륨 등과 같은 미생물의 성장과 2-케토-L-굴론산의 제조를 촉진할 수 있는 물질을 순수 화합물의 형태로, 또는 이를 함유한 천연물의 형태로 적당량 가할 수 있다.
배양방법으로는, 정치 배양, 진탕 배양, 침지 배양 등이 이용될 수 있다. 대량 생산을 위해서는, 소위 침지 배양이 바람직하다.
물론, 배양 조건은 박테리아 균주, 배지 조성 및 기타 요인에 따르며, 목적 화합물이 가장 높은 효율로 수득될 수 있는 경우를 선택할 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 배양 온도는 25∼35℃가 유리하며, 배지의 pH는 약 5∼9이다.
배양이 상기 조건하에 10∼120시간 동안 수행될 때, 2-케토-L-굴론산이 높은 농도로 축적된다. 배지의 pH 값은 목적 화합물이 형성됨에 따라 낮아지기 때문에 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아와 같은 적당한 염기성 물질을 때때로 가하여, 배지를 박테리아 균주에 의해 2-케토-L-굴론산을 제조할 수 있는 최적 pH로 유지하거나 배지에 적당한 완충제가 함유되도록 하여 배지 pH를 일정하게 유지해야 한다.
상기 한 것 이외에도, 산화 균주 이외의 박테리아의 살균된 배양브로스를 배지 성분으로 유리하게 사용할 수 있다. 이 방법에 이용될 수 있는 박테리아는 예를 들면 바실루스 속, 슈도모나스 속, 시트로박터 속, 에스케리키아 속 및 에르위니아 속의 균주가 있다. 특히, 하기의 박테리아가 언급될 수 있다.
바실루스 세레우스 IFO 3131
바실로스 서브틸리스 IFO 3023
바실루스 푸밀루스 IFO 12089
바실루스 메가테리움 IFO 12108
바실루스 아밀로리퀘페시엔스 IFO 3022
슈도모나스 트리플리이 IFO 12056
시트로박터 프레운디이 IFO 12681
에스케리키아 콜리 IFO 3456
에르위니아 헤르비콜라 IFO 12686
그러므로 이들 박테리아를 20∼40℃에서 2∼4일동안 성장시킬 수 있는 배지에서 배양하고, 생성된 배양브로스를 살균하여 0.5∼5.0%(v/v) 비율로 산화균주용 배지에 가한다. 이 방법으로, 산화균주의 성장이 촉진될 수 있다.
이렇게 배양 브로스에 생성 및 축적된 2-케토-L-굴론산 또는 반응 혼합물을 수거하여 그의 특성을 이용한 공지방법에 의해 정제할 수 있다. 2-케토-L-굴론산은 유리산의 형태로 수거되거나, 예를 들면 소듐, 포타슘, 칼슘, 암모늄 등과의 염의 형태로 분리될 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 어떤 회수방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양 브로스에서 필요하다면 여과, 원심분리 또는 활성탄 처리에 의해 세포를 제거하고, 용액을 농축한다. 침전된 결정을 여과에 의해 수거하고, 재결정하여 목적 화합물을 회수한다. 더우기, 용매추출, 크로마토그래피, 침전 또는 염석, 및 기타 방법을 적당히 배합 및/또는 반복할 수 있다.
2-케토-L-굴론산을 유리된 형태로 수득할 때, 공지 방법에 의해 예를 들면, 소듐, 포타슘, 칼슘, 암모늄 등과의 염으로 전환될 수 있다. 목적 화합물의 염의 형태로 회수될 때, 공지 방법에 의해 유리산 또는 다른 염으로 전환될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 생성 화합물의 2-케토-L-굴론산이라는 확인은 원소분석, 융점, 비선광도, 적외선 흡수 스펙트럼 등과 같은 물리 화학적 상수의 측정에 의해 수행된다.
