CN109804061A - 产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法 - Google Patents

产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供能够高效地生产芽孢的新培养方法，提供一种产芽孢细菌的培养方法，其将抑制芽孢形成的物质添加到培养基后培养产芽孢细菌，其特征在于，所述培养基的碳的含量为9.1g/L以上，优选提供还包括在所述培养基中添加促芽孢形成物质的工序的产芽孢细菌的培养方法。

Description

产芽孢细菌的培养方法和有用物质的制造方法
技术领域
本发明涉及产芽孢细菌的培养方法。
背景技术
芽孢杆菌属等产芽孢细菌被用于酶、有用物质的生产、发酵食品的生产、有机物的分解、整肠剂、微生物农药、微生物肥料等各种领域。
作为整肠剂、微生物农药、微生物肥料利用产芽孢细菌时，需要将活着的菌体作为有效成分加入到产品中，但一般而言是利用耐久力优异的芽孢状态的菌体。因此，正在寻求更高效地生产芽孢的方法。
产芽孢细菌通过被放置到适于增殖的环境而增殖，通过被放置到适于芽孢形成的环境而在营养细胞中形成芽孢。芽孢的数目不可能超过原本的营养细胞的数目，因此对于芽孢的生产率提高而言，存在以下的至少2个方面，即，营养细胞的培养生产率的提高、和自营养细胞的芽孢形成率的提高。
适于增殖的环境是指，即对于该菌株而言，增殖所需的营养成分充分，且水分量、浸透压、温度、pH、氧浓度等处于能够增殖的范围内。
另外，在酶、有用物质的生产中，正在寻求更高效地生产目标代谢物的方法。对于酶、有用物质的生产率提高而言，存在以下的至少2个方面，即，向高生产目标物质的代谢状态的诱导、和长时间维持该状态。
以往，营养细胞的培养生产率提高、高生产代谢物的代谢状态的维持，是通过上述的各种条件的最适化、特别是培养基组成的改良和其浓度的提高来达成。
关于芽孢杆菌属细菌的高生产芽孢的技术，例如如非专利文献1～3中所例示地存在大量报道，但均使用了改良培养基的组成、浓度的方法。它们中的非专利文献3是报道了最高生产率的一篇，但根据该文献，每1L培养基中使用的糖的量为约100g/L(包括补料的量)，使用了包含非常高浓度的糖的培养基。但是，若将浓度提高到更高，则培养装置的氧供给能力赶不上氧需求量的增大、或者营养成分在培养基中长期残留，因此产生芽孢形成率降低、或者培养所需要的时间变得长期化等弊病。另外，糖等营养成分本身为高浓度时，存在表现出增殖抑制作用的可能性。此外，培养中的营养细胞浓度提高时，因检测自身浓度并切换代谢的机理“群体效应”而启动芽孢形成诱导，因此会产生无论使营养成分变得多浓，营养细胞也不会增殖到一定水平以上的现象。
如上所示，使添加到培养基中的营养成分的浓度变浓来提高培养生产率的以往方法存在极限。
另一方面，专利文献1中公开了如下的方法，即，通过在营养细胞的增殖后使溶存氧浓度降低来进行芽孢形成的方法。另外，专利文献2中公开了如下的方法，即，通过在将碳源消耗殆尽后继续长时间的培养来形成芽孢的方法。另外，专利文献3中公开了如下的方法，即，通过规定培养液的磷酸盐浓度的范围、以及作为培养条件的氧供给量、搅拌速度的范围来生产芽孢的方法。但是，这些技术均是赋予适于营养细胞形成芽孢时的条件的技术，而不是有助于对于从根本上提高芽孢的生产率而言必须的“营养细胞的高浓度增殖”的技术。
另外，非专利文献4中示出，通过使用使增殖抑制浓度为更低浓度的抗生素可以抑制芽孢杆菌属细菌培养中的芽孢化、通过向其中加入德夸菌素可消除芽孢化的抑制效果。但是非专利文献4中使用的低浓度的培养基(葡萄糖浓度1％、培养基中的碳含量4.0g/L)中显示出，所形成的芽孢的浓度依赖于所添加的抗生素的浓度地降低，从而不能说是能够有助于芽孢的高生产的技术。
关于利用芽孢杆菌属细菌的有用物质生产技术，例如专利文献4～5所例示地报道了很多，但均是记载了改良培养基组成、培养条件的方法。但是如前所述，由于氧需求量的增大、营养成分所致的增殖抑制、群体效应所致的芽孢形成诱导等，使培养基成分的浓度变浓来提高培养生产率的方法存在极限。
另外，该专利文献中记载了通过转化体、突变来获得高生产目标代谢物的菌株的方法，但由于改变了野生型菌株的遗传性状，因此存在其他有用的性质丧失、或变弱的可能性。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-236286号公报
专利文献2：日本特开2000-217567号公报
专利文献3：日本特开2007-195542号公报
专利文献4：日本专利第3635638号
专利文献5：日本专利第4338080号
非专利文献
非专利文献1：Biotechnology progress 2005，21，4，1026-1031
非专利文献2：Curr Microbiol 2013，66，279-285
非专利文献3：Advances in Microbiology 2014，4，444-454
