CN108130296A - 一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，公开了一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂的制备方法。本发明首次采用多级连续发酵，将上级发酵罐中的发酵液以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出到下级发酵罐中，通过补加发酵培养基或补料培养基，控制各级发酵罐中的残糖浓度，直至最后一级发酵罐中的残糖在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。将丁酸梭菌菌液于载体一起真空搅拌干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。本发明高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，促进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，得到的丁酸梭菌菌液菌体浓度达到10¹¹cfu/ml以上。

Description

一种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法及丁酸梭菌微生态制剂 的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种丁酸梭菌高密连续发酵的方 法，还包括一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法。

背景技术

丁酸梭菌，即酪酸梭菌，又名丁酸梭状芽孢杆菌，是一种广泛存在于动 物或人的肠道、酸奶和土壤的厌氧革兰氏阴性菌。丁酸梭菌能形成内生芽孢， 具有耐高温、耐胃酸、耐胆盐，耐部分抗生素等特性。同时，丁酸梭菌能够 刺激免疫系统，提高机体免疫力，其代谢产物具有一定抗癌，促进小肠细胞 自我修复与提高小肠细胞吸收功能。丁酸梭菌的诸多优点使其在临床医学和 畜牧业方面广泛应用于整肠药物、保健食品、饲料添加剂、微生物肥料等， 是一种较为理想的应用前景的微生态制剂。随着抗生素滥用日益严重，丁酸 梭菌活菌制剂作为替代减少抗生素的使用在预防肠道疾病中具有重要意义。 丁酸梭菌菌剂的活性与其数量密切相关，现阶段限制丁酸梭菌的使用推广主 要是发酵密度不高。由于丁酸梭菌在生长过程中会产生大量有机酸类代谢产 物，导致培养液的pH值迅速下降；当培养液的pH值降到4.5以下时，菌体 的生长繁殖就会受到抑制。因此，采用传统的菌种生产工艺，菌种的数量得 不到保证，且生产成本高。

现有技术对丁酸梭菌的发酵均采用了分批发酵的形式，发酵周期长，同 时菌体的生长容易受到代谢物积累的负反馈，抑制其生长，导致其菌体发酵 密度不高。专利CN100523171C，使用石蜡隔绝空气对丁酸梭菌进行发酵， 操作不便，发酵密度较低，为15-20×10⁸cfu/ml，发酵周期为45小时。专利 CN102220269B中丁酸梭菌为固体发酵，密度为4.35×10⁹cfu/ml，发酵周期 长40～55h。专利CN103710286B对丁酸梭菌为二级种子发酵，步骤繁琐， 同时发酵周期为28～32小时，发酵密度最高为2×10⁹cfu/ml。

发明内容

本发明的目的是为了避免分批发酵的劣势，提供了一种丁酸梭菌的高密 度连续发酵方法，最大限度的降低代谢产物的累积，减小负反馈，促进丁酸 梭菌在发酵后期的进一步生长，提高丁酸梭菌的发酵密度。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，包括如下步骤：

将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；

在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发 酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出 发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持 残糖浓度在一级设定值范围内；

当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当 残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液 到下一级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓 度在二级设定值范围内；

按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级 发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。

优选的，所述发酵培养基包括：8～25g/L蛋白胨和/或酵母粉,30～80g/L 甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种，0.1～0.2g/L MgSO₄，2～4g/L K₂HPO₄，1～2g/L KH₂PO₄，1～2mg/L MnSO₄。

优选的，所述补料培养基包括：30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤 维素水解糖浆中的至少一种。

优选的，所述丁酸梭菌种子液的接种量为发酵培养基体积的3～10％。

更优选的，所述丁酸梭菌种子液的制备方法包括：将丁酸梭菌孢子接种 于种子培养基中，在37℃下厌氧培养12～18h，得到的培养液为丁酸梭菌种 子液。

进一步优选的，每升所述种子培养基包括：酵母膏2～4g，牛肉膏8～12g， 蛋白胨8～12g，可溶性淀粉0.5～1.5g，葡萄糖4～6g，半胱氨酸盐酸盐0.5g， NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg；所述种子培养基的pH值为6.0～7.0。

