JPH078235B2

JPH078235B2 - シュードグルコノバクター属酸化菌

Info

Publication number: JPH078235B2
Application number: JP5076754A
Authority: JP
Inventors: ▲いく▼雄野上; 英夫白藤; 正秀岡; 高正山口
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-10-22
Filing date: 1993-04-02
Publication date: 1995-02-01
Anticipated expiration: 2010-02-01
Also published as: ES2053443T3; US5474924A; IE862776L; JPS62228288A; HU201804B; EP0221707B1; IE59623B1; DK489686D0; DK171869B1; ATE86665T1; CN86107277A; KR870004145A; CA1318871C; DE3687946D1; DE3687946T2; KR950009199B1; JPH067157A; EP0221707A3; HUT43636A; CN1024022C

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−アスコルビン酸合
成の中間体として有用な２−ケト−Ｌ−グロン酸の、醗
酵法による製造法等に用いるシュードグルコノバクター
属菌に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−アスコルビン酸合成の中間体として
有用な２−ケト−Ｌ−グロン酸は、工業的に確立された
いわゆるライヒシュタイン法[ヘルベチカ・キミカ・ア
クタ(Ｈelvetica Ｃhimica Ａcta)第１７巻,３１１
頁,(１９３４)]によって生産されてきた。しかし、この
方法は工程数も多く、多量の溶媒を必要とし現代の工業
技術として満足すべきものではない。また一方でライヒ
シュタイン法に代わる方法として、主に微生物を使った
方法がいくつか提案されてきている。例えばグルコース
を微生物的に酸化して５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成
せしめ、これを化学的、または微生物的に還元してＬ−
イドン酸とし、これをまた微生物的に酸化して２−ケト
−Ｌ−グロン酸を得る方法[米国特許第２,４２１,６１
１号]さらにはグルコースを微生物的に酸化して、２,５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸とし、これをさらに微生物
的、化学的に２−ケト−Ｌ−グロン酸にする方法[特公
昭３９−１４４９３,特公昭５３−２５０３３,特公昭５
６−１５８７７,特公昭５９−３５９２０]が検討されて
きた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしこれらの方法に
用いられる化学的還元工程即ち、前者の５−ケト−Ｄ−
グルコン酸のＬ−イドン酸への還元と後者の２,５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸の２−ケト−Ｌ−グロン酸への還
元は立体特異性に問題があり、それぞれ前者ではＤ−グ
ルコン酸、後者では２−ケト−Ｄ−グルコン酸を副生し
収率の低下をきたす。また前記の還元を微生物で行う場
合は、還元エネルギー源として余分の糖質を微生物に供
給せねばならずやはり収率の低下をもたらすものであ
る。この点Ｌ−ソルボースを出発原料とする場合は酸化
工程のみで２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造することがで
きる。事実この方向をとる試みがグルコノバクター属,
シュードモナス属,セラチア属,アクロモバクター属およ
びアルカリゲネス属の細菌を用いてなされている。[バ
イオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング
( Ｂiotechnology andＢioengineering)第１４巻,７
９９頁,(１９７２),特公昭４１−１５９,特公昭４１−
１６０, 米国特許第３,０４３,７４９号, 特公昭４９−
３９８３８, 中国微生物学報, 第２０巻, 第２４６頁
(１９８０)および第２１巻, 第１８５頁(１９８１)]
しかしこれまでに公表された菌株の成績は充分な収率が
得られていず、工業的に利用されるには程遠いものであ
った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、この様な
事情に鑑み、工業的に有利な２−ケト−Ｌ−グロン酸の
製造法につき種々研究を行った結果、和歌山県の土壌資
料から分離した細菌,Ｋ５９１s株,滋賀県の土壌資料か
ら分離した細菌,１２−５株,１２−１５株,１２−４株
および２２−３株が従来の知見を遥かに上廻る収率でＬ
−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換し、また
分類学的研究の結果、これまでに知られない新しい細菌
であることを見い出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち、本発明は、好気性細菌で補酵素Ａの存在下に
生育するシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネ
スである。本発明の微生物は例えば、(1) シュードグル
コノバクター属に属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ
−グロン酸に酸化する能力を有する微生物またはその処
理物を、Ｌ−ソルボースに接触させて２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造法及び(2) シュード
グルコノバクター属に属し、Ｌ−ソルボースを２−ケト
−Ｌ−グロン酸に酸化する能力を有する微生物をＬ−ソ
ルボースに接触させて２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄
積せしめるに際し、バチルス属,シュードモナス属,プロ
テウス属,シトロバクター属,エンテロバクター属,エル
ウィニア属,キサントモナス属,フラボバクテリウム属,
ミクロコッカス属またはエシェリヒア属に属する微生物
のうち少なくとも１種を存在させることを特徴とする２
−ケト−Ｌ−グロン酸の製造法等に用いることができ
る。前記５菌株のうちＫ５９１s,１２−５両菌株の分類
学的性状は次の通りである。

【０００５】(a)形態 (１)桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μm。 (２)細胞の多形性は認められない。 (３)運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。 (４)胞子を形成しない。 (５)グラム陰性。 (６)非抗酸性。 (b)生育の状態 (１)肉汁寒天平板培養:殆ど生育しない。酵母エキス添
加肉汁寒天平板培養では円形,全縁,平滑,乳白色。 (２)酵母エキス添加肉汁寒天斜面:生育中程度,糸状,平
滑,乳白色。 (３)酵母エキス添加肉汁液体培養:生育中程度,培地全体
を均一に混濁する。 (４)肉汁ゼラチン穿刺培養:上部のみ微弱に生育。ゼラ
チンは液化しない。 (５)リトマスミルク:酸性化する。凝固する。 (c)生理学的性質 (１)硝酸の還元は微弱であるが陽性。 (２)脱窒反応は認められない。 (３)メチルレッド(ＭＲ)テストは陽性。 (４)フォーゲス・プロスカウエル(ＶＰ)テストは陰性。 (５)インドールを生成しない。 (６)硫化水素を生成しない。 (７)デンプンを加水分解しない。 (８)クエン酸の利用性は陰性。 (９)アンモニウム塩を利用する。 (10)色素の生成は認められない。 (11)ウレアーゼを生成する。 (12)オキシダーゼは陽性。 (13)カタラーゼは陽性。 (14)１６〜３６℃で生育し、至適生育温度は２４〜３４
℃。pＨ５．５〜８．７で生育し、至適生育pＨは６．０
〜７．５。 (15)好気性。 (16)ヒュー・ライフソンのOFテストで糖の分解は酸化
的。 (17)Ｌ−アラビノース,Ｄ−キシロース,Ｄ−グルコー
ス,Ｄ−フラクトース,Ｄ−ガラクトース,Ｄ−マンノー
ス,麦芽糖,ショ糖,乳糖,トレハロース,Ｄ−マンニトル,
グリセロールから酸を生成するが、ガスは生成されな
い。Ｄ−ソルビトール,イノシトール,デンプンから酸、
ガスの生成は認められない。 (d)その他の性質 (１)エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。 (２)ビオチン,チアミン,リボフラビンおよび補酵素Ａ
(以下ＣoＡと称することもある)を生育に要求する。 (３)グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成
する。 (４)ＤＮＡのグアニン＋シトシン含量は６７±１モル
％。 (５)イソプレンユニット数１０のユビキノン(ＣoＱ₁₀)
を有する。 (６)Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸
を生成する。 (７)ストレプトマイシンに耐性を有する。ついで１２−１５株の分類学的性状は以下の通りであ
る。

