CN113293110A - 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 - Google Patents
一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113293110A CN113293110A CN202110618266.2A CN202110618266A CN113293110A CN 113293110 A CN113293110 A CN 113293110A CN 202110618266 A CN202110618266 A CN 202110618266A CN 113293110 A CN113293110 A CN 113293110A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- bacillus subtilis
- antibacterial lipopeptide
- peptone
- ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 57
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 57
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 35
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 3
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 3
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N Potassium ion Chemical compound [K+] NPYPAHLBTDXSSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 4
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 claims 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 abstract description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 abstract description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 4
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 3
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 2
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，解决了枯草芽孢杆菌现有发酵培养基产量低、生产成本高、抗菌脂肽类化合物提取困难等问题。本发明选用的发酵培养基在氮源选择方面采用价格低廉、添加方便的牛骨蛋白胨代替原有昂贵、黏稠的牛肉膏，有效的降低了抗菌脂肽类化合物发酵生产成本，同时加入了锰、镁等金属离子，更有利于促进枯草芽孢杆菌产孢及合成产物，显著提高了抗菌脂肽类化合物的产量以及抗菌活性的能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，特别是一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。
背景技术
近年来，随着现代化和工厂化畜禽和水产养殖的迅速发展，为抑制病害而引发的抗生素滥用现象屡禁不绝。在饲料或养殖水体中添加益生菌或者益生菌发酵代谢产生的活性物质，进而代替抗生素已成为健康养殖新的研究方向。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，能够产生耐热、抗逆的芽孢，可以在恶劣的环境中生存。抗菌脂肽类化合物是枯草芽孢杆菌通过非核糖体途径合成的小分子抗菌脂肽类化合物，具有抑菌性广、耐药性低和热稳定性高等优点。在食品领域，抗菌脂肽类化合物能作为防腐剂来改善食品的性状；在农业领域，它能够抑制植物致病菌，生防效果良好；在医药领域可用于脂肽类疫苗，用来控制细菌病原菌；在畜牧业领域常用于饲料添加剂，促进畜禽生长。此外，抗菌脂肽类化合物也是目前唯一从微生物中得到并对黄曲霉具有显著抑制作用的活性物质。
但是在现有的技术中，由枯草芽孢杆菌发酵培养基生产抗菌脂肽类化合物的活性水平比较低，且价格昂贵，这严重制约了抗菌脂肽类化合物的大规模工业化生产。因此，寻找一种可以提高产量、降低生产成本的发酵培养基和一种制备抗菌脂肽类化合物的方法是当下迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是要解决现有技术中抗菌脂肽类化合物产量低，生产成本高的问题，提供一种抗菌脂肽类化合物的制备方法。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养16-18h，得到枯草芽孢杆菌活化液，所述枯草芽孢杆菌活化液的OD600为0.8-1.0；
步骤二、将枯草芽孢杆菌活化液接种于发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌活化液的接种量为4-8％，于28-32℃，150-210r/min旋转条件下发酵培养36-60h，得到发酵液；
步骤三、将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
步骤四、调节所述发酵上清液的pH＝2，静置2-8h，离心收集沉淀；再用甲醇反复抽提，使用旋转蒸发仪干燥其抽提液，得到抗菌脂肽类化合物脂肽提取物。
优选地，所述步骤一中，所述LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2-7.4。
优选地，所述步骤二中，发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.5％-3％、金属离子化合物以金属离子计0.01％-1％，所述金属离子为锌离子、钾离子、镁离子、锰离子中的一种或多种，所述糖为葡萄糖、蔗糖、甘油中的一种或多种，所述蛋白胨为胰蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种，所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0。
优选地，所述步骤三中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为10-20min。
优选地，所述步骤四中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-15min。
优选地，所述步骤四中，使用4-8mol/L的HCl溶液调节发酵上清液的pH值。
优选地，所述步骤四中，旋转蒸发仪干燥温度为50-70℃。
优选地，所述步骤二中，枯草芽孢杆菌活化液的接种量为5％。
优选地，所述发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖1％、蛋白胨1.5％、金属离子化合物以金属离子计0.54％。
优选地，所述钾离子以磷酸氢二钾的形式添加，所述镁离子以硫酸镁的形式添加，所述锰离子以硫酸锰的形式添加。
与现有技术相比，本发明提供了一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，解决了枯草芽孢杆菌现有发酵培养基产量低、生产成本高、抗菌脂肽类化合物提取困难等问题。本发明选用的发酵培养基在氮源选择方面采用价格低廉、添加方便的牛骨蛋白胨代替原有昂贵、黏稠的牛肉膏，有效的降低了抗菌脂肽类化合物发酵生产成本，同时加入了锰、镁等金属离子，更有利于促进枯草芽孢杆菌产孢及合成产物，能快速地培养枯草芽孢杆菌，提高抗菌脂肽类化合物的产量以及抗菌活性的能力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