优选的，所述保护气体为CO₂和/或N₂，或体积比为1:0.2～1的CO₂和 H₂的混合气体；所述保护气体的通气量为0.5～1.0vvm。

优选的，所述一级发酵罐中的初始糖浓度为50～150g/L。

优选的，所述连续发酵培养的温度为30～40℃，pH值为6.0～7.5，搅拌 速率为100～200rpm。

优选的，当发酵罐数量为3个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定 值：90～80％残糖；二级设定值：60～45％残糖；三级设定值：15～0％残糖。

优选的，当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定 值：95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残 糖；四级设定值：15％～0％残糖。

优选的，当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定 值：95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残 糖；四级设定值：15％～0％残糖。

优选的，当发酵罐数量为5个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定 值：95％～85％残糖；二级设定值：75％～60％残糖；三级设定值：55％～40％ 残糖；四级设定值：35％～20％残糖；五级设定值：15％～0％。

本发明还提供了一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法， 包括：

将上述技术方案所述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃的条件下 静止产孢，得到产孢丁酸梭菌菌液；

将所述产孢丁酸梭菌菌液与载体混合后，在40～50℃下进行真空干燥， 得到丁酸梭菌微生态制剂。

优选的，所述载体为蒙脱石粉和/或硅藻土，所述产孢丁酸梭菌菌液与载 体的质量比为1:0.5～5。

现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明丁酸梭菌高密度连续发酵的方法，首次采用多级连续发酵，将上 级发酵罐中的发酵液以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出到下级发酵罐 中，通过补加发酵培养基或补料培养基，控制各级发酵罐中的残糖浓度，直 至最后一级发酵罐中的残糖在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。 本发明提供的高密度多级连续发酵的方法能够控制各级发酵罐中菌体的生 长速率与菌体密度，最大限度的降低了代谢产物的累积，减小了负反馈，促 进丁酸梭菌在发酵后期的进一步生长，达到了较高的密度，得到的丁酸梭菌 菌液菌体浓度达到10¹¹cfu/ml以上。同时，由于是连续发酵，可以在末级发 酵罐不断地连续获得高密密度菌液，使得发酵周期大大减小，并且避免了重 复灭菌接种等繁琐操作，简化生产工艺流程。

作为一种具体的实施方案，本发明采用甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖或木质纤维 素水解糖浆等做为碳源，减少了碳源在丁酸梭菌代谢过程中的产酸程度，促 进了菌体生长。

本发明还提供了一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法， 将上述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃的条件下静止产孢，得到的产 孢丁酸梭菌菌液与载体混合后，在40～50℃下进行真空干燥，得到丁酸梭菌 微生态制剂。本发明使用常温真空干燥方法，不仅减少了能耗，降低温度对 菌体的伤害，同时省去粉碎环节，保护了菌体活性。

具体实施方式

为了克服现有技术中分批发酵菌体浓度低的技术问题，本发明提供了一 种丁酸梭菌高密度连续发酵的方法，包括如下步骤：

将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；

在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发 酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出 发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持 残糖浓度在一级设定值范围内；

当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当 残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液 到三级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓度 在二级设定值范围内；

按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级 发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。

本发明中，所述发酵培养基为适用于丁酸梭菌生长和繁殖的培养基。优 选所述发酵培养基包括：8～25g/L蛋白胨和/或酵母粉,30～80g/L甘蔗蜜糖、 甜菜蜜糖或木质纤维素水解糖浆中的至少一种，0.1～0.2g/L MgSO₄，2～4g/L K₂HPO₄，1～2g/L KH₂PO₄，1～2mg/LMnSO₄，更优选所述发酵培养基包括： 12～18g/L蛋白胨和/或酵母粉,50～70g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖或木质纤维素水 解糖浆中的至少一种，0.2g/L MgSO₄，4g/L K₂HPO₄，1g/L KH₂PO₄，1mg/L MnSO₄。其中，蛋白胨、酵母粉作为本发明发酵培养基的氮源，本发明所述 发酵培养基的碳源为甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖或木质纤维素水解糖浆中的至少一 种，K₂HPO₄与KH₂PO₄为本发明发酵培养基的缓冲液体系成分，MgSO₄与 MnSO₄为微量元素无机盐。

