CN100560728C - 2-kga的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过连续或半连续发酵模式从L-山梨糖生产2-KGA的方法，其中使用Gluconobacter oxydans DSM 4025和第二种微生物成分的混合培养物，或者，向发酵培养基中补充酵母或酵母产品，以代替第二种微生物成分。
Description
技术领域
本发明涉及从L-山梨糖对2-酮基-L-古洛糖酸或其盐进行连续生产的方法，所述方法包括：在有第二种成分存在的情况下，培养属于Gluconobacter属的微生物。
背景技术
2-酮基-L-古洛糖酸(下文中以2-KGA表示)是用于生产L-抗坏血酸的重要中间产物。根据公知的Reichstein方法可将该化合物转化为L-抗坏血酸。人们尝试用L-山梨糖或D-山梨糖醇作为起始原料直接对2-KGA进行微生物生产，例子包括对微生物，特别是对Pseudomonas striata和Gluconobacter oxydans进行混合培养的试验。用该方法时，L-山梨糖的起始浓度为70g/L的情况下，产物浓度为30g/L；L-山梨糖的起始浓度为100g/L的情况下，产物浓度为37g/L。EP 0 221 707 B1中公开了在伴随细菌存在及不存在的情况下通过Pseudogluconobacter saccharoketogenes从L-山梨糖对2-KGA进行的生产。然而，该方法的产物浓度至多为55.3至87.6g/L(转化比率为34.2％至54.1％)。
发明内容
本发明的一个目的是提供通过连续发酵从L-山梨糖以高产量生产2-KGA的方法。2-KGA的盐，例如2-KGA的钠盐和钙盐也包括在内。
本发明涉及通过连续发酵或半连续发酵从L-山梨糖生产2-KGA或其盐的方法，所述方法中，使用了选自由Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物及其突变体所构成的组的微生物；所述方法中使用含有酵母或酵母产品的培养基，或者所述方法在有第二种微生物成分存在的情况下进行。
因此，本发明的一个目的是提供通过连续或半连续发酵模式从L-山梨糖生产2-KGA或其盐的方法，其中使用了选自由Gluconobacter oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物及其突变体所构成的组的微生物；所述方法在有第二种微生物成分存在的情况下进行，此情况下不向发酵培养基中额外补充酵母或酵母产品。
在本发明的另一个目的中，提供了通过连续或半连续发酵模式从L-山梨糖生产2-KGA或其盐的方法，其中使用了选自由Gluconobacter oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物及其突变体所构成的组的微生物；其中，向发酵培养基中补充酵母或酵母产品，代替第二种微生物成分。
具体实施方式
更具体地，本发明提供了通过连续或半连续发酵从L-山梨糖生产2-KGA的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在一个或多个发酵容器中，培养选自由Gluconobacter oxydansDSM 4025(FERM BP-3812)、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物及其突变体所构成的组的微生物，所述培养在含有酵母或酵母产品的培养基中进行，或在第二种微生物成分存在的情况下，在没有酵母或酵母产品的培养基中进行；
(b)向发酵容器中连续补给含有L-山梨糖的营养培养基，发酵的稀释速率设置在大约0.01h-1至大约0.05h-1，所述L-山梨糖的浓度在大约20g/L至大约250g/L之间，
(c)连续从发酵容器中取出发酵培养液；和
(d)从所述发酵培养液中回收2-酮基-L-古洛糖酸或其盐。
上述步骤(a)至(d)的方法是关于连续发酵方法的，所述连续发酵方法的特征是连续向发酵容器中补给营养培养基(上述步骤(b))，并连续取出发酵培养液(上述步骤(c))，使得发酵罐中的工作体积可以保持大致恒定。
在一种实施方式中，上述对2-KGA进行连续生产的方法是在一个发酵容器中进行的。
根据《布达佩斯条约》的规定，G.oxydans DSM 4025于1987年3月17日被保藏在
(德国)的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，编号为DSM No.4025。送交保藏者是东方科学仪器进出口集团有限公司，其是为中华人民共和国北京市三里河路52号的中国科学院微生物研究所而送交的。有效的送交保藏者是所述的研究所，其完整地址是中国人民共和国北京市海淀区中关村中国科学院微生物研究所，100080。
此外，该菌株的传代培养物也已于1992年3月30日被保藏在National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)，Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan，这也是根据《布达佩斯条约》的规定，保藏编号为FERM BP-3812。送交保藏者是Nippon Roche K.K.，6-1，Shiba 2-chrome，Minato-ku，Tokyo 105-8532Japan。
用于本发明方法的第二种微生物成分可以是，例如，Bacillus和Xanthomonas属的细菌。优选使用B.megaterium DSM 4026和X.maltophilia IFO 12692等菌株。任何上述菌株都可以在适当的培养基中于20℃至40℃被培养1至4天，得到的培养物被用作培养的接种体，在所述伴随细菌存在的情况下进行培养。
根据《布达佩斯条约》的规定，于1987年3月17日将B.megateriumDSM 4026送交至DSMZ保藏，编号为DSM 4026。送交保藏者是东方科学仪器进出口集团有限公司，其是为中华人民共和国北京市三里河路52号的中国科学院微生物研究所而送交的。有效的送交保藏者是所述的研究所，其完整地址是中国人民共和国北京市海淀区中关村中国科学院微生物研究所，100080。根据《布达佩斯条约》的规定，X.maltophilia IFO 12692于1968年7月31日被保藏到Institute for Fermentation(Osaka，Japan)。
在本发明的一种实施方式中，用于从L-山梨糖生产2-KGA或其盐的方法中，使用了选自由Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物及其突变体所构成的组的微生物；并且使用了含有酵母或酵母产品的培养基，其中所述的酵母或酵母产品属于Ascomycetes亚纲。优选地，所述酵母或酵母产品属于Saccharomyces属，例如S.cerevisiae。
术语“酵母产品”也包括新鲜酵母、干酵母和酵母提取物。
在一种实施方式中，上述步骤(a)中的培养是通过多阶段连续发酵来进行的。因此，本发明涉及用多阶段连续发酵来进行上述2-KGA生产的方法。两阶段连续发酵是这样的多阶段发酵模式的一种实施方式。可将多阶段连续发酵系统应用到2-KGA发酵方法中，以获得对2-KGA的更高的生产能力以及更高的2-KGA浓度，而没有L-山梨糖剩余，这对制备2-KGA钠中的分离步骤来说是优选的情况。
发酵过程开始时，Bacillus菌落与Gluconobacter菌落的数量比例和Xanthomonas菌落与Gluconobacter菌落的比例并不重要。该比例可以在大约1∶10至大约1∶300的范围内(Bacillus：Gluconobacter和Xanthomonas：Gluconobacter)。在发酵过程中，该比例可对自身进行自动调节，达到最优的值。
当在含有L-山梨糖以及适当营养物的培养基中培养微生物的时候，可以方便地在有氧条件下将所述微生物培养于水性培养基中。然而，可以用任何传统的发酵条件来开展本发明的方法。
本发酵方法可以在pH为大约4.0至大约9.0之间进行，pH优选为大约6.0至大约8.0之间。优选用于开展本发酵方法的温度范围是在大约13℃至大约36℃之间。更优选地，所述本发酵方法可以进行于大约18℃至大约33℃的范围内的温度下。发酵时间可以在大约100小时至大约1300小时之间。在本方法中，用作起始原料的L-山梨糖的浓度可以在大约20g/L至大约250g/L之间，优选在大约50g/L至大约200g/L之间。
用于本发酵方法的培养基通常含有用于微生物的营养物，例如可被吸收的碳源、可被消化的氮源和无机物、维生素、痕量元素和其它促进生长的因子。除在本方法中用作起始原料的L-山梨糖之外，还可以添加其它碳源物质，例如甘油、葡萄糖、甘露醇、果糖、D-阿糖醇等。
若干有机或无机物质也可被用作氮源，例如肉类提取物、蛋白胨、酪蛋白、玉米浆、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐等。无机物硫酸镁、磷酸钾、氯化亚铁和氯化铁、碳酸钙等也可以使用。
连续发酵系统可以由培养基储藏罐、一个或多个发酵罐和收获容器构成。发酵过程中可以向所述发酵罐中补给含有L-山梨糖的营养培养基，可以将向所述发酵罐提供营养培养基的速率调节为发酵培养液从发酵罐中排出的速率，使得发酵罐中的工作体积可以保持大致恒定。优选地，发酵罐中的发酵可以开展于液体流的稀释速率(D)为大约0.01h-1至大约0.05h- 1的情况下，更优选为大约0.02h-1至大约0.045h-1。以有实质性增加的产量从L-山梨糖来生产2-KGA是可能的，即当L-山梨糖起始浓度为120g/L时产物浓度超过112.2g/L(摩尔转化率为91.0％)，起始浓度更高时产量更高。在连续模式的稳定状态，对2-KGA的生产能力被计算为3.9g/L/h至4.8g/L/h。对转化率的计算基于生产出的2-KGA和消耗掉的L-山梨糖的量。
在本发明方法的另一种实施方式中，可以通过半连续(重复补料分批)发酵，在有第二种微生物成分存在的情况下，对G.oxydans DSM4025进行培养，所述第二种微生物成分例如是Bacillus和Xanthomonas属的微生物或酵母。该半连续模式是获得对2-KGA的高生产能力的方法之一，其中，培养液的一部分被用作下一次发酵的接种体。针对G.oxydansDSM 4025菌株和第二种微生物成分的混合培养物进行的半连续模式是通过如下方法来获得的：例如，在发酵罐中保留经过48小时培养获得的全部培养液中的10％(v/v)，用其作为第二步的种子，并向所述发酵罐中注满新鲜的营养培养基。根据上面第一步中所描述的同样的方式，第二步的一部分作为第三步制备的种子。
在传统的分批或补料分批模式中，每一批次之后弃去生物催化剂例如生物物质导致了更高的生产成本，反应器清理和启动(接种)所需要的时间导致了反应器生产能力的损失。然而，半连续模式能利用培养液作为下一次培养的种子。因此，该操作可被应用于2-KGA的发酵，而无需进行若干次从小量种子接种的步骤，并且不需要用于准备培养物的时间，例如清理和启动时间。此外，在长时间的发酵过程中反应器都能保持更高的生产能力。
本发明部分涉及通过多阶段连续发酵方法从L-山梨糖生产2-KGA的方法，其中，在有第二种微生物成分存在的情况下，使用了G.oxydansDSM 4025的培养物。所述多阶段连续发酵系统由两个或更多个的发酵容器组成。为使该方法的产量达到最优，可以通过在整个过程中使用多于一个的发酵容器来开展发酵。例如，从L-山梨糖到2-KGA的发酵可以在两个或多个发酵容器中开展，所述发酵容器以连续顺序放置。
本发明部分涉及通过多步骤发酵系统从D-山梨糖醇生产2-KGA的方法，所述多步骤发酵系统将“从D-山梨糖醇到L-山梨糖的发酵方法”和“从L-山梨糖到2-KGA的发酵方法”前后连接了起来。该方法使用的培养液含有经过产L-山梨糖的细菌转化D-山梨糖醇得到的L-山梨糖，对所述细菌没有特定的限制。已知有若干Gluconobacter的菌株例如G.xylinum和G.suboxydans，都能从D-山梨糖醇对L-山梨糖进行有效的生产。
可在无菌条件下，将收获的含有Gluconobacter的菌株的细胞的培养液与经过灭菌的营养培养基混合，L-山梨糖的浓度可被调节为13％。在本发明方法的一种具体的实施方式中，L-山梨糖培养液可被直接用作底物，而不需经过加热灭菌。因此，当建立D-山梨糖醇到2-KGA的发酵生产系统时，从D-山梨糖醇到L-山梨糖的发酵系统可以与从L-山梨糖到2-KGA的连续发酵系统直接相连，而不需要对L-山梨糖发酵液进行灭菌。通过使用含有L-山梨糖发酵液的培养基，可以利用对G.oxydans DSM 4025和X.maltophilia IFO 12692的混合培养，在发酵罐中开展以两阶段连续发酵模式进行的对2-KGA的发酵。在所述连续模式的稳定状态，可能生产出超过128.9g/L的2-KGA以及获得超过83.4％的摩尔转化率。此外，混合培养液中的L-山梨糖可被全部耗尽。
微生物“Gluconobacter oxydans”、“Gluconobacter xylinum”、“Gluconobacter suboxydans”、“Bacillus megaterium”和“Xanthomonasmaltophilia”还包括：由《国际原核生物命名法规》(International Code ofNomenclature of Prokaryotes)所定义的，此类物种的具有相同物理-化学属性的同物异名体(synonym)或基原异名体(basonym)。
在本发明方法的另一个优选的方面，发酵在溶解氧浓度为大约0.1％至大约200％空气饱和度的情况下开展，优选是大约5％至大约150％的空气饱和度。
此外，发酵优选在气流中氧浓度为大约0.1％至大约100％之间以及气流速率在大约0.01v/v/min至大约2.0v/v/min的情况下开展。(每分钟每体积单位的反应器中的气体体积)。
因此，本发明涉及上述从L-山梨糖对2-KGA或其盐进行连续生产的方法，其中，所述连续生产进行于发酵容器中溶解氧浓度为大约5％至大约100％饱和度的情况下或进行于气流中氧浓度为大约0.1％至100％之间的情况下。
连续补料培养基中L-山梨糖的浓度在大约20g/L至大约250g/L之间，以及稀释速率在大约0.01h-1至大约0.05h-1之间的情况下，在发酵容器中开展发酵也是优选的。
虽然根据本发明的发酵可以在常压下进行，即在大约1bar下进行，但是，在大约1至大约5bar的压力下工作通常来说是优选的，更优选是在大约1至大约3bar的压力下。
根据本发明，无需针对微生物的固定方法，例如化学键或用于细胞保持的物理方法，例如基质包埋，也无需生物物质控制或保持，例如膜系统，就可能从L-山梨糖来生产2-KGA。
可从反应混合物中分离出根据本方法获得的2-KGA，例如，通过形成盐来分离，或者通过利用产物和周围杂质属性的不同来分离，所述属性例如是溶解度、被吸收性和溶剂间的分布系数。吸附，例如在离子交换树脂上进行的，是一种方便的用于分离产物的方法。可用传统方法对由此得到的产物进行进一步的纯化，例如，通过重结晶或色谱。
或者，通过酯化及随后的烯醇化和内酯化，所述的反应混合物能被直接用于向L-抗坏血酸的转化。
下面将通过实施例对本发明加以阐述。
实施例1：通过G.oxydans DSM 4025在补充有酵母的培养基中从12％的
L-山梨糖来进行单阶段的2-KGA连续发酵
将含有8.0％的L-山梨糖(单独灭菌)、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母(Oriental Yeast IndustryCo.)(灭菌前pH为7.0)、0.5％的CaCO3、0.5％的尿素(单独灭菌)和0.03％的消泡剂CA-115(Nissan)的种子培养基装入到500ml的Erlenmeyer瓶中(每瓶100ml)，并在121℃灭菌20分钟。将一接种环量的微生物G.oxydans DSM 4025的细胞接种到该种子培养基中，在30℃培养24小时，所述G.oxydans DSM 4025的细胞已在含有5.0％的D-甘露醇、0.25％的MgSO4·7H2O、1.75％的玉米浆、5.0％的面包酵母(灭菌前pH为7.0)、0.5％的CaCO3、0.5％的尿素(单独灭菌)和2.0％的琼脂的平板培养基中于27℃被培养了4天。得到的种子培养物被接种到500mlErlenmeyer瓶中的100ml与上述相同的培养基中，在30℃培养24小时。
在单阶段连续发酵系统中使用了D型的玻璃发酵罐(Able，Tokyo，Japan)。所述发酵罐总体积为3L，其具有顶驱(top drive)系统以及对温度、pH、溶解氧(DO)和废气的监测器。其工作体积为2L，温度被控制在30℃。搅拌速度和通气速率被分别设置在800rpm和1.0L/min。用氢氧化钠溶液将pH控制在7.0。此外，准备了10L的补料培养基以连续提供新鲜底物。发酵开始时，接种体占10％(v/v)。用蠕动泵来控制连续补料的速率，用另一只蠕动泵连续将含有2-KGA的培养液从发酵罐收取到收获容器中，此时工作体积保持在2L。
生产培养基(2L)和连续补料培养基(10L)由12.0％的L-山梨糖(单独灭菌)、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、3.0％的玉米浆、7.5％的面包酵母、0.15％的消泡剂CA-115组成。在121℃对所述培养基灭菌20分钟。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0。种子培养物的接种体体积为10％(v/v)。
分批发酵进行30小时后，通过将连续补料速率细调至81.0ml/h，将培养模式转为连续模式，稀释速率(D)被设置为0.0405h-1。结果，连续发酵进行了120小时，产物2-KGA的平均浓度为112.2g/L。2-KGA摩尔转化率平均为91.3％。在连续模式的稳定状态，对2-KGA的生产能力被计算为3.9至4.8g/L/h。
实施例2：通过G.oxydans DSM 4025在补充有酵母的培养基中从14％的
L-山梨糖来进行单阶段的2-KGA连续发酵
用与实施例1中所述的相同的手段，制备200ml种子培养物，并将其接种到2L如实施例1中所述的生产培养基中。分批发酵进行30小时后，将培养模式转变为连续模式。连续补料培养基(10L)由14.0％的L-山梨糖(单独灭菌)、0.05％的甘油、0.25％的MgSO4·7H2O、3.0％的玉米浆、7.5％的面包酵母、0.15％的消泡剂CA-115组成。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0。连续发酵进行了100小时，在连续模式的稳定状态生产了134.3g/L的2-KGA。D被计算为平均0.0356h-1。2-KGA摩尔转化率平均为93.2％。在所述连续模式的稳定状态，对2-KGA的生产能力被计算为4.78g/L/小时。
实施例3：通过使用G.oxydans DSM 4025和B.megaterium DSM 4026的混
合培养物用重复补料分批(半连续)模式从L-山梨糖来进行2-KGA发酵
在含有0.5％的D-葡萄糖、0.5％牛肉提取物、0.5％多聚蛋白胨(Nippon Seiyaku)、0.30％的NaCl(灭菌前pH为7.0)和2.0％琼脂的琼脂培养基上，于27℃对B.megaterium DSM 4026进行一天的培养。
将一接种环的B.megaterium DSM 4026的琼脂培养物和两至三接种环的G.oxydans DSM 4025的琼脂培养物，同时接种到500ml Erlenmeyer瓶中的100ml培养基中，并在30℃培养一天，所述培养基中含有2％的L-山梨糖、0.3％的牛肉提取物、0.3％的酵母提取物、0.3％的玉米浆、1％的多聚蛋白胨(Nippon Seiyaku)、0.1％的尿素、0.1％的KH2PO4、0.02％的MgSO4·7H2O(在加入CaCO3及灭菌之前，pH为6.7)、0.10％的CaCO3和0.03％的消泡剂CA-115。取10ml该培养物，转移到500ml Erlenmeyer瓶中100ml同样的培养基中，并在30℃培养1天。用该培养物向用于发酵罐发酵的培养基接种。
200ml上述的种子培养物被接种到2L含有8％的L-山梨糖(单独灭菌)、2.5％玉米浆、0.0086％的MgSO4·7H2O、0.086％的KH2PO4、0.067％消泡剂CA-115的生产培养基中。分批发酵持续48小时后，收获出1.8L的培养液。0.2L培养液被留在发酵罐中，用作下一次发酵的种子。向发酵罐中注满含有10％的L-山梨糖(单独灭菌)、2.5％玉米浆、0.0086％的MgSO4·7H2O、0.086％的KH2PO4、0.067％消泡剂CA-115的新鲜培养基。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0。结果，第一步骤和第二步骤的2-KGA摩尔转化率分别为84.7％和90.1％。在第二步骤中对2-KGA的生产能力的最大值被计算为2.55g/L/h。
实施例4：通过使用G.oxydans DSM 4025和B.megaterium DSM 4026的
混合培养物从L-山梨糖来进行单阶段的2-KGA连续发酵
生产培养基(2L)和连续补料培养基(10L)由10％的L-山梨糖(单独灭菌)、2.5％玉米浆、0.0086％的MgSO4·7H2O、0.086％的KH2PO4和0.067％消泡剂CA-115组成。在121℃对上述培养基进行20分钟的灭菌。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0。用与实施例3中所述的相同的手段，制备200ml种子培养物，并将其接种到2L的生产培养基中。
分批发酵进行30小时后，通过将连续补料速率细调至61.0ml/h，将培养模式转变为连续模式，D在0.0305h-1至0.0407h-1的范围内变动。2-KGA的平均浓度为41.2g/L，还获得了92.7％的2-KGA平均摩尔转化率。在所述连续模式的稳定状态，对2-KGA的生产能力被计算为1.51g/L/h。
实施例5：在3L发酵罐中通过使用G.oxydans DSM 4025和X.maltophilia
IFO 12692的混合培养物从L-山梨糖来进行两阶段的2-KGA连续发酵
在两阶段的连续发酵系统中，给玻璃发酵罐装备了如实施例2中所述的同样的设施。此发酵系统由两个发酵罐构成。通常，发酵开始时，接种体占10％(v/v)。两个发酵罐的工作体积都为2L，通过与单阶段模式中相同的办法，用蠕动泵对连续补料速率进行控制。用第二个泵将从第一发酵罐中取出来的培养液转移到第二阶段发酵罐中。最终，用第三个蠕动泵将培养液取到收获储藏罐中。温度被控制在30℃，搅拌速度和通气速率分别被设置为800rpm和1.0L/min。用氢氧化钠溶液将pH控制在7.0。
在含有1％的多聚蛋白胨、0.2％的酵母提取物、0.1％的MgSO4·7H2O(灭菌前pH为7.0)和2％的琼脂的琼脂培养基上，于27℃将X.maltophilia IFO 12692培养2天。
将一接种环的X.maltophilia IFO 12692的琼脂培养物和两至三接种环的G.oxydans DSM 4025的琼脂培养物，同时接种到500ml Erlenmeyer瓶中的100ml培养基中，并在30℃培养一天，所述培养基与用于对G.oxydans DSM 4025和B.megaterium DSM 4026进行混合培养的培养基相同。取10ml培养物，转移到500ml Erlenmeyer瓶中的100ml相同的培养基中，并在30℃培养1天。用该培养物向用于发酵罐发酵的培养基接种。
生产培养基(2L)由12％的L-山梨糖(单独灭菌)、3％的玉米浆、0.4％的酵母提取物、0.25％的MgSO4·7H2O、0.05％的甘油和0.067％的消泡剂CA-115组成。在121℃对上述培养基进行20分钟的灭菌。发酵期间用NaOH将pH控制在7.0。将200ml上述种子培养物接种到2L的生产培养基中。
两阶段连续发酵系统由第一阶段和第二阶段发酵罐组成。将从第一阶段发酵罐中获得的发酵培养液转移到第二阶段发酵罐中去，以使L-山梨糖完全转化为2-KGA。对第一和第二发酵罐而言，D于恰当的时机在分别为0.0277至0.070h-1的范围内和0.0314至0.0549h-1的范围内变化，以研究出将L-山梨糖完全转化为2-KGA并且在最终的收获罐中没有L-山梨糖残留的必要的D值。在1，331.5小时后发酵被终止。表1中概括了G.oxydansDSM 4025和X.maltophilia IFO 12692的混合物通过两阶段连续模式的发酵活性。在此两阶段连续模式中，表观D为0.0380h-1的情况下，实际获得了含有113.1g/L 2-KGA的培养液，在第二栏中显示了总的稀释速率，其被计算为0.019h-1。总的2-KGA摩尔转化率为90.1％。在该连续模式的稳定状态下，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力和总的对2-KGA的生产能力分别被计算为3.34g/L/h和2.15g/L/h。
表1：使用3L发酵罐的两阶段连续模式的发酵活性
| 状态 | 总活性 | 第一阶段 | 第二阶段 |
| 稀释速率(平均：h<sup>-1</sup>) | 0.0190 | 0.0382 | 0.0380 |
| 2-KGA浓度(平均：g/L) | 113.1 | 87.5 | 113.1 |
| 对2-KGA的生产能力(g/L/h) | 2.14 | 3.34 | - |
| 2-KGA摩尔转化率(％) | 90.1 | 90.4 | 90.1 |
实施例6：在30L发酵罐中使用G.oxydans DSM 4025和X.maltophilia
IFO 12692的混合培养物从L-山梨糖来进行两阶段的2-KGA连续发酵
用30L的发酵罐，来开展与应用于3L发酵罐的连续培养模式相同的模式。所述连续发酵进行了超过180小时，当D被设置为0.041h-1时，在第二阶段观察到了稳定的2-KGA生产，并且没有L-山梨糖剩余。结果，在30L规模的发酵罐中再现了3L发酵罐中获得的对2-KGA的生产能力。表2对发酵活性进行了概括。在连续模式的稳定状态，生产出了118.5g/L的2-KGA。在所述连续模式的稳定状态，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力被计算为4.72g/L/h。此外，总的生产能力被计算为2.55g/L/小时，总的2-KGA摩尔转化率为89.6％。
表2：使用30L发酵罐的两阶段连续模式的发酵活性
| 状态 | 总活性 | 第一阶段 | 第二阶段 |
| 稀释速率(平均：h<sup>-1</sup>) | 0.0215 | 0.0430 | 0.0430 |
| 2-KGA浓度(平均：g/L) | 118.5 | 109.9 | 118.5 |
| 对2-KGA的生产能力(g/L/h) | 2.55 | 4.72 | - |
| 2-KGA摩尔转化率(％) | 89.6 | 89.0 | 89.6 |
实施例7：在3L发酵罐中通过使用G.oxydans DSM 4025和X.maltophilia
IFO 12692的混合培养物从由D-山梨糖醇转化来的L-山梨糖培养液来进行
两阶段的2-KGA连续发酵
本实施例中从D-山梨糖醇开展了对2-KGA的连续发酵，其中建立了将“从D-山梨糖醇到L-山梨糖的发酵方法”和“从L-山梨糖到2-KGA的发酵方法”前后连接起来的多步发酵系统，并对从D-山梨糖醇到2-KGA的发酵活性进行了研究。含有通过产L-山梨糖的细菌从D-山梨糖醇转化得来的L-山梨糖的培养液被用作为L-山梨糖源，所述产L-山梨糖的细菌例如是Gluconobacter的菌株。在无菌条件下，将收获到的含有Gluconobacter细胞的培养液与经过灭菌的含有3％玉米浆、0.4％的酵母提取物、0.25％的MgSO4·7H2O、0.05％的甘油和0.067％消泡剂CA-115的培养基混合起来，L-山梨糖的浓度被调节为13％。对G.oxydans DSM4025和X.maltophilia IFO 12692进行混合培养，在3L的发酵罐中开展两阶段连续培养模式的2-KGA发酵。
发酵进行了290小时。在该期间内保持了相对稳定的发酵活性，第一发酵罐和第二发酵罐中的平均D分别为0.0410h-1和0.0404h-1。表3对结果进行了概括。在连续模式的稳定状态，生产出了128.9g/L的2-KGA。在所述连续模式的稳定状态，第一发酵罐中对2-KGA的生产能力被计算为4.31g/L/h。总的生产能力被计算为2.34g/L/h，从L-山梨糖的摩尔转化率为83.4％。