반응 혼합물 또는 배양브로스에서 2-케토-L-굴론산의 정량분석은 술폰화폴리스티렌겔 컬럼(시마쯔 세이사꾸쇼, 일본, SCR-101H 컬럼, 7.9㎜×30㎝)를 사용한 고성능 액체크로마토그래피(이동상 : 묽은 황산 pH 2.2; 유속 : 0.5㎖/분; 검출기; 미분굴절계)에 의해 수행된다. 표준으로는, 소듐2-케토-L-굴로네이트 모노히드레이트의 결정이 사용된다. 2-케토-L-굴론산의 검출은 박막 크로마토그래피에 의해 수행된다. 그러므로, 셀룰로오즈 플레이트(미합중국, 메르크)에 시료를 스포트하고, 페놀-물-포름산(75 : 25 : 5)의 용매계로 실온에서 3시간 동안 전개한 후, 건조시키고, 착색제로 처리할 때, 2-케토-L-굴론산은 약 0.3의 Rf에서 스포트가 나타나며, 이때, 질산온으로 처리하면 흑갈색, o-페닐렌디아민으로 처리하면 황색, 또는 아닐린 프탈산으로 처리하면 분홍색의 스포트가 나타난다.
2-케토-L-굴론산은 슈도글루코노박터 속에 속하며 L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시킬 수 있는 미생물을 사용한 본 발명의 방법에 의해 양호한 수율로 제조될 수 있다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 것이다. 배지와 관련된 %의 수지는 중량/부피%를 나타낸다.
[실시예 1]
200㎖ 원추 플라스크에 2.0%의 글루코오즈, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 이스트 및 2.0%의 CaCO3를 함유한 종 배양배지 20㎖를 채우고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균한다. 표 1의 사면 배지에서 28℃로 4일 동안 성장된 1루우프의 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K592s(IFO 14464; FERM BP-1130, KFCC-10275)를 플라스크에 접종하고, 30℃에서 2일 동안 진탕(200rpm) 배양한다. 생성된 브로스 2㎖를 상기와 같은 종 배양배지를 함유한 플라스크에 옮기고, 같은 조건하에 배양하여 총 배양액을 수득한다.
200㎖ 원추 플라스크에 2.0%의 CSL, 0.5%의 건조 이스트, 0.5%의 황산암모늄, 0.05%의 Na2S2O3·5H2O, 0.2%의 황산 제1철, 4.0%의 CaCO3및 10.0%이 L-소르보즈(별도 살균)를 함유하는 발효배지 25㎖를 채우고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균한다. 상기 발효 배지를 함유한 원추 플라스크에 1.25㎖의 상기에서 제조된 종 배양액을 접종하고, 30℃에서 3일동안 진탕 배양한다.
고성능 액체크로마토그래피로 분석하면, 새성된 발효 브로스는 60.5㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 56.1%)을 함유한다. 이 발효 브로스(1000㎖)를 원심분리하여 세포질 및 기타 침전물을 제거한다. 수득된 상층액(980㎖)을 앰버라이트 IR 120(롬 앤드 하스사, 미합중국, H-형, 500㎖) 컬럼에 통과시키고, 약 300㎖의 탈이온수로 세척한다. 유출물 및 세척물을 합하여 활성탄(500㎖) 컬럼에 통과시키고, 약 300㎖의 탈이온수로 세척하여 양이온 및 염료를 제거한다. 유출물 및 세척물을 합하고(1600㎖), 수산화나트륨에 의해 pH 6.5로 조절한 후, 50℃에서 감압하 약 70㎖로 농축한다. 이 농축물을 5℃에서 24시간 동안 방치하여 무색프리즘상 결정을 수득한다. 프리즘을 여과 수거하고, 소량의 냉메탄올로 세척한 후, 실온에서 감압하 오산화인으로 건조시켜, 37.5g의 모노소듐 2-케토-L-굴로네이트 모노히드레이트를 수득한다.
융점 147∼155℃(분해)
원소분석(C6H3O7Na·H2O)
계산치(%) : C; 30.78, H; 4.74
실측치(%) : C; 30.94, H; 4.85
비선광도 :
Figure kpo00002
-23.3°(C=1.0, 몰).
HPLC 체류시간, TLC Rf값 및 색에 있어서, 상기 생성물은 진짜 새료와 일치한다.
[실시예 2]
표 2에 완전 배지 5㎖를 함유한 시험관(16㎜×160㎜)에 표 1의 사면 배지에서 성장된 1루우프의 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s를 접종하고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 이 배양액(1㎖)을 5㎖의 같은 배지를 함유한 시험관에 옮기고, 4시간 동안 진탕 배양한다. 생성된 브로스(5㎖)를 5℃에서 15분동안 무균 원심분리(12,000rpm)하여 세포를 수거한다. 세포를 10㎖의 트리스-말레산 완충액(pH 6.5; 0.05M)에 현탁시키고, 재 원심분리한다. 상기의 방법을 2번 반복하고, 세척된 세포를 1㎎/㎖의 니트로소구아니딘을 함유한 상술한 완충액 5㎖에 현탁시킨 후, 30℃에서 2시간 동안 진탕하여 변이 처리한다. 현탁액을 5℃에서 15분동안 원심분리(12,000rpm)하여 세포를 수거하고, 10㎖씩의 트리스-말레산 완충액으로 2번 세척하여 니트로소구아니딘-처리 세포를 함유한 분획을 회수한다.
이들 0.85% 염수에 의해 적당한 농도로 희석하고, 15㎖의 완전 배지(고체)를 함유한 플레이트(직경 : 9㎝)에 넓게 편다. 접종된 플레이트 배지를 28℃에서 5일 동안 배양하여 군락을 성장시킨다. 군락의 수를 세고, 비처리된 대조군과 비교한다. 니트로소구아니딘 처리로 인한 미생물의 사망률은 90.4%이다. 완전한 배지 플레이트상의 군락의 표 3의 최소 필수 배지 플레이트에 복제하고, 28℃에서 3일 동안 배양한 후, 영양 요구균(영양성 변이주)의 빈도를 관찰한다. 빈도는 약 6.6%이다.
완전한 배지 플레이트 상에서 변이원으로 처리된 군락을 플레이트 당 12균주의 비율로 약 2㎝길이로 신선한 완전 배지 플레이트에 줄을 긋는다. 28℃에서 2일동안 배양한 후, 1루우프의 성장된 세포를 7.0%의 L-소르보즈(별도 멸균), 1.0%의 건조 이스트, 1.0%의 펩톤, 0.1%의 염화 제1철 및 3.0%의 CaCO3로 구성된 배지(pH 6.5) 3㎖가 채워진 시험관에 옮기고, 30℃에서 4일 동안 진탕 배양한다. 시험된 변이주중에서, 균주 TH 14-86은 상기 조건하에 모균주 K519s보다 2배 많은 2-케토-L-굴론산을 제조한다는 것이 발견되었다. 이 균주 TH 14-86(IFO 14466; FERM BP-1128, KFCC-10273)을 L-소르보즈의 산화능을 갖는 산화균주로 선택한다.
[표 1]
[사면배지(g/1)]
Figure kpo00003
[표 2]
[완전한 배치(g/1)]
Figure kpo00004
[표 3]
[최소 필수 배지(g/1)]
Figure kpo00005
[실시예 3]
실시예 2에서 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s로부터 유도된 변이주 TH 14-86을 사면 배지에서 28℃로 4일동안 성장시킨다. 사면 배양액으로부터 1루우프의 세포를 취하고, 실시예 1에 기재된 종 배양 배지 20㎖를 함유한 200㎖들이 원추 플라스크에 접종시킨 후, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양한다. 1ℓ들이 원추 플라스크에 3.0%의 글루코즈, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 이스트 및 2.0%의 CaCO3를 함유한 배지 200㎖를 채우고, 120℃에서 20분동안 오트클레이브 살균한다. 이 원추 플라스크에 상기 배양액 20㎖를 배양하고, 28℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 종 배양액을 수득한다. 한편, 사면 배지에서 28℃로 2일동안 성장된 바실루스 메가테리움 IFO 12108 1루우프를 4.0%의 슈크로오즈, 4.0%의 면실유, 0.65%의 K2HPO4, 0.05%의 황산 암모늄, 0.55%의 KH2PO4, 0.05%의 NaCl, 0.05%의 황산 마그네슘 및 0.05%의 칼슘 판토테네이트(pH 7.0)로 구성된 배지(120℃에서 20분간 오토클레이브 살균) 20㎖가 담겨진 200㎖들이 원추 플라스크에 접종하고, 30℃에서 3일동안 배양한다. 생성된 배양 브로스틀 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균하고, 냉소에서 저장한 후, 하기에 설명된 발효배지의 성분으로 사용한다. 5ℓ들이 병발효기에 12.5%의 L-소르보즈(120℃에서 15분간 별도 살균), 0.5%의 황산암모늄, 0.03%의 KH2PO4, 0.05%의 Na2S2O3·5H2O, 0.05%의 황산 마그네슘, 0.1%의 FeSO4·7H2O, 5㎍/㎖의 MnSO4·4H2O, 5㎍/㎖의 티아민, 0.1㎍/㎖의 비오틴, 0.1㎍/㎖의 FMN, 5.0%의 CaCO3, 및 4.0%의 상기 바실루소 메가테리움 살균 브로스로 구성된 이스트 배지 3ℓ를 채우고, 120℃에서 30분간 오토클레이브 살균한다.
이 발효 배지를 300㎖의 상기 종배양액으로 접종하고, 32℃에서 2.4ℓ/분으로 통기 및 800rpm으로 교반하면서 3일 동안 배양한다. 생성된 발효 브로스는 102.0㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 75.7%)를 함유한다. 이 브로스(1ℓ)를 실시예 1과 같은 방법으로 정제하여 73.2g의 모노소듐 2-케토-L-굴로네이트 모노히드레이트 결정을 수득한다.
[실시예 4]
슈도글루코노박터 사케로케토게네스 12-5(IFO 14465; FERM BP-1129, KFCC-10274)를 실시예 1과 같은 방법으로 배양하여 종 배양액을 수득한다. 200㎖ 원추 플라스크에 실시예 3에 기재되 9.0%의 L-소르보즈를 함유한 발효 배지 20㎖를 채우고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균한다. 플라스크를 1.5㎖의 상기 종배양으로 접종하고, 32℃에서 2시간 동안 배양한다. 생성된 발효 브로스 73.2㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 75.4%)을 함유한다.
[실시예 5]
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 12-4(FERM BP-1131, IFO 14483, KFCC-10276), 12-15(FERM BP-1132, IFO 14482, KFCC-10277) 및 22-3(FERM BP-1133, IFO 14484, KFCC-10278)을 실시예 4와 같은 방법으로 각각 3일간 진탕 배양한다. 브로스에서 2-케토-L-굴론산의 수율은 균주 12-4의 경우 52.1㎎/㎖(전환비 : 53.7%); 균주 12-15의 경우 48.7㎎/㎖(전환비 : 50.2%); 및 균주 22-3의 경우 69.3㎎/㎖(전환비 : 71.4%)이다.
[실시예 6]
200㎖들이 원추 플라스크에 1.0%의 L-소르보즈(별도 살균), 0.5%의 펩톤 및 0.5%의 이스트 추출물로 구성된 배지(pH 7.0) 25㎖를 채우고, 120℃에서 15분간 오토클레이브 살균한다. 플라스크를 표 1의 사면 배지에서 성장된 1루우프의 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH 14-86으로 28℃에서 4일동안 접종 시키고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 종 배양액을 수득한다.
200㎖들이 원추 플라스크에 5.0%의 L-소르보즈(별도 살균), 1.0%의 펩톤, 0.5%의 이스트 추출물 및 2.0%의 CaCO3로 구성된 배지(pH 7.0), 25㎖를 채우고, 120℃에서 15분 동안 오토클레이브 살균한다. 이 플라스크를 1.0㎖의 상기 종배양액으로 접종하고, 30℃에서 2일 동안 배양한다.
생성된 배양액(500㎖)을 실온에서 20분간 방치하여, 침전물을 경사분리에 의해 제거한다. 나머지 액체를 1,000rpm의 느린 속도로 실온에서 원심분리하여 CaCO3가 현저히 많은 침전물을 제거한다. 이렇게 수득된 세포 현탁액을 5℃에서 10분동안 더 원심분리(6,000rpm)하고, 수거된 세포를 약 100㎖씩의 냉염수(0.85%)로 2번 세척한 후, 5℃에서 재원심분리(6,000rpm)하여 세척된 세포를 수득한다. 세포를 35㎖의 냉염수(0.85%)에 더 현탁시켜 세척된 세포 현탁액을 수득한다. 이 세척된 세포 현탁액 4㎖에 300㎎의 L-소르보즈, 0.5㎖의 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산(MES) 완충액(pH 6.5; 0.5M) 및 180㎎의 CaCO3를 가하고, 물로 10㎖까지 희석한다. 혼합물을 30℃의 100㎖ 원추 플라스크에서 진탕하면서 24시간 동안 반응시킨다. 이 방법으로 수득된 반응 혼합물을 24.6㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 76.0%)을 함유한다.
[실시예 7]
슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s, 12-5 및 TH 14-86을 사면 배지에서 28℃로 4일 동안 각각 성장시킨다. 한편, 표 4의 수반 박테리아를 같은 사면 배지에서 28℃로 2일 동안 성장시킨다.
각 균주 1루우프를 실시예 1의 종배양 배지 20㎖를 함유한 200㎖들이 원추 플라스크에 접종하고, 30℃에서 2일 동안 진탕(200rpm)배양한다. 이런 방법으로, 각종 배양 브로스가 수득된다.
200㎖ 원추 플라스크에 2.0%의 CSL, 0.3%의 건조 이스트, 0.5%의 황산암모늄, 0.05%의 Na2S2O3·5H2, 0.2%의 황산 제1철, 5.0%의 CaCO3및 15.0%의 L-소르보즈(별도 살균)으로 구성된 발효배지 25㎖를 채우고, 120℃에서 20분 동안 오토클레이브 살균한다. 상기 배지를 함유한 원추 플라스크를 상기의 것중 하나의 종배양액(1.5㎖)으로 접종한다. 슈도글루코노박터 사카로케토게네스(산화) 균주를 30℃에서 5일동안 진탕 배양하여 순수 배양액을 수득한다. 혼합 배양액의 경우, 상기 수반 박테리아의 종 배양액 0.1㎖를 산화균주의 접종과 동시에 접종하고, 접종된 배지를 30℃에서 5일 동안 진탕 배양한다.
각 브로스에 생성된 2-케토-L-굴론산의 양을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석한다. 결과는 표 4에 나타낸다. 수반 박테리아의 존재는 2-케토-L-굴론산의 수율을 증가시킨다는 것을 알 수 있다.
[수반 박테리아의 존재 또는 부재하에 균주 슈도글루코노박터 사카로케토게네스의 배양에 의한 2-케토-L-굴론산의 제조]
[표 4]
Figure kpo00006
괄호안의 수치는 전환비를 나타낸 것이다.
[실시예 8]
2ℓ들이 사까구찌 플라스크에 2.0%의 글루코즈, 1.0%의 펩톤, 1.0%의 건조 이스트, 2.0%의 CaCO3및 0.01%의 악트콜(거품방지제, 다께다야꾸힝고오교가부시끼가이샤)로 구성된 예비 배양 배지 500㎖를 채우고, 120℃에서 20분간 오토클레이브 살균한다. 표 1의 사면 배지에서 성장된 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH 14-86의 세포를 10㎖ 멸균수에 현탁시키고, 총량을 사까구찌 플라스크에 접종하고, 왕복 진탕기(85s.p.m)에서 28℃로 3일 동안 배양하여 예비 배양액을 수득한다. 200ℓ 발효기에 3.0%의 글루코즈, 1.0%의 CSL, 0.5%의 건조 이스트, 0.05%의 티오황산나트륨, 1.05 황산 제1철, 2.0%의 탄산칼슘 및 0.03%의 악트콜로 구성된 종배양액 120ℓ(pH 6.5)을 채우고, 125℃에서 30분간 살균한다. 이 발효기에 1.8ℓ의 상술한 예비 배양액을 옮기고, 120rpm(회전), 100ℓ/분(통기), 1.0㎏/㎠G(압력) 및 30℃에서 3일 동안 배양하여 종배양액을 수득한다.