【０００６】(a)形態 (１)桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μm。 (２)細胞の多形性は認められない。 (３)運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。 (４)胞子を形成しない。 (５)グラム陰性。 (６)非抗酸性。 (b)生育の状態 (１)肉汁寒天平板培養:殆ど生育しない。酵母エキス添
加肉汁寒天平板培養では円形,全縁,平滑,乳白色。 (２)酵母エキス添加肉汁寒天斜面:生育中程度,糸状,平
滑,乳白色。 (３)酵母エキス添加肉汁液体培養:生育中程度,培地全体
を均一に混濁する。 (４)肉汁ゼラチン穿刺培養:上部のみ微弱に生育。ゼラ
チンは液化しない。 (５)リトマスミルク:酸性化するが凝固しない。 (c)生理学的性質 (１)硝酸の還元は陰性。 (２)脱窒反応は認められない。 (３)メチルレッド(ＭＲ)テストは陽性。 (４)フォーゲス・プロスカウエル(ＶＰ)テストは陰性。 (５)インドールを生成しない。 (６)硫化水素を生成しない。 (７)デンプンを加水分解しない。 (８)クエン酸の利用性は陰性。 (９)アンモニウム塩を利用する。 (10)色素の生成は認められない。 (11)ウレアーゼを生成する。 (12)オキシダーゼは陽性。 (13)カタラーゼは陽性。 (14)２３〜３２℃で生育し、至適生育温度は２８〜３２
℃。pＨ６．０〜７．５で生育し、至適生育pＨは６．５
〜７．１。 (15)好気性。 (16)ヒュー・ライフソンのOFテストで糖の分解は酸化
的。 (17)Ｌ−アラビノース,Ｄ−キシロース,Ｄ−グルコー
ス,Ｄ−フラクトース,Ｄ−ガラクトース,Ｄ−マンノー
ス,麦芽糖,ショ糖,乳糖,トレハロース,グリセロールか
ら酸を生成するが、ガスは生成されない。Ｄ−マンニト
ール,Ｄ−ソルビトール,イノシトール,デンプンから
酸、ガスの生成は認められない。 (d)その他の性質 (１)エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。 (２)ビオチン,チアミン,リボフラビンおよびＣoＡを生
育に要求する。 (３)グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成
する。 (４)ＤＮＡのグアニン＋シトシン含量は６７±１モル
％。 (５)イソプレンユニット数１０のユビキノン(ＣoＱ₁₀)
を有する。 (６)Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸
を生成する。 (７)ストレプトマイシンに耐性を有する。また１２−４株の分類学的性状を記載すると次の通りで
ある。

【０００７】(a)形態 (１)桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μm。 (２)細胞の多形性は認められない。 (３)運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。 (４)胞子を形成しない。 (５)グラム陰性。 (６)非抗酸性。 (b)生育の状態 (１)肉汁寒天平板培養:微少コロニーとしてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形,全縁,平滑,乳白色。 (２)酵母エキス添加肉汁寒天斜面:生育中程度,糸状,平
滑,乳白色。 (３)酵母エキス添加肉汁液体培養:生育中程度,培地全体
を均一に混濁する。 (４)肉汁ゼラチン穿刺培養:上部のみ微弱に生育。ゼラ
チンは液化しない。 (５)リトマスミルク:酸性化するが凝固しない。 (c)生理学的性質 (１)硝酸の還元は陰性。 (２)脱窒反応は認められない。 (３)メチルレッド(ＭＲ)テストは陽性。 (４)フォーゲス・プロスカウエル(ＶＰ)テストは陰性。 (５)インドールを生成しない。 (６)硫化水素を生成する。 (７)デンプンを加水分解しない。 (８)クエン酸の利用性は陰性。 (９)アンモニウム塩を利用する。 (10)色素の生成は認められない。 (11)ウレアーゼを生成する。 (12)オキシダーゼは陽性。 (13)カタラーゼは陽性。 (14)１６〜３６℃で生育し、至適生育温度は２４〜３４
℃。pＨ５．５〜８．２で生育し、至適生育pＨは６．０
〜７．５。 (15)好気性。 (16)ヒュー・ライフソンのOFテストで糖の分解は酸化
的。 (17)Ｌ−アラビノース,Ｄ−キシロース,Ｄ−グルコー
ス,Ｄ−フラクトース,Ｄ−ガラクトース,Ｄ−マンノー
ス,麦芽糖,ショ糖,乳糖,トレハロース,グリセロールか
ら酸を生成するが、ガスは生成されない。Ｄ−マンニト
ール,Ｄ−ソルビトール,イノシトール,デンプンから
酸、ガスの生成は認められない。 (d)その他の性質 (１)エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。 (２)ビオチン,チアミンおよびリボフラビンとＣoＡまた
はパントテン酸を生育に要求する。 (３)グリセロールからジハイドロオキシアセトンを生成
する。 (４)ＤＮＡのグアニン＋シトシン含量は６７±１モル
％。 (５)イソプレンユニット数１０のユビキノン(ＣoＱ₁₀)
を有する。 (６)Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸
を生成する。 (７)ストレプトマイシンに耐性を有する。さらに２２−３株の分類学的性状は次の通りである。