非专利文献4：Journal of General Microbiology 1983，129，3709-3720
发明内容
发明要解决的课题
如上所述，通过提高培养基浓度来使产芽孢细菌的芽孢生产率、代谢物等有用物质的生产率提高的以往方法存在极限，本发明的课题在于提供通过利用新的途径使培养中的营养细胞增殖效率提高，由此能够高效地生产芽孢、代谢物等有用物质的新型培养方法。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过使用以高浓度包含碳源的培养基，在抑制芽孢形成的物质的存在下使营养细胞增殖，然后诱导芽孢形成，由此与未添加抑制芽孢形成的物质的情况相比，大幅提高了芽孢、代谢物等有用物质的生产率，从而完成了本发明。
本发明如下所示。
[1]一种产芽孢细菌的培养方法，其特征在于，包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳含量为9.1g/L以上。
[2]根据[1]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为酶抑制剂。
[3]根据[1]或[2]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质为选自林可霉素、红霉素、利福平、氯霉素、链霉素、咖啡因、咖啡酸、放线菌素、夫西地酸、脂霉素、嘌呤霉素、壮观霉素、四环素、硫链丝菌素中的一种以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为对所述产芽孢细菌抑制增殖的浓度以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述抑制芽孢形成的物质的浓度为15ppm以下。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其包括在所述培养基添加促芽孢形成物质的工序。
[7]根据[6]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，从培养开始起5小时～70小时后向培养基中添加所述促芽孢形成物质。
[8]根据[6]或[7]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为核酸碱基类似物、有机酸、氨基酸、铵化合物、硝酸化合物、亚硝酸化合物或矿物质。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质为选自德夸菌素、咪唑立宾、麦考酚、6-氮尿嘧啶、乳酸及其盐、乙酸及其盐、丁酸及其盐、锰、铵、钙、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、乳酸铵、乙酸铵中的一种以上。
[10]根据[6]～[9]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述促芽孢形成物质以10ppm～10，000ppm的浓度被添加到培养基中。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，所述产芽孢细菌为芽孢杆菌属细菌。
[12]根据[11]所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，芽孢杆菌属细菌选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、pichinotyi芽孢杆菌(Bacillus pichinotyi)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、好碱芽孢杆菌(Bacillus alkalicola)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、环庚烷芽孢杆菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢杆菌(Bacillus migulanus)、深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis)、潮间带芽孢杆菌(Bacillus aestuarii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中。
[13]一种有用物质的制造方法，其特征在于，使用[1]～[12]中任一项所述的培养方法来生成有用物质。
[14]根据[13]所述的有用物质的制造方法，其中，所述有用物质为所述产芽孢细菌的芽孢。
[15]根据[13]所述的有用物质的制造方法，其中，所述有用物质为所述产芽孢细菌的代谢物。
[16]根据[15]所述的制造方法，其中，所述代谢物为环状脂肽。
[17]根据[16]所述的制造方法，其中，所述环状脂肽为选自伊枯草菌素(ィシリン)、表面活性肽(サ一フアクチン)、制磷脂菌素(プリパスタチン)、丰原素(フエンジシン)、杆菌霉素(バシロマィシン)、地衣素(リチエニシン)、库尔斯塔克素(クルスタキン)、抗霉枯草菌素(マィコサブチリン)、粘杆菌素(コリスチン)、杀镰孢菌素(フザリシジン)、类芽孢杆菌素(パエニバクテリン)、多粘菌素(ポリミキシン)和短小酸素(ピユミラシジン)中的至少一种。
发明效果
产芽孢细菌因营养成分枯竭的感知、群体效应，将代谢从营养细胞状态下的增殖转换到芽孢形成。本发明的方法中，不依赖于培养基浓度提高这种以往的方法，通过抑制朝向芽孢形成的代谢切换，来保持比通常更长的营养增殖的期间，结果可以得到更高的营养细胞浓度和代谢物浓度。通过在该基础上进行促芽孢形成物质的添加、抑制物质的除去、或者充分地确保长的培养期间，由此能够形成芽孢、并最终从根本上提高芽孢生产率、代谢物等有用物质的生产率。
具体实施方式
本发明的产芽孢细菌的培养方法的特征在于，包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳含量为9.1g/L以上。
通过使用本发明的产芽孢细菌的培养方法，由此能够以良好的生产率得到产芽孢细菌的芽孢、代谢物等有用物质。
本发明中，产芽孢细菌的种类没有特别限制，可例示芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌(パエニバチルス属細菌)、土芽孢杆菌属细菌、梭菌属、芽孢八迭球菌属。
作为芽孢杆菌属细菌，只要是被分类为芽孢杆菌属的细菌，则没有特别限制，例如可举出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、单纯芽孢杆菌(Bacillus simplex)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvci)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilluae)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、暹罗芽孢杆菌(Bacillus ssiamensis)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、pichinotyi芽孢杆菌(Bacillus pichinotyi)、嗜酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、好碱芽孢杆菌(Bacillus alkalicola)、产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、巴达维亚芽孢杆菌(Bacillus bataviensis)、环庚烷芽孢杆菌(Bacillus cycloheptanicus)、解硫胺素芽孢杆菌(Bacillus aneurinilyticus)、米氏芽孢杆菌(Bacillus migulanus)、深海芽孢杆菌(Bacillus abyssalis)、潮间带芽孢杆菌(Bacillus aestuarii)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
作为类芽孢杆菌属细菌，可举出浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)、淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)、Paenibacillus peoriate、Paenibacillus elgii等。
作为土芽孢杆菌属细菌，可举出热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、Geobacillus caldoxylosilyticus、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophil us)等。
作为梭菌属细菌，可举出丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、克鲁维氏梭菌(Clostridium kluyveri)、丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、氨基丁酸梭菌(Clostridium aminobutyricum)、拜氏梭杆菌(Clostridium beijerinckii)、糖多丁醇乙酸梭杆菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)、热纤梭杆菌(Clostridium thermocellum)、杨氏梭杆菌(Clostridium ljungdahlii)、肉毒梭杆菌(Clostridium botulinum)等。
作为芽孢八迭球菌属细菌，可举出巴氏芽孢八叠球菌属(Sporosarcinapasteurii)、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、Sporosarcina psychrophila、耐热芽孢八叠球菌(Sporosarcina thermotolerans)等。
芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌可以为非基因重组细菌，也可以为基因重组细菌，但优选为不包含抗生素耐性基因的细菌。
本发明中，有用物质是指，显示出动植物生长促进作用、灭菌/抑菌作用、基因活化作用等生理活性的物质、各种酶、乳酸、氨基酸等能够在产业上活用的物质、作为纳豆、酸奶等食品等使用的发酵物本身，具体地可举出产芽孢菌的芽孢、芽孢杆菌属细菌的代谢物。芽孢杆菌属细菌的代谢物为通过培养产生的活菌以外的有效成分，可举出具有抗菌性、表面活性作用的环状肽、蛋白酶、脂肪酶等酶。
关于作为芽孢杆菌属细菌的代谢物的环状脂肽，可举出选自伊枯草菌素(Iturin)、表面活性肽(Surfactin)、制磷脂菌素(plipastatin)、丰原素(Fengycin)、杆菌霉素(bacillomycin)、地衣素、库尔斯塔克素(kurstakin)、抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)、粘杆菌素(Colistin)、杀镰孢菌素(Fusaricidin)、类芽孢杆菌素(Paenibacterin)、多粘菌素(Polymixin)和短小酸素(Pumilacidin)中的至少一种。
培养中使用的液体培养基包含碳源和氮源，作为芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌能够分解代谢的碳源，可例示芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌能够分解代谢的糖(淀粉、葡萄糖、乳糖、甘油、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、果糖、甘露糖、肌醇、甘露醇、山梨糖醇、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇等)或者糖源原料、醇、有机酸、有机酸盐、烷烃或其他一般的碳源，作为芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌能够分解代谢的氮源，可例示来源于大豆的成分、来源于酵母的成分、来源于玉米的成分、动植物蛋白质及其分解物、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵等铵盐、氨、硝酸钠、硝酸钾、谷氨酸钠、尿素等。
本发明中使用的液体培养基中，碳含量为9.1g/L以上，优选为10.2g/L以上，更优选为15g/L以上。进一步优选为18g/L以上。
需要说明的是，培养基成分中的天然系原料的碳含量可以分别以总糖量的40％重量和总蛋白质量的50％重量估算。总糖量可以在酸中在100℃进行水解2.5小时后，利用绍莫吉法以还原糖浓度定量。总蛋白质量可以通过先利用凯氏定氮法对总氮量定量后，乘以换算系数6.25来估算。
培养基的碳源浓度低时，伴随碳源的枯竭而开始形成芽孢。此时，若添加抑制(延缓)芽孢形成的物质，则营养细胞状态的菌体长期暴露在营养成分枯竭下。因此，与不添加抑制芽孢形成的物质时相比，营养细胞的死亡提早，结果是其培养生产率降低(可认为非专利文献4属于该情况)。另一方面，在培养基的碳源浓度充分高时，伴随营养细胞的增殖，因群体效应等而开始形成芽孢。此时，若添加抑制芽孢形成的物质，则营养增殖期间与不添加抑制芽孢形成的物质时相比变得更长。通常，营养细胞大幅超过因群体效应等而芽孢化的菌体密度地进行增殖，结果是菌体、代谢物的培养生产率提高。
另一方面，液体培养基中的碳含量的上限没有特别限制，例如碳含量优选为100g/L以下，更优选为72g/L以下。
本发明中，优选培养中使用C/N比(碳含量与氮含量的重量比)为3～12的液体培养基。
C/N比如下所示地算出。
C/N比＝各培养基成分中含有的碳含量的合计÷各培养基成分中含有的氮含量的合计。
作为其他培养基成分，只要不对芽孢形成、目标代谢物的生产率造成不良影响，则可以添加芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的培养中通常使用的微量金属盐等培养基成分，可以根据需要还添加氨基酸或维生素等。
本发明的方法中，在培养基中添加芽孢形成抑制(延缓)物质并培养产芽孢细菌。作为抑制芽孢形成的物质，只要是可以抑制芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的芽孢形成的物质即可，可举出酶抑制剂，具体地可以利用林可霉素、红霉素、利福平、氯霉素、链霉素、咖啡因、咖啡酸、放线菌素、夫西地酸、脂霉素(リピアマィシン)、嘌呤霉素、壮观霉素、四环素、硫链丝菌素。
这些中的大多数在某一浓度下显示出营养细胞的增殖抑制效果，但在与该浓度相比以极低的浓度使用时，可不显示出对营养细胞增殖的抑制效果地抑制芽孢形成。
本发明的方法中，添加到培养基的抑制芽孢形成的物质的浓度，优选为针对上述产芽孢细菌的增殖抑制浓度以下，例如优选为15ppm以下，更优选为10ppm以下。另一方面，关于浓度的下限，只要是能够发挥出抑制形成芽孢的作用的浓度即可，但优选为0.01ppm以上。
例如林可霉素优选为0.05～15ppm。进一步优选为0.05～1ppm，更优选为0.05～0.75ppm。红霉素优选为0.05～lppm，利福平优选为5～10ppm，氯霉素优选为0.1～2ppm，链霉素优选为5～15ppm，咖啡因优选为5～10ppm，咖啡酸优选为5～10ppm，放线菌素优选为0.1～10ppm，夫西地酸优选为0.1～10ppm，脂霉素优选为0.1～10ppm，嘌呤霉素优选为0.1～10ppm，壮观霉素优选为0.1～10ppm，四环素优选为0.1～10ppm，硫链丝菌素优选为0.1～10ppm。
抑制芽孢形成的物质可以从培养开始时就包含在培养基中，也可以在培养过程中添加。在培养过程中添加时，例如优选从培养开始至0～10小时之间进行添加。
在添加了抑制芽孢形成的物质的状态下，优选将芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌培养到菌体浓度为高浓度，例如1×108/ml以上，具体地优选培养5～80小时。
需要说明的是，也存在以下的情况，即，能够通过在存在抑制芽孢形成的物质的条件下长期进行培养，而促进芽孢形成的情况。例如林可霉素的情况下，通过添加0.05～0.5ppm、培养40～80小时，由此能够促进芽孢形成。氯霉素的情况下，通过添加0.1～0.5ppm、培养40～80小时，由此能够促进芽孢形成。红霉素的情况下，通过添加0.05～0.2ppm、培养40～80小时，由此能够促进芽孢形成。
本发明的方法中，可以在存在抑制芽孢形成的物质的条件下高浓度地培养营养细胞后，进行添加芽孢形成促进剂的操作。由此，能够促进芽孢形成。
在此，作为促芽孢形成物质，只要是能够促进芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的芽孢形成的物质即可，但可举出核酸碱基类似物、有机酸、氨基酸、铵化合物、硝酸化合物、亚硝酸化合物、矿物质等。更具体地可例示德夸菌素、咪唑立宾、麦考酚、6-氮尿嘧啶、乳酸及其盐、乙酸及其盐、丁酸及其盐、锰、铵、钙、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、乳酸铵、乙酸铵。
促芽孢形成物质在营养细胞的增殖中或增殖后进行添加是有效的，因此，优选在菌体浓度为1×108/ml以上时添加，例如优选在存在抑制芽孢形成的物质的条件下培养5～70小时后进行添加，例如期望从培养开始至5～70小时后进行添加。
而且，通过在添加了促芽孢形成物质的状态例如进行10～30小时的培养，由此可以得到高浓度的芽孢。
关于促芽孢形成物质的浓度，例如德夸菌素优选为10～1,000ppm，咪唑立宾优选为10～1,000ppm，麦考酚优选为10～1,000ppm，6-氮尿嘧啶优选为10～1,000ppm，乳酸优选为500～10,000ppm，乙酸优选为500～10,000ppm，丁酸优选为500～10,000ppm，锰优选为100～1,000ppm，铵优选为500～10,000ppm，钙优选为100～1,000ppm，丙氨酸优选为500～10,000ppm，精氨酸优选为500～10,000ppm，天冬酰胺优选为500～10,000ppm，天冬氨酸优选为500～10,000ppm，半胱氨酸优选为500～10,000ppm，谷氨酰胺优选为500～10,000ppm，谷氨酸优选为500～10,000ppm，甘氨酸优选为500～10,000ppm，组氨酸优选为500～10,000ppm，异亮氨酸优选为500～10,000ppm，亮氨酸优选为500～10,000ppm，赖氨酸优选为500～10,000ppm，蛋氨酸优选为500～10,000ppm，苯丙氨酸优选为500～10,000ppm，脯氨酸优选为500～10,000ppm，丝氨酸优选为500～10,000ppm，苏氨酸优选为500～10,000ppm，色氨酸优选为500～10,000ppm，酪氨酸优选为500～10,000ppm，缬氨酸优选为500～10,000ppm。
关于其他培养容器、培养基组成、浓度、温度、pH、氧浓度等各种条件，只要是通常的芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的液体培养中使用的条件即可，例如可例示在20～40℃在好氧条件(例如氧浓度15～50％)下边搅拌边进行培养的条件。培养基的pH优选6.5～8.5，更优选7.0～8.0。
如此地可得到高芽孢化率(例如50％以上、优选80％以上)的芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的菌体、芽孢杆菌属细菌的代谢物。这样的高芽孢化率的芽孢杆菌属细菌等产芽孢细菌的菌体、芽孢杆菌属细菌的代谢物可以在适宜进行培养基的浓缩或除去、干燥等操作的基础上用于期望的目的。
以下举出实施例来具体地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
(实施例1)
<通过抑制芽孢形成带来的高浓度增殖(枯草芽孢杆菌)>
使用500mL三角烧瓶(带挡板)，分别制成各100ml的表1中记载的培养基，进行高压反应釜灭菌。需要说明的是，为了避免美拉德反应，葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合。
需要说明的是，培养基成分中的葡萄糖、脱脂大豆粉、玉米浸渍液、酵母提取物的碳含量分别以总糖量的40％重量和总蛋白质量的50％重量算出。总糖量在酸中在100℃水解2.5小时后，利用绍莫吉法以还原糖浓度定量。总蛋白质量先通过凯氏定氮法定量总氮量后，乘以换算系数6.25来算出。
【表1】
表l培养基组成
按照表2中的记载设定试验区。依照各试验区的条件，将过滤器灭菌后的抑制芽孢形成的物质的水溶液无菌地添加到培养基中。从在普通琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳进行接种后，在30℃以150rpm振荡培养64小时。
对于所得到的培养液，用灭菌水稀释到10倍，然后使用光学显微镜和细菌用细胞计测器，计测菌体浓度(营养细胞和芽孢)和芽孢形成率(芽孢浓度÷菌体浓度)。结果示出于表2。
【表2】
试验结果
表2试验结果
林可霉素浓度为0.1ppm的试验区中，未观察到对芽孢形成的抑制效果，但lppm的试验区中，观察到对芽孢形成的抑制效果。另一方面，菌体浓度显示出随着林可霉素浓度而增高的倾向。
同样地，红霉素浓度为0.1ppm的试验区中，未观察到对芽孢形成的抑制效果，但1ppm的试验区中，观察到对芽孢形成的抑制效果。另外，菌体浓度显示出随着红霉素浓度而增高的倾向。
另外，链霉素浓度为12.5ppm的试验区中，未观察到对芽孢形成的抑制效果，但15.0ppm的试验区中，观察到对芽孢形成的抑制效果。另一方面，菌体浓度显示出随着链霉素浓度而增高的倾向。
(实施例2)
<基于芽孢形成抑制的营养细胞的高浓度增殖、和基于芽孢形成诱导的芽孢高生产(枯草芽孢杆菌)>
使用500mL三角烧瓶(带挡板)，分别制成各100ml的表1中记载的培养基，进行高压反应釜灭菌。需要说明的是，为了避免美拉德反应，葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合。
按照表3中的记载设定试验区。依照各试验区的条件，将过滤器灭菌后的抑制芽孢形成的物质的水溶液无菌地添加到培养基中。依照各试验区的条件，从在普通琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600的菌落取1铂耳进行接种后，在30℃以150rpm进行振荡培养。
从培养开始经过16小时后，依照各试验区的条件添加促芽孢形成物质，然后继续培养。从培养开始经过45小时后，停止培养。
对于所得到的培养液，用灭菌水稀释到10倍，然后使用光学显微镜和细菌用细胞计测器，计测菌体浓度(营养细胞和芽孢)和芽孢形成率(芽孢浓度÷菌体浓度)。结果示出于表3。
【表3】
表3试验结果
林可霉素浓度为0.3ppm的试验区中，未观察到对芽孢形成的抑制效果，但0.5ppm以上的试验区中，观察到对芽孢形成的抑制效果。另一方面，菌体浓度显示出随着林可霉素浓度而增高的倾向。
在添加乳酸铵作为芽孢形成物质的试验区中，与林可霉素浓度无关地，与无添加时相比，均在芽孢形成率方面观察到改善。特别是在林可霉素浓度为0.3ppm和0.5ppm且添加了乳酸铵的试验区中，与无添加的试验区相比，芽孢的生产率均大幅提高。
在林可霉素浓度为0.5ppm且添加了乙酸铵的试验区中，观察到菌体浓度和芽孢形成率随着乙酸铵的添加量而增加的倾向。与无添加的试验区相比，芽孢的生产率均大幅提高。
氯霉素浓度为1.4ppm的试验区中，观察到对芽孢形成的抑制效果，但在加入氯霉素、且在过程中添加了德夸菌素的区中，在芽孢形成率方面观察到改善，与无添加的试验区相比，芽孢的生产率均提高了。
(实施例3)
<基于芽孢形成抑制的营养细胞的高浓度增殖、和芽孢高生产(苏云金芽孢杆菌)>
使用500mL三角烧瓶(带挡板)，分别制成各100ml的表1中记载的培养基，进行高压反应釜灭菌。需要说明的是，为了避免美拉德反应，葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合。
按照表4中的记载设定试验区。依照各试验区的条件，将过滤器灭菌后的抑制芽孢形成的物质的水溶液无菌地添加到培养基中。依照各试验区的条件，从在普通琼脂培养基上生长的苏云金芽孢杆菌NBRC 101235株的菌落取1铂耳进行接种后，在30℃以150rpm进行40小时振荡培养。
对于所得到的培养液，用灭菌水稀释到10倍，然后使用光学显微镜和细菌用细胞计测器，计测菌体浓度(营养细胞和芽孢)和芽孢形成率(芽孢浓度÷菌体浓度)。结果表示于表4。
【表4】
表4试验结果
林可霉素浓度为12.5ppm时观察到对芽孢形成的抑制效果。另一方面，为10.0ppm以下的试验区中显示出菌体浓度和芽孢浓度增高的倾向。
氯霉素浓度为6.0ppm时观察到对增殖和芽孢形成的抑制效果。另一方面，在为2.0ppm的试验区中显示出菌体浓度和芽孢浓度增高的倾向。
红霉素浓度为0.1ppm时观察到对芽孢形成的抑制效果。另一方面，在0.05ppm的试验区中显示出菌体浓度和芽孢浓度增高的倾向。
通过加入一定量的抗生素来提高菌体浓度、并以充分时间(40小时)进行培养，由此能够在不加入芽孢化促进物质的情况下提高芽孢的生产率。
(实施例4)
<基于芽孢形成抑制的表面活性肽的高生产(枯草芽孢杆菌)>
使用500mL三角烧瓶(带挡板)，分别制成各100ml的表5中记载的培养基，进行高压反应釜灭菌。需要说明的是，为了避免美拉德反应，葡萄糖在另外灭菌的基础上无菌地进行混合。
按照表6中的记载设定试验区。依照各试验区的条件，将过滤器灭菌后的抑制芽孢形成的物质的水溶液无菌地添加到培养基中。依照各试验区的条件，从在普通琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌MBI-600株的菌落取1铂耳进行接种后，在30℃以150rpm进行振荡培养。
【表5】
表5培养基组成
从培养开始经过50小时后，停止培养。
对于所得到的培养液，使用冷却离心机(公司TOMYSEIKO MX-307)，进行10,000rpm、20℃、30分钟离心分离，回收上清。
向固相提取柱(日本Waters公司Oasis HLB 3cc(400mg)LP ExtractionCartridge)加入含有0.1％TFA的乙腈3mL，使其过柱后加入含有0.1％TFA的蒸馏水3mL，并使其过柱。加入回收的培养液离心上清2mL，使其过柱，依次过柱含有0.1％TFA的蒸馏水6mL、含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(20∶80，v/v)3mL，从而进行清洗。接着，过柱含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90：10，v/v)3mL，回收洗脱液。以使回收液达到4mL的方式加入含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90∶10，v/v)，利用以下的条件进行HPLC分析。
HPLC：Agilent Technologies公司1260Infinity
柱：日本Waters公司XBridge C18 5μm 4.6x 250mm
移动相：A：含有0.1％TFA的蒸馏水、B：含有0.1％TFA的乙腈
0～5分钟 A 80％/B 20％
5～25分钟 A 80％/B 20％→B 100％
25～30分钟 B 100％
30～40分钟 A 80％/B 20％
流量：1mL/分钟
温度：40℃
检测：UV205nm
注入量：20μL
标样：Surfactin Sodium Salt(和光纯药工业公司)
浓度：30ppm、120ppm
溶剂：含有0.1％TFA的乙腈/蒸馏水(90：10，v/v)
对于在洗脱时间27.6分钟和28.4分钟检测到的峰面积，根据与标样的比较算出培养液中的表面活性肽浓度。
结果示出于表6。
【表6】
表6试验结果
红霉素浓度为0.1ppm和0.2ppm时，显示出芽孢浓度和表面活性肽浓度增高的倾向。
通过加入一定量的抗生素，由此不仅能够提高芽孢的生产率，也能够提高作为有用物质的表面活性肽的生产率。

Claims (17)

1.一种产芽孢细菌的培养方法，其特征在于，
包括在培养基中添加抑制芽孢形成的物质后培养产芽孢细菌的工序，所述培养基的碳源的含量为9.1g/L以上。
2.根据权利要求1所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述抑制芽孢形成的物质为酶抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述抑制芽孢形成的物质为选自林可霉素、红霉素、利福平、氯霉素、链霉素、咖啡因、咖啡酸、放线菌素、夫西地酸、脂霉素、嘌呤霉素、壮观霉素、四环素、硫链丝菌素中的一种以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述抑制芽孢形成的物质的浓度为对所述产芽孢细菌抑制增殖的浓度以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述抑制芽孢形成的物质的浓度为15ppm以下。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其包括在所述培养基添加促芽孢形成物质的工序。
