DK171869B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre samt biologisk ren mikroorganismekultur til anvendelse ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 171869 B1

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, der er værdifuld som mellemprodukt til syntese af L-askorbinsyre, og opfindelsen angår tillige biologisk 5 rene mikroorganismekulturer af slægten Pseudoglucono-bacter til anvendelse ved den nævnte fremgangsmåde.

2-Keto-L-gulonsyre, der er et værdifuldt mellemprodukt til syntese af L-askorbinsyre, er hidtil blevet fremstillet ved Reichsteins kommercielt fastslåede fremgangs-10 måde (Helvetica Chimica Acta J_7, 31 1 , 1934). Denne fremgangsmåde indebærer imidlertid mange trin, fordrer store mængder opløsningsmidler og er derfor ikke tilfredsstillende som moderne teknologi. Som alternativer til Reichsteins metode har der været foreslået flere fremgangsmå-15 der som i hovedsagen udnytter mikroorganismer. Der kan fx nævnes en fremgangsmåde som omfatter oxidation af glukose til 5-keto-D-glukonsyre ved hjælp af en mikroorganisme som bevirker reduktion enten kemisk eller mikrobiologisk til L-idonsyre, hvorpå denne forbindelse yderligere oxi-20 deres mikrobiologisk til 2-keto-L-gulonsyre (US patentskrift nr. 2.421.611). En anden kendt fremgangsmåde består i oxidation af glukose til 2, 5-diketo-D-glukonsyre ved hjælp af en mikroorganisme og påfølgende omdannelse af den vundne forbindelse til 2-keto-L-gulonsyre mikro-25 biologisk eller kemisk (Japanske patentpublikationer nr. 39-14493, 53.25033, 56-15877 og 59-35920).

Med de kemiske reduktionstrin i disse kendte fremgangsmåder, nemlig reduktion af 5-keto-D-glukonsyre til L-idonsyre ved førstnævnte fremgangsmåde og reduktion 30 af 2,5-diketo-D-glukonsyre til 2-keto-L-gulonsyre i sidstnævnte fremgangsmåde, har ulemper med hensyn til stereospecificitet, således at sideproduktionen af D-glukonsyre ved førstnævnte og 2-keto-L-gulonsyre ved sidstnævnte resulterer i nedsatte udbytter af den ønskede forbindelse.

35 Desuden gælder det, at selv når de ovennævnte reduktioner 2 DK 171869 B1 udføres ved hjælp af en mikroorganisme, går det samlede produkts udbytte ned fordi mikroorganismen må forsynes med overskud af glukose (udgangsmaterialet) som er energikilde til reduktionen. Hvad dette angår indebærer fremstil-5 ling af 2-keto-L-gulonsyre ved hjælp af L-sorbose som udgangsmateriale kun en oxidationsproces. Faktisk har der allerede med henblik herpå været gjort forsøg på at anvende bakterier hørende til slægten Gluconobacter, slægten Pseudomonas, slægten Serratia, slægten Achromobacter 10 og slægten Alcaligenes. I så henseende kan der henvises til litteraturen som fx Biotechnology and Bioengineering 14, 799 ( 1972), Acta Microbiologica Sinica 2Q_, 246 ( 1980) og 2_1_, 185 ( 1981 ), Japanske patentpublikationer nr. 41-159 og 41-160, US patentskrift nr. 3.043.749 og japansk 15 patentpublikation nr. 49-39838.

De resultater der er opnået med de stammer der hidtil er anført i litteraturen er imidlertid ikke tilfredsstillende, og udbytterne er for lave til at indbyde til kommerciel udnyttelse af organismerne.

20 Under disse omstændigheder har nærværende opfinde re forsket med henblik på at finde frem til en kommercielt profitabel fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, og det har herved vist sig at en bakteriestamme K591s, der blev isoleret fra en jordbundsprøve samlet i 25 Wakayama Prefecture, samt bakteriestammerne nr. 12-5, 12-15, 12-4 og 22-3, der blev isoleret fra jordbundsprøver opsamlet i Shiga Prefecture, har evne til at omdanne L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre i udbytter der langt overgår de tidligere resultater.

30 Desuden har det som resultat af en taksonomisk un dersøgelse vist sig at disse stammer er hidtil ukendte bakterier der ikke tidligere har været beskrevet i litteraturen. Nærværende opfindelse er udviklet på basis af ovennævnte resultater.

35 Den foreliggende opfindelse angår således (1) en 3 DK 171869 B1 fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, ejendommelig ved at man bringer en mikroorganisme valgt blandt Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591S (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86

5 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM

BP-1131) eller 22-3 (FERM BP-1133) med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre, som den er, i kontakt med L-sorbose for at frembringe og akkumulere 2-keto-L-gulonsyre med påfølgende indhøst-10 ning af denne; (2) en fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, ejendommelig ved at man bringer en mikroorganisme af slægten Pseudogluconobacter med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre i kontakt med L-sorbose i nærværelse af mindst én af de mikroorganismer der 15 hører til slægten Bacillus, slægten Pseudomonas, slægten Proteus, slægten Citrobacter, slægten Enterobacter, slægten Erwinia, slægten Xanthomonas, slægten Flavobacterium, slægten Micrococcus eller slægten Escherichia; og (3)

Biologisk ren mikroorganisme kultur, ejendommelig ved 20 at det er en kultur af en mikroorganisme valgt blandt Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130) , 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM BP-1131) eller 22-3 (FERM BP-1133) som vokser aerobt i nærværelse af 25 koenzym A.

Blandt de ovennævnte 5 bakteriestammer har stammerne K591s og 12-5 følgende taksonomiske egenskaber.

30 35 4 DK 171869 B1 (a) Morfologi (1) Stave med en størrelse på 0,3 til 0,5 x 0,7 til 1,4 ym (2) Ingen cellulær polymorfLsme 5 (3) Bevægelig med 2-4 polære flageller (4) Ikke-sporedannende (5) Gramnegativ (6) Ikke syrefast 10 (b) Kulturegenskaber (1) Næringsagarplade: praktisk calt ingen vækst.

Gær-ekstrakt-næringsagar: rund, hel rand, glat overflade, opaleserende.

(2) Gærekstrakt-næringsagar skråkultur: vækst mo- 15 derat og filiform, glat, opaleserende.

(3) Gærekstraks-næringsvæskekultur: moderat vækst, ensartet uklarhed gennem mediet.

(4) Næringsgelatinestik: Sparsom overflade vækst; gelatine ikke flydendegjort.

20 (5) Lakmusmælk: syrnes og koaguleres.

(c) Fysiologiske egenskaber (1) Nitratreduktion: svag men positiv (2) Denitrifikation: negativ 25 (3) Metylrødt-test (MR): positiv (4) Voges-Proskauer-test (PV): negativ (5) Indol: dannes ikke (6) Hydrogensulfid: dannes ikke (7) Stivelse: hydrolyseres ikke 30 (8) Citronsyre: udnyttes ikke (9) Ammoniumsalte: udnyttes (10) Pigment: dannes ikke (11) Urease: dannes (12) Oxidase: positiv 35 (13) Katalase: positiv 5 DK 171869 B1 (14) Temperaturområde for vakst: 16-36°C; optimalt temperaturområde for vækst: 24-34°C. pH-område for vækst: 5,5-8,7; optimalt pH-område 6,0-7,5 (15) Aerob 5 (16) Hugh-Leifsons OF-test: oxldativ (17) Syre dannes, men der dannes ikke gas ud fra L-arabinose, D-xylose, D-glukose, D-fruktose, D-galaktose, D-mannose, maltose, sakkarose, lak-tose, trehalose, D-mannitol eller glycerol.

10 Der produceres hverken syre eller gas ud fra D-sorbitol, inositol eller stivelse (d) Andre egenskaber (1) Svag produktion af eddikesyre fra ætanol 15 <2> Biotin, tiamin, riboflavin og koenzym A (CoA) behøves til vækst (3) Dannelse af dihydroxyacetone ud fra glycerol (4) Guanin + cytosin-indhold i DNA: 67+1 mol% (5) Tilstedeværelse af ubiquinon indeholdende 10 20 isopren-enheder (CoQ^) (6) Udtalt dannelse af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose (7) Streptomycin-resistent 25 De taksonomiske egenskaber af stammen 12-15 beskrives i det følgende.

(a) Morfologi (1) Stavformet; celler 0,3 til 0,5 x 0,7 til 1,4pm 30 (2) Ingen cellulær polymorfisme (3) Mobil med 2-4 polære flageller (4) Ikke sporedannende (5) Gramnegativ (6) Ikke syrefast 35 6 DK 171869 B1 (b) Kulturegenskaber (1) Næringsagarplade: praktisk talt ingen vækst; Gærekstrakt-næringsagarplade: rund, hel rand, glat og opaleserende ^ (2) Gærekstrakt-næringsagar skråkultur: vækst moderat og filiform, glat og opaleserende (3) Gærekstrakt-næringsvæskekuLtur: moderat vækst, ensartet uklarhed gennem mediet (4) Næringsgelatinstik: sparsom vækst kun på top-pen; gelatine ikke flydendegjort (5) Lakmusmælk: syrnes men koaguleres ikke (c) Fysiologiske egenskaber (1) Nitratreduktion: negativ (2) Denitrifikation: negativ (3) Metylrødt-test (MR): positiv (4) Voges-Proskauer-test (VP): negativ (5) Indol: dannes ikke (6) Hydrogensulfid: dannes ikke (7) Stivelse: hydrolyseres ikke 2 0 (8) Citrat: udnyttes ikke (9) Ammoniumsalte: udnyttes (10) Ingen pigment dannelse (11) Urease: dannes 25 (12) Oxidase: positiv (13) Katalase: positiv (14) Vækst sker ved 23-32°C, optimalt ved 28-32°C; pH-området for vækst: pH 6,0-7,5; optimalt pH-område: 6,5-7,1 2q (15) Aerob (16) Hugh-Leifsons OF-test: oxidativ (17) Syre dannes men gas dannes ikke ud fra L-ara-binose, D-xylose, D-glukose, D-fruktose, D-mannose, maltose, sakkarose, laktose, trehalose 35 eller glycerol; Der dannes hverken syre eller DK 171869 Bl 7 gas ud fra D-mannitol, D-sorbitol, inositol eller stivelse (d) Andre egenskaber 5 (1) Svag produktion af eddikesyre fra ætanol (2) Der behøves biotin, tiamin, riboflavin og CoA til vækst (3) Dannelse af dihydroxyacetone ud fra glycerol (4) Indholdet af guanin + cytosin i DNA:67+1 mol% 10 (5) Tilstedeværelse af et ubiquinon indeholdende 10 isopren-enheder (CoQ^) (6) Udtalt dannelse af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose (7) Streptomycin-resistent 15

De taksonomiske egenskaber af stammen 12-4 beskrives i det følgende.

(a) Morfologi 20 (1) Stave, hver celle med en størrelse på 0,3 til 0,5 x 0,7 til 1,4 pm (2) Ingen cellulær polymorfisme (3) Mobil med 2-4 polære flageller (4) Ikke-sporedannende 25 (5) Gramnegativ (6) Ikke syrefast (b) Kulturegenskaber (1) Næringsagarplade: ganske små kolonier mulig- 30 gør ikke detaljerede iagttagelser. Gærekstrakt- suppe-agar: runde kolonier, hel rand, glatte, opaleserende (2) Gærekstrakt-næringsagar skråkultur: vækst moderat og filiform, glat, opaleserende 35 8 DK 171869 B1 (3) Gaerekstrakt-næringsvæskekultur: moderat vækst, ensartet uklarhed gennem mediet (4) Næringsgelatinestik: svag vækst kun i toppen; gelatine gøres ikke flydende 5 (5) Lakmusmælk: syrnes men koaguleres ikke (c) Fysiologiske egenskaber (1) Nitratreduktion: negativ (2) Denitrifikation: negativ 10 (3) Metylrødt-test (MR): positiv (4) Voges-Proskauer-test (VP): negativ (5) Indol: dannes ikke (6) Hydrogensulfid: dannes (7) Stivelse: hydrolyseres ikke 15 (8) Citrat: udnyttes ikke (9) Ammoniumsalte: udnyttes (10) Ingen pigmentproduktion (11) Urease: dannes (12) Oxidase: positiv 20 (13) Katalase: positiv (14) Vækst sker ved 16-36°C, optimalt ved 24-34°C; pH-området for vækst: 5,5-8,2; optimalt pH-område: 6,0-7,5 (15) Aerob 25 (16) Hugh-Leifsons OF-test: oxidativ (17) Der dannes syre men ikke gas ud fra L-arabino-se, D-xylose, D-glukose, D-fruktose, D-galak-tose, D-mannose, maltose, sakkarose, laktose, trehalose og glycerol. Der dannes hverken syre el-30 ler gas ud fra D-mannitol, D-sorbitol, inosi tol eller stivelse 35 9 DK 171869 B1 (d) Andre egenskaber (1) Svag produktion af eddikesyre ud fra ætanol (2) Biotin, tiamin, riboflavin og enten CoA eller pantotensyre behøves til vækst 5 (3) På dannelse af dihydroxyacetone ud fra glycerol (4) Indholdet af guanin + cytosin i DNA: 67+1 mol% (5) Tilstedeværelse af en ubiquinon indeholdende 10 isopren-enheder (CoQ1Q) (6) Udtalt produktion af 2-keto-L-gulonsyre ud fra 10 L-sorbose (7) Streptomycin-resistent

De taksonomiske egenskaber af stammen 22-3 beskrives i det følgende.

