CN112831437B - 枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法 - Google Patents

枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法。属于微生物发酵技术领域。该枯草芽孢杆菌命名为8‑32，于2020年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20824。本发明通过补料、控制发酵条件、发酵后发酵液处理方法，使枯草芽孢杆菌含量达到2×1010CFU/mL以上，吲哚乙酸含量达120mg/L以上，芽孢形成率达到98％以上，提供了一种既能高产吲哚乙酸且芽孢形成率高的液体枯草芽孢杆菌菌株发酵方法，解决了液体发酵吲哚乙酸产量低，芽孢形成诱导时间长、芽孢形成率不稳定的问题。

Description

枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体的说是涉及一株枯草芽孢杆菌及其高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类环境中广泛存在的革兰氏阳性细菌，属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的一种。枯草芽孢杆菌具有产植物促生物质、拮抗物质、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等功能，且产生的芽孢具有耐热、抗逆性强等特点，已被广泛应用于农业、畜牧业、医药等领域。目前已经有一些芽孢杆菌产吲哚乙酸(IAA)的报道，例如以下专利中关于芽孢杆菌产吲哚乙酸发酵方法：
CN106011003A采用固体发酵方式，发酵获得巨大芽孢杆菌T482菌剂，培养基组成为：麸皮65～72份，豆粕22～28份，NaCl 3～4份，CaCO3 1.5～2.5份，MnSO4·H2O 0.01～0.04份，MgSO4·7H2O 0.01～0.05份，培养基的pH为7.1～7.4。发酵后吲哚乙酸含量为200～300mg/L。CN111117909A中将Cd103菌株接种于含有L-色氨酸(100mg/L)的LB液体培养基，培养48h时IAA产量为30.39mg/L。上述专利用的或是固体发酵方法，然而固体发酵存在易污染、发酵过程易产生高温、发酵参数不易控制、不适用大规模生产等缺点；或是采用液体发酵，然而发酵液中吲哚乙酸的含量较低。
另外关于提高芽孢生成率的专利：CN111849857A中公开了一种提高芽孢形成率的方法，采用的诱导培养温度为50～55℃、时间为6～8h、搅拌速度为120～150r/min、通气比为0.6-0.8(V/V·min)，凝结芽孢杆菌芽孢形成率为95～98％。CN102533579B中公开了一种产芽孢培养基及其优化过程与应用，其培养基组成为：葡萄糖0.5～1.0％，玉米粉0.5～3％，麸皮0.1～1％，黄豆饼粉0.1～0.5％，十二水磷酸二氢钾0.01～0.1％，无水碳酸钙0.05～0.3％，余量为水，pH＝6.5。培养条件为：罐压0.05～0.06Mpa，风量100:10～100:150vvm，转速220～250rpm，培养温度为35℃～37℃，海洋地衣芽孢杆菌发酵液中芽孢率达到80～99％。上述专利中或诱导条件时间较长，增加了成本还会使增加污染的风险，或没有严格的诱导条件导致芽孢形成率不稳定。
综上，如何提供一种既能高产吲哚乙酸且芽孢形成率高的枯草芽孢杆菌菌株发酵方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌及其高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法。解决了液体发酵吲哚乙酸产量低，芽孢形成诱导时间长、芽孢形成率不稳定的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌命名为8-32，于2020年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20824，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，8-32菌株的分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所述枯草芽孢杆菌8-32的16S rDNA的测序结果如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为120～180mg/L，且经诱导后芽孢形成率≧98％。
一种高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法，采用枯草芽孢杆菌8-32进行发酵，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：
将枯草芽孢杆菌8-32接种于摇瓶培养基中培养，得到摇瓶种子液；
其中，培养温度为30～37℃，转速为150～200r/min，培养时间为18～24h；
(2)种子罐发酵：
将摇瓶种子液按体积比5～10％接种于种子培养基中发酵，得到种子液；
其中，发酵温度为30～37℃，转速为150～300r/min，DO值为30～80％，罐压为0.03～0.05Mpa，发酵时间为16～24h；
(3)发酵罐发酵：
将种子液按体积比5～10％接种于发酵培养基中发酵；
其中，发酵温度为30～37℃，转速为150～300r/min，DO值为30～80％，罐压为0.03～0.05Mpa，发酵时间为16～18h；
之后补料发酵6～12h得到发酵液；
(4)发酵后处理：
将发酵液加热至50～80℃，保持15～60min，冷却至室温；或将发酵液pH值调整至5.5～6.0即可。
本方法诱导时间短。
优选的，步骤(3)中所述补料发酵的具体操作为：向发酵罐中添加葡萄糖使其质量浓度维持在1％直至发酵结束；或向发酵罐中添加氨水使pH值维持在7.5～8.5直至发酵结束。
补料发酵可以提高发酵液中菌体和产物(吲哚乙酸)的积累，减少形成的产物(吲哚乙酸)反馈抑制作用，提高发酵液中吲哚乙酸的含量，增加菌体量。
优选的，步骤(1)中所述摇瓶培养基和步骤(2)中所述种子培养基均由如下质量百分比的组分组成：碳源2～5％、氮源2～5％、组分A0.01～0.03％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.01～0.03％，余量为水；
所述组分A为磷酸二氢钾、氯化铁或氯化钠中任意一种。
优选的，步骤(3)中所述发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：碳源2～5％、氮源2～5％、组分A0.01～0.03％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.01～0.03％、色氨酸0.2～0.5％，余量为水；
所述组分A为磷酸二氢钾、氯化铁或氯化钠中任意一种。
在发酵培养基中添加了吲哚乙酸的前体物质：色氨酸，可以得到更多的产物。
优选的，所述碳源为玉米粉、酵母浸粉、麦芽糖和葡萄糖中的一种或多种的混合。
优选的，所述氮源为黄豆饼粉、蛋白胨和牛肉膏中的一种或多种的混合。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：通过补料、控制发酵条件、发酵后发酵液处理方法，枯草芽孢杆菌含量达到2×1010CFU/mL以上，吲哚乙酸含量达120mg/L以上，芽孢形成率达到98％以上，提供了一种既能高产吲哚乙酸且芽孢形成率高的液体枯草芽孢杆菌菌株发酵方法，解决了液体发酵吲哚乙酸产量低，芽孢形成诱导时间长、芽孢形成率不稳定的问题。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1：
(1)摇瓶培养
取斜面保存的枯草芽孢杆菌8-32，用接种环将菌种接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基由如下质量份数的组分组成：玉米粉2％，黄豆饼粉5％，磷酸二氢钾0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，余量为水；将摇瓶置于振荡培养箱中，培养温度为30℃，转速为150r/min，培养18h，得到摇瓶种子液；
(2)种子罐发酵
将摇瓶种子液按体积比10％接种于种子培养基中，种子培养基由如下质量份数的组分组成：酵母浸粉5％，蛋白胨2％，氯化钠0.03％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.03％，余量为水；控制种子罐发酵条件：温度为37℃，种子罐转速为300r/min，DO值为80％，罐压为0.05Mpa，培养24h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵
将种子液按体积比5％接种于发酵培养基中，发酵培养基由如下质量份数的组分组成：麦芽糖2％，牛肉膏5％，氯化铁0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，色氨酸0.2％，余量为水；控制发酵罐发酵条件为：温度为30℃，发酵罐转速为150r/min，DO值为30％，罐压为0.03Mpa，培养16h后，向发酵罐中补加葡萄糖，使葡萄糖的质量浓度维持在1％直至发酵结束，继续发酵6h得到发酵液；
(4)发酵后处理
将发酵液加热至50℃，保持60min，冷却至室温即可，得到灌装液。
通过平板计数法测得灌装液中活菌数含量为2×1010CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为120mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为99.5％。
实施例2：
(1)摇瓶培养
取斜面保存的枯草芽孢杆菌8-32，用接种环将菌种接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基由如下质量份数的组分组成：玉米粉5％，黄豆饼粉2％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.03％，余量为水；将摇瓶置于振荡培养箱中，培养温度为37℃，转速为200r/min，培养24h，得到摇瓶种子液；
(2)种子罐发酵
将摇瓶种子液按体积比5％接种于种子培养基中，种子培养基由如下质量份数的组分组成：酵母浸粉2％，蛋白胨5％，氯化钠0.01％，硫酸镁0.01％，氯化钙0.01％，余量为水；控制种子罐发酵条件：温度为30℃，种子罐转速为150r/min，DO值为30％，罐压为0.03Mpa，培养16h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵
将种子液按体积比10％接种于发酵培养基中，发酵培养基由如下质量份数的组分组成：麦芽糖5％，牛肉膏2％，氯化铁0.03％，硫酸镁0.03％，氯化钙0.03％，色氨酸0.5％，余量为水；控制发酵罐发酵条件为：温度为37℃，发酵罐转速为150r/min，DO值为30％，罐压为0.03Mpa，培养18h，向发酵罐中补加氨水，使其pH维持在7.5直至发酵结束，继续发酵12h得到发酵液；
(4)发酵后处理
将发酵液加热至80℃，保持15min，冷却至室温即可，得到灌装液。
通过平板计数法测得灌装液中活菌数含量为3×1010CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为130mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为99％。
实施例3：
(1)摇瓶培养
取斜面保存的枯草芽孢杆菌8-32，用接种环将菌种接种于摇瓶培养基中，摇瓶培养基由如下质量份数的组分组成：葡萄糖3.5％，黄豆饼粉3.5％，氯化铁0.02％，硫酸镁0.02％，氯化钙0.02％，余量为水；将摇瓶置于振荡培养箱中，培养温度为35℃，转速为180r/min，培养20h，得到摇瓶种子液；
(2)种子罐发酵
将摇瓶种子液按体积比8％接种于种子培养基中，种子培养基由如下质量份数的组分组成：酵母浸粉3.5％，蛋白胨3.5％，氯化钠0.02％，硫酸镁0.02％，氯化钙0.02％，余量为水；控制种子罐发酵条件：温度为35℃，种子罐转速为250r/min，DO值为50％，罐压为0.04Mpa，培养20h，得到种子液；
(3)发酵罐发酵
将种子液按体积比8％接种于发酵培养基中，发酵培养基由如下质量份数的组分组成：玉米粉3.5％，黄豆饼粉3.5％，磷酸二氢钾0.02％，硫酸镁0.02％，氯化钙0.02％，色氨酸0.35％，余量为水；控制发酵条件为：温度为35℃，发酵罐转速为250r/min，DO值为50％，罐压为0.04Mpa，培养20h，向发酵罐中补加葡萄糖，使葡萄糖的质量浓度维持在1％直至发酵结束，继续发酵8h得到发酵液；
(4)发酵后处理
将发酵液pH值调整至5.5即可，得到灌装液。
通过平板计数法测得灌装液中活菌数含量为2.5×1010CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为180mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为99.8％。
实施例4：
步骤(1)～(3)同实施例3，步骤(4)中，将发酵液pH值调整至6.0。
通过平板计数法测得灌装液中活菌数含量为2.8×1010CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为175mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为99.6％。
对比例1：
采用枯草芽孢杆菌N-11，其余条件同实施例2。
发酵后平板计数法测得灌装液中活菌数含量为7.8×109CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为15mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为97％。
对比例2：
步骤(1)～(2)同实施例3。
(3)发酵罐发酵
将种子液按体积比8％接种于LB培养基中，控制发酵条件为：温度为30℃，发酵罐转速为140r/min，DO值为25％，罐压为0.02Mpa，培养24h。
步骤(4)同实施例3。
发酵后平板计数法测得灌装液中活菌数含量为2.3×109CFU/mL，采用Salkowski比色方法测得灌装液中吲哚乙酸含量为42.13mg/L，通过显微镜检测方法测得灌装液中芽孢含量为93％。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河北冀微生物技术有限公司
河北农业大学
<120> 枯草芽孢杆菌及高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggcgggcg tgctatacat gcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttaggagcca gccgccgaag 1440
gtggaccaga ag 1452

Claims (6)

1.一种高产吲哚乙酸、高芽孢形成率的发酵方法，其特征在于，采用枯草芽孢杆菌8-32进行发酵，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：
将枯草芽孢杆菌8-32接种于摇瓶培养基中培养，得到摇瓶种子液；
其中，培养温度为30～37℃，转速为150～200r/min，培养时间为18～24h；
(2)种子罐发酵：
将摇瓶种子液按体积比5～10％接种于种子培养基中发酵，得到种子液；
其中，发酵温度为30～37℃，转速为150～300r/min，DO值为30～80％，罐压为0.03～0.05Mpa，发酵时间为16～24h；
(3)发酵罐发酵：
将种子液按体积比5～10％接种于发酵培养基中发酵；
其中，发酵温度为30～37℃，转速为150～300r/min，DO值为30～80％，罐压为0.03～0.05Mpa，发酵时间为16～18h；之后补料发酵6～12h得到发酵液；
(4)发酵后处理：
将发酵液加热至50～80℃，保持15～60min，冷却至室温；或将发酵液pH值调整至5.5～6.0即可；
所述枯草芽孢杆菌8-32，于2020年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.20824。
2.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述补料发酵的具体操作为：
向发酵罐中添加葡萄糖使其质量浓度维持在1％直至发酵结束；或向发酵罐中添加氨水使
pH值维持在7.5～8.5直至发酵结束。
3.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)中所述摇瓶培养基和步骤(2)中
所述种子培养基均由如下质量百分比的组分组成：碳源2～5％、氮源2～5％、组分A0.01～0.03％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.01～0.03％，余量为水；
所述组分A为磷酸二氢钾、氯化铁或氯化钠中任意一种。
4.如权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：碳源2～5％、氮源2～5％、组分A 0.01～0.03％、硫酸镁0.01～0.03％、氯化钙0.01～0.03％、色氨酸0.2～0.5％，余量为水；
所述组分A为磷酸二氢钾、氯化铁或氯化钠中任意一种。
5.如权利要求3或4任一所述的发酵方法，其特征在于，所述碳源为玉米粉、酵母浸粉、麦芽糖和葡萄糖中的一种或多种的混合。
6.如权利要求3或4任一所述的发酵方法，其特征在于，所述氮源为黄豆饼粉、蛋白胨和牛肉膏中的一种或多种的混合。
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