7.根据权利要求6所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
从培养开始起5小时～70小时后向培养基中添加所述促芽孢形成物质。
8.根据权利要求6或7所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述促芽孢形成物质为核酸碱基类似物、有机酸、氨基酸、铵化合物、硝酸化合物、亚硝酸化合物或矿物质。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述促芽孢形成物质为选自德夸菌素、咪唑立宾、麦考酚、6-氮尿嘧啶、乳酸及其盐、乙酸及其盐、丁酸及其盐、锰、铵、钙、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、乳酸铵、乙酸铵中的一种以上。
10.根据权利要求6～9中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述促芽孢形成物质以10ppm～10,000ppm的浓度被添加到培养基中。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
所述产芽孢细菌为芽孢杆菌属细菌。
12.根据权利要求11所述的产芽孢细菌的培养方法，其中，
芽孢杆菌属细菌为选自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、单纯芽孢杆菌Bacillus simplex、迟缓芽孢杆菌Bacillus lentus、侧孢芽孢杆菌Bacillus laterosporus、蜂房芽孢杆菌Bacillus alvei、日本甲虫芽孢杆菌Bacillus popilliae、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、短芽孢杆菌Bacillus brevis、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus、嗜碱芽孢杆菌Bacillus alcalophilus、凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans、环状芽孢杆菌Bacillus circulans、暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis、灿烂芽孢杆菌Bacillus lautus、克劳氏芽孢杆菌Bacillus clausii、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、坚强芽孢杆菌Bacillus firmus、贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis、pichinotyi芽孢杆菌Bacillus pichinotyi、嗜酸热芽孢杆菌Bacillus acidocaldarius、好碱芽孢杆菌Bacillus alkalicola、产氮芽孢杆菌Bacillus azotoformans、炭疽芽孢杆菌Bacillus anthracis、栗褐芽孢杆菌Bacillus badius、巴达维亚芽孢杆菌Bacillus bataviensis、环庚烷芽孢杆菌Bacillus cycloheptanicus、解硫胺素芽孢杆菌Bacillus aneurinilyticus、米氏芽孢杆菌Bacillus migulanus、深海芽孢杆菌Bacillus abyssalis、潮间带芽孢杆菌Bacillus aestuarii、多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa、和芽孢杆菌属Bacillus sp.中的芽孢杆菌属细菌。
13.一种有用物质的制造方法，其特征在于，
使用权利要求1～12中任一项所述的培养方法来生成有用物质。
14.根据权利要求13所述的有用物质的制造方法，其中，
所述有用物质为所述产芽孢细菌的芽孢。
15.根据权利要求13所述的有用物质的制造方法，其中，
所述有用物质为所述产芽孢细菌的代谢物。
16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，
所述代谢物为环状脂肽。
17.根据权利要求16所述的制造方法，其中，
所述环状脂肽为选自伊枯草菌素、表面活性肽、制磷脂菌素、丰原素、杆菌霉素、地衣素、库尔斯塔克素、抗霉枯草菌素、粘杆菌素、杀镰孢菌素、类芽孢杆菌素、多粘菌素和短小酸素中的至少一种。
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