【０００８】(a)形態 (１)桿菌。細胞の大きさは０．３〜０．５×０．７〜
１．４μm。 (２)細胞の多形性は認められない。 (３)運動性を有し、２〜４本の極鞭毛を有する。 (４)胞子を形成しない。 (５)グラム陰性。 (６)非抗酸性。 (b)生育の状態 (１)肉汁寒天平板培養:微少コロニーとしてのみ生育
し、充分な観察はできない。酵母エキス添加肉汁寒天平
板培養では円形,全縁,平滑,乳白色。 (２)酵母エキス添加肉汁寒天斜面:生育中程度,糸状,平
滑,乳白色。 (３)酵母エキス添加肉汁液体培養:生育中程度,培地全体
を均一に混濁する。 (４)肉汁ゼラチン穿刺培養:上部のみ微弱に生育。ゼラ
チンは液化しない。 (５)リトマスミルク:酸性化するが凝固しない。 (c)生理学的性質 (１)硝酸の還元は微弱であるが陽性。 (２)脱窒反応は認められない。 (３)メチルレッド(ＭＲ)テストは陽性。 (４)フォーゲス・プロスカウエル(ＶＰ)テストは陰性。 (５)インドールを生成しない。 (６)硫化水素を生成しない。 (７)デンプンを加水分解しない。 (８)クエン酸の利用性は陰性。 (９)アンモニウム塩を利用する。 (10)色素の生成は認められない。 (11)ウレアーゼを生成する。 (12)オキシダーゼは陽性。 (13)カタラーゼは陽性。 (14)１６〜３８℃で生育し、至適生育温度は２４〜３４
℃。pＨ５．５〜８．７で生育し、至適生育pＨは６．０
〜７．８。 (15)好気性。 (16)ヒュー・ライフソンのOFテストで糖の分解は酸化
的。 (17)Ｌ−アラビノース,Ｄ−キシロース,Ｄ−グルコー
ス,Ｄ−フラクトース,Ｄ−ガラクトース,Ｄ−マンノー
ス,麦芽糖,ショ糖,乳糖,トレハロース,グリセロールか
ら酸を生成するが、ガスは生成されない。Ｄ−マンニト
ール,Ｄ−ソルビトール,イノシトール,デンプンから
酸、ガスの生成は認められない。 (d)その他の性質 (１)エタノールから微弱ではあるが酢酸を生成する。 (２)ビオチン,チアミンおよびリボフラビンとＣoＡまた
はパントテン酸を生育に要求する。 (３)グリセロールからハイドロオキシアセトンを生成す
る。 (４)ＤＮＡのグアニン＋シトシン含量は６７±１モル
％。 (５)イソプレンユニット数１０のユビキノン(ＣoＱ₁₀)
を有する。 (６)Ｌ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸
を生成する。 (７)ストレプトマイシンに耐性を有する。

【０００９】以上土壌分離細菌５株の分類学的諸性質
を、バージーズ・マニュアル・オブ・デタミネーティブ
・バクテリオロジー(Ｂergey's manual of Ｄetermina
tiveＢacteriology) 第８版(１９７４年)およびバージ
ーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー(Ｂergey's manual of Ｓystematic Ｂacterio
logy)第１巻(１９８４年)に照合してみると、５菌株即
ち、Ｋ５９１s株, １２−５株,１２−１５株,１２−４
株と22-3株は、グラム陰性,極鞭毛を有する運動性桿菌
で、好気性、オキシダーゼ陽性であることからシュード
モナス(Ｐseudomonas)属細菌種と一応は考えられる。生
育因子を要求すること、ＤＮＡのグアニンとシトシンと
の総含量が６７±１モル％であること、キノン系はイソ
プレンユニット数１０のユビキノンであることから、こ
の属のセクションIVのＲＮＡグループIVに属するシュー
ドモナス・ディミニュタ( Ｐseudomonas diminuta), シ
ュードモナス・ベシキユラリス(Ｐseudomonas vesicul
aris)に類似している。しかしながらエタノールから微
弱ながらも酢酸を生成すること、グリセロールからジハ
イドロオキシアセトンを生成することはシュードモナス
属菌の性質とは異なる。

【００１０】これらの性質は、グルコノバクター(Ｇluc
onobacter) 属菌種のそれである。しかしまたこれ等５
菌株はオキシダーゼテストが陽性であること、pＨ４.５
では生育できないこと,糖(力源)を含まない酵母エキス
添加肉汁培地またはペプトン−酵母エキス培地でよく生
育出来ること、ＤＮＡグアニンとシトシンとの総含量が
６７±１モル％であること等の性質はグルコノバクター
属の菌種のそれとは異なる。従って、これら５菌株即
ち、Ｋ５９１s株,１２−５株,１２−１５株,１２−４株
と２２−３株は既知の属に該当するものを見い出だすこ
とが出来ず新しい属の新菌種とみなさざるを得ない。そ
こでＫ５９１s株,１２−５株,１２−１５株,１２−４株
と２２−３株の５菌株はシュードグルコノバクター・サ
ッカロケトゲネス（Pseudogluconobacter saccharoket
ogenes)と命名された。ここでこれ等５菌株の栄養要求
性について触れると、Ｋ５９１s株,１２−５株および１
２−１５株はＣoＡを生育に要求する珍しい性質を有し
ている。これら３株のＣoＡ要求性はパントテン酸によ
って代替することは出来ない。一方１２−４株と２２−
３株はＣoＡ存在下においてもパントテン酸存在下にお
いても生育出来る。以下、これらのシュードグルコノバ
クター・サッカロケトゲネスを酸化菌と称することもあ
る。

【００１１】本発明に用いられる菌株は上記した５菌株
は勿論のこと、例えば、５菌株を紫外線やＸ線照射した
り、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン(ニトロソグアニジン),メチルメタンスルホン酸,ナイ
トロジエンマスタードの様な変異誘起剤で処理して得ら
れる変異株も有利に用いられる。その例としてシュード
グルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１sから
ニトロソグアニジン処理によって誘導されたＴＨ１４−
８６株を挙げることができる。ＴＨ１４−８６株はＬ−
ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸生成能が増強さ
れている他は、親株であるＫ５９１s株と同じ分類学的
性質を示した。上記シュードグルコノバクター・サッカ
ロケトゲネスＫ５９１s株, １２−５株およびＴＨ１４
−８６株は、昭和６０年(１９８５年)９月１９日に、シ
ュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１
５株,１２−４株および２２−３株は、昭和６０年(１９
８５年)１２月１６日にＩＦＯ１４４６４,ＩＦＯ１４
４６５, ＩＦＯ１４４６６, ＩＦＯ１４４８２,
ＩＦＯ１４４８３,およびＩＦＯ１４４８４としてそれ
ぞれ寄託され、またシュードグルコノバクター・サッカ
ロケトゲネスＫ５９１s株,１２−５株およびＴＨ１４−
８６株は、昭和６０年１０月７日に、シュードグルコノ
バクター・サッカロケトゲネス１２−１５株,１２−４
株および２２−３株は昭和６０年１２月２０日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲＩ)に受託番
号ＦＥＲＭＰ−８４８１,ＦＥＲＭＰ−８４８０,Ｆ
ＥＲＭＰ−８４７９,ＦＥＲＭＰ−８５７７,ＦＥＲ
ＭＰ−８５７６およびＦＥＲＭＰ−８５７８として
それぞれ寄託され、該寄託がブダペスト条約に基づく寄
託に切換えられて、下記に示す受託番号として同研究所
に保管されている。

【００１２】シュードグルコノバクター・サッカロゲネス K591s FERM BP-1130 シュードグルコノバクター・サッカロゲネス 12-5 FERM BP-1129 シュードグルコノバクター・サッカロゲネス TH14-86 FERM BP-1128 シュードグルコノバクター・サッカロゲネス 12-15 FERM BP-1132 シュードグルコノバクター・サッカロゲネス 12-4 FERM BP-1131 シュードグルコノバクター・サッカロゲネス 22-3 FERM BP-1133 本発明の菌を用いて、Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ
−グロン酸を製造するには、Ｌ−ソルボースを含有する
培地に前記の菌を培養してもよく、またＬ−ソルボース
に前記の菌の菌体処理物を作用させてもよい。本発明で
用いられる「菌体処理物」とは、前記の菌を培養して得ら
れる培養物の洗浄菌体、アセトンパウダー,ポリアクリ
ルアミドゲルまたはＫ−カラギーナン包括固定化菌体な
どをいう。原料のＬ−ソルボースを培地に加えるに際
し、使用全量を培養当初から培地に添加してもよいし、
全量を何回かに分けて、または連続的に培養液に加えて
もよい。Ｌ−ソルボースと前記の微生物とを接触させて
行う反応における反応液中のＬ−ソルボースの濃度は、
培地に対して３〜３０％(w／v)、好ましくは５〜２５％
(w／v)である。Ｌ−ソルボースと菌体処理物とを接触さ
せる方法としては、たとえば、菌体処理物にＬ−ソルボ
ース,２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)
緩衝液(pＨ６．５,０．５Ｍ)およびＣaＣＯ₃を加え、水
で希釈して三角フラスコ中で振盪させる方法が挙げられ
る。

【００１３】Ｌ−ソルボースと前記の微生物の処理物を
接触させて行なう反応における反応液中のＬ−ソルボー
スの濃度は、０．１〜１０％(w／v)、好ましくは０．３
〜３％(w／v)である。微生物の処理物の量は、処理前の
乾燥菌体量として１〜３０mg／mｌである。反応液のpＨ
は、約５.５〜７.５に調整され、反応温度は、約２０〜
４０℃,反応時間は約１〜１００時間である。本発明に
おいてシュードグルコノバクター属細菌をＬ−ソルボー
スを含有する液体培地に培養し、２−ケト−Ｌ−グロン
酸を培養液中に生成蓄積せしめる場合に、本酸化菌シュ
ードグルコノバクター属細菌を単独で培養するよりも、
本酸化菌とは別種の細菌を混在させると、２−ケト−Ｌ
−グロン酸の蓄積量が顕著に増加する。混在させる菌と
しては、例えば、バチルス属,シュードモナス属,プロテ
ウス属,シトロバクター属,エンテロバクター属,エルウ
ィニア属,キサントモナス属およびフラボバクテリウム
属等に属する菌が挙げられ、さらに具体例として下記に
示す菌が挙げられる。

【００１４】バチルス・セレウス (Ｂacillus cereus) ＩＦＯ３１３１バチルス・リケニホルミス (Ｂacillus licheniformis) ＩＦＯ１２２０１バチルス・メガテリウム (Ｂacillus megaterium) ＩＦＯ１２１０８バチルス・プミルス (Ｂacillus pumilus) ＩＦＯ１２０９０バチルス・アミロリケフアシエンス (Ｂacillus amyloliquefaciens) ＩＦＯ３０２２バチルス・ズブチリス (Ｂacillus subtilis) ＩＦＯ１３７１９バチルス・サーキユランス (Ｂacillus circulans) ＩＦＯ３９６７シュードモナス・トリホリ (Ｐseudomonas trifolii) ＩＦＯ１２０５６シュードモナス・マルトフィリア (Ｐseudomonas maltophilia) ＩＦＯ１２６９２プロテウス・インコンスタンス (Ｐroteus inconstans) ＩＦＯ１２９３０シトロバクター・フロインディ (Ｃitrobacter freundii)ＩＦＯ１３５４４エンテロバクター・クロアカ (Ｅnterobacter cloacae) ＩＦＯ３３２０エルウィニア・ハービコラ (Ｅrwinia herbicola) ＩＦＯ１２６８６キサントモナス・ピシ (Ｘanthomonas pisi) ＩＦＯ１３５５６キサントモナス・シトリ (Ｘanthomonas citri) ＩＦＯ３８３５フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム (Ｆlavobacterium meningosepticum) ＩＦＯ１２５３５ミクロコッカス・バリアンス (Ｍicrococcus varians) ＩＦＯ３７６５エシェリヒア・コリ（Ｅscherichia coli）ＩＦＯ３３６６

【００１５】これらの菌のいずれかを適当な培地に、２
０℃〜４０℃で１日から４日間培養して得られる培養液
を混合菌の種培養液として、用いることができる。その
移植量は通常、酸化菌(シュードグルコノバクター属)の
それの１／１０から１／１０００とするのが望ましい。
この程度の移植量で混合菌を酸化菌と混合培養すると、
酸化菌の生育が促進され、それにつれて、酸化菌単独培
養の場合より、より高濃度のＬ−ソルボースが、より短
い時間で２−ケト−Ｌ−グロン酸に酸化される。混合菌
として用いられる細菌は、本発明の原料であるＬ−ソル
ボースや生産物である２−ケト−Ｌ−グロン酸の資化性
が無いかまたは微弱な菌であることが望ましい。その他
の培養条件は、酸化菌の単独培養と特に変わるところは
ない。前記の微生物の培養に用いられる培地は、該菌株
が利用し得る栄養源を含むものなら液状でも固体状でも
よいが、大量のものを得る時には液体培地を用いるのが
好ましい。該培地には、通常微生物の培養に用いられる
炭素源,窒素源,無機塩類,有機酸塩及び微量栄養素が用
いられる。炭素源としては原料であるＬ−ソルボースが
そのまま使用されうるが、その他の補助炭素源として、
例えば、グルコース,グリセリン,ショ糖,乳糖,麦芽糖,
糖蜜等が使用できる。窒素源としては、例えば、アンモ
ニウム塩類(例、硫酸アンモニウム,硝酸アンモニウム,
塩化アンモニウム,リン酸アンモニウム等),コーンスチ
ープリカー(以下ＣＳＬと称することもある),ペプトン,
肉エキス,酵母エキス,乾燥酵母,大豆粉,綿実粕,尿素等
の無機または有機の窒素含有物が挙げられる。また無機
塩類としてはカリウム,ナトリウム,カルシウム,マグネ
シウム,鉄,マンガン,コバルト,亜鉛,銅及び燐酸の塩類
が用いられる。

【００１６】微量栄養素としては前記の菌の生育必須因
子であるＣoＡ,パントテン酸, ビオチン, チアミン, リ
ボフラビンは勿論のこと、生育及び２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸生成に促進的効果を示すフラビンモノヌクレオチド
(以下ＦＭＮと称することもある),フラビンアデニンジ
ヌクレオチド(以下ＦＡＤと称することもある),その他
のビタミン類,Ｌ−システイン,Ｌ−グルタミン酸,チオ
硫酸ナトリウム等が化合物として、または、それらを含
むものとして天然物を適宜加えられる。培養の手段は、
静置培養でも、振盪培養あるいは通気攪拌培養法等の手
段を用いてもよい。大量の処理には、いわゆる深部通気
攪拌培養によるのが望ましい。培養条件は、勿論菌株の
種類,培地の組成,その他によっても異なり、要するに目
的物が最も効率よく生産される様に個々の場合に応じて
選択すればよい。例えば、培養温度は２５〜３５℃にて
行うのがよく、培地のpＨは５〜９程度が望ましい。以
上の様な条件下で１０〜１２０時間培養または反応する
ことにより２−ケト−Ｌ−グロン酸が最高濃度に蓄積さ
れる。尚この場合目的物の生成に伴ってpＨが低下する
のが一般的であるので、適当な塩基性物質、例えば苛性
ソーダ,苛性カリ,アンモニアを添加して常に微生物の２
−ケト−Ｌ−グロン酸生成に最も適したpＨに保持する
のもよく、また培地中に適当な緩衝剤を添加しておいて
最適のpＨが維持される様にするのもよい。この他、前
記の酸化菌とは別種の細菌の滅菌培養物を培地成分とし
て有効に利用することもできる。利用できる菌として
は、例えば、バチルス属,シュードモナス属,シトロバク
ター属,エシェリヒア属およびエルウィニア属に属する
菌が挙げられ、さらに具体例として下記に示す菌が挙げ
られる。

【００１７】バチルス・セレウス (Ｂacillus cereus) ＩＦＯ３１３１バチルス・ズブチリス (Ｂacillus subtilis) ＩＦＯ３０２３バチルス・プミルス (Ｂacillus pumilus) ＩＦＯ１２０８９バチルス・メガテリウム (Ｂacillus megaterium) ＩＦＯ１２１０８バチルス・アミロリケファシエンス (Ｂacillusamyloliquefaciens) ＩＦＯ３０２２シュードモナス・トリホリ (Ｐseudomonas trifolii) ＩＦＯ１２０５６シトロバクター・フロインディ (Ｃitrobacter freundii)ＩＦＯ１２６８１エシェリヒア・コリ (Ｅscherichia coli) ＩＦＯ３４５６エルウィニア・ハービコラ (Ｅrwinia herbicola) ＩＦＯ１２６８６これらの細菌を、これらが生育しうる培地に、２０℃〜
４０℃で２日から４日間培養し、得られる培養液を滅菌
し、これを本酸化菌の培地に０．５〜５．０％(v／v)の
割合で加え、酸化菌の生育を促進させることもできる。
この様にして培養液中または反応液中に生成し蓄積した
２−ケト−Ｌ−グロン酸は、その性状を利用したそれ自
体公知の手段で分離精製することができる。２−ケト−
Ｌ−グロン酸は遊離の酸として分離してもよく、例え
ば、ナトリウム,カリウム,カルシウム,アンモニウム等
の塩として分離してもよい。分離の方法としては目的を
阻害しないかぎり、いかなるものでもよいが、例えば必
要に応じて反応生成物から濾過、遠心分離あるいは活性
炭処理等を行って、菌体を除去した後、この溶液をその
まま濃縮し、析出する結晶を濾取し、さらに再結晶させ
て目的物を取り出す方法、溶媒抽出法、クロマトグラフ
ィー法、塩析法などを単独で、あるいは適宜組み合わ
せ、また反復して利用することもできる。

【００１８】２−ケト−Ｌ−グロン酸が遊離型で得られ
る場合はこれを適宜の方法によって、例えば、ナトリウ
ム,カリウム,カルシウム,アンモニウム等の塩にしても
よく、また塩として得られる場合は、これを適宜の方法
によって遊離型あるいは他の塩にかえてもよい。本発明
の方法によって得られる目的物が２−ケト−Ｌ−グロン
酸であることは、例えば元素分析,融点,旋光度,赤外線
スペクトル等の物理化学的諸性質の測定によって同定さ
れた。反応液,培養液中に生成した２−ケト−Ｌ−グロ
ン酸の定量は、スルホン化ポリスチレンゲル充填カラム
(島津製作所製,ＳＣＲ−１０１Ｈカラム、７．９mm×３
０cm）を用いる高速液体クロマトグラフィー法（移動
相：ｐＨ２．２の希硫酸，流量；０.５mｌ／ｍｉｎ，検
出器：示差屈折計）で行ない、標準品としては２−ケト
−Ｌ−グロン酸ナトリウム１水塩の結晶を使用した。ま
た２−ケト−Ｌ−グロン酸の検出は薄層クロマトグラフ
ィー法で行なった。セルロースプレート(メルク社製,米
国)にサンプルをスポットし、フェノール:水:ギ酸 (７
５:２５:５)の溶媒で室温、３時間展開後、プレートを
乾燥し発色させると、２−ケト−Ｌ−グロン酸は、硝酸
銀試薬では黒褐色の、o−フエニレンジアミン試薬では
黄色の、アニリンフタル酸試薬では桃色のスポットをＲ
f値０．３０付近に与えることにより検出された。