本发明是将枯草芽孢杆菌活化液接种于上述发酵培养基中培养，得到发酵液。本发明对具体的枯草芽孢杆菌种类没有特别限制，本领域用于生产抗菌脂肽类化合物的枯草芽孢杆菌均可。为了说明本发明发酵培养基的作用，在本发明更具体的实施方式中，所述枯草芽孢杆菌活化液优选使用保存的枯草芽孢杆菌菌株(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)经活化得到。所述接种量优选为4％-8％，更优选为5％；所述发酵培养温度优选为28-32℃，更优选为30℃；所述发酵培养振荡频率优选为150-210r/min，更优选为180r/min；所述发酵培养时间为36-60h，更优选为48h。
实施例1
按重量称取葡萄糖1％、牛骨蛋白胨1.5％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.02％、磷酸氢二钾0.5％，将上述组份依次溶解后，调节pH值为7.0，121℃灭菌20min，制备成由枯草芽孢杆菌生产抗菌脂肽类化合物的发酵培养基。
实施例2
将保存的枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养至OD600为0.8-1，得到枯草芽孢杆菌活化液。本实施例中，LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2。
实施例3(摇瓶发酵液)
将实施例2培养的枯草芽孢杆菌活化液，按5％的接种量接种于实施例1制备的发酵培养基，1L发酵摇瓶中装液量为200mL培养基，于30℃，180r/min发酵培养48h。离心取发酵上清液200μL，以副溶血性弧菌为指示菌检测上清液的抑菌直径。
实施例4(摇瓶发酵成品)
将实施例3中5个摇瓶的发酵液，经离心合并收集上清液共1L。经喷雾干燥器(蠕动泵速率为30％、风机大小为90％、进风温度为200℃)得到该枯草芽孢杆菌粉末状干品，称重并计算收率。
实施例5(发酵罐发酵液)
将实施例2培养的枯草芽孢杆菌活化液，按5％的接种量接种于实施例1制备的发酵培养基，20L发酵罐中起始培养基装量为13L，于30℃，180r/min发酵培养40h。离心取发酵上清液200μL，以副溶血性弧菌为指示菌检测上清液的抑菌直径。
实施例6(发酵罐成品)
将实施例5中的13L发酵液利用膜过滤进行固液分离，收集发酵清液，加入5％的可溶性淀粉作为载体，经喷雾干燥器(蠕动泵速率为30％、风机大小为90％、进风温度为200℃)得到该枯草芽孢杆菌粉末状干品，称重并计算收率。
实施例7
称取实施例6制备的干品40mg，溶于1mL无菌水中，取200μL溶解液，以副溶血性弧菌为指示菌检测其抑菌直径。
对比例1(对照摇瓶发酵液)
发酵培养基采用原始培养基，其余同实施例3。
原始培养基由如下质量百分比的组分组成：1.0％葡萄糖、1.5％牛肉膏、0.6％K2HPO4，调节pH值为7.0。
对比例2(对照摇瓶发酵成品)
发酵培养基采用对比例1中的原始培养基，其余同实施例4。
对比例3(对照发酵罐发酵液)
发酵培养基采用原始培养基，其余同实施例5。
对比例4(对照发酵罐成品)
干品由对比例3中的发酵液制备，其余同实施例6。
对比例5
干品由对比例3中的发酵液制备，其余同实施例7。
分别将对比例1、对比例3和对比例5与实施例3、实施例5和实施例7的发酵上清液以副溶血性弧菌为指示菌测定其抑菌圈直径大小，其检测结果如表1所示。
表1
由表1可知，三个实施例子的发酵上清液的抑菌圈直径比对应的三个对比例子提高20-30％。
再分别将对比例2和对比例4与实施例4和实施例6的制备抗菌脂肽产量和收率进行比较，结果如表2所示。
表2
由表2可知，三个实施例子的制备抗菌脂肽产量收率比对应的三个对比例子提高40-60％。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、取枯草芽孢杆菌菌株，接种于斜面LB培养基上，于30℃培养24h，挑取单菌落，接种于液体LB培养基，于30℃摇瓶培养16-18h，得到枯草芽孢杆菌活化液，所述枯草芽孢杆菌活化液的OD600为0.8-1.0；
步骤二、将枯草芽孢杆菌活化液接种于发酵培养基中，所述枯草芽孢杆菌活化液的接种量为4-8％，于28-32℃，150-210r/min旋转条件下发酵培养36-60h，得到发酵液；
步骤三、将所述发酵液离心，得到发酵上清液；
步骤四、调节所述发酵上清液的pH＝2，静置2-8h，离心收集沉淀；再用甲醇反复抽提，使用旋转蒸发仪干燥其抽提液，得到抗菌脂肽类化合物脂肽提取物。
2.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述LB培养基由如下质量百分比的组分组成：胰蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠1％，所述LB培养基的pH值为7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖0.5％-2.5％、蛋白胨0.5％-3％、金属离子化合物以金属离子计0.01％-1％，所述金属离子为锌离子、钾离子、镁离子、锰离子中的一种或多种，所述糖为葡萄糖、蔗糖、甘油中的一种或多种，所述蛋白胨为胰蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨中的一种或多种，所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0。
4.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为10-20min。
5.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，离心转速为4000-10000r/min，离心时间为5-15min。
6.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，使用4-8mol/L的HCl溶液调节发酵上清液的pH值。
7.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，旋转蒸发仪干燥温度为50-70℃。
8.根据权利要求1所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，枯草芽孢杆菌活化液的接种量为5％。
9.根据权利要求3所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基由如下质量百分比的组分组成：糖1％、蛋白胨1.5％、金属离子化合物以金属离子计0.54％。
10.根据权利要求3所述的抗菌脂肽类化合物的制备方法，其特征在于，所述钾离子以磷酸氢二钾的形式添加，所述镁离子以硫酸镁的形式添加，所述锰离子以硫酸锰的形式添加。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110618266.2A CN113293110B (zh) | 2021-06-01 | 2021-06-01 | 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110618266.2A CN113293110B (zh) | 2021-06-01 | 2021-06-01 | 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113293110A true CN113293110A (zh) | 2021-08-24 |
| CN113293110B CN113293110B (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=77327033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110618266.2A Active CN113293110B (zh) | 2021-06-01 | 2021-06-01 | 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113293110B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801186A (zh) * | 2021-10-12 | 2021-12-17 | 大连工业大学 | 一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法 |