表3：使用L-山梨糖培养液的两阶段连续模式的发酵活性
| 状态 | 总活性 | 第一阶段 | 第二阶段 |
| 稀释速率(平均：h<sup>-1</sup>) | 0.0202 | 0.0410 | 0.0404 |
| 2-KGA浓度(平均：g L) | 115.9 | 105.2 | 115.9 |
| 对2-KGA的生产能力(g/L/h) | 2.34 | 4.31 | - |
| 2-KGA摩尔转化率(％) | 83.4 | 83.7 | 83.4 |
Claims (13)
1.一种通过连续发酵或半连续发酵从L-山梨糖生产2-酮基-L-古洛糖酸或其盐的方法，所述方法中，使用了选自由Gluconobacter oxydans DSM4025、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物所构成的组的微生物；所述方法中使用含有酵母或酵母产品的培养基，或者所述方法在有第二种微生物成分存在的情况下进行，所述第二种微生物成分选自由Bacillus和Xanthomonas所构成的组。
2.如权利要求1所述的方法，包括如下步骤：
(a)在一个或多个发酵容器中，培养选自Gluconobacter oxydansDSM 4025、具有Gluconobacter oxydans DSM 4025的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物的微生物；所述培养在含有酵母或酵母产品的培养基中进行，或在第二种微生物成分存在的情况下在没有酵母或酵母产品的培养基中进行；
(b)向发酵容器中连续补给含有L-山梨糖的营养培养基，发酵的稀释速率设置在0.01h-1至0.05h-1，所述L-山梨糖的浓度在20g/L至250g/L之间，
(c)连续从发酵容器中取出发酵培养液；和
(d)从所述发酵培养液中回收2-酮基-L-古洛糖酸或其盐，
其中，所述第二种微生物成分选自由Bacillus和Xanthomonas所构成的组。
3.如权利要求2所述的方法，步骤(a)中的所述培养在一个发酵容器中进行。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，第二种微生物成分选自由Bacillus megaterium DSM 4026和Xanthomonas maltophilia IFO 12692所构成的组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的酵母或酵母产品属于Ascomycetes亚纲。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述的酵母或酵母产品属于Saccharomyces属。
7.如权利要求2所述的方法，其中使用多阶段连续发酵。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述的发酵开展于pH在4.0至9.0的范围内的情况下。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述的发酵开展于温度在13℃至36℃的范围内的情况下。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述的发酵开展于发酵容器中溶解氧浓度在5％至100％饱和度之间或气流中氧浓度在0.1％至100％之间的情况下。
11.如权利要求1所述的方法，其中使用半连续发酵，其中，发酵培养液的一部分被用作下一次培养的种子培养物，并且此过程被连续重复。
12.如权利要求1所述的方法，其中，含有从D-山梨糖醇转化来的L-山梨糖的培养液被用作发酵的底物，所述L-山梨糖是通过产L-山梨糖的细菌从D-山梨糖醇转化来的。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述细菌是Gluconobacter或Acetobacter。
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