【００１９】

【参考例】以下に参考例を挙げて本発明の微生物により
２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造する方法をさらに具体的
に説明する。なお培地の％は、重量／容量％を示す。参考例１グルコース２．０％,ペプトン１．０％, 乾燥酵母１．
０％, ＣaＣＯ₃２．０％からなる種培地２０mｌを２０
０mｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸
気滅菌した。このフラスコに〔表１〕に示す斜面培地に
２８℃、４日間生育させたシュードグルコノバクター・
サッカロケトゲネスＫ５９１s株(ＩＦＯ１４４６４,Ｆ
ＥＲＭＢＰ−１１３０)の菌体１白金耳を植菌し、３
０℃で２日間振盪(２００rpm)培養した。得られた培養
液２mｌを上記と同じ種培地を含むフラスコに移植し同
じ条件で培養し種培養液を得た。ＣＳＬ２．０％,乾燥
酵母０．５％,硫安０．５％,Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃ ０．０５％,
硫酸第１鉄０．２％,ＣaＣＯ₃ ４．０％,Ｌ−ソルボー
ス１０．０％(別滅菌)からなる発酵培地２５mｌを２０
０mｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間
蒸気滅菌した。この発酵培地を含む三角フラスコに上記
種培養液１．２５mｌを移植し、３０℃で３日間振盪培
養した。この様にして得られた発酵液は高速液体クロマ
トグラフィー法で定量すると６０．５mg／mｌの２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸を含んでいた。(モル変換収率:５６.
１％ )この発酵液１０００mｌを遠心分離して、菌体等
の残渣を除き、９８０mｌの上清を得た。この上清をア
ンバーライトＩＲ１２０(ローム・アンド・ハース社製,
米国,Ｈ型,５００mｌ)カラムに通し、カラムを約３００
mｌの脱イオン水で洗浄した。通過液と洗液を合せて、
活性炭(５００mｌ)カラムを通過させ、ついで約３００m
ｌの脱イオン水で洗浄し、脱カチオンと脱色を行った。
この通過液と洗液の合計１６００mｌを苛性ソーダでpＨ
６．５に調整した後、５０℃で約７０mｌ迄減圧下、濃
縮した。この濃縮液を５℃に２４時間放置すると無色柱
状の結晶を生じた。生じた結晶を濾取し、少量の冷メタ
ノールで洗浄後、室温,減圧下に五酸化燐上で乾燥して
３７．５gの２−ケト−Ｌ−グロン酸モノナトリウム・
１水塩を得た。得られた結晶の分析値は融点:１４７〜
１５５℃(分解) 元素分析値(Ｃ₆Ｈ₉Ｏ₇Ｎa・Ｈ₂Ｏ) 理論値:Ｃ,３０．７８％;Ｈ,４．７４％測定値:Ｃ,３０．９４％;Ｈ,４．８５％比旋光度：［α］_D ²⁴ −２３．３°(Ｃ＝１．０,水) で、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と薄層クロ
マトグラフィーのＲf値と色調は標準品のものと一致し
た。

【００２０】参考例２〔表１〕に示す斜面培地で生育したシュードグルコノバ
クター・サッカロケトゲネスＫ５９１s株の菌体１白金
耳を〔表２〕に示す完全培地５mｌを含む試験管(１６mm
×１６０mm)に植菌し、３０℃で２日間振盪培養した。
この培養液１mｌを同じ培地５mｌを含む試験管に移植
し、４時間振盪培養した。得られた培養液５mｌを無菌
的に５℃で１５分間遠心分離(１２,０００rpm)して集菌
し、次いで１０mｌのトリスマレイン酸緩衝液(pＨ６．
５,０．０５Ｍ)に懸濁し、再び遠心分離(１２,０００rp
m)した。これを２回繰り返して得た洗浄菌体を１mg／m
ｌのニトロソグアニジンを含む上記緩衝液５mｌに懸濁
し、３０℃で２時間振盪して変異剤処理した。この処理
液を５℃で１５分間遠心分離(１２,０００rpm)して菌体
を集め、１０mｌのトリスマレイン酸緩衝液で上記と同
じ様に２回洗浄して、ニトロソグアニジン処理菌体を得
た。これを０．８５％の食塩水で適当に希釈して、１５
mｌの完全培地(固型)を含むプレート(直径９cm)に撒
き、２８℃で５日間培養しコロニーを生成させた。生じ
たコロニーを計数し、無処理のものと比較すると、この
ニトロソグアニジン処理による菌の死滅率は９０．４％
であった。また完全培地プレート上のコロニーを〔表
３〕に示す最小培地プレートにレプリカし、２８℃で３
日間培養後、栄養要求変異株の出現頻度を調べると約
６．６％であった。以上の様に変異剤処理した完全培地
プレート上のコロニーを新しい完全培地プレートに一枚
当り１２株の割合で約２cmの長さに画線移植した。２８
℃で２日間培養後、生育した菌体１白金耳をＬ−ソルボ
ース７.０％(別滅菌),乾燥酵母１.０％,ペプトン１．０
％,塩化第１鉄０．１％およびＣaＣＯ₃ ３．０％から
なる培地(pＨ６．５)３mｌを含む試験管に移植し、３０
℃で４日間振盪培養した。この条件下で親株Ｋ５９１s
株の２倍程度の２−ケト−Ｌ−グロン酸生成能を有する
ＴＨ１４−８６株 (ＩＦＯ１４４６６, ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１２８)が、Ｌ−ソルボース酸化能増強株と
して選択された。

【表１】斜面培地(g／ｌ) ────────────────────── Ｄ−ソルビトール２５ペプトン１０酵母エキス１０ＣaＣＯ₃ ２寒天２０ pＨ７．０ ──────────────────────

【表２】完全培地(g／ｌ) ────────────────────── Ｄ−ソルビトール２５ペプトン１０酵母エキス１０ pＨ６.５(固型培地では寒天２０gを加える。) ──────────────────────

【表３】最小培地(g／ｌ) ─────────────────────── ショ糖５Ｋ₂ＨＰＯ₄ ３ＫＨ₂ＰＯ₄ １ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄ １ＮaＣl １ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１ＭnＣl₂・nＨ₂Ｏ０．００２ L-グルタミン酸ナトリウム０．１Ｌ−システイン０．１ＣoＡ０．００２ＦＭＮ０．００２チアミン０．００２ビオチン０．００１ pＨ7.0(固型培地では寒天２０gを加える。) ───────────────────────

【００２１】参考例３シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９
１s株から参考例２で誘導された変異株ＴＨ１４−８６
株を〔表１〕の斜面培地に２８℃で４日間生育させた。
この斜面培地から菌体１白金耳を参考例１の種培地２０
mｌを含む２００mｌ容の三角フラスコに接種し、３０℃
で２日間振盪培養した。グルコース３．０％,ペプトン
１．０％,乾燥酵母１．０％およびＣaＣＯ₃ ２．０％
からなる培地２００mｌを１ｌ容三角フラスコに分注
し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。この三角フラス
コに上記培養液２０mｌを移植し、２８℃で２日間振盪
培養し種培養液を得た。一方、〔表１〕の斜面培地で２
８℃,２日間生育させたバチルス・メガテリウムＩＦＯ
１２１０８株の菌体１白金耳を、ショ糖４．０％,綿実
粕４．０％,Ｋ₂HPO₄ ０．６５％,ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５
５％,硫安０．０５％,ＮaＣl ０．０５％,硫酸マグネ
シウム０．０５％およびパントテン酸カルシウム０．０
５％からなる培地(pＨ７．０)２０mｌを含む２００mｌ
容三角フラスコ(１２０℃,２０分間蒸気滅菌)に接種
し、３０℃で３日間培養した。得られた培養液は１２０
℃,２０分間蒸気滅菌して、冷所に保存し、バチルス・
メガテリウムの滅菌培養物として下記する醗酵培地の１
成分として使用した。Ｌ−ソルボース１２．５％(１２
０℃,１５分別滅菌),硫安０．５％,ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０
３％,Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏ０．０５％,硫酸マグネシウ
ム０．０５％,ＦeＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．１％,ＭnＳＯ₄
・４Ｈ₂Ｏ５μg／mｌ,チアミン５μg／mｌ,ビオチン
０．１μg／mｌ,ＦＭＮ０．１μg／mｌ,ＣaＣＯ₃ ５．
０％および上記バチルス・メガテリウムの滅菌培養物
４．０％(v／v)からなる醗酵培地３ｌを５ｌ容醗酵槽に
入れ、１２０℃,３０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に
前記の種培養液３００mｌを移植し、３２℃,通気２．４
ｌ／min攪拌８００rpmの条件下で３日間培養した。この
様にして得られた醗酵液には１０２．０mg／mｌの２−
ケト−Ｌ−グロン酸が含まれていた。(モル変換収率:
７５．７％)この醗酵液１ｌを参考例１と同じ方法で分
離精製し、２−ケト−Ｌ−グロン酸モノナトリウム１水
塩の結晶７３．２gを採取した。

【００２２】参考例４シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−
５株(ＩＦＯ１４４６５, ＦＥＲＭＢＰ−１１２
９)を参考例１と同じ方法で培養して種培養液を得た。
Ｌ−ソルボース濃度を１２．５％から９．０％に変えた
参考例３の醗酵培地２０mｌを２００mｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。このフラ
スコに上記種培養液１．５mｌを移植し、３２℃で２日
間振盪培養したところ７３．２mg／mｌの２−ケト−Ｌ
−グロン酸が培養液中に生成した。(モル変換収率:７
５．４％) 参考例５シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−
４株(ＦＥＲＭＢＰ−１１３１,ＩＦＯ１４４８３),
１２−１５株(ＦＥＲＭＢＰ−１１３２, ＩＦＯ１
４４８２) および２２−３株 (ＦＥＲＭＢＰ−１１
３３,ＩＦＯ１４４８４)を参考例４と同じ方法でそれ
ぞれ３日間振盪培養したところ、１２−４株では５２．
１mg／mｌ(モル変換収率:５３．７％),１２−１５株で
は４８．７mg／mｌ(モル変換収率:５０．２％),２２−
３株では６９．３mg／mｌ(モル変換収率:７１．４％)の
２−ケト−Ｌ−グロン酸がそれぞれ培養液中に生成し
た。

【００２３】参考例６Ｌ−ソルボース１．０％(別滅菌),ペプトン０．５％お
よび酵母エキス０．５％からなる培地(pＨ７．０)２５m
ｌを２００mｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃,１５
分間蒸気滅菌した。このフラスコに〔表１〕に示す斜面
培地で２８℃、４日間生育したシュードグルコノバクタ
ー・サッカロケトゲネスＴＨ１４−８６株の菌体１白金
耳を植菌し、３０℃で２日間振盪培養して種培養液を得
た。Ｌ−ソルボース５.０％(別滅菌),ペプトン１.０％,
酵母エキス０．５％およびＣaＣＯ₃２．０％からなる培
地(pＨ７．０)２５mｌを２００mｌ容三角フラスコに分
注し、１２０℃,１５分間蒸気滅菌した。このフラスコ
に上記した種培養液１．０mｌを移植し、３０℃で２日
間振盪培養した。得られた培養液５００mｌを２０分間
室温で静置後、デカントして沈澱物を除き、ついで室
温，１,０００rpmの低速で５分間遠心分離して、主にＣ
aＣＯ₃からなる沈澱物を除き菌体懸濁液を得た。これを
さらに５℃で１０分間遠心分離(６,０００rpm)して菌体
を集め、約１００mｌの冷食塩水(０．８５％)で２回洗
浄、５℃で遠心分離(６,０００rpm)して洗浄菌体を得
た。これを３５mｌの冷食塩水(０．８５％)に懸濁し
て、洗浄菌体懸濁液とした。この洗浄菌体懸濁液４mｌ
にＬ−ソルボース３００mg,２−(Ｎ−モルホリノ)エタ
ンスルホン酸(ＭＥＳ)緩衝液(pＨ６．５,０．５Ｍ)０．
５mｌとＣaＣＯ₃１８０mgを加え、水で総量を１０mｌと
し、１００mｌ容三角フラスコ中で３０℃,２４時間振盪
しながら反応させた。この様にして得られた反応液中に
は２４．６mg／mｌの２−ケト−Ｌ−グロン酸が生成し
ていた。(モル変換収率:７６．０％)

【００２４】参考例７シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９
１s株,１２−５株とＴＨ１４−８６株を各々〔表１〕に
示す斜面培地で２８℃、４日間生育させた。一方〔表
４〕に示す混合菌は同じ斜面培地で２８℃,２日間成育
させた。各々の菌体１白金耳を参考例１に示す種培地２
０mｌを含む２００mｌ容三角フラスコに植菌し３０℃で
２日間振盪(２００rpm)培養し、各々の種培養液を得
た。ＣＳＬ２．０％,乾燥酵母０．３％,硫酸アンモニウ
ム０．５％,Ｎa₂Ｓ₂Ｏ₃・５Ｈ₂Ｏ０．０５％,硫酸第
１鉄０．２％,ＣaＣＯ₃ ５．０％およびＬ−ソルボー
ス１５．０％(別滅菌)からなる醗酵培地２５mｌを２０
０mｌ容三角フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸
気滅菌した。この醗酵培地を含む三角フラスコに前記し
たシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス(酸
化菌)の各菌株の種培養液１．５mｌを植菌、３０℃で５
日間振盪培養しこれを純粋培養とした。一方混合培養と
する場合には酸化菌の植菌と同時に前記した混合液の種
培養液０．１mｌをそれぞれ植菌し３０℃で５日間振盪
培養した。得られた培養液中に生成した２−ケト−Ｌ−
グロン酸量を高速液体クロマトグラフィーで測定し、そ
の結果を〔表４〕にまとめた。混合菌の共存により２−
ケト−Ｌ−グロン酸の生成量が増加した。

【表４】

【００２５】参考例８グルコース２．０％,ペプトン１．０％,乾燥酵母１．０
％およびアクトコール(消泡剤,武田薬品工業製)０．０
１％からなる前培養培地５００mｌを２ｌ容の坂口フラ
スコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。〔表
１〕に示す斜面培地に２８℃で４日間生育させたシュー
ドグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ１４−８
６株の菌体を１０mｌの滅菌水に懸濁し全量を坂口フラ
スコに植菌し、２８℃,３日間往復振盪(８５spm)培養し
て前培養液を得た。グルコース３．０％,ＣＳＬ１．０
％,乾燥酵母０．５％,チオ硫酸ナトリウム０．０５％,
硫酸第一鉄０．１％,炭酸カルシウム２．０％およびア
クトコール０．０３％からなる種培養培地１２０ｌ(pＨ
６．５)を２００ｌ容の醗酵槽に仕込み、１２５℃で３
０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に上記した前培養液
１．８ｌを移植し、攪拌１２０rpm,通気１００ｌ／min,
内圧１．０Kg／cm²Ｇ,３０℃の条件下で３日間培養して
種培養液を得た。一方、〔表１〕に示す斜面培地に２８
℃,２日生育させた混合菌バチルス・メガテリウムＩＦ
Ｏ１２１０８株の菌体１白金耳を上記前培養培地５０
０mｌを含む２ｌ容坂口フラスコに植菌して、２８℃,２
日間往復振盪(８５spm)培養して前培養液を得た。前培
養培地と同じ組成の培地３０ｌを５０ｌ容の醗酵槽に入
れ１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。この醗酵槽に混合
菌の前培養液５００mｌを植菌し、攪拌１２０rpm, 通気
３０ｌ／min,内圧１．０Kg／cm²Ｇの条件下で３０℃,２
日間培養して混合菌の種培養液を得た。Ｌ−ソルボース
１５．０％(別に滅菌して加えた),炭酸カルシウム５．
０％,ＣＳＬ２．０％,乾燥酵母０．２％,硫酸アンモニ
ウム０．３％,チオ硫酸ナトリウム０．０５％,硫酸第一
鉄０．１％,アクトコール０．０３％からなる醗酵培地
１０００ｌを２m³容醗酵槽に仕込み、１２５℃で３０分
間蒸気滅菌した。この醗酵槽に前記したシュードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ１４−８６株の種
培養液１１０ｌおよび混合菌バチルス・メガテリウムＩ
ＦＯ１２１０８株の種培養液１０ｌを移植し、攪拌１１
０rpm, 通気９００ｌ／ min, 内圧０.５Kg／cm²Ｇ,温度
３０℃で培養した。４日間培養後得られた培養液中に
は、１２３．１mg／mｌの２−ケト−Ｌ−グロン酸が含
まれていた。(モル変換収率 : ７６．１％)

【００２６】参考例９参考例８の前培養培地２０mｌを２００mｌ容三角フラス
コに分注し、１２０℃で３０分間蒸気滅菌した。〔表
１〕に示す斜面培地に２８℃で４日間生育させたシュー
ドグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ１４−８
６の菌体１白金耳を上記フラスコに植菌し、３０℃で２
日間振盪培養した。得られた培養液２０mｌを同じ培地
２００mｌを含む１ｌ容三角フラスコに移植し、３０℃
で２日間振盪培養してＴＨ１４−８６株の種培養液を得
た。前培養培地２０mｌを含む２００mｌ容三角フラス
コに、斜面培地に２８℃で２日間生育させたバチルス・
メガテリウムＩＦＯ１２１０８株の菌体１白金耳を植菌
し、２８℃で２日間振盪培養して、混合菌の種培養液を
得た。Ｌ−ソルボース３．０％(別滅菌して加えた),Ｃ
ＳＬ２．０％,乾燥酵母０．２％,硫酸アンモニウム０．
３％,チオ硫酸ナトリウム０．０５％,硫酸第一鉄０．１
％,アクトコール０．０２％および炭酸カルシウ９．０
％からなる醗酵培地の３ｌ分を２．１ｌに調製し、１２
０℃で３０分間蒸気滅菌し、予め滅菌した５ｌ容の醗酵
槽に仕込んだ。この醗酵槽に前記したＴＨ１４−８６
株の種培養液３００mｌと混合菌の種培養液４mｌを移植
し、３０℃,通気２．４ｌ／min,攪拌８００rpmの条件で
培養を開始した。一方ソルボース５１０gを水で溶解し
て８００ mｌとし、１２０℃で２０分間蒸気滅菌したソ
ルボース溶液を、培養６時間目から連続的に醗酵槽に加
え、３６時間で全量添加した。ソルボース添加終了後さ
らに２８時間前記条件下で培養し、合計７０時間培養し
た。この様にして得られた培養液中には１６３．５mg／
mｌの２−ケト−Ｌ−グロン酸が蓄積していた。(モル変
換収率 : ７５．８％)

【００２７】

【発明の効果】本発明の、シュードグルコノバクター・
サッカロケトゲネスの微生物は、Ｌ−ソルボースを２−
ケト−Ｌ−グロン酸に酸化する能力を有し、この微生物
を用いる方法により、２−ケト−Ｌ−グロン酸が収率よ
く製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】好気性細菌で、補酵素Ａの存在下に生育す
るシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス。
【請求項２】オキシダーゼ陽性で、エタノールから酢酸
を生成する能力を有する請求項１記載のシュードグルコ
ノバクター・サッカロケトゲネス。
【請求項３】シュードグルコノバクター・サッカロケト
ゲネスＫ５９１Ｓ（ＦＥＲＭＢＰ−１１３０），シュ
ードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５
（ＦＥＲＭＢＰ−１１２９），シュードグルコノバク
ター・サッカロケトゲネスＴＨ１４−８６（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１１２８），シュードグルコノバクター・サッカ
ロケトゲネス１２−１５（ＦＥＲＭＢＰ−１１３
２），シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス
１２−４（ＦＥＲＭＢＰ−１１３１）およびシュード
グルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３（ＦＥ
ＲＭＢＰ−１１３３）である請求項１記載のシュード
グルコノバクター・サッカロケトゲネスに属する微生
物。