本发明对发酵罐的种类及结构没有特殊限定，采用本领域中的常规发酵 罐即可。各级发酵罐的大小没有特殊限制，可以采用同大小的发酵罐，或采 用体积逐渐增大的发酵罐，以适应发酵液的体积及残糖量的调整。

本发明将发酵罐串联。所述发酵罐优选为灭菌后的发酵罐。本发明中， 优选发酵罐中的发酵培养基为发酵罐体积的40～90％，更优选为50～80％。向 发酵罐中装入发酵培养基。本发明中，优选一级发酵罐中的装液量体积大于 其他发酵罐中的装液量体积，便于上级发酵罐中的发酵液流入下级发酵罐。 本领域技术人员可以根据发酵罐中的发酵情况合理设置发酵培养基在发酵 罐中的装液量。

本发明中，所述保护气体优选为CO₂和/或N₂。当保护气体为CO₂和N₂的混合气体时，本发明对两者的混合比例没有特殊限制，任意比例均可。本 发明的保护气体还可以是体积比为1:0.2～1的CO₂和H₂的混合气体。所述保 护气体的通气量优选为0.5～1.0vvm，更优选为0.6～0.8vvm。由于各级发酵罐 是串联形式，本发明对保护气体的通入方式没有特殊限定，优选在第一发酵 罐中通入保护气体，串联后各级发酵罐之间均形成保护气体环境。

本发明对丁酸梭菌种子液的接种方法及接种量没有特殊限定，采用本领 域技术人员所熟知的方法即可。在本发明中，所述丁酸梭菌种子液的接种量 为所述发酵培养基体积的3～10％，更优选为5～8％。

本发明对丁酸梭菌种子液的来源没有特殊限定，可以采用自行发酵的 方法进行制备。在本发明中，优选将丁酸梭菌孢子接种于种子培养基中， 在30～40℃下厌氧培养12～18h，得到的培养液为丁酸梭菌种子液。本发明 中的丁酸梭菌孢子为本领域中的常规丁酸梭菌孢子，对其来源没有限制。 在本发明中，所述种子培养基优选为RCM培养基，具体为每升所述种子培 养基包括：酵母膏2～4g，牛肉膏8～12g，蛋白胨8～12g，可溶性淀粉0.5～1.5g， 葡萄糖4～6g，半胱氨酸盐酸盐0.5g，NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg，所 述种子培养基的pH值优选为6.0～7.0。在本发明中，所述厌氧培养的温度 更优选为35～38℃；所述厌氧培养的时间更优选为14～16h。

本发明中，所述丁酸梭菌连续发酵培养的温度优选为30～40℃，更优选 为35～38℃；培养的pH值优选为6.0～7.5，更优选为6.0；发酵时搅拌速率 为100～200rpm，更优选为120～150rpm。本发明发酵液的pH值优选采用碳 酸钠、碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁中的一种或多种来 调节，以使发酵液的pH值达到上述发酵条件。本发明中的各级发酵罐中的 发酵培养均在上述培养条件下进行发酵。

本发明中，所述补料培养基优选为碳源补料培养基，所述补料培养基优 选包括：甘蔗蜜糖和/或甜菜蜜糖和/或木质纤维素水解糖浆30～80g/L，更优 选为40～70g/L，进一步的为45～65g/L。

本发明采用甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖或木质纤维素水解糖浆等做为发酵培养 基和补料培养基中的碳源，减少了碳源在代谢过程中所产酸程度，促进了菌 体生长。

本发明中，所述一级发酵罐的初始糖浓度为50～150g/L，优选为 80～120g/L，更优选为100～110g/L，合理的初糖浓度有利于减少延滞期与提 高对数期的生长速度。本发明中，一级发酵罐中的初始发酵液从一级发酵罐 流入二级发酵罐，二级发酵罐中的发酵液流入到下一级发酵罐中，这样发酵 液从一级发酵罐中依次流入末级发酵罐中，通过设置不同发酵罐的残糖量， 直至放罐得到丁酸梭菌菌液。

具体地，当一级发酵罐残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％， 优选为7～8％发酵罐体积的速度连续放出发酵液到二级发酵罐中，同时一级 发酵罐补充相应体积的上述发酵培养基，维持残糖浓度在一级设定值范围 内。本发明所述补加发酵培养基优选为连续补加，优选补加速率与一级发酵 罐流出发酵液速率相同。

上一级发酵罐流入的发酵液在二级发酵罐中继续发酵。当二级发酵罐装 液量体积达到70～80％罐体积，更优选为73～78％罐体积时，监测残糖浓度， 当残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％，优选为7～8％发酵罐体积 的速度释放发酵液到下一级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的上述补 料培养基，维持残糖浓度在二级设定值范围内。本发明中，所述补料培养基 优选为连续补加，优选补料培养基的补加速率为这一级发酵罐中的发酵液流 出的速率减去上一级发酵罐中的发酵液流进的速率。以此类推调节以后各级 发酵罐的残糖浓度。

本发明对发酵罐的串联数量没有特殊的限定，可以根据实际发酵情况设 置合适的发酵罐数量，并根据发酵罐数量逐级设定不同发酵的残糖量。作为 优选的实施方式，当发酵罐数量为3个时，各级发酵罐内的糖浓度优选为： 一级设定值：90～80％残糖；二级设定值：60～45％残糖；三级设定值：15～0％ 残糖。

当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度优选为：一级设定值： 95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残糖； 四级设定值：15％～0％残糖。

当发酵罐数量为5个时，各级发酵罐内的糖浓度优选为：一级设定值： 95％～85％残糖；二级设定值：75％～60％残糖；三级设定值：55％～40％残糖； 四级设定值：35％～20％残糖；五级设定值：15％～0％。

当最后一级发酵罐中残糖浓度在15％以下时，更优选为10％以下时，放 出发酵液即为丁酸梭菌菌液。经检测，本发明方法发酵得到的丁酸梭菌菌液 菌体密度能够达到3.1～6.9×10¹¹cfu/ml，大大提高了丁酸梭菌的发酵效果。同 时，由于是连续发酵，可以在末级发酵罐不断地连续获得高密密度菌液，使 得发酵周期大大减小，并且避免了重复灭菌接种等繁琐操作，简化生产工艺 流程。

本发明还提供了一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法， 包括以下步骤：将上述技术方案所述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃ 的条件下静止产孢，得到产孢丁酸梭菌菌液；将所述产孢丁酸梭菌菌液与载 体混合后，在40～50℃下进行真空干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。

本发明中，丁酸梭菌菌液产孢的温度优选为4～15℃，更优选为6～10℃； 产孢时间优选为3～5h，更优选为4h，产孢完全。

本发明中，所述载体可以为本领域技术人员所熟知的常规载体，优选为 蒙脱石粉和/或硅藻土。本发明中，所述产孢丁酸梭菌菌液与所述载体混合的 质量比优选为1:0.5～5，更优选为1:2～4。

本发明中，对产孢丁酸梭菌菌液与载体混合后的混合物进行真空干燥， 干燥的温度优选为43～47℃，真空度优选为10～20Pa。在干燥过程中优选对 上述混合物在低速率下进行搅拌，所述搅拌速率优选为20～100rpm，更优选 为30～50rpm。本发明中，所述干燥的时间优选为20～48，更优选为24～36。 优选干燥至含水量小于5％时结束。本发明使用常温真空干燥方法，不仅减 少了能耗，降低温度对菌体的伤害，同时省去粉碎环节，保护了菌体活性。 本发明干燥后得到粉末态丁酸梭菌的微生态制剂，分散优良，经检测其活菌 数范围为5～50×10¹¹cfu/g。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对 本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)种子培养：

配制300ml的RCM种子培养基，每1L种子培养基中含：酵母膏2g， 牛肉膏8g，蛋白胨8g，可溶性淀粉0.5g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g， NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg，种子培养基的pH值为6.0。将配制好的种 子培养基进行121℃，20min高压灭菌。

将丁酸梭菌菌种孢子液转接于种子培养基，置于氮气保护的厌氧箱培 养，在37℃下培养时间18h，得到丁酸梭菌种子液。

(2)连续发酵

配制发酵培养基和补料培养基，并进行121℃，高压灭菌20min，其中 具体培养基成分如下：

发酵培养基：蛋白胨:10g/L,甘蔗蜜糖:40g/L；MgSO₄0.2g/L；K₂HPO₄ 4g/L，KH₂PO₄1g/L,MnSO₄1mg/L；

补料培养基：甘蔗蜜糖:40g/L。

使用3个发酵罐进行3级连续发酵：其中一级罐为5升发酵罐，二级罐 为10升发酵罐，三级罐为50升发酵罐。在各级发酵罐中预先装入发酵培养 基：一级发酵罐中装入80％体积的发酵培养基，其余各级发酵罐的装液量为 50％。对串联的三级发酵罐以及配套的补料罐进行121℃，30min的高温高 压灭菌。向一级发酵罐中通入99.9％氮气，通气量为0.5vvm。待发酵罐冷却 至37℃时，按照10％发酵培养基体积的接种量接种300ml种子液，搅拌速 度为150rpm，温度控制在37℃，其余各级发酵罐搅拌速度与温度与一级发 酵罐相同，开始进行发酵。当一级发酵罐残糖浓度低于设定值(残糖80％) 时，以每小时10％发酵罐体积(即0.5升)的速度放出发酵液到下一级发酵 罐中，同时一级发酵罐以0.5g/L补充相应体积的发酵培养基，维持残糖浓度 为80～90％。当一级的发酵液以固定速率流入二级发酵罐，并且二级发酵罐 装液量体积达到80％罐体积时，监测残糖浓度，当残糖浓度小于45％时，开 始以1L/h的速度释放发酵液到下一级发酵罐，同时以0.5L/h补充补料培养 基，维持残糖浓度在45～60％。当最后一级发酵罐中残糖浓度在5％以下时， 既可按10L/h速度放出发酵液，同时补加9.5L/h速度补加补料培养基，流出 的发酵液即为丁酸梭菌菌液，经检测菌体浓度为3.2×10¹¹cfu/ml。

该连续发酵过程中发酵液的pH值使用4M氢氧化钠溶液近性调节，维 持发酵过程pH＝6.0。

(3)真空常温干燥

丁酸梭菌发酵液与蒙脱石粉载体按照体积比1:5拌匀后，在40℃下进行 真空(真空度为10pa)搅拌干燥24h，干燥后即得分散优良的粉末态丁酸梭 菌微生态制剂，经检测其活菌数范围为21×10¹¹cfu/g。

实施例2

(1)种子培养：

配制400ml的RCM种子培养基，每1L种子培养基中含：酵母膏3g， 牛肉膏10g，蛋白胨12g，可溶性淀粉1g，葡萄糖5g，半胱氨酸盐酸盐0.5g， NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg，种子培养基的pH值为6.0，将配制好的种 子培养基进行121℃，20min高压灭菌。

将丁酸梭菌菌种孢子液转接于种子培养基，置于氮气保护的厌氧箱培 养，在37℃下培养时间15h，得到丁酸梭菌种子液。

(2)连续发酵

配制发酵培养基和补料培养基，并进行121℃，高压灭菌20min，其中 具体培养基成分如下：

发酵培养基：蛋白胨:25g/L,木质纤维水解糖浆:50g/L；MgSO₄0.2g/L； K₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄1g/L,MnSO₄1mg/L；

补料培养基：木质纤维水解糖浆:50g/L。

使用3个发酵罐进行3级连续发酵：其中一级罐为10升发酵罐，二级 罐为50升发酵罐，三级罐为100升发酵罐。在各级发酵罐中预先装入发酵 培养基：一级发酵罐中装入80％体积的发酵培养基，其余各级发酵罐装液量 为50％，对串联的三级发酵罐以及配套的补料罐进行121℃，30min的高温 高压灭菌。向一级发酵罐中通入体积比为1:1的二氧化碳与氢气，通气量为 0.5vvm，待发酵罐冷却至37℃时，接400ml种子液，搅拌速度为150rpm， 温度控制在37℃，开始进行发酵。当一级发酵罐残糖浓度低于设定值(残糖 80％)时，以每小时10％发酵罐体积(即1L/h)的速度放出发酵液到第二级 发酵罐中，同时一级发酵罐以1L/h补充发酵培养基，维持残糖浓度为 80～90％。当一级的发酵液以固定速率流入二级发酵罐，并且二级发酵罐装 液量体积达到80％罐体积时，搅拌速度为100rpm，温度为37℃，监测残糖 浓度，当残糖浓度小于45％时，开始以每小时5升发酵液的速度释放发酵液 到第三级发酵罐，同时以4L/h补充补料培养基，维持残糖浓度在45～60％。 当第三级发酵罐装液量达到70％时，监测残糖浓度。当残糖浓度在10％以下 时，既可按8L/h速度释放发酵液，同时补加3L/h速度补加补料培养基，流 出的发酵液即为丁酸梭菌菌液，经检测菌体浓度为4.6×10¹¹cfu/ml。

该连续发酵过程中发酵液的pH值使用4M氢氧化钠溶液近性调节，维 持发酵过程pH＝6.0。

(3)真空常温干燥

将丁酸梭菌发酵液与硅藻土载体按照1:2体积比拌匀后，在45℃下进行 真空(10pa以下)搅拌干燥32小时，干燥后既得分散优良的粉末态丁酸梭 菌微生态制剂，经检测其活菌数范围为49×10¹¹cfu/g。

实施例3

(1)种子培养：

配制500ml的RCM种子培养基，每1L中种子培养基含：酵母膏4g， 牛肉膏12g，蛋白胨12g，可溶性淀粉1.5g，葡萄糖6g，半胱氨酸盐酸盐0.5g， NaCl 3g，NaAc 3g，刃天青3mg，种子培养基的pH值为6.0，将配制好的种 子培养基进行121℃，20min高压灭菌。

将丁酸梭菌菌种孢子液转接于种子培养基，置于氮气保护的厌氧箱培 养，在37℃下培养时间12h，得到丁酸梭菌种子液。

(2)连续发酵

配制发酵培养基和补料培养基，并进行121℃，高压灭菌20min，其中 具体培养基成分如下：

发酵培养基：蛋白胨:20g/L,甜菜蜜糖:40g/L；MgSO₄0.2g/L；K₂HPO₄ 4g/L，KH₂PO₄1g/L,MnSO₄1mg/L；

补料培养基：甜菜蜜糖:40g/L；

使用4个发酵罐进行4级连续发酵：其中一级罐为10升发酵罐，二级 罐为50升发酵罐，三级罐为100升发酵罐，四级为500升发酵罐。在各级 发酵罐中预先装入发酵培养基：一级发酵罐装液量为80％，其余各级发酵罐 装液量为50％，对串联的四级发酵罐以及配套的补料罐进行121℃，30min 的高温高压灭菌。向一级发酵罐中通入99.9％的二氧化碳，通气量为1vvm， 待发酵罐冷却至37℃时，接500ml种子液，搅拌速度为150rpm，温度控制 在37℃，其余发酵罐搅拌速度控制在100rpm，温度控制在37℃开始进行发 酵。当一级发酵罐残糖浓度低于设定值(残糖80％)时，以每小时10％发酵 罐体积(即1L/h)的速度放出发酵液到下一级发酵罐中，同时一级发酵罐以 1L/h补充发酵培养基，维持残糖浓度为80～90％。当一级的发酵液以固定速 率流入二级发酵罐，并且二级发酵罐装液量体积达到80％罐体积时，监测残 糖浓度，当残糖浓度小于45％时，开始以每小时5升发酵液的速度释放发酵液到下一级发酵罐，同时以4L/h补充补料培养基，维持残糖浓度在45～60％。 当第三级发酵罐装液量达到70％时，监测残糖浓度。当残糖浓度在25％以下 时，既可按10L/h速度释放发酵液到第四级发酵罐，同时补加5L/h速度补加 补料培养基。当第四级发酵罐装液量为70％时，监测残糖浓度，若残糖浓度 小于5％，以每小时35L/h释放发酵液，同时以25L/h补加补料培养基，流 出的发酵液即为丁酸梭菌菌液，经检测菌体浓度为5.2×10¹¹cfu/ml。

该连续发酵过程中发酵液的pH值使用4M氢氧化钠溶液近性调节，维 持发酵过程pH＝6.0。

(3)真空常温干燥

将丁酸梭菌发酵液与蒙脱石粉载体按照体积比1:3拌匀后在50℃下进行 真空(10pa以下)搅拌干燥36h，干燥后即得分散优良的粉末态丁酸梭菌微 生态制剂，经检测其活菌数范围为41×10¹¹cfu/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丁酸梭菌的高密度连续发酵方法，包括如下步骤：

将发酵罐串联，接入发酵培养基，通入保护气体；

在一级发酵罐中接种丁酸梭菌种子液进行连续发酵培养；当所述一级发酵罐中残糖浓度低于一级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度放出发酵液到二级发酵罐中，同时一级发酵罐补充相应体积的发酵培养基，维持残糖浓度在一级设定值范围内；

当二级发酵罐中装液量体积达到70～80％罐体积时，监测残糖浓度，当残糖浓度小于二级设定值时，以每小时5～10％发酵罐体积的速度释放发酵液到三级发酵罐，同时二级发酵罐补充相应体积的补料培养基，维持残糖浓度在二级设定值范围内；

按照二级发酵罐的方法依次调节下一级发酵罐的残糖浓度，当最后一级发酵罐中残糖浓度在15％以下时，放出发酵液即为丁酸梭菌菌液。

2.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：8～25g/L蛋白胨和/或酵母粉,30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种，0.1～0.2g/LMgSO₄，2～4g/LK₂HPO₄，1～2g/LKH₂PO₄，1～2mg/LMnSO₄。

3.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述补料培养基包括：30～80g/L甘蔗蜜糖、甜菜蜜糖和木质纤维素水解糖浆中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述一级发酵罐中的初始糖浓度为50～150g/L。

5.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，所述连续发酵培养的温度为30～40℃，pH值为6.0～7.5，搅拌速率为100～200rpm。

6.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，当发酵罐数量为3个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：90～80％残糖；二级设定值：60～45％残糖；三级设定值：15～0％残糖。

7.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，当发酵罐个数为4个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：95％～85％残糖；二级设定值：70～55％残糖；三级设定值：40％～25％残糖；四级设定值：15％～0％残糖。

8.根据权利要求1所述的高密度连续发酵方法，其特征在于，当发酵罐数量为5个时，各级发酵罐内的糖浓度为：一级设定值：95％～85％残糖；二级设定值：75％～60％残糖；三级设定值：55％～40％残糖；四级设定值：35％～20％残糖；五级设定值：15％～0％。

9.一种连续发酵生产高密度丁酸梭菌微生态制剂的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1～8任意一项所述方法制备得到的丁酸梭菌菌液在2～20℃的条件下静止产孢，得到产孢丁酸梭菌菌液；

将所述产孢丁酸梭菌菌液与载体混合后，在40～50℃下进行真空干燥，得到丁酸梭菌微生态制剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述载体为蒙脱石粉和/或硅藻土，所述产孢丁酸梭菌菌液与载体的质量比为1:0.5～5。