| CN114931166A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-23 | 焦作市佰役安生物工程有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽提取物在玉米贮藏中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103757075A (zh) * | 2013-06-13 | 2014-04-30 | 江苏海华生物科技有限公司 | 一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法 |
| KR101498272B1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-03-06 | 주식회사 컬처바이오 | 김치에서 분리되고 항균물질생성 및 면역활성 효능을 가진 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제 조성물 |
| CN104878060A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-09-02 | 湖南农业大学 | 一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌培养基及其应用 |
| CN111705098A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-09-25 | 庄国宏 | 一种抗菌脂肽高效生产以及分离提取方法 |
-
2021
- 2021-06-01 CN CN202110618266.2A patent/CN113293110B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103757075A (zh) * | 2013-06-13 | 2014-04-30 | 江苏海华生物科技有限公司 | 一种大规模发酵生产枯草芽孢杆菌抗菌脂肽的方法 |
| KR101498272B1 (ko) * | 2013-10-08 | 2015-03-06 | 주식회사 컬처바이오 | 김치에서 분리되고 항균물질생성 및 면역활성 효능을 가진 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제 조성물 |
| CN104878060A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-09-02 | 湖南农业大学 | 一种生产抗菌肽的枯草芽孢杆菌培养基及其应用 |
| CN111705098A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-09-25 | 庄国宏 | 一种抗菌脂肽高效生产以及分离提取方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801186A (zh) * | 2021-10-12 | 2021-12-17 | 大连工业大学 | 一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法 |
| CN113801186B (zh) * | 2021-10-12 | 2024-05-14 | 焦作市佰役安生物工程有限公司 | 一种提取枯草芽孢杆菌发酵液中抗菌脂肽类化合物的方法 |
| CN114931166A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-08-23 | 焦作市佰役安生物工程有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌抗菌脂肽提取物在玉米贮藏中的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113293110B (zh) | 2023-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102864095B (zh) | 一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌及其使用方法 | |
| CN113293110B (zh) | 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法 | |
| CN113215031A (zh) | 一种贝莱斯芽孢杆菌19573-3及其应用 | |
| CN108998393A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其制备具有调节肠道功能的普洱茶方法 | |
| WO2020207048A1 (zh) | 一种短小芽孢杆菌抗菌活性物质的制备方法及应用 | |
| CN110468083B (zh) | 一株分离的链霉菌dl70及其生防促生应用 | |
| CN110295129B (zh) | 一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用 | |
| CN115074290B (zh) | 一种联产苯乳酸和γ-氨基丁酸的干酪乳杆菌及其应用 | |
| US20230118242A1 (en) | Novel daptomycin-producing streptomyces strain and use thereof | |
| CN111235039B (zh) | 一种用于培养高毒力金龟子绿僵菌的培养基及其制剂和应用 | |
| CN110819579A (zh) | 一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法 | |
| CN102634553B (zh) | 一种海南霉素的发酵方法 | |
| CN102286411B (zh) | 植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用 | |
| CN114806976B (zh) | 一种短乳杆菌及其抑菌物质制备方法 | |
| CN108277243B (zh) | 一种假单胞菌酸a的制备方法 | |
| CN108570422A (zh) | 一株布氏乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂 | |
| CN103710291A (zh) | 一株巨大芽孢杆菌z2013513及其生产苯基乳酸的方法 | |
| CN110669678A (zh) | 一种灰黄霉素菌种固体培养基 | |
| CN113046257B (zh) | 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法 | |
| CN113396214B (zh) | 从链霉菌属sp.mcc 0151生产尼日利亚菌素的方法 | |
| CN114231460A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌、组合物及其应用与枯草芽孢杆菌的发酵培养方法 | |
| CN113337403A (zh) | 一种球毛壳菌hjf 13菌株及其应用 | |
| CN107164438B (zh) | 一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法 | |
| CN110214852B (zh) | 一种青贮玉米饲料的发酵方法 | |
| CN107058137B (zh) | 一种渥曼青霉及其生产渥曼青霉素的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |