CN113046257B - 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法 - Google Patents

一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113046257B
CN113046257B CN201911363287.3A CN201911363287A CN113046257B CN 113046257 B CN113046257 B CN 113046257B CN 201911363287 A CN201911363287 A CN 201911363287A CN 113046257 B CN113046257 B CN 113046257B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
bacillus pumilus
culturing
culture
dissolved oxygen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911363287.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113046257A (zh
Inventor
周莉
刘华梅
刘守德
潘渝
龚永华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd
Original Assignee
Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd filed Critical Wuhan Kernel Bio Tech Co ltd
Priority to CN201911363287.3A priority Critical patent/CN113046257B/zh
Publication of CN113046257A publication Critical patent/CN113046257A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113046257B publication Critical patent/CN113046257B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法，属于微生物发酵技术领域。本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，同时在发酵后期进行降温和溶氧处理，与现有技术相比，不仅增加了短小芽孢杆菌发酵液中的活芽孢数，提升了现有发酵水平，同时又提高了发酵液中代谢产物抗菌肽和生物素IAA的含量，从而增加了发酵产物的药物活性。

Description

一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法。
背景技术
芽孢杆菌是最早应用的一种益生菌，因其广泛存在于自然界中，生长过程能产生很多抗菌活性代谢物，而且具有抗逆性强、无污染、无毒无残留、稳定性好等优势。2020年，国家将会全面禁止抗生素在饲料中的添加使用，芽孢杆菌作为替代抗生素的理想微生物制剂，具有广阔的应用前景。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为芽孢杆菌属，菌体呈细杆状，一般为0.6～0.7μm×2.0～3.0μm，革兰氏阳性，具有抗逆性强、能抑制多种病原细菌、真菌，在饲料添加剂、水产养殖、生物农药、生物腐熟剂等方面应用广泛。短小芽孢杆菌除了具备以上功能和特性外，还具有能低温生长和繁殖代谢的能力。短小芽孢杆菌在环境温度只有15℃左右时即可起到净水作用，而常规菌株需要20℃或25℃以上才能发挥作用。短小芽孢杆菌的代谢产物主要有生长素、抗菌肽、氨基酸等，其中生长素最明显的作用是促进植物的生长，同时还有促进愈伤组织形成和诱导生根的作用。抗菌肽具有抑制霉菌等真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、部分病毒的生物活性，因其广谱的抗菌能力，在饲料添加剂、生物农药等领域得到广泛应用。但是目前短小芽孢杆菌繁殖能力有限，国内短小芽孢杆菌发酵液活芽孢数在100-200亿cfu/ml，原粉活芽孢数在1000-5000亿cfu/g，很少有对发酵液和原粉中的活性物质进行研究的报道。若能提高发酵水平和代谢产物含量，将其用于生物农药和生物肥料等领域，将会有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对以上现有技术的缺陷，提供一种高产活芽孢数和代谢产物的短小芽孢杆菌发酵培养方法。
一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法，该方法包括将短小芽孢杆菌发酵培养至对数期时向培养基中加入甘氨酸的步骤。
优选地，所述甘氨酸的添加量为培养基重量的0.2-2％。
进一步优选地，所述甘氨酸的添加量为培养基重量的0.5％。
该方法还包括将短小芽孢杆菌发酵培养至90％以上的营养体形成芽孢后进行降温和/或溶氧处理，并继续培养3-8h的步骤。
优选地，所述降温和/或溶氧处理，是指将培养温度相比初始培养温度下降2-5℃，溶氧量控制在30％以上。
优选地，所述培养基为豆粕粉1-10％、D-木糖1-5％、酵母粉0.2-0.8％、玉米浆0.5-2％、玉米淀粉0.8-2％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、氯化钙0.01-0.1％、硫酸镁0.05-0.2％、氯化锰0.01-0.1％，pH 6.5-8.5。
进一步优选地，所述培养基为豆粕粉2％、D-木糖3％、酵母粉0.5％、玉米浆1.2％、玉米淀粉1.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.03％、硫酸镁0.15％、氯化锰0.02％，pH 7-7.2。
本发明进一步提供一种短小芽孢杆菌原粉，该原粉是将短小芽孢杆菌按以上所述的方法发酵培养后，将发酵液经过滤、干燥等处理制得的。
经检测，该短小芽孢杆菌原粉中含有8千亿CFU/g以上的活芽孢，400μg/g以上的抗菌肽和7.0ng/g以上的生物素IAA，与现有短小芽孢杆菌原粉相比，本发明具有更好的促进作物生长和抑菌作用。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明通过在发酵过程中添加甘氨酸，同时在发酵后期进行降温和/或溶氧处理，不仅增加了短小芽孢杆菌发酵液中的活芽孢数，提升了现有发酵水平，同时又提高了发酵液中代谢产物抗菌肽和生物素IAA的含量，从而增加了发酵产物的药物活性。
本发明减少了短小芽孢杆菌的生产成本，提高了其应用效果，具有显著的经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细地说明。应当理解，所述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
用于生产短小芽孢杆菌发酵液的菌种来源于市售菌株。发酵前先按常规方法对菌株进行活化和培养，制备种子液，具体如下：
1)菌种活化：挑取一环短小芽孢杆菌接种于液体培养基，将接种好的液体摇瓶置于30℃往复式恒温摇床中培养，转速为160rpm；将培养好的菌悬液挑取一环接种于斜面培养基，将接种好的斜面置于30℃隔水恒温培养箱中培养72h。
液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、自来水1000ml，pH7.0-7.2，混匀后121℃灭菌30min。
斜面培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠10g、琼脂粉15g、自来水1000ml，pH7.0-7.2，混匀后121℃灭菌30min。
2)种子培养：取活化好的短小芽孢杆菌接种于种子培养基，接种量1％，然后置于30℃，160rpm的往复式恒温摇床中培养7-9h。
种子培养基：豆粕粉0.8％、D-木糖1％、酵母粉0.5％、玉米浆1％、磷酸二氢钾0.1％，pH值为6.5-7.2。
实施例1
将制备好的种子液接入发酵培养基中，进行15L发酵罐发酵培养，培养温度为30℃，当培养至对数期时，向发酵培养基中加入不同种类的氨基酸，使其终浓度分别为0.5％，培养至90％以上的营养体形成芽孢后，结束培养。以未加入甘氨酸的发酵培养基为空白对照。
采用梯度稀释法测定发酵液中的活芽孢数，采用高效液相法测定发酵液中抗菌肽的含量，采用液质联用检测生物素IAA的含量，其中活芽孢数测定2次取平均值，代谢产物含量测定1次。结果见表1。
发酵培养基：豆粕粉2％、D-木糖3％、酵母粉0.5％、玉米浆1.2％、玉米淀粉1.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.03％、硫酸镁0.15％、氯化锰0.02％，pH为7.2。
表1氨基酸种类对发酵液中活芽孢数和代谢产物含量的影响
Figure BDA0002337755020000041
发酵过程中加入甘氨酸能提高发酵液中活芽孢数和代谢产物含量。
实施例2
在实施例1的基础上，向发酵培养基中分别加入不同重量的甘氨酸，使其终浓度分别为0、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、1.5％、2％，以未加入甘氨酸的发酵培养基为空白对照。发酵方法参照实施例1。发酵结束后检测活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表2。
表2甘氨酸含量对发酵液中活芽孢数和代谢产物含量的影响
Figure BDA0002337755020000042
Figure BDA0002337755020000051
从以上结果可以看出，当甘氨酸的添加量为0.2～2％时，发酵液中的活芽孢数和代谢产物含量较高。但考虑其实际生产成本，优选0.5％的添加量为最佳使用量。
实施例3