한편, 표 1의 사면 배지에서 28℃로 2일 동안 성장된 수반 균주 바실루스 메가테리움 IFO 12108 1 루우프를 500㎖의 상술한 예비 배양배지를 함유한 2ℓ들이 사까구찌 플라스크에 접종하고, 왕복진탕기(85s.p.m)에서 28℃로 2일 동안 배양하여 예비배양액을 수득한다. 50ℓ들이 발효기에 상술한 예비 배양배지와 같은 배지 30ℓ를 채우고, 120℃에서 20분간 살균한다. 이 발효기를 수반 균주의 예비 배양액 500㎖로 접종하고, 120rpm(회전), 30ℓ/분(통기), 1.0㎏/㎠G(압력) 및 30℃에서 2일 동안 배양하여 수반 균주의 종배양액을 수득한다.
2㎥ 발효기에 15.0%의 L-소르보즈(별도 멸균), 5.0%의 탄산칼슘, 2.0%의 CSL, 0.2%의 건조 이스트, 0.3%의 황산암모늄, 0.05%의 티오황산나트륨, 0.1%의 황산 제1철 및 0.03%의 악트콜로 구성된 발효배지 1000ℓ를 채우고, 125℃에서 30분간 살균한다. 이 발효기에 균주 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH 14-86의 종배양액 110ℓ 및 수반 균주 바실루스 메가테리움 IFO 12108의 종배양액 10ℓ를 옮기고, 110rpm(회전), 900ℓ/분(통기), 0.5㎏/㎠G(압력) 및 30℃에서 배양한다. 배양 4일 후의 배양 브로스는 123.1㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 76.1%)을 함유한다.
[실시예 9]
200㎖들이 원추 플라스크에 실시예 8의 예비 배양 배지 20㎖를 채우고, 120℃에서 30분간 오토클레이브 살균한다. 표 1의 사면 배지에서 28℃로 4일 동안 성장된 1 루우프의 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH 14-86을 상기 플라스크에 접종하고, 30℃에서 2일동안 진탕 배양한다. 생성된 배양액(20㎖)를 같은 배지 200㎖를 함유한 1ℓ들의 원추 플라스크에 옮기고, 30℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 TH 14-86의 종배양을 수득한다.
사면 배지에서 28℃로 2일 동안 성장된 바실루스 메가테리움 IFO 12108 1 루우프를 20㎖의 예비 배양배지를 함유한 200㎖들이 원추 플라스크에 접종하고, 28℃에서 2일 동안 진탕 배양하여 수반 박테리아의 종배양액을 수득한다. 3.0%의 L-소르보즈(별도 멸균), 2.0%의 CSL, 0.2%의 건조 이스트, 0.3%의 황산암모늄, 0.05%의 티오황산나트륨, 0.1%의 황산 제1철, 0.02%의 악트콜 및 9.0%의 탄산칼슘으로 구성된 발효배지(3ℓ)를 2.1ℓ로 조절하고, 120℃에서 30분간 오토클레이브 살균한다. 살균된 배지를 5ℓ들이 병 발효기에 채운다.
이 병 발효기를 균주 TH 14-86의 종배양액 300㎖ 및 수반 균주의 종배양액 4㎖로 접종하고, 30℃, 2.4ℓ/분(통기) 및 800rpm(회전)에서 배양을 수행한다.
한편, 510g의 L-소르보즈를 물에 용해시켜 800㎖의 소르보즈 용액을 제조하고, 120℃에서 30분간 오토클레이브 살균한다. 이 살균된 용액을 배양의 6시간째로부터 42시간째까지 병 발효기에 연속적으로 가한다. L-소르보오즈를 가한 후, 상기와 같은 조건하에 28시간 더 배양을 계속한다(총 70시간), 생성된 브로스는 163.5㎎/㎖의 2-케토-L-굴론산(전환비 : 75.8%)을 함유한다.

Claims (8)

  1. L-소르보즈를 2-케토-L-굴론산으로 산화시킬 수 있는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 그 자체로 또는 가공한 후 L-소르보즈와 접촉시켜 2-케토-L-굴론산을 생성 및 축적하고 이를 수거 함을 특징으로 하는 2-케토-L-굴론산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s(FERM BP-1130, KFCC-10275), 12-5(FERM BP-1129, KFCC-10274), TH 14-86(FERM BP-1128, KFCC-10273), 12-15(FERM BP-1132, KFCC-10277), 12-4(FERM BP-1131, KFCC-10276) 또는 22-3(FERM BP-1133, KFCC-10278)인 방법.
  4. L-소르보즈 2-케토-L-굴론산으로 산화할 수 있는 슈도글루코노박터 속의 미생물을 바실루스 속, 슈도모나스 속, 프로테우스 속, 시트로박터 속, 엔테로박터 속, 에르위니아 속, 크산토모나스 속, 또는 플라보박테리움 속에 속하는 1종 이상의 미생물 존재하와 L-소르보즈와 접촉시킴을 특징으로 한 2-케토-L-굴론산의 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 슈도글루코노박터 속의 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 슈도글루코노박터 속의 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s(FERM BP-1130, KFCC-10275), 12-5(FERM BP-1129, KFCC-10274), TH 14-86(FERM BP-1128, KFCC-10273), 12-15(FERM BP-1132, KFCC-10277), 12-4(FERM BP-1131, KFCC-10276) 또는 22-3(FERM BP-1133, KFCC-10278)인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 슈도글루코노박터 속의 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 TH 14-86(FERM BP 1128, KFCC-10273)이고, 바실루스 속의 미생물 바실루스 세레우스(IFO 3131), 바실루스 리케니포르미스(IFO 12201), 바실루스 메가테리움(IFO 12108), 바실루스 푸밀루스(IFO 12090), 바실루스 아밀로리퀘페시엔스(IFO 3022) 또는 바실루스 서브틸리스(IFO 13719)이며, 슈도모나스 속의 미생물이 슈도모나스 트리플리이(FIO 12056) 또는 슈도모나스 말토필리아(IFOR 12692)이고, 프로테우스 속의 미생물이 프로테우스 인콘스탄스(IFOR 12930)이며, 시트로박터 속의 미생물이 시트로박터 프레운디이(IFO 13544)이고, 엔테로박터 속의 미생물이 엔테로박터 클로아카에(IFO 3320)이며, 에르위니아 속의 미생물이 에르위니아 헤르비콜라(IFO 12686)이고, 크산토모나스 속의 미생물이 크산토모나스 피시(IFO 13556)이며, 플라보박테리움 속의 미생물이 플라보박테리움 메닌고셉티쿰(IFO 12535)인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 슈도글루코노박터 속의 미생물이 슈도글루코노박터 사카로케토게네스 K519s(FERM BP-1130, KFCC-10275) 또는 12-5(FERM BP-1129, KFCC-10274)이며, 바실루스 속의 미생물이 바실루스 세레우스(IFO 3131), 바실루스 메가테리움(IFO 12108), 바실루스 푸밀루스(IFO 12090) 또는 바실루스 서브틸리스(IFO 13719)이고 슈도모나스 속의 미생물이 슈도모나스 트리플리이(IFO 12056 또는 슈도모나스 몰토필리아(IFO 12692)이며, 시트로박터 속의 미생물이 시트로박터 프레운디이(IFO 13544)이고, 엔테로박터 속의 미생물이 엔테로박터 클로아카에(IFO 3320)이며, 에르위니아 속의 미생물이 에르위니아 헤르비콜라(IFO 12686)인 방법.
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