15 (a) Morfologi (1) Stave, hver celle med dimensioner på 0,3 til 0,5 x 0,7 til 1,4pm (2) Ingen cellulær polymorfisme 20 (3) Mobil med 2-4 polære flageller (4) Ikke-sporedannende (5) Gramnegativ (6) Ikke syrefast 25 (b) Kulturegenskaber (1) Næringsagarplade: ganske små kolonier tillader ikke detaljerede iagttagelser. Gærekstraks-næringsagar: rund, helt rand, glat, opalese-rende 30 (2) Gærekstrakt-næringsagar skråkultur: vækst mo derat og filiform, glat, opaleserende (3) Gærekstrakt-næringsvæskekultur: moderat vækst; ensartet uklarhed gennem hele mediet (4) Næringsgelatinestik: svag vækst kun ved toppen; 35 gelatine gøres ikke flydende 10 DK 171869 B1 (5) Lakmusmælk: Syrnes men koaguleres ikke (c) Fysiologiske egenskaber (1) Nitratreduktion: positiv (svag) 5 (2) Denitrifikation: negativ (3) Metylrødt-test (MR): positiv (4) Voges-Proskauer-test (VP): negativ (5) Indol: dannes ikke (6) Hydrogensulfid: dannes ikke 10 (7) Stivelse: hydrolyseres ikke (8) Citrat: udnyttes ikke (9) Ammoniumsalte: udnyttes (10) Ingen pigmentproduktion (11) Urease: dannes 15 (12) Oxidase: positiv (13) Katalase: positiv (14) Vækst finder sted ved 16-38°C, optimalt ved 24-34°C; pH-området for vækst: 5,5-8,7; optimalt pH-område: 6,0-7,8 20 (15) Aerob (16) Hugh-Leifsons OF-test: oxidativ (17) Der dannes syre men ikke gas fra L-arabinose, D-xylose, D-glukose, D-fruk1:ose, D-galaktose, D-mannose, maltose, sakkarose,· laktose, trehalo- 25 se og glycerol; der dannes hverken syre eller gas ud fra D-mannitol, D-sorbitol, inositol og stivelse (d) Andre egenskaber 30 (1) Svag produktion af eddikesyre ud fra ætanol (2) Biotin, tiamin, riboflavin og enten CoA eller pantotensyre behøves til vækst (3) Dannelse af dihydroxyacetone ud fra glycerol (4) Guanin + cytosin-indhold i DNA: 67+1 mol% 35 (5) Tilstedeværelse af et ubiquinon indeholdende 10 isopren-enheder (CoQ^q) DK 171869 B1 1 1 (6) Udtalt af produktion af 2-keto-L-gulonsyre ud fra L-sorbose (7) Streptomycin-resistent 5 De foran beskrevne taksonomiske egenskaber af de 5 stammer stammende fra jordbundsprøver blev gennemgået under hensyn til Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8. udgave (1974) og Bergey's Manual of Systematic Bacteriology bind 1 (1984). Denne gennemgang viste at stam-10 merne på K591s, 12-5, 12-15, 12-4 og 22-3 forsøgsvis kunne henføres til slægten Pseudomonas i betragtning af konstateringen af at de er gramnegative, bevægelige og stavbakterier med polære flageller. I betragtning af at det konstateredes,at de behøver visse vækstfaktorer, at ind-15 holdet af kombineret guanin og cytosin i DNA er 67+1 mol% og at deres quinonsystem er et ubiquinon med 10 isopren-enheder, ligner de Pseudomonas diminuta og Pseudomonas vesicularis, der hører til RNA-gruppe IV i sektion IV i denne slægt. Imidlertid er den svage produktion af eddike-20 syre ud fra ætanol og produktionen af dihydroxyacetone ud fra glycerol karakterer som differentiere stammerne fra bakterierne hørende til slægten Pseudomonas.

De ovenfor nævnte karakterer er dem der kendetegner arter af slægten Gluconobacter. I lyset af den kends-25 gerning at disse fem stammer giver positive reaktioner på oxidase-testen, ikke er i stand til at vokse ved pH 4,5 og udviser god vækst i enten gærekstrakt-næringsmedium eller pepton-gærekstrakt-medium foruden kulhydrater, og at de har et guanin og cytosin-indhold på 67+1 mol% kombine-30 ret, afviger de fra arterne af slægten Gluconobacter.

Disse fem stammer K591s, 12-5, 12-15, 12-4 og 22-3 kunne således ikke henføres til nogen af de kendte slægter og måtte anses for bakterier af en ny art af en ny slægt. Som følge heraf blev stammerne K591s, 12-5, 12-15, 35 12-4 og 22-3 kollektivt betegnet som Pseudogluconobacter saccharoketogenes.

12 DK 171869 B1

Hvad angår næringskravene som disse fem stammer stiller, har stammerne K591s, 12-5 og 12-15 den enestående egenskab at de fordrer CoA for vækst. CoA-behovet af disse tre stammer kan ikke erstattes med pantotensyre.

5 På den anden side kan stammerne 12-4 og 22-3 vokse i nærværelse af pantotensyre såvel som i nærværelse af CoA.

I den følgende beskrivelse omtales disse stammer af Pseudogluconobacter saccharoketogenes under tiden som oxidative stammer.

10 De stammer som kan bruges i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse er ikke blot de ovenfor beskrevne fem stammer, men også andre stammer inklusive de mutanter afledet af de fem stammer ved bestråling med ultraviolet lys eller røntgenstråler eller ved behandling 15 med kemiske mutagener såsom N-metyl-N'-nitro-N-nitroso- guanidin (nitrosoguanidin), metylmetansulfonat, nitrogensennepsgas og lignende mutagener. Som eksempel på en sådan mutant kan nævnes stammen TH 14-86, der stammede fra Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s ved behand-20 ling med nitrosoguanidin. Denne mutantstamme TH 14-18 udviser taksonomiske karakterer som moderstammen, blot med den forskel at den forøget har evne til at danne 2-keto-L-gu-lonsyre ud fra L-sorbose.

De ovenfor nævnte stammer af Pseudogluconobacter 25 saccharoketogenes K591s, 12-5 og TH 14-86 blev deponeret hos Institute for Fermentation, Osaka, (IFO) fra 19. september 1985 og stammerne 12-15, 12-4 og 22-3 af Pseudogluconobacter saccharoketogenes den 16. december 1985.

Desuden blev stammerne K591s, 12-5 og TH 14-86 af 30 Pseudogluconobacter saccharoketogenes deponeret hos Fermentation Research Institute (FRI) under Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry den 7. oktober 1981 og stammerne 12-15, 12-4 og 22-3 af Pseudogluconobacter saccharoketogenes 35 den 20. december 1985.

Deponeringerne blev omdannet til deponeringer under Budapest traktaten, og disse mikroorganismer har be- DK 171869 B1 1 3 fundet sig hos FRI siden den 9. august 1986.

Deponeringsnumrene hos IFO og FRI er som følger:

Mikroorganisme IFO FRI

5 Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s 14464 P-8481 BP-1130

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 14465 P-8480 BP-1129

Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH14-86 14466 P-8479 BP-1128

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15 14482 P-8577 BP-1132

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 14483 P-8576 BP-1131

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 22-3 14484 P-8578 BP-1133 20 Ved udøvelse af den foreliggende opfindelse kan de ovennævnte stammer dyrkes i L-sorboseholdige medier, eller L-sorbose kan bringes i kontakt med et præparat stammende fra celler af disse stammer.

Med udtrykket "præparat stammende fra disse celler" 25 eller "cellepræparat" menes i nærværende beskrivelse en hvilken som helst eller alle vaskede celler fra kultursupper af disse bakterier, acetonetørrede celler, immobi-liserede celler på bæremedier som fx polyakrylamidgel, K-carrageenin og andre tilsvarende præparater.

30 Udgangsmaterialet L-sorbose kan sættes til dyrk ningsmedium på en gang ved dyrkningens igangsættelse, i flere portioner i løbet af dyrkningen eller kontinuerligt.

Ved reaktionen ved kontakt mellem L-sorbose og de nævnte mikroorganismer er koncentrationen af L-sorbose i 35 reaktionssystemet hensigtsmæssigt 3-30% v/r (vægt/rumfang), dvs. forholdet mellem enheder af fast stof og af væske som mellem gram og ml (fortrinsvis 5-25% v/r, regnet på mediet).

14 DK 171869 B1

Som eksempel på en fremgangsmåde til at bringe L-sorbose i kontakt med det omtalte bakteriecellepræparat kan man sætte L-sorbose, 2-(N-morfolino)-ætansulfonsyre (MES) puffer (pH 6,5, 0,5M) og CaC03 til cellepræparatet, 5 fortyndet med vand og rysteblandingen i en konisk kolbe.

Koncentrationen af L-sorbose i et sådant reaktionssystem til fremkaldelse af kontakt mellem L-sorbose og cellepræparatet er 0,1-10% v/r, fortrinsvis 0,3-3% v/r. Mængden af cellepræparatet af 1-30 mg/ml, regnet på basis af 10 tørre celler før reaktionen. Reaktionssystemets pH-værdi kontrolleredes i området 5,5-7,5, reaktionstemperaturen er omkring 20-40°C og reaktionstiden fra ca. 1 til ca.

100 timer.

Ved gennemførelse af den foreliggende fremgangs-15 måde i praksis,ved inkubering af en stamme Pseudoglucono-bacter i et L-sorboseholdigt flydende medium til frembringelse og akkumulering af 2-keto-L-gulonsyre i gæringssuppen, har det vist sig at det akkumulereide udbytte af 2-keto-L-gulonsyre er bemærkelsesværdigt højere når man 20 lader andre bakterier være til stede i kombination med den oxidative Pseudogluconobacter-stamme end tilfældet er når den oxidative stamme dyrkes alene.

De bakterier som man kan lade va»re tilstede samtidig under gæring kan fx være bakterier hørende til følgen-25 de slægter: Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas og Flavobacterium. Som særlige arter af disse slægter kan nævnes de følgende:

Bacillus cereus IFO 3131 30 Bacillus licheniformis IFO 12201

Bacillus megaterium IFO 12108

Bacillus pumilus IFO 12090

Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022

Bacillus subtilis IFO 13719 35 Bacillus circulans IFO 3967

Pseudomonas trifolii IFO 12056

Pseudomonas maltophilia IFO 12692 15 DK 171869 B1

Proteus inconstans IFO 12930

Citorobacter freundii IFO 13544

Enterobacter cloacae IFO 3320

Erwinia herbicola IFO 12686 5 Xanthomonas pisi IFO 13556

Xanthomonas citri IFO 3835

Flavobacterium menigosepticum IFO 12535

Micrococcus varians IFO 3765

Escherichia coli IFO 3366 10

En hvilken som helst af disse stammer kan inkuberes i et passende medium ved 20-40°C i 1-4 dage, og den resulterende kultur kan bruges som inokulum til dyrkning i nærværelse af nævnte ledsagende bakterier. Inokulets 15 størrelse er hensigtsmæssigt i almindelighed 1/10 til 1/1000 af mængden af den oxidative stamme. Når den ledsagende stamme i denne mængde inkuberes sammen med den oxidative stamme fremmes væksten af den oxidative stamme således,at den blandede kultur i sammenligning med en ren 20 kultur af den oxidative stamme er i stand til at oxidere L-sorbose til højere koncentrationer af 2-keto-L-gulonsyre på kortere tid end ellers. De bakterier der bruges som led-sage-bakterier er fortrinsvis sådanne,som ikke kan assimilere eller kun i beskedent omfang assimilere L-sorbose 25 og 2-keto-L-gulonsyre. løvrigt kan der bruges de samme dyrkningsbetingelser som ved dyrkning af den rene kultur af den oxidative stamme. Det medium der bruges til dyrkning af de ovenfor nævnte mikroorganismer kan være et flydende eller et fast medium indeholdende næringsstoffer,som 30 kan udnyttes af vedkommende stamme. Til masseproduktion foretrækkes der imidlertid et flydende medium. Mediet indeholder de kulstofkilder, nitrogenkilder, uorganiske salte og organiske syresalte og spor-næringsstoffer som i almindelighed bruges ved dyrkning af mikroorganismer. Mens ud-35 gangsmaterialet L-sorbose tjener som kulstofkilder, kan der også bruges andre hjælpe-kulstofkilder såsom glukose, glycerol, sakkarose, laktose, maltose eller melasse. Som DK 171869 B1 1 6 eksempler på nitrogenkilder kan nævnes forskellige uorganiske og organiske nitrogenholdige forbindelser eller ni-trogenholdige materialer såsom ammoniumsalte, fx ammoniumsulfat, ammoniumnitrat, ammoniumklorid og ammoniumfosfat, 5 majsstøbevand (CSL), pepton, kødekstrakt, gærekstrakt, tørret gær, sojamel, bomuldfrømel og urinstof. Som uorganiske salte kan der bruges salte af kalium, natrium, kalcium, magnesium, jern, mangan, kobolt, zink, kobber og/ eller fosforsyre.

10 Som sporstoffer foruden CoA, pantotensyre, bio tin, tiamin og riboflavin, der er essentielle vækstfaktorer for de beskrevne mikroorganismer, kan der tilsættes stoffer som fremmer mikroorganismens vækst og dermed produktionen af 2-keto-L-gulonsyre såsan, flavin-mononukleo-15 tid (FMN), flavin-adenin-dinukleotid (FAD), andre vitaminer, L-cystein, L-glutaminsyre og natriumtiosulfat, enten i form af de rene kemiske forbindelser eller i form af naturlige materialer indeholdende dem, og i passende mængder.

20 Hvad angår dyrkningsmetoden kan der bruges stationær kultur, rystekultur, submergkultur og andre velkendte dyrkningsformer. Til masseproduktion foretrækkes den såkaldte submerge dyrkning.

Dyrkningsbetingelserne afhænger selvsagt af bak-25 teriestammen, mediets sammensætning og andre faktorer, men kan i de enkelte tilfælde vælges således at den ønskede forbindelse vindes med den højeste effektivitet. Således kan fx inkuberingstemperaturen med fordel være i området 25-35°C og medium pH i området 5-9.

30 Efterhånden som dyrkningen gennemføres under de for an beskrevne betingelser i 10-120 timer akkumuleres 2-keto-L-gulonsyre i den højeste koncentration. Eftersom mediets pH-værdi i almindelighed går ned med dannelse af den ønskede forbindelse, kan det være fordelagtigt at tilsæt-35 te et passende basisk stof såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid eller ammoniak fra tid til anden for at opretholde mediet på optimal pH-værdi til dannelse af 2-keto- 17 DK 171869 B1 L-gulonsyre ved hjælp af den valgte bakteriestamme, eller man kan sørge for at der er et passende pufferstof til stede i mediet for dermed at holde dets pH-værdi konstant.

5 Bortset fra hvad der er sagt foran kan de sterili serede dyrkningsvæsker for andre bakterier end de omhandlede oxidative stammer med fordel bruges som komponenter i mediet. De bakterier som kan udnyttes på denne måde er blandt andet bakterier af slægten Bacillus, slægten 10 Pseudomonas, slægten Citrobacter, slægten Escherichia og slægten Erwinia. Særlig kendt som egnede nævnes følgende bakteriestammer:

Bacillus cereus IFO 3131 15 Bacillus subtilis IFO 3023

Bacillus pumilus IFO 12089

Bacillus megaterium IFO 12108

Bacillus amyloliquefaciens IFO 3022

Pseudomonas trifolii IFO 12056 20 Citrobacter feundii IFO 12681

Escherichia coli IFO 3456

Erwinia herbicola IFO 12686

Disse bakterier inkuberes således i medier som 25 tillader deres vækst ved 20-40°C i 2-4 dage, hvorpå de resulterende dyrkningssupper steriliseres og sættes til mediet for den oxidative stamme i en mængde på 0,5-5,0 rum-fangs%. På denne måde kan væksten af den oxidative stamme fremmes.

30 Den på denne måde i dyrkningssuppen eller reak tionsblandingen dannede og akkumulerede 2-keto-L-gulonsyre kan indhøstes og renses på i og for sig kendt måde under udnyttelse af forbindelsens egenskaber. 2-Keto-L-gulonsyre kan indhøstes i form af fri syre eller fraskilles i form 35 af et salt med fx natrium, kalium, kalcium eller ammonium.

Man kan anvende en hvilken som helst indhøstnings- DK 171869 B1 1 8 metode som er forenelig med opfindelsens formål. Fx kan dyrkningssuppen befries for celler efter behov ved filtrering, centrifugering eller behandling med aktiveret kul og opløsningen kan derpå koncentreres. De udfældede kry-5 staller opsamles ved filtrering og omkrystalliseres til udvinding af den ønskede forbindelse. Desuden kan man anvende opløsningsmiddelekstraktion, kromatografering, udfældning eller udsaltning eller andre fremgangsmåder i passende kombination og/eller gentagent.

10 Når 2-keto-L-gulonsyre vindes i sin frie form kan den omdannes til et salt med fx natrium, kalium, kalcium eller ammonium på konventionel måde. Når den ønskede forbindelse udvindes i form af et salt kan den omdannes til den fri syre eller et andet salt på kendt måde.

15 Identiteten af den ved fremgangsmåden ifølge opfin delse producerede forbindelse med 2-keto-L-gulonsyre er fastslået ved bestemmelse af fysisk-kemiske konstanter såsom elementar analyse, smeltepunkt, optisk drejning og infrarødt absorptionsspektrum.

20 Den kvantitative bestemmelse af 2-keto-L-gulonsyre i reaktionsblandingen eller dyrkningssuppen udførtes ved højtydende væskekromatografering (HPLC; mobilfase: tynd svovlsyre pH 2,2; strømningshastighed 0,5 ml/minut; detektor: differentielt refraktometer) under anvendelse af 25 en sulfoneret polystyrengelkolonne (fra Shimadzu Seisa- kusho Ltd., Japan, SCR-101H kolonne, 7,9 mm x 30 cm). Som standard brugtes der krystaller af natrium-2-keto-L-gu-lonat-monohydrat. Detekteringen af 2-keto-L-gulonsyre udførtes ved tyndlagskromatografering. Herved blev en cel-30 luloseplade (fra Merck, USA) plettet med en prøve, og efter fremkaldelse med et opløsningsmiddelsystem af fenol/ vand/myresyre 75:25:5 ved stuetemperatur i 3 timer,tørret og behandlet med et farvereagens; 2-keto-L-gulonsyre gav en plet ved Rf ca. 0,30, og denne plet blev sortbrun med 35 sølvnitrat, gul med o-fenylendiamin eller lyserød med anilinftalsyre.

2-Keto-L-gulonsyre kan fremstilles i godt udbytte 19 DK 171869 B1 med fremgangsmåden ifølge nærværende opfindelse under anvendelse af mikroorganismer hørende til slægten Pseudoglu-conobacter og med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre.

5 De følgende eksempler tjener til nærmere belys ning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. De %tal der er nævnt i forbindelse med medier er vægt/rumfang-procen-ter.

10 Eksempel 1 I en 200 ml stor konisk kolbe indførtes der 20 ml af et udsædsdyrkningsmedium indeholdende 2,0% glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørret gær og 2,0% CaCO^ og der steri-15 1 iseredes ved autoklavering ved 120°C i 20 minutter. Kol ben blev podet med 1 løkkefuld Pseudogluconobacter saccha-roketogenes K591s (IFO 14464; FERM BP-1130) dyrket på et skråkultursmedium som beskrevet i omstående tabel 1 ved 28°C i 4 dage og inkuberet ved 30°C under rystning (200 2Q opm) i 2 dage. 2 ml af den resulterende suppe overførtes til en kolbe indeholdende samme udsædsdyrkningsmedium som foran og inkuberedes under samme betingelser til frembringelse af en udsædskultur.

I en 200 ml konisk kolbe anbragtes der 25 ml af 25 et gæringsmedium indeholdende 2,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,5% ammoniumsulfat, 0,05% ^2820^ - 51^0, 0,2% ferrosulfat, 4,0% CaCOj og 10,0% L-sorbose (særskilt steriliseret) og der steriliseredes ved autoklavering ved 110°C i 20 minutter. Denne koniske kolbe indeholdende ovennævnte gærings-3q medium podedes med 1,25 ml af den på den ovenfor beskrevne måde tilberedte udsædskultur og inkuberedes under rystning ved 30°C i 3 dage. I henhold til bedømmelse ved HPLC indeholdt den resulterende gæringssuppe 60,5 mg/ml 2-ke-to-L-gulonsyre (omdannelsesgrad: 56,1%). 1000 ml af denne 25 gæringssuppe centrifugeredes til fjernelse af cellerester og andre sedimenter. Den fremkomne ovenstående væske, 980 ml, førtes gennem en kolonne med "Amberlite" IR 120 20 DK 171869 B1 (Rohm & Haas Co., USA, H-form, 500 ml), der derefter vaskedes med ca. 300 ml deioniseret vand. Effluenten og vaskevæskerne forenedes og førtes gennem en kolonne af 500 ml aktiveret kul efterfulgt af vand med ca. 300 ml deio-5 niseret vand til fjernelse af kationer og farve. Effluenten og vaskevæskerne forenedes og udgjorde 1600 ml; der reguleredes til pH 6,5 med natriumhydroxid og koncentreredes under nedsat tryk ved 50°C til ca. 70 ml. Dette koncentrat henstod ved 5°C i 24 timer hvorved der vandtes 10 farveløse prismer. Prismerne opsamledes ved filtrering, vaskedes med en ringe mængde kold metanol og tørredes over fosforpentoxid ved stuetemperatur under nedsat tryk til frembringelse af 37,5 g mononatrium-2-keto-L-gulonat-monohydrat med smp. 147-155°C (sønderdeling).

15 Beregnet for CgH^O^Na.H2O: C 30,78 H 4,74 Fundet: C 30,94 H 4,85%

Optisk drejning [a]p4 = -23,3° (c=1,0 i vand). Med hensyn til HPLC-retentionstid, Rf-værdi ved TLC og farve var ovennævnte produkt i overensstemmelse med en autentisk 20 prøve.

Eksempel 2

Et reagensglas (16 mm x 160 mm) indeholdende 5 ml 25 fuldstændigt medium som beskrevet i tabel 2 blev podet med en løkkefuld Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s dyrket på det i tabel 1 angivne skråkulturmedium, og der inkuberedes ved 30°C under rystning i 2 dage. 1 ml af denne kultur overførtes til et reagensglas indeholdende 5 ml 2Q af samme medium hvorpå der inkuberedes under rystning i 4 timer. Den resulterende kultursuppe, 5 ml, blev centrifugeret aseptisk ved 12.000 opm og 5°C i 15 minuter til indhøstning af cellerne. Cellerne blev suspenderet i 10 ml tris-rnaleinsyrepuffer (oH 6,5; 0,05K) og gencentri-25 fugeredes. Denne procedure gentoges to gange og de vaskede celler suspenderes i 5 ml af ovennævnte puffer indeholdende 1 mg/ml nitrosoguanidin og rystede i 30°C i 2 21 DK 171869 B1 timer til mutagenisk behandling. Suspensionen centrifugeredes ved 12.000 opm og 5°C i 15 minutter til opsamling af cellerne, der derpå vaskedes to gange med portioner på 10 ml tris-maleinsyrepuffer til udvinding af en 5 fraktion indeholdende nitrosoguanidinbehandlede celler.

Den blev fortyndet med 0,85% saltvand til en passende koncentration og udspredtes på en plade (diameter 9 cm) indeholdende 15 ml af det fuldstændige medium (fast). Det podede plademedium inkuberedes ved 28°C i 5 dage til udvin-10 ding af kolonier. Kolonier taltes og sammenlignedes med den ubehandlede kontrol. Mikroorganismernes mortalitet på grund af nitrosoguanidinbehandlingen var 90,4%. Kolonnierne på pladen med det fuldstændige medium blev overført til pladen med det minimale essentielle medium 15 angivet i tabel 3, og efter inkubering ved 28°C i 3 dage blev frekvensen af auxotrofer (næringsmutanter) undersøgt. Frekvensen var ca. 6,6%.

De med mutagenbehandlede kolonier på den fuldstændige mediumplade blev udstrøget over en længde på ca.

20 2 cm på en plade med frisk fuldstændigt medium og med et

antal på 12 stammer pr. plade. Efter inkubering ved 28°C i 2 dage blev en løkkefuld af de dyrkede celler overført til et reagensglas indeholdende 3 ml af et medium (pH

6,5) sammensat af 7,0% L-sorbose (særskilt steriliseret), 25 1,0% tørgær, 1,0% pepton, 0,1% ferroklorid og 3,0% CaCO^ og inkuberet under rystning ved 30°C i 4 dage. Blandt de afprøvede mutantstammer viste stammen TH 14-86 sig at producere dobbelt så meget 2-keto-L-gulonsyre som moderstammen K591s under de ovenfor beskrevne betingelser. Denne stamme 30 TH 14-86 (IFO 14466, FERM BP-1128) valgtes som oxidativ stamme med en forøget evne til at oxidere L-sorbose.

35 22 DK 171869 B1

Tabel 1 Skråkulturmedium g/1 D-sorbitol 25

Pepton 10 Gærekstrakt 10 5 CaC03 2

Agar 20 pH 7,0

Tabel 2 Fuldstændigt medium, g/1 10 D-sorbitol 25

Pepton 10 Gærekstrakt 10 pH 6,5 (til brug for et fast medium tilsattes der 20 g agar) 15

Tabel 3 Minimalt essentielt medium, g/1

Sakkarose 5 K2HP04 3 KH-PO· 1 2 4 20 (NH4)2S04 1

NaCl 1

MgS04.7H20 0,1

MnCl2.nH20 0,002

Natrium-L-glutamat 0,1 25 L-cystein 0,1

CoA 0,002 FMN 0,002

Tiamin 0,002

Biotin 0,001 30 pH 7,0 (til brug et fast medium tilsattes der 20 g agar) 35 23 DK 171869 B1

Eksempel 3

Mutantstammen TH 14-86 afledet af Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s ifølge eksempel 2 dyrkedes på skråkulturmedium ved 28°C i 4 dage. Der blev taget en løkke-5 fuld af cellerne af skråkulturen og de podedes i en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml af det udsædskulturmedium som er beskrevet i eksempel 1 , og inkuberedes ved 30°C under rystning i 2 dage.

I en konisk flaske med en kapacitet på 1 1 anbrag-10 tes der 200 ml af et medium sammensat af 3,0% glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørret gær og 2,0% CaCO^ og der steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 20 minutter. Denne koniske kolbe blev podet med 20 ml af ovennævnte kultur og inkuberedes ved 28°C under rystning i 2 dage til frem-15 bringelse af en udsædskultur. Særskilt podedes en løkkefuld Bacillus megaterium IFO 12108 dyrket på et skråkul-tursmedium ved 28°C i 2 dage, i en 200 ml konisk kolbe indeholdende 20 ml af et medium sammensat af 4,0% sakkarose, 4,0% bomuldsfrømel, 0,65% K2HP04, 0,55% KH2PC>4, 20 0,05% ammoniumsulfat, 0,05% NaCl, 0,05% magnesiumsulfat og 0,05% kalciumpantotenat (pH 7,0; steriliseret ved autoklavering ved ved 120°C i 20 minutter) og der inkuberedes ved 30°C i 3 dage. Den resulterende dyrkningssuppe steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 20 minut-25 ter, opbevaredes koldt og brugtes som komponent i nedenstående gæringsmedium. I en 5 1 stor krukkefe.rmentor indfyldtes der 3 1 af et gærmedium indeholdende 12,5% L-Sor-bose (særskilt steriliseret ved 120°C i 15 minutter). 0.5% ammoniumsulfat, 0,03% KH2P04, 0,05% Na2S203.5H20, 0,05% 30 magnesiumsulfat, 0,1% FeS04.7H20, 5 pg/ml MnSC>4 4H20, 5 ug/ml tiamin, 0,1 yg/ml biotin, 0,1 pg/ml FMN, 5,0%

CaCOg og 4,0 rumfangs% af ovennævnte steriliserede suppe med Bacillus megaterium, hvorpå der steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 30 minutter. Dette gæringsme-35 dium podedes med 300 ml af ovennævnte udsædskultur og dyrkedes ved 32°C under luftning med 2,4 1/minut og omrøring 24 DK 171869 B1 ved 800 opm i 3 dage. Den resulterende gæringssuppe indeholdt 102.0 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (omdannelsesgrad: 75,7%). 1 1 af denne suppe er renset på den i eksempel 1 beskrevne måde eller til frembringelse af 73,2 g kry-5 staller af mononatrium-2-keto-L-gulonat-monohydrat.

Eksempel 4

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 (IFO 14465, FERM BP-1129) inkuberedes på den i eksempel 1 beskrevne måde til frembringelse af en udsædskultur. I en 200 stor konisk kolbe anbragtes der 20 ml af et gæringsmedium med 9,0% L-sorbose som beskrevet i eksempel 3 og der steriliseredes ved autoklavering ve:d 120°C i 20 minut-ter. Kolben podedes med 1,5 ml af den ovennævnte udsædskultur og der inkuberedes ved 32°C i 2 dage. Den resulterende gæringssuppe indeholdt 73,2 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (omdannelsesgrad: 75,4%).

2g Eksempel 5

Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 (FERM

BP-1131, IFO 14483), 12-15 (FERM BP-1132, IFO 14482) og 22-3 (FERM BP-1133, IFO 14484) inkuberedes hver for sig under rystning på den i eksempel 4 beskrevne måde i 3 da-25 ge. Udbytterne af 2-keto-L-gulonsyre i suppen var 52,1 mg/ ml ved dyrkning af stammen 12-4 (omdannelsesgrad: 53,7%), 48,7 mg/ml ved dyrkning af stammen 12-15 (omdannelsesgrad: 50,2%), og 69,3 mg/ml ved anvendelse af stammen 22-3 (omdannelsesgrad, 71,4%).

30

Eksempel 6 I en 200 stor konisk kolbe indfyldtes der 25 ml af et medium (pH 5,0) indeholdende 1,0% L-sorbose (særskilt 35 steriliseret), 0,5% pepton og 0,5% gærekstrakt og der steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 15 minutter. Kolben podedes med en løkkefuld Pseudogluconobacter saccharo- 25 DK 171869 B1 ketogenes TH 14-86, dyrket på skråkulturmedium som angivet i tabel 1 ved 28°C i 4 dage, og der inkuberedes ved 30°C under rystning i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur.

5 I en 200 ml stor konisk kolbe anbragtes der 25 ml af et medium (pH 7,0) indeholdende 5,0% L-sorbose (særskilt steriliseret), 1,0% pepton, 0,5% gærekstrakt og 2,0% CaCO^ og der steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 15 minutter. Denne kolbe podedes med 1,0 ml af ovennævn-10 te udsædskultur og inkuberedes ved 30°C i 2 dage.

Den resulterende kultur, 500 ml, fik lov at henstå ved stuetemperatur i 20 minutter hvorpå sedimentet fjernedes ved dekantering. Den tilbageværende væske centrifugeredes ved lav hastighed ved 1000 opm, ved stuetempera-15 tur til fjernelse af sedimentet,der overvejende bestod af CaCOj. Den på denne måde vundne cellesuspension centrifugeredes yderligere (6000 opm) ved 5°C i 10 minutter, og de opsamlede celler vaskedes to gange med ca. 100 ml store portioner koldt saltvand (0,85%s) og gencentrifugeredes 20 ved 6000 opm og 5°C til opnåelse af vaskede celler. Cellerne blev yderligere suspenderet i 35 ml 0,85% koldt saltvand så der fremkom en vasket cellesuspension. Til 4 ml af denne vaskede cellesuspension sattes der 300 ml L-sorbose, 0,5 ml 2-(N-morfolino)-ætanolsulfonsyre (MES)-25 puffer (pH 6,5; 0,5M) og 180 mg CaCO^, hvorpå der fortyndedes med vand så rumfanget blev 10 ml. Blandingen bragtes til reaktion i en 100 ml stor konisk kolbe ved 30°C under omrystning i 24 timer. Den på denne måde vundne reaktionsblanding viste sig at indeholde 24,6 mg/1 2-keto-L-gulonsyre 30 (omdannelsesgrad: 76,6%).

Eksempel 7

Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s, 12-25 5 og TH 14-86 dyrkedes hver for sig på et skråkulturmedi um ved 28°C i 4 timer. De i tabel 4 angivne ledsagebak-terier dyrkedes på samme skråkulturmedium ved 28°C i 2 26 DK 171869 B1 dage. En løkkefuld af hver stamme podedes i en 200 ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml af det i eksempel 1 angivne udsædskulturmedium og inkuberedes under rystning ved 200 opm og 30°C i 2 dage. På denne måde vandtes der for-5 skellige dyrkningssupper.

I en 200 ml stor konisk kolbe anbragtes der 25 ml gæringsmedium indeholdende 2,0% CSL, 0,3% tørret gær, 0,5% ammoniumsulfat, 0,05% Na2S203.5H2C), 0,2% ferrosulfat, 5,0% CaCO^ og 15,0% L-sorbose (særskilt steriliseret) og 10 steriliseret ved autoklavering ved 120°C i 20 minutter.

Den koniske kolbe indeholdende ovennævnte medium inkuberedes med 1,5 ml af den ovenfor beskrevne udsædskultur af en af de oxidative Pseudogluconobacter saccharoketogenes-stammer og inkuberedes under rystning ved 30°C i 5 dage 15 til frembringelse af en ren kultur.

I tilfældet af blandede kulturer blev 0,1 ml af en udsædskultur af nævnte ledsagebakterier podet samtidig med podningen af den oxidative stamme og det podede medium inkuberedes ved 30°C under rystning i 5 dage.

20 Den mængde 2-keto-L-gulonsyre som frembragtes i hver dyrkningsmedium bedømtes ved højtydende væskekroma-torafering (HPLC). Resultaterne fremgår af tabel 4. Tilstedeværelse af ledsagebakterier resulterede i forøgede udbytter af 2-keto-L-gulonsyre.

25 30 35 27 DK 171869 B1

Tabel 4

Produktion af 2-keto-L-gulonsyre ved dyrkning af stammer af Pseudogluconobacter saccharoketogenes uden og med en ledsagebakterie 5 Ledsagebakterier Pseudogluconobacter saccharoketogenes_ _K59 1 s_12-5 TH 14-86 mg/ml mg/ml mg/ml

Intet additiv 55,3 74,1 87,6 _(34,2%) (45,8%) (54,1%)

Bacillus cereus 87,3 101,5 125,9 I FO 3131_(54,0%) (62,7%) (77,8%)

Bacillus licheniformis - - 125,0 I FO 12201_(77,3%) ^ Bacillus megaterium 69,3 90,2 135,4 IFO 12108_(42,8%) (55,8%) (83,7%)

Bacillus pumilus 93,1 129,0 134,7 IFO 12090_(57,5%) (79,8%) (83,3%)

Bacillus amyloliquefaciens - - 126,9 20 IFO 3022_(78,5%)

Bacillus subtilis 81,7 94,4 135,3 IFO 13719_(50,5%) (58,4%) (83,7%)

Pseudomonas trifolii 67,2 98,8 122,6 IFO 12056_(41,5%) (61,1%) (75,8%) 25 Pseudomonas maltophillia 71,9 79,8 135,3 IFO 12692_(44,4%) (49,3%) (83,7%)

Proteus inconstans - - 124,5 IFO 12930_(77,0%)

Citrobacter freundii - - 132,3 30 IFO 13544_(81,8%)

Enterobacter cloacae - - 132,0 IFO 3320_(81,6%)

Erwinia herbicola 71,8 111,6 129,1 IFO 12686_(44,4%) (69,0%) (79,8%) 35 Xanthomonas pisi - - 121,5 IFO 13556_(75,1%)

Flavobacterium meningosepticum - - 122,8 IFO 12535_(75,9%) 28 DK 171869 B1

Tallene i parantes angiver omdannelsesgraden.

Eksempel 8 I en 2 1 stor Sakaguchi-kolbe blev der anbragt 500 5 ml fordyrkningsmedium indeholdende 2,0% glukose, 1,0% pepton, 1,0% tørret gær, 2,0% CaCO^ og 0,01% "Actcol" (anti-skumningsmiddel fra Takeda Chemical Industries, Ltd.) og der steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 20 minutter. Celler af Pseudogluconobacter saccharoketogenes 10 TH 14-86, dyrket på et skråkultursmedium som beskrevet i tabel 1, blev suspenderet i 10 ml sterilt vand og hele mængden blev podet i Sakaguchi-kolben cg inkuberedes på en frem- og tilbageryster (85 slag pr. minut) ved 28°C i 3 dage til frembringelse af en forkultur. I en 200 1 stor 15 fermentor blev der anbragt 120 1 (pH 6,5) af en udsædskultur indeholdende 3,0% glukose, 1,0% CSL, 0,5% tørret gær, 0,5% natriumtiosulfat, 0,1% ferrosulfat, 2,0% kalciumkarbonat og 0,03% "Actcol", og der steriliseredes ved 125°C i 30 minutter. Til denne fermenter overførtes der 20 1,8 1 af den ovenfor nævnte forkultur efterfulgt af dyrk ning under omrøring ved 120 opm, luftning med 100 1/minut og et tryk på 1,0 kg/cm^ G samt en temperatur på 30°C i 3 dage til frembringelse af en udsædskultur.

På den anden side podedes én løkkefuld af ledsage-25 bakterien Bacillus megaterium IFO 12108, dyrket på skråkultursmedium som anført i tabel 1 ved 28°C i 2 dage, i en 2 1 stor Sakaguchi-kolbe indeholdende 500 ml af det ovennævnte forkulturmedium, og der inkuberedes på en frem-og tilbagegående ryster med 85 slag pr. minut ved 28°C i 30 2 dage til frembringelse af en forkultur. I en 50 1 stor fermentor blev der anbragt 30 1 af samme medium som ovennævnte forkulturmedium og der steriliseredes ved 120°C i 20 minutter. Denne fermentor podedes med 500 ml af forkulturen af ledsagestammen og dyrkedes ved en omrøring på 35 120 opm, en luftning på 30 1/minut, et tryk på 1,0 kg/ cm^ G og en temperatur på 30°C i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur af ledsagebakteriestammen.

3 29 DK 171869 B1 I en 2 m stor fermentor anbragtes der 1000 1 af et gæringsmedium indeholdende 15,0% L-sorbose (særskilt steriliseret), 5,0% kalciumkarbonat, 2,0% CSL, 0,2% tørret gær, 0,3% ammoniumsulfat, 0,05% natriumtiosulfat, 0,1% 5 ferrosulfat og 0,03% "Actcol" og der steriliseredes ved 125°C i 30 minutter. Til denne fermentor overførtes der 110 1 af ovennævnte udsædskultur af stammen af Pseudoglu-conobacter saccharoketogenes TH 14-86 og 10 1 udsædskultur af ledsagestammen Bacillus megaterium IFO 12108, og 10 der udførtes dyrkning under en omrøring på 110 opm, en luftning på 900 1/minut, en tryk på 0,5 kg/cm^ G og 30°C. Dyrkningssuppen efter 4 dages inkubering indeholdt 123,1 mg/ml 2-keto-L-gulonsyre (svarende til en omdannelsesgrad på 76,1%).

15

Eksempel 9 I en 200 1 stor konisk kolbe anbragtes der 20 ml af det i eksempel 8 beskrevne formedium og der sterilise-2Q redes ved 120°C i 30 minutter. I denne kolbe podedes der en løkkefuld Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH I486, dyrket på et skråkulturmedium som angivet i tabel 1 ved 28°C i 4 dage, og der inkuberedes ved 30°C under rystning i 2 dage. Den resulterende kultur, 20 ml, overførtes 25 til en 1 1 stor konisk kolbe indeholdende 200 ml af samme medium og der inkuberedes ved 30°C under rystning i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur af TH 14-86.

En løkkefuld Bacillus megaterium IFO 12108, dyrket på skråkulturmedium ved 28°C i 2 dage, podedes i en 200 3Q ml stor konisk kolbe indeholdende 20 ml af samme forkulturmedium og der inkuberedes under rystning ved 28°C i 2 dage til frembringelse af en udsædskultur af denne ledsa-gebakterie. 3 1 gæringsmedium indeholdende 3,0% L-sorbose (særskilt steriliseret), 2,0% CSL, 0,2% tørret gær, 0,3% 25 ammoniumsulfat, 0,05% natriumtiosulfat, 0,1% ferrosulfat, 0,02% "Actcol” og 9,0% kalciumkarbonat reguleredes til 2,1 1 og steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 30 mi- 30 DK 171869 B1 nutter. Det steriliserede medium anbragtes i en 5 1 stor krukkefermentor.

Denne krukkefermentor podedes med 300 ml ovennævnte udsædskultur af stammen TH 14-86 og 4 ml af udsæds-5 kulturen af ledsagebakterien, hvorpå der dyrkedes ved 30°C med en luftning på 2,4 1/minut og en omrøring på 800 opm.

Særskilt opløstes 510 g L-sorbose i vand for at tilberede 800 ml L-sorboseopløsning, og det steriliseredes ved autoklavering ved 120°C i 20 minutter. Den steriliserede 10 opløsning sattes kontinuerligt til en krukkefermentor fra dyrkningens 6. til 42. time. Efter tilsætningen af L-sorbose fortsattes dyrkningen på de samme betingelser som ovenfor i yderligere 28 timer, altså i alt 70 timer. Den resulterende suppe indeholdt 163,5 mg/ml 2-keto-L-gulon-15 syre(svarende til en omdannelsesgrad på 75,8%) 20 25 30 35

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, kendetegnet ved, at man bringer en mikroorganisme valgt blandt Pseudogluconobacter 5 saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM BP-1131) eller 22-3 (FERM BP-1133) med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre, som den er, i kontakt med L-sorbose for at producere og 10 akkumulere 2-keto-L-gulonsyre, der derpå indhøstes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l til fremstilling af 2-keto-L-gulonsyre, kendetegnet ved, at man bringer en mikroorganisme af stammen Pseudogluconobacter med evne til at oxidere L-sorbose til 2-keto-L- 15 gulonsyre med L-sorbose i nærværelse af mindst én mikroorganisme hørende til slægten Bacillus, slægten Pseudomonas, slægten Proteus, slægten Citrobacter, slægten Enterobacter, slægten Erwinia, slægten Xantho-monas, slægten Flavobacterium, slægten Micrococcus 20 og/eller slægten Escherichia.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at der som mikroorganisme af slægten Pseudogluconobacter anvendes Pseudogluconobacter saccharoketogenes.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg ne t ved, at der som mikroorganisme af slægten Pseudogluconobacter anvendes Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 30 12-4 (FERM BP-1131) eller 22-3 (FERM BP-1133).

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der som mikroorganisme af slægten Pseudogluconobacter anvendes Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 (FERM BP-1128), som mikroor-35 ganisme af slægten Bacillus anvendes Bacillus cereus DK 171869 B1 (IFO 3131), Bacillus licheniformis (IFO 12201) , Bacillus megaterium (IFO 12108), Bacillus pumilus (IFO 12090), Bacillus amyloliquefaciens (IFO 3022) eller Bacillus subtilis (IFO 13719), som nu kroorganisme af 5 slægten Pseudomonas anvendes Pseudomonas trifolii (IFO 12056) eller Pseudomonas maltophilia (IFO 12692), som mikroorganisme af slægten Proteus anvendes Proteus inconstans (IFO 12930), som mikroorganisme af slægten Citrobacter anvendes Citrobacter freundii (IFO 13544), 10 som mikroorganisme af slægten Enterobacter anvendes Enterobacter cloacae (IFO 3320), som mikroorganisme af slægten Erwinia anvendes slægten Erwinia herbicoa (IFO 12686), som mikroorganisme af slægten Xanthomonas anvendes Xanthomonas pisi (IFO 13556) og som mikroorga-15 nisme af slægten Flavobacterium anvendes Flavobacterium meningosep ticum (IFO 12535).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der som mikroorganisme af slægten Pseudogluconobacter anvendes Pseudogluconobacter 20 saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130) eller 12-5 (FERM BP-1129) og som mikroorganisme af slægten Bacillus anvendes Bacillus cereus (IFO 3131), Bacillus megaterium (IFO 12108), Bacillus pumilus (IFO 12090) eller Bacillus subtilis (IFO 13719), som mikroorganisme af 25 slægten Pseudomonas anvendes Pseudomonas trifolii (IFO 12056) eller Pseudomonasmaltophilia (IFO 12692), som mikroorganisme af slægten Citrobacter anvendes Citrobacter freumdii (IFO 13544), som mikroorganisme af slægten Enterobacter anvendes Enterobacter cloacae (IFO 30 3320) og som mikroorganisme af slægten Erwinia anvendes Erwinia herbicola (IFO 12686). DK 171869 B1

7. Biologisk ren mikroorganismekultur, kende -tegnet ved, at det er en kultur af en mikroorganisme valgt blandt Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s (FERM BP-1130), 12-5 (FERM BP-1129), TH 14-86 5 (FERM BP-1128), 12-15 (FERM BP-1132), 12-4 (FERM BP- 1131) eller 22-3 (FERM BP-1133) som vokser aerobt i nærværelse af koenzym A.