将制备好的种子液接入发酵培养基中，进行15L发酵罐发酵培养，培养温度为30℃，当培养至对数期时，向发酵培养基中加入0.5％(重量)的甘氨酸，继续培养至90％以上的营养体形成芽孢后，发酵温度不变(仍为30℃)，增加通气量以控制溶氧量为30％、50％、70％，继续培养5h。以不增加通气量不控制溶解氧的实验组为空白对照。发酵结束后检测活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表3。
表3溶氧控制对发酵液中活芽孢数和代谢产物含量的影响
Figure BDA0002337755020000052
当在发酵后期控制溶氧量超过30％时，发酵液的代谢产物含量有明显提升。当溶氧量控制为30％、50％和70％时，发酵液中的活芽孢数和代谢产物含量相当，考虑实际生产成本，优选控制30％溶氧量为最佳培养条件。
实施例4
将制备好的种子液接入发酵培养基中，进行15L发酵罐发酵培养，前期培养温度为30℃，当培养至对数期时，向发酵培养基中加入0.5％(重量)的甘氨酸，继续培养至90％以上的营养体形成芽孢后，设置发酵温度为25℃、28℃、30℃，不增加通气量控制溶解氧，继续培养5h。发酵结束后检测活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表4。
表4后期发酵温度对发酵液中活芽孢数和代谢产物含量的影响
Figure BDA0002337755020000061
从以上结果可以看出，在降温5℃以内，三组的发酵活芽孢数水平相当，均在300亿CFU/ml左右，但当温度下降超过5℃时，发酵液中代谢产物的含量明显下降。
实施例5
将制备好的种子液接入发酵培养基中，进行15L发酵罐发酵培养，前期培养温度为30℃，当培养至对数期时，向发酵培养基中加入0.5％(重量)的甘氨酸，继续培养至90％以上的营养体形成芽孢后，设置不同的培养温度和溶氧量，继续培养5h。发酵结束后检测活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表5。
(1)发酵全程30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，结束培养；
(2)发酵全程30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，不控温度和溶氧量，继续培养5h；
(3)发酵前期30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，发酵温度降至25℃，DO控制在70％左右，继续培养5h；
(4)发酵前期30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，发酵温度降至28℃，DO控制在30％左右，继续培养5h；
(5)发酵前期30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，发酵温度降至27℃，DO控制在50％左右，继续培养5h；
(6)发酵前期30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，发酵温度降至26℃，DO控制在40％左右，继续培养5h；
表5后期发酵温度和溶氧量对发酵液中活芽孢数和代谢产物含量的影响
Figure BDA0002337755020000062
Figure BDA0002337755020000071
当后期发酵温度控制在25-28℃，溶解氧控制在30％以上时，各实验组的代谢产物明显要高于不进行温度和溶解氧控制的实验组。实验表明，发酵后期同时控制温度和溶氧量是有利于代谢产物的产生，代谢产物含量提高30％以上。
实施例6
将制备好的种子液接入发酵培养基中，进行15L发酵罐发酵培养，实验组设置如下。发酵结束后检测发酵液活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表7。
(1)发酵过程中不添加甘氨酸，发酵全程30℃培养，当营养体90％以上形成芽孢后，结束培养；
(2)培养至对数期时，向发酵培养基中加入0.5％(重量)的甘氨酸，继续培养至90％以上的营养体形成芽孢后，发酵温度降至28℃，DO控制在30％左右，继续培养5h。并设置3组重复试验，验证本发明培养方法的稳定性。实验组编号分别为3、4、5组。
发酵结束后，将发酵液酸化、过滤、离心，最后喷雾干燥，获得短小芽孢杆菌原粉。检测原粉活芽孢数、抗菌肽和生物素的含量，结果见表6。
表6不同发酵方法制备原粉的结果对比
Figure BDA0002337755020000072
Figure BDA0002337755020000081
*：原粉CFU、抗菌肽、生物素检测结果的单位分别为个/g、μg/g、ng/g。
从表中结果可以看出，用本发明的发酵方法生产的发酵液和原粉的活芽孢数比用原有的发酵方法生产的发酵液和原粉的活芽孢数分别提高了39.5％和62.1％，芽孢数有显著的提升。发酵液中抗菌肽和生物素含量也比用原有发酵方法均提高了50％以上。由于发酵液经过后处理工艺后，抗菌肽和生物素损失较大，但是采用本发明生产的原粉，其抗菌肽和生物素的含量比用原有发酵方法生产的原粉的活性物质含量要提高20％以上，活芽孢数提高了60％以上。采用本发明生产的短小芽孢杆菌原粉，发酵结果的稳定性较好，活芽孢数达到了8千亿CFU/g以上，抗菌肽含量达到400μg/g以上，生物素达到了7.0ng/g以上。

Claims (2)

1.一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法，其特征在于：包括将短小芽孢杆菌发酵培养至对数期时向培养基中加入甘氨酸的步骤，所述甘氨酸的添加量为培养基重量的0.5％；
还包括将短小芽孢杆菌发酵培养至90％以上的营养体形成芽孢后进行降温和/或溶氧处理，并继续培养3-8h的步骤，所述降温和/或溶氧处理，是指将培养温度相比初始培养温度下降2-5℃，溶氧量控制在30％以上，
所述培养基为豆粕粉1-10％、D-木糖1-5％、酵母粉0.2-0.8％、玉米浆0.5-2％、玉米淀粉0.8-2％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、氯化钙0.01-0.1％、硫酸镁0.05-0.2％、氯化锰0.01-0.1％，pH 6.5-8.5，
该方法用于增加短小芽孢杆菌发酵液中的活芽孢数和代谢产物抗菌肽和生物素IAA的含量。
2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌发酵培养方法，其特征在于：所述培养基为：豆粕粉2％、D-木糖3％、酵母粉0.5％、玉米浆1.2％、玉米淀粉1.5％、磷酸二氢钾0.1％、氯化钙0.03％、硫酸镁0.15％、氯化锰0.02％，pH7-7.2。
CN201911363287.3A 2019-12-26 2019-12-26 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法 Active CN113046257B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363287.3A CN113046257B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911363287.3A CN113046257B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113046257A CN113046257A (zh) 2021-06-29
CN113046257B true CN113046257B (zh) 2023-04-28

Family

ID=76505268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911363287.3A Active CN113046257B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113046257B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117025464A (zh) * 2023-06-02 2023-11-10 江苏海洋大学 一种微生物生根剂及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109804061A (zh) * 2016-10-07 2019-05-24 出光兴产株式会社 产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109804061A (zh) * 2016-10-07 2019-05-24 出光兴产株式会社 产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillus subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45;C. Leifert等;《Journal of Applied Bacteriology》;19951231;第78卷;第97-108页 *
嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及热稳定性改造;李祝;《博士电子期刊库》;20181215(第12期);第1-110页 *
石斑鱼原籍短小芽孢杆菌SE5液体发酵条件优化研究;王杰;《万方学位论文库》;20190823;第1-71页 *
菌根辅助细菌短小芽孢杆菌HR10扩繁条件优化;林司曦等;《森林资源培育》;20151231;第29卷(第1期);第46-48页 *
陈红等.第10章核酸与核苷类药物.《生物制药工艺学》.成都：电子科技大学出版社,2018,第175页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113046257A (zh) 2021-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105524866B (zh) 提高凝结芽孢杆菌出芽率及l-乳酸产量的发酵方法
CN110295129B (zh) 一种用于防治黄瓜灰霉病和白粉病的生防菌及应用
CN105524867A (zh) 一种植物乳杆菌及其在天然牧草青贮中的应用
CN107981034A (zh) 一株布氏乳杆菌hew-a666及其应用
CN111248409A (zh) 一种低盐豆瓣酱发酵方法
CN111394280A (zh) 一种适合地衣芽孢杆菌生长的培养基及其应用
CN105907661A (zh) 一种枯草芽胞杆菌的工业发酵方法
CN109182397B (zh) 一种提高罗伊氏菌素产量的方法
CN110819579A (zh) 一种固态枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法
CN113046257B (zh) 一种短小芽孢杆菌的发酵培养方法
CN113046253B (zh) 一种提高马克斯克鲁维酵母耐热性的培养方法
CN102943101A (zh) 一种发酵生产恩拉霉素的方法
CN113293110A (zh) 一种抗菌脂肽类化合物的制备方法
CN104620861A (zh) 利用桑枝种植金针菇的方法
CN111748486A (zh) 一种芽孢杆菌培养基
CN110964676A (zh) 一种侧孢短芽孢杆菌的高菌量发酵液的培养方法
CN108277243B (zh) 一种假单胞菌酸a的制备方法
CN116622547A (zh) 一株莫海威芽孢杆菌yl-78及其应用
CN102787153A (zh) 微生物发酵补料生产恩拉霉素的方法
CN1579197A (zh) 菌糠单细胞蛋白饲料生产方法
CN102329747A (zh) 木糖葡萄球菌a2的高密度培养的培养基及培养方法
CN116355771A (zh) 具有抑菌功能的酵母蛋白及其制备方法
CN113598270A (zh) 一种菊花叶微生物发酵饲料的制备方法
CN107164438B (zh) 一种提高短短芽孢杆菌细菌素生产水平的发酵方法
CN104962498A (zh) 一种乳酸链球菌的发酵培养基及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant