CN104878060A - 一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵培养基及其在生产抗菌肽中的应用，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：可溶性淀粉或玉米淀粉0.5～1.5％，多价胨或牛肉膏0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，硫酸镁0.05～0.15％、碳酸钙0.005～0.015％，硫酸锰0.05～0.15％，黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。本发明提供的抗菌肽生产方法中所得到的发酵液中不仅枯草芽孢杆菌细胞数量高，而且所产生的抗菌肽效价较高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌培养基及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性细菌，在其生长过程中可产生枯草菌素、多粘菌素、短杆菌肽等抗菌肽，对肠道或植物致病菌具有明显的抑制作用，通过降低肠道环境中游离氧、促进乳酸菌等益生微生物的生长、肠道免疫调节等发挥益生作用。基于枯草芽孢杆菌所产抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，枯草芽孢杆菌所产抗菌肽被广泛应用于饲料添加剂的研究，并取得了较好的应用效果。由于微生物生产抗菌肽具有成本低、无毒害、周期短等明显优点，目前已有一些研究报道了利用液态发酵工艺来生产枯草芽孢杆菌抗菌肽的方法，其中《一种抗菌化合物的制备方法》(CN101979629A)、《一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺》(CN103966297A)等，但这些方法所用的培养基原料多为黄豆粉、葡萄糖、蛋白胨等碳源和氮源，存在生产成本高、获得的抗菌肽效价低等缺点。
黄浆水是传统豆制品(豆腐、豆腐干、腐乳、豆腐皮)等生产过程中压滤成型后排出的废水，又称乳清废水。我国大豆制品的年消费量接近1000万吨，而在大豆制品加工过程中产生的黄浆水，总量大约为豆重的5.5～7倍。黄浆水含有大量的大豆低聚糖、蛋白质和其他生长因子，豆制品加工过程中黄浆水的随意排放，不但造成了能源的大量浪费，同时还污染了环境。利用黄浆水作为培养基原料来培养微生物或生产活性物质不仅有效降低了生产的成本，同时还可以起到变废为宝的目的，提高黄浆水的工业附加值。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌培养基及其应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵培养基，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：可溶性淀粉或玉米淀粉0.5～1.5％，多价胨或牛肉膏0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，硫酸镁0.05～0.15％、碳酸钙0.005～0.015％，硫酸锰0.05～0.15％，黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。
作为优选，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：可溶性淀粉1％、多价胨0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.01％、硫酸锰0.1％、黄浆水作为余量，调节pH值为7.0～7.5，121℃灭菌20min。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的生产方法，所述方法包括如下步骤：菌种的活化、种子罐培养和发酵罐发酵；发酵罐发酵利用前述发酵培养基进行枯草芽孢杆菌的发酵培养。
进一步地，所述菌种的活化包括以下步骤：将斜面保存的枯草芽孢杆菌接种至装有BHI培养基的摇瓶中，于30～42℃，转速100～250rpm的条件下培养20～24h，得活化后的枯草芽孢杆菌。
所述BHI培养基为脑心浸液培养基(Brian Heart Infusion；BHI)：是由小牛的脑及牛的心的浸出物(Infusion)配置而成：牛脑200.0g；牛心浸出汁250.0g；蛋白胨10.0g；葡萄糖2.0g；NaCl 5.0g；琼脂20.0g；蒸馏水1000ml；pH 6.8～7.2。
进一步地，所述种子罐培养包括以下步骤：将种子培养基加入种子罐，加入量占罐总体积的50％，灭菌冷却后，将活化后的摇瓶发酵液按照种子培养基总体积的0.5％～3％进行接种，培养得到枯草芽孢杆菌菌液；所述种子培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5％、多价胨0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，其余为黄浆水。
更进一步地，种子罐培养的条件为：35～42℃，转速100～400rpm的条件下培养16～24h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
进一步地，所述发酵罐发酵包括以下步骤：将发酵培养基加入发酵罐中，加入量不超过发酵罐总体积的50％，待发酵培养基灭菌后，将种子罐培养步骤中得到的枯草芽孢杆菌菌液以3％～8％的体积比接种于前述发酵培养基的发酵罐中，在35～37℃，转速100～250rpm的条件下培养24～48h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
本发明还提供了前述发酵培养基在枯草芽孢杆菌生产抗菌肽中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明将黄浆水作为一种新的原料来生产抗菌肽，充分利用黄浆水中的低聚糖、蛋白质等成分，可大幅降低枯草芽孢杆菌抗菌肽的生产成本。本发明提供的抗菌肽生产方法中所得到的发酵液中不仅枯草芽孢杆菌细胞数量高，而且所产生的抗菌肽效价较高。
本发明解决了豆制品加工过程中黄浆水的利用问题，提高了豆制品加工业的工业附加值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(1)活化培养：将斜面中保存的芽孢杆菌接种至BHI培养基中进行活化，于30～42℃，转速100～250rpm的条件下培养20～24h，得活化后的枯草芽孢杆菌发酵液。
(2)种子罐培养：在100L发酵罐中装入50L种子培养基，将活化后的摇瓶发酵液按照种子培养基总体积的0.5％～3％进行接种，控制种子罐的发酵条件为：发酵温度为35～42℃，转速100～400rpm的条件下培养16～24h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
(3)种子培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉1.5％、多价胨1.0％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钾0.3％，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。
(4)发酵罐培养：将种子罐中的枯草芽孢杆菌菌液按照3～8％接种量(v/v)接种至发酵培养基中，发酵培养条件为：培养温度35～37℃，转速100～250rpm，接种量为1～5％(v/v)，振荡培养20～36h。
(5)所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：可溶性淀粉1％、多价胨0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.01％、硫酸锰0.1％、黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。
实施例2
(1)活化培养：将斜面中保存的芽孢杆菌接种至BHI培养基中进行活化，于30～42℃，转速100～250rpm的条件下培养20～24h，得活化后的枯草芽孢杆菌发酵液。
(2)种子罐培养：在100L发酵罐中装入50L种子培养基，将活化后的摇瓶发酵液按照种子培养基总体积的0.5％～3％进行接种，控制种子罐的发酵条件为：发酵温度为35～42℃，转速100～400rpm的条件下培养16～24h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
(3)种子培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉0.5％、多价胨0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.1％，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。
(4)发酵罐培养：将种子罐中的枯草芽孢杆菌菌液按照3～8％接种量(v/v)接种至发酵培养基中，发酵培养条件为：培养温度35～37℃，转速100～250rpm，接种量为1～5％(v/v)，振荡培养20～36h。
(5)所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：玉米淀粉0.5％，牛肉膏1.0％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.005％，硫酸锰0.15％，黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
所述种子培养基组成如下(按重量百分比)：可溶性淀粉0.8％，黄浆水作为余量，搅拌均匀，加热。黄浆水的制备：将新鲜黄浆水进行离心，取上清液作为液体培养基原料。
所述发酵培养基由以下原料组成(重量百分比)：可溶性淀粉1.5％，氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.3％，硫酸镁0.15％、碳酸钙0.015％，硫酸锰0.05％，黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。
对比例1
1、将斜面培养基中保藏的枯草芽孢杆菌，在BHI活化后，分别接种至BHI、营养肉汤以及本发明中的发酵培养基中进行培养，计算细胞数以及产生的抗菌肽效价。
2、细胞计数方法采用平板稀释法，计数培养基采用营养琼脂培养基。
3、抗菌肽活性测定方法：牛津杯法，测试菌采用单增李斯特菌54002。
4、发酵产抗菌肽培养基：
(1)营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。采用250mL三角瓶，装入50mL培养基，121℃灭菌20min，备用。
(2)BHI培养基：牛脑200.0g，牛心浸出汁250.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖2.0g,NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml,pH 6.8～7.2。采用250mL三角瓶，装入50mL培养基，121℃灭菌20min，备用。
(3)本发明发酵培养基：实施例1所制备的发酵培养基。
5、种子液的制备：将斜面保存的枯草芽孢杆菌接种至装有BHI培养基的摇瓶中，于37℃，转速250rpm的条件下培养24h，得活化后的枯草芽孢杆菌。
6、发酵产抗菌肽：将活化后的枯草芽孢杆菌菌液按照5％接种量(v/v)分别接种至营养肉汤培养基、BHI培养基以及本发明的发酵培养基中进行发酵，发酵培养条件为：发酵温度37℃，转速250rpm，振荡培养时间为20～36h。
7、细胞数量计数：将培养后的枯草芽孢杆菌菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释，选择合适的稀释度进行涂布营养琼脂平板，37℃培养24h，对平板中单菌落进行计数，见表1。
8、抗菌肽活性测定：将培养后的枯草芽孢杆菌发酵液进行10000rpm、4℃离心10min，取上清液。利用牛津杯法测试上清液中抗菌肽对单增李斯特菌54002的抑制作用，通过抑菌圈直径大小来比较培养液中抗菌肽的产量，见表1。
表1不同培养基培养枯草芽孢杆菌的细胞记数结果和所产生的抗菌肽对单增李斯特菌的抑制效果
| 细胞数(CFU/mL) | 抑菌圈直径(cm) | |
| 营养琼脂培养基 | 6.8×108 | 2.3 |
| 脑心浸液培养基 | 1.2×109 | 2.5 |
| 本发明培养基 | 2.5×109 | 2.8 |
可见，本发明提供的发酵培养基本发明提供的抗菌肽生产方法中所得到的发酵液中不仅枯草芽孢杆菌细胞数量高，而且所产生的抗菌肽效价较高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：可溶性淀粉或玉米淀粉0.5～1.5％，多价胨或牛肉膏0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，硫酸镁0.05～0.15％、碳酸钙0.005～0.015％，硫酸锰0.05～0.15％，黄浆水作为余量，调整pH值为7.0～7.5。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：可溶性淀粉1％、多价胨0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.05％、碳酸钙0.01％、硫酸锰0.1％、黄浆水作为余量。
3.一种枯草芽孢杆菌抗菌肽的生产方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：菌种的活化、种子罐培养和发酵罐发酵；发酵罐发酵利用权利要求1或2所述的培养基进行枯草芽孢杆菌的发酵培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌种的活化包括以下步骤：将斜面保存的枯草芽孢杆菌接种至装有BHI培养基的摇瓶中，于30～42℃，转速100～250rpm的条件下培养20～24h，得活化后的枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养包括以下步骤：将种子培养基加入种子罐，加入量占罐总体积的50％，灭菌冷却后，将活化后的摇瓶发酵液按照种子培养基总体积的0.5％～3％进行接种，培养得到枯草芽孢杆菌菌液；所述种子培养基由以下重量百分比的组分组成：可溶性淀粉0.5～1.5％、多价胨0～1.0％、氯化钠0～0.5％、磷酸二氢钾0～0.3％、磷酸氢二钾0～0.3％，其余为黄浆水。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，种子罐培养的条件为：35～42℃，转速100～400rpm的条件下培养16～24h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵罐发酵包括以下步骤：将发酵培养基加入发酵罐中，加入量占发酵罐总体积的50％，灭菌后将种子罐培养步骤中得到的枯草芽孢杆菌菌液以3％～8％的体积比接种于含有权利要求1或2所述培养基的发酵罐中，在35～37℃，转速100～250rpm的条件下培养24～48h，接种前起始pH值为7.0～7.5，通风量为1：0.5。
8.权利要求1或2所述的发酵培养基在枯草芽孢杆菌生产抗菌肽中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |