CN1180747A

CN1180747A - 从葡萄糖发酵制备2－酮基－l－古龙酸的新方法

Info

Publication number: CN1180747A
Application number: CN 96116536
Authority: CN
Inventors: 尹光琳
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 1998-05-06

Abstract

本发明涉及一种制备维生素C前体2－酮基－L－古龙酸(2－KLG)的改进方法,其特点是直接以葡萄糖为原料,采用二种微生物进行串联发酵,通过生产中间体2,5－二酮基－D－葡萄糖酸(2,5－DKG)进而制备得2－KLG。

Description

从葡萄糖发酵制备2-酮基-L-古龙酸的新方法

本发明涉及生产维生素C的新工艺。具体来说。本发明以葡萄糖作为原料，采用两种微生物进行串联发酵和微生物转化，通过生成中间体2，5-二酮基-D-葡萄糖(盐)(2，5-diketo-D-gluconicacid，简称2，5-DKG)来制备维生素C的重要前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)的新方法。

2-KLG是合成维生素C的一个重要前体，从本世纪三十年代以来，维生素C工业化生产一直采用“莱氏法”(“Reichstein′s Method”)进行化学合成(图1)，需要五步反应过程并消耗大量有毒有害化学物质。我国于七十年代初期发明的“二步发酵法”在工艺上有所改进，但仍需用葡萄糖高压加氢生成的D-山梨醇作为原料(图2)。

本发明的目的在于寻找一种利用葡萄糖直接发酵产生2-KLG的方法，力求简化维生素C生产工艺并开拓新的代谢途径。

本发明的目的是通过诱变选育能直接利用葡萄糖的菌种及进行相应的发酵工艺研究而得到实现的。具体地说，是使用了欧文氏菌属(Erwinia sp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)进行串联发酵，并筛选获得了优良的欧文氏菌SCB125(武汉：武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心。保藏编号：CCTCC～NO：M96010)和棒状杆菌SCB3058(武汉：中国典型培养物保藏中心。保藏编号：CCTCC～NO：M96011)，从欧文氏菌SCB125发酵生产中间体2，5-DKG进而由棒状杆菌SCB3058转化为2-KLG(图3)。

为了使本发明被更好理解，下面对技术方案作较详细的说明：

发酵菌株的生理生化特征：

可以利用葡萄糖生成2，5-DKG的微生物有葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)和欧文氏菌属(Erwinia sp.)菌株。本发明采用的菌株是欧文氏菌属(Erwinia sp.)SCB125。SCB125菌株主要形态及生理特征如下：

细胞短杆状，革兰氏染色阴性(G^-)，无芽孢。28-30℃培养三天后，细胞大小为0.6-0.8×1.2-3.5微米(μm)，单个排列为主，次端生鞭毛(近似周生鞭毛)有粘液物质形成。未见到多形态细胞，但可观察到有丝状结构物形成。菌落圆形，平滑，培养三天以上在菌落表面可出现皱褶。最适pH6.5-8.0，最适生长温度25-35℃，可利用葡萄糖产酸，可利用葡萄糖酸盐和瑚珀酸盐，好氧，氧化酶阴性，接触酶阳性。

能将2，5-DKG转化生成2-KLG的菌株有棒状杆菌属和短杆菌属菌株。本发明中转化2，5-DKG产生2-KLG的菌株是棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058菌株，主要生理特征如下：

细胞呈短杆状，革兰氏染色阳性(G⁺)至可变(G±)，无芽孢。在普通牛肉汁斜面培养基上30℃培养两天后，细胞大小为0.6-0.8×0.9×2.1微米(μm)，单个或成对排列，可观察到明显的栅状交叉排列。菌落圆形，呈黄色，表面光滑微有突起。在含有硝酸盐及铵盐的培养基上生长良好，最适pH7.0-8.0，最适生长温度25-30℃，可利用D-葡萄糖酸及微弱利用2-酮基-葡萄糖酸(2-KDG)。好氧，接触酶阳性。SCB125的诱变筛选

以初筛得到的能转化D-葡萄糖生成2，5-DKG的988作为出发菌株，通过紫外和亚硝基胍先后进行诱变，并在选择性平板上分离得到能产生明显溶钙圈的单菌落，最后以发酵对比试验挑选转化率高且性状稳定的菌株，编号SCB125；选择性培养基的成分为：D-葡萄糖10％，玉米浆2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，CaCO₃ 3％。串联发酵工艺过程

在含有葡萄糖，碳酸钙，玉米浆，磷酸氢二铵的培养基中以及合适的通气条件下，把欧文氏菌SCB125进行液体培养。当初始葡萄糖被利用至快耗尽时，流加50％葡萄糖液以促使微生物发酵产生2，5-DKG。发酵终了用表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)处理达到灭菌的目的以作为下一步发酵的底物。

在含有葡萄糖，氯化铵和玉米浆的合适培养基中，将棒状杆菌SCB3058进行通气培养。当SCB3058生长到一定时间，开始流加经SDS处理过的2，5-DKG发酵酪液作为反应底物，转化产生终产物2-KLG。同时加入0.2％(w/v)葡萄糖作为氢供体，以使转化反应得以顺利进行。

本发明已在摇瓶、5L、15L、147L和1,000L发酵罐规模中实现。在发酵过程中，pH可以控制在5到8之间，最佳为6.8-7.2；温度可以控制在25-35℃，最适为28-32℃；葡萄糖浓度在20-200g/l之间，最好在60-160g/l之间，适当流加葡萄糖有利于2，5-DKG的生成和最后转化产生2-KLG。发酵中适当补加碳酸钙有利于2，5-DKG的大量积累，也影响到2-KLG的生成。发酵周期随pH、温度和葡萄糖浓度而有所变化，一般产生2，5-DKG的过程约为33-36小时，将2，5-DKG转化产生2-KLG的过程约为64-72小时。

按本发明经过串联发酵所得2-KLG能从最终反应混合液中分离得到，并采用提取和化学转化等方法得到维生素C(L-抗坏血酸)。

与莱氏法相比，本发明采用了微生物转化的方法，不需再使用有毒有害物质，且工艺步骤简单，操作方便。与正在使用的二步发酵法相比，本发明提出了从葡萄糖直接产生2-KLG的新方法，在工艺过程中，省略了将葡萄糖高压加氢制备D-山梨醇作为原料的步骤，可以直接利用葡萄糖作为原料，有利于安全生产。国内现有工厂大多数均采用“两步发酵法”工艺，就设备而言，改用葡萄糖串联发酵工艺，不必改动和增加设备，可以较快地使用。

本发明中所使用菌株是欧文氏菌SCB125和棒状杆菌SCB3058以及具有同样功效的亚株、突变株或由此而得到的变异株。

实施例1：在5L发酵罐中2，5-DKG的生成

将欧文氏菌SCB125在茄瓶斜面上28℃培养48小时，以无菌水制备的菌悬液接入种子摇瓶中培养，再接入种子罐中培养。斜面和种子培养基的主要成分有：葡萄糖(1％)、玉米浆(5％)、磷酸二氢钾(0.1％)及硫酸镁(0.02％)等，二级种子培养温度28℃，均培养10小时左右。取生长旺盛的菌株SCB125种液以10％的接种量接入发酵罐内。初始葡萄糖浓度为6.62％，28℃，搅拌转速250rpm，通气量2.0vvm，当发酵液中残糖快耗尽时开始流加50％葡萄糖溶液并继续发酵到总糖浓度达到16.54％(w/v)时停止流加，发酵总时间为36小时。发酵培养基的主要成分除葡萄糖外，还有玉米浆(3％)，磷酸二氢铵(0.2％)和碳酸钙(3-5％)等。发酵产物即为中间体2，5-DKG，产量为150.32mg/ml，转化率77.52mol％。由于2，5-DKG对热不稳定，为了有利于第二步的微生物转化，故在菌株SCB125所生成的2，5-DKG发酵液(活菌数为1×10⁸-10⁹个/ml)中，加入250μg/ml左右的表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)处理5-7小时左右，此时活菌数即下降至1.4×10³/ml左右，可达到灭菌的目的。低温放置待用。实施例2：在15L发酵罐中2-KLG的生成

首先将棒状杆菌SCB3058在斜面上28℃培养40小时，再经摇瓶和种子罐二级种子培养，均采用常规的LB培养基，培养16-20小时左右。将SCB3058种液以10％接种量接入发酵罐内，发酵培养基成分为葡萄糖(2％)、玉米浆(3％)和氯化铵(0.25％)等，在28℃，搅拌转速200-300rpm，通气量0.44vvm的条件下菌细胞得以迅速生长，当16小时左右活菌数增长到一定程度时，开始流加经SDS处理过的2，5-DKG发酵液作为反应底物进行转化。在流加2，5-DKG的同时必须加入0.2％(w/v)葡萄糖作为氢供体，才能促使这一还原反应的进行而有利于终产物2-KLG的不断积累和生成。总发酵转化时间68小时。产生2-KLG19.09mg/ml，克分子转化率为89.41mol％。实施例3：葡萄糖串联发酵在147L发酵罐和1m³罐中的产酸结果

欧文氏菌SCB125采用二级种子培养，经147L罐发酵33小时产生2，5-DKG136.21mg/ml，总糖浓度15.07％，同时亦将棒状杆菌SCB3058采用三级种子培养，在1000升罐中进行发酵，16小时左右开始流加经0.025％SDS处理过的2，5-DKG发酵液(浓度有所下降)，最后经68小时发酵，产生2-KLG12.21mg/m1。从葡萄糖经两步串联发酵产生2-KLG总转化率为67.13％。

Claims

1.采用微生物转化D-葡萄糖产生2-KLG，其特点是使用了欧文氏菌属(Erwinia sp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株进行串联发酵。

2.按权项要求1的方法，有代表性的菌株是欧文氏菌SCB125和棒状杆菌SCB3058，以及具有相同功效的亚株，突变株或由此而得的变异株。

3.按权项1和2要求的方法，欧文氏菌SCB125能在下列条件下利用葡萄糖产生中间产物2，5-二酮基-D-葡萄糖酸(2，5-DKG)。

A)最适生长温度25-35℃。

B)最适pH6.5-8.0

C)在残存底物少时流加50％葡萄糖，可以提高转化率。

4.按权项要求1和2的方法产生的2，5-DKG，发酵液先用SDS处理约5-7小时。

5.按权项要求1和2的方法，用作原料的葡萄糖浓度在20-200g/l之间，最适为60-160g/l之间。

6.按权项要求1和2中所述方法，棒状杆菌SCB3058在以下条件可以将第一步发酵产生的2，5-DKG转化成Vc前体2-KLG。

A)生长温度25-30℃，最适发酵温度28-32℃

B)发酵pH5.0-8.0，最适pH6.8-7.2

C)发酵过程中必须流加0.2％葡萄糖作为氢供体。