JP2000217567A - バチルス属細菌の芽胞化方法 - Google Patents
バチルス属細菌の芽胞化方法Info
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
- Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 芽胞化されたバチルス属細菌を高濃度で得ら
れる方法を提供し、この方法により得られた芽胞を用い
た、より有用性の高い飼料や添加剤を提供する。 【解決手段】 １〜５重量％のコーンスティープリカー
及び炭素源を含有する培地において、バチルス属細菌を
炭素源が消費し尽くされるまで培養し、その後２４〜７
２時間通気することを特徴とするバチルス属細菌の芽胞
化方法及びこの方法により得られた芽胞を含有する飼
料。
れる方法を提供し、この方法により得られた芽胞を用い
た、より有用性の高い飼料や添加剤を提供する。 【解決手段】 １〜５重量％のコーンスティープリカー
及び炭素源を含有する培地において、バチルス属細菌を
炭素源が消費し尽くされるまで培養し、その後２４〜７
２時間通気することを特徴とするバチルス属細菌の芽胞
化方法及びこの方法により得られた芽胞を含有する飼
料。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バチルス属細菌の
芽胞化方法、並びにこの方法により得られるバチルス属
細菌を含有する動物又は魚介類用の飼料及び魚介類の養
殖場への添加剤に関する。
芽胞化方法、並びにこの方法により得られるバチルス属
細菌を含有する動物又は魚介類用の飼料及び魚介類の養
殖場への添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】バチルス属細菌は動物への整腸作用、成
長促進作用等を有することが報告されている。このた
め、バチルス属細菌を家畜や家禽の飼料に配合する試み
がなされている。本出願人も、バチルス属細菌の感染症
予防治療効果を既に確認しており、これを魚介類用の飼
料として配合することを試みている。このとき、飼料中
の菌数が多いほど、高いバチルス属細菌の効果が得られ
るが、飼料製造時の加熱工程や製造後の流通時におい
て、生菌数が減ってしまうという問題があった。
長促進作用等を有することが報告されている。このた
め、バチルス属細菌を家畜や家禽の飼料に配合する試み
がなされている。本出願人も、バチルス属細菌の感染症
予防治療効果を既に確認しており、これを魚介類用の飼
料として配合することを試みている。このとき、飼料中
の菌数が多いほど、高いバチルス属細菌の効果が得られ
るが、飼料製造時の加熱工程や製造後の流通時におい
て、生菌数が減ってしまうという問題があった。
【０００３】また、本出願人らは水溶性タンパク質を資
化する能力を有するバチルス属細菌が、魚介類の養殖場
等における硫化物の発生を抑制することを見出し、これ
を特許出願している（ＷＯ９８／４５４０２）。しか
し、この硫化物発生抑制剤も上記と同様に生菌数維持が
困難なものである。
化する能力を有するバチルス属細菌が、魚介類の養殖場
等における硫化物の発生を抑制することを見出し、これ
を特許出願している（ＷＯ９８／４５４０２）。しか
し、この硫化物発生抑制剤も上記と同様に生菌数維持が
困難なものである。
【０００４】バチルス属細菌の生菌数維持のためには、
芽胞を形成させ安定化を図ることが望ましい。
芽胞を形成させ安定化を図ることが望ましい。
【０００５】バチルス属細菌を芽胞化させる方法や、芽
胞を含有する飼料に関しては、数種の報告がある。例え
ば、特開昭４８−７５７２０号公報には、バチルス・セ
レウスの芽胞を有効成分とする動物用下痢治療剤が開示
されている。また、特開昭４８−７５７２０号公報に
は、４６ppm以上のＭｇイオン及び０．６ppm以上の銅イ
オンを含有する培地でバチルス・セレウスを培養し、培
養物から芽胞を採取する細菌芽胞の採取方法が開示され
ている。
胞を含有する飼料に関しては、数種の報告がある。例え
ば、特開昭４８−７５７２０号公報には、バチルス・セ
レウスの芽胞を有効成分とする動物用下痢治療剤が開示
されている。また、特開昭４８−７５７２０号公報に
は、４６ppm以上のＭｇイオン及び０．６ppm以上の銅イ
オンを含有する培地でバチルス・セレウスを培養し、培
養物から芽胞を採取する細菌芽胞の採取方法が開示され
ている。
【０００６】しかしながら、細菌の増殖は、栄養分を多
く与えることが必要である一方、芽胞化は栄養分を不足
させることが必要であり、上記の公報記載の方法でも高
濃度のバチルス属細菌芽胞を調製することは困難であっ
た。すなわち、バチルス属細菌濃度として、多くとも１
×１０8cfu／ml、芽胞化率として７０％程度を達成する
のが限界であった。
く与えることが必要である一方、芽胞化は栄養分を不足
させることが必要であり、上記の公報記載の方法でも高
濃度のバチルス属細菌芽胞を調製することは困難であっ
た。すなわち、バチルス属細菌濃度として、多くとも１
×１０8cfu／ml、芽胞化率として７０％程度を達成する
のが限界であった。
【０００７】また、バチルス属細菌の株によっては、上
記のような技術を用いても芽胞化が不充分なものもあ
る。このため、より広範囲の株に適用し得る芽胞化方法
の開発が要求されている。
記のような技術を用いても芽胞化が不充分なものもあ
る。このため、より広範囲の株に適用し得る芽胞化方法
の開発が要求されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、芽胞化されたバチルス属細菌を高濃度で得られる方
法を提供し、この方法により得られた芽胞を用いた、よ
り有用性の高い飼料や添加剤を提供することにある。
は、芽胞化されたバチルス属細菌を高濃度で得られる方
法を提供し、この方法により得られた芽胞を用いた、よ
り有用性の高い飼料や添加剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】斯かる実状に鑑み本発明
者は鋭意研究を行った結果、一定濃度のコーンスティー
プリカー及び炭素源を含有する培地でバチルス属細菌を
培養し、炭素源が消費し尽くされた後一定時間通気すれ
ば、芽胞化したバチルス属細菌が高濃度で得られること
を見出し本発明を完成した。
者は鋭意研究を行った結果、一定濃度のコーンスティー
プリカー及び炭素源を含有する培地でバチルス属細菌を
培養し、炭素源が消費し尽くされた後一定時間通気すれ
ば、芽胞化したバチルス属細菌が高濃度で得られること
を見出し本発明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、１〜５重量％のコーン
スティープリカー及び炭素源を含有する培地において、
バチルス属細菌を炭素源が消費し尽くされるまで培養
し、その後２４〜７２時間通気することを特徴とするバ
チルス属細菌の芽胞化方法を提供するものである。
スティープリカー及び炭素源を含有する培地において、
バチルス属細菌を炭素源が消費し尽くされるまで培養
し、その後２４〜７２時間通気することを特徴とするバ
チルス属細菌の芽胞化方法を提供するものである。
【００１１】また本発明は、該芽胞化方法により得られ
たバチルス属細菌を含有する動物又は魚介類の飼料を提
供するものである。
たバチルス属細菌を含有する動物又は魚介類の飼料を提
供するものである。
【００１２】更に本発明は、該芽胞化方法により得られ
たバチルス属細菌を含有する魚介類の養殖場への添加剤
を提供するものである。
たバチルス属細菌を含有する魚介類の養殖場への添加剤
を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明が適用し得るバチルス属細
菌は特に限定されないが、バチルス・パミルス（Bacill
us pumils）、バチルス・レンタス（Bacillus lentu
s）、バチルス・ラテロスポルス（Bacillus laterospor
us）、バチルス・アルベイ（Bacillus alvei）が優れた
作用を有するため好ましく、特にバチルス・パミルス及
びバチルス・レンタスが最も好ましい。また、飼料や各
種の製剤等にこれを応用する場合にも、上記のような各
種の作用を有する菌株を用いることが好ましく、特に、
ＷＯ９８／４５４０２に開示されているバチルス・パミ
ルスＡ−１株及びＡ−４株、バチルス・レンタスＡ−２
株及びＡ−３株を用いれば、魚介類の養殖場等における
硫化物の発生を抑制でき好ましい。
菌は特に限定されないが、バチルス・パミルス（Bacill
us pumils）、バチルス・レンタス（Bacillus lentu
s）、バチルス・ラテロスポルス（Bacillus laterospor
us）、バチルス・アルベイ（Bacillus alvei）が優れた
作用を有するため好ましく、特にバチルス・パミルス及
びバチルス・レンタスが最も好ましい。また、飼料や各
種の製剤等にこれを応用する場合にも、上記のような各
種の作用を有する菌株を用いることが好ましく、特に、
ＷＯ９８／４５４０２に開示されているバチルス・パミ
ルスＡ−１株及びＡ−４株、バチルス・レンタスＡ−２
株及びＡ−３株を用いれば、魚介類の養殖場等における
硫化物の発生を抑制でき好ましい。
【００１４】本発明方法において、バチルス属細菌の培
養に用いる培地成分としては、窒素源としてのコーンス
ティープリカー（以下「ＣＳＬ」という）及び糖類等の
炭素源が必須である。すなわち、ＣＳＬの添加はバチル
ス属細菌の増殖と芽胞化を促進し、炭素源の添加はバチ
ルス属細菌の増殖を促進するため必要である。
養に用いる培地成分としては、窒素源としてのコーンス
ティープリカー（以下「ＣＳＬ」という）及び糖類等の
炭素源が必須である。すなわち、ＣＳＬの添加はバチル
ス属細菌の増殖と芽胞化を促進し、炭素源の添加はバチ
ルス属細菌の増殖を促進するため必要である。
【００１５】ＣＳＬは、市販のものもしくはＣＳＬ原液
を処理して得たものを用いることができる。ＣＳＬは、
培地に多量に添加しすぎると集菌時等にＣＳＬの沈殿が
生じることがあり、後に飼料調製等を行う場合、雑菌汚
染や作業性の悪化という問題が生じることがある。他
方、ＣＳＬの添加量が少なすぎるとバチルス属細菌の増
殖および芽胞化が促進されない。従ってＣＳＬの添加量
は、培地中１〜５重量％とすることが好ましく、特に１
〜３重量％とすることが好ましい。
を処理して得たものを用いることができる。ＣＳＬは、
培地に多量に添加しすぎると集菌時等にＣＳＬの沈殿が
生じることがあり、後に飼料調製等を行う場合、雑菌汚
染や作業性の悪化という問題が生じることがある。他
方、ＣＳＬの添加量が少なすぎるとバチルス属細菌の増
殖および芽胞化が促進されない。従ってＣＳＬの添加量
は、培地中１〜５重量％とすることが好ましく、特に１
〜３重量％とすることが好ましい。
【００１６】また、ＣＳＬとしては、不溶物を除去した
ものを用いれば、バチルス属細菌の芽胞化を更に促進で
きるので好ましい。
ものを用いれば、バチルス属細菌の芽胞化を更に促進で
きるので好ましい。
【００１７】不溶物の除去方法としては、ＣＳＬをアル
カリで処理し、遠心後上清を回収する方法や、ＣＳＬに
クエン酸を添加して、その後、ＣＳＬを微アルカリに戻
し、遠心後上清を回収する方法が挙げられる。このと
き、不溶物の除去量および処理ＣＳＬの添加量は、菌の
増殖や芽胞化、集菌時の作業性等に影響することもある
ため、除去量としては、ＣＳＬ由来の不溶物を乾物重量
でＣＳＬ全量の３重量％乃至１０重量％、特に４重量％
乃至７重量％除去することが好ましく、添加量として
は、不溶物を除去したＣＳＬの上清を１重量％乃至５重
量％添加することが好ましい。すなわち、除去量が少な
く添加量が多いと飼料等製造時の作業性（遠心回収、濃
縮液の生残性）が悪くなり、除去量が多く添加量が少な
いと培養時の菌体増殖や芽胞化が促進されがたいのであ
る。また、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、アンモニア水等をいずれを用いてもよ
く、ＣＳＬ溶液のpHをおおよそ６．５〜８．０程度まで
上昇させることにより、不溶物の除去を効率よく行うこ
とが可能となる。このとき、pHが高すぎると、その後の
培養時における菌体の増殖・芽胞化が抑制され、低すぎ
ると上清に不溶物が多く含まれてしまうため、遠心分離
時などに菌体に混入し、雑菌汚染等の原因となってしま
う。
カリで処理し、遠心後上清を回収する方法や、ＣＳＬに
クエン酸を添加して、その後、ＣＳＬを微アルカリに戻
し、遠心後上清を回収する方法が挙げられる。このと
き、不溶物の除去量および処理ＣＳＬの添加量は、菌の
増殖や芽胞化、集菌時の作業性等に影響することもある
ため、除去量としては、ＣＳＬ由来の不溶物を乾物重量
でＣＳＬ全量の３重量％乃至１０重量％、特に４重量％
乃至７重量％除去することが好ましく、添加量として
は、不溶物を除去したＣＳＬの上清を１重量％乃至５重
量％添加することが好ましい。すなわち、除去量が少な
く添加量が多いと飼料等製造時の作業性（遠心回収、濃
縮液の生残性）が悪くなり、除去量が多く添加量が少な
いと培養時の菌体増殖や芽胞化が促進されがたいのであ
る。また、アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、アンモニア水等をいずれを用いてもよ
く、ＣＳＬ溶液のpHをおおよそ６．５〜８．０程度まで
上昇させることにより、不溶物の除去を効率よく行うこ
とが可能となる。このとき、pHが高すぎると、その後の
培養時における菌体の増殖・芽胞化が抑制され、低すぎ
ると上清に不溶物が多く含まれてしまうため、遠心分離
時などに菌体に混入し、雑菌汚染等の原因となってしま
う。
【００１８】不溶物の除去されたＣＳＬ（以下処理ＣＳ
Ｌと略す）を調製する手段は、より詳細にはまず、ＣＳ
Ｌの原液に蒸留水を添加し希釈を行った後、アルカリを
添加してpH６．５程度に調整する。次いで、この溶液か
ら遠心分離により上清を回収すれば処理ＣＳＬが調製で
きる。また、ＣＳＬの原液をクエン酸処理、アルカリ処
理、加熱処理した後、遠心分離して上清を回収すること
でも調製できる。
Ｌと略す）を調製する手段は、より詳細にはまず、ＣＳ
Ｌの原液に蒸留水を添加し希釈を行った後、アルカリを
添加してpH６．５程度に調整する。次いで、この溶液か
ら遠心分離により上清を回収すれば処理ＣＳＬが調製で
きる。また、ＣＳＬの原液をクエン酸処理、アルカリ処
理、加熱処理した後、遠心分離して上清を回収すること
でも調製できる。
【００１９】一方、培地中に添加する炭素源としては、
バチルス属細菌が資化しうるものであれば、いずれも使
用可能であるが、増殖の促進や芽胞化促進等の理由から
グルコース、ラクトース、ガラクトース、マルトース等
の糖類が好ましく、特にグルコース、ラクトースが好ま
しい。ここで、炭素源の添加量は、バチルス属細菌培養
時の菌濃度が最大となる時点において消費し尽くされる
程度がよい。すなわち、菌の芽胞化を行うためには、培
地中の炭素源が全て消費し尽くされた後に一定時間通気
する必要があり、その際バチルス属細菌が死滅期にいる
と、菌体の活性、保存性等の点から好ましくないからで
ある。このような炭素源の添加量の目安として具体例を
挙げると、グルコースの場合１．５乃至２．０重量％と
することが好ましい。
バチルス属細菌が資化しうるものであれば、いずれも使
用可能であるが、増殖の促進や芽胞化促進等の理由から
グルコース、ラクトース、ガラクトース、マルトース等
の糖類が好ましく、特にグルコース、ラクトースが好ま
しい。ここで、炭素源の添加量は、バチルス属細菌培養
時の菌濃度が最大となる時点において消費し尽くされる
程度がよい。すなわち、菌の芽胞化を行うためには、培
地中の炭素源が全て消費し尽くされた後に一定時間通気
する必要があり、その際バチルス属細菌が死滅期にいる
と、菌体の活性、保存性等の点から好ましくないからで
ある。このような炭素源の添加量の目安として具体例を
挙げると、グルコースの場合１．５乃至２．０重量％と
することが好ましい。
【００２０】本発明の培地には、更に、増殖をより促進
させるためイースト（酵母）エキスを添加することが好
ましい。イーストエキスを使用することにより、バチル
ス属細菌培養時の増殖がより活発となるためである。し
かしながら、イーストエキスを過剰に添加すると、バチ
ルス属細菌の芽胞化能が低下してしまうため、添加濃度
は、０．０５重量％〜２．５重量％程度とすることが好
ましく、特に０．１重量％〜０．３重量％程度とするこ
とが好ましい。
させるためイースト（酵母）エキスを添加することが好
ましい。イーストエキスを使用することにより、バチル
ス属細菌培養時の増殖がより活発となるためである。し
かしながら、イーストエキスを過剰に添加すると、バチ
ルス属細菌の芽胞化能が低下してしまうため、添加濃度
は、０．０５重量％〜２．５重量％程度とすることが好
ましく、特に０．１重量％〜０．３重量％程度とするこ
とが好ましい。
【００２１】上記の成分を含有する培地にて、バチルス
属細菌を高濃度に芽胞化させる際には、培養時のpHを調
節することが望ましい。すなわち、初発pHを８．０程度
とし、培養時はバチルス属細菌の酸生成により低下する
pHをＮａＯＨ等のアルカリで７．５〜８．０程度に中和
することが望ましい。
属細菌を高濃度に芽胞化させる際には、培養時のpHを調
節することが望ましい。すなわち、初発pHを８．０程度
とし、培養時はバチルス属細菌の酸生成により低下する
pHをＮａＯＨ等のアルカリで７．５〜８．０程度に中和
することが望ましい。
【００２２】また、芽胞化を促進するため、バチルス属
細菌が炭素源を消費し尽くした後に、２４〜７２時間、
好ましくは２４〜４８時間の通気を行う必要がある。２
４時間未満では十分な芽胞形成が達成されない場合があ
り、７２時間を超えると芽胞が細胞から遊離してしまい
菌体の回収が困難になる場合があるためである。また、
このとき、通気の時間が上記の範囲外でも芽胞化可能な
菌株を用いる場合には、適宜通気時間を設定してもよ
い。ここで通気は攪拌しながら行うことが好ましい。
細菌が炭素源を消費し尽くした後に、２４〜７２時間、
好ましくは２４〜４８時間の通気を行う必要がある。２
４時間未満では十分な芽胞形成が達成されない場合があ
り、７２時間を超えると芽胞が細胞から遊離してしまい
菌体の回収が困難になる場合があるためである。また、
このとき、通気の時間が上記の範囲外でも芽胞化可能な
菌株を用いる場合には、適宜通気時間を設定してもよ
い。ここで通気は攪拌しながら行うことが好ましい。
【００２３】このようにして調製されたバチルス属細菌
芽胞を用いれば、集菌等の工程における生残率が高く、
雑菌汚染の可能性の低い、高濃度に菌体を含有する飼料
や製剤等を製造することができる。
芽胞を用いれば、集菌等の工程における生残率が高く、
雑菌汚染の可能性の低い、高濃度に菌体を含有する飼料
や製剤等を製造することができる。
【００２４】本発明により得られるバチルス属細菌を飼
料として用いる場合には、バチルス属細菌そのままでも
よいが、通常養殖に用いられる飼料原料、例えば、魚
粉、小麦粉、無機塩等を混合又は配合することが好まし
い。
料として用いる場合には、バチルス属細菌そのままでも
よいが、通常養殖に用いられる飼料原料、例えば、魚
粉、小麦粉、無機塩等を混合又は配合することが好まし
い。
【００２５】また、養殖場等への添加剤として用いる場
合、硫化物発生抑制剤、環境改善剤、異臭発生抑制剤等
様々な用途に使用可能である。例えば魚介類の養殖場に
おける硫化物の発生抑制剤として用いる場合には、上記
のようにして培養した培養液から遠心分離等の手段で菌
体を回収し、５０％の人工海水に懸濁後、化成岩等に固
定化することが好ましい。
合、硫化物発生抑制剤、環境改善剤、異臭発生抑制剤等
様々な用途に使用可能である。例えば魚介類の養殖場に
おける硫化物の発生抑制剤として用いる場合には、上記
のようにして培養した培養液から遠心分離等の手段で菌
体を回収し、５０％の人工海水に懸濁後、化成岩等に固
定化することが好ましい。
【００２６】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、「％」は重量％を示す。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、「％」は重量％を示す。
【００２７】試験例１ 窒素源の検討 培地中の窒素源の種類がバチルス属細菌の増殖に及ぼす
影響を検討した。 １．菌株：バチルス・パミルスＡ−１株及びバチルス・
レンタスＡ−２株を用いた。 ２．培地：下記処方のSpirizen培地に炭素源としてグル
コース０．５重量％を添加し、更に窒素源としてイース
トエキス（アサヒビール株式会社製）、ＣＳＬ（サンエ
イ糖化製）、醤油抽出残渣アミノ酸液（味の素株式会社
製）、魚肉エキスカルチベータ（焼津水産化学社製）、
ポリペプトン（和光純薬社製）をそれぞれ０．２重量％
添加して培地を調製し、増殖を比較した。
影響を検討した。 １．菌株：バチルス・パミルスＡ−１株及びバチルス・
レンタスＡ−２株を用いた。 ２．培地：下記処方のSpirizen培地に炭素源としてグル
コース０．５重量％を添加し、更に窒素源としてイース
トエキス（アサヒビール株式会社製）、ＣＳＬ（サンエ
イ糖化製）、醤油抽出残渣アミノ酸液（味の素株式会社
製）、魚肉エキスカルチベータ（焼津水産化学社製）、
ポリペプトン（和光純薬社製）をそれぞれ０．２重量％
添加して培地を調製し、増殖を比較した。
【００２８】
【表１】
【００２９】３．培養方法：５００ml坂口フラスコを用
い、振盪培養を行った。このとき、培養条件は培地量１
００ml、菌株接種量０．４％、培養温度２５℃、振盪回
数１１６stroke／minとした。
い、振盪培養を行った。このとき、培養条件は培地量１
００ml、菌株接種量０．４％、培養温度２５℃、振盪回
数１１６stroke／minとした。
【００３０】４．結果：結果を図１及び図２に示す。Ａ
−１株は培養２４時間目でfull growth（グルコースを
全て消費）に達し、その時の生菌数はイーストエキス添
加培地が５．４×１０9／mlで最も高く、次いでＣＳＬ
の３．２×１０9／mlであった。一方、Ａ−２株は培養
４８時間目でfull growthに達し、その時の生菌数はイ
ーストエキス添加培地が４．５×１０7／mlで最も高
く、次いでＣＳＬの４．０×１０7／mlであった。
−１株は培養２４時間目でfull growth（グルコースを
全て消費）に達し、その時の生菌数はイーストエキス添
加培地が５．４×１０9／mlで最も高く、次いでＣＳＬ
の３．２×１０9／mlであった。一方、Ａ−２株は培養
４８時間目でfull growthに達し、その時の生菌数はイ
ーストエキス添加培地が４．５×１０7／mlで最も高
く、次いでＣＳＬの４．０×１０7／mlであった。
【００３１】試験例２ イーストエキスとＣＳＬとの増
殖の比較 試験例１において増殖性の良好であったイーストエキス
及びＣＳＬの培地組成濃度を増量し、バチルス属細菌の
増殖性への影響を検討した。また、このときバチルス属
細菌の芽胞化についても検討した。培地はグルコースを
１．０％、イーストエキス及びＣＳＬをそれぞれ１．０
％とし、その他の条件は試験例１と同様に培養を行っ
た。その結果、Ａ−１株は培養２４時間目でfull growt
hに達し、その時の生菌数はイーストエキスが８．３×
１０9／ml、ＣＳＬが６．０×１０9／mlであった。一
方、Ａ−２株は培養４８時間目でfull growthに達し、
その時の生菌数はイーストエキスが２．０×１０9／ml
で最も高く、次いでＣＳＬの１．１×１０9／mlであっ
た（図３、４）。また、full growth 後の培養液に通気
を継続し（Ａ−１株４８時間、Ａ−２株２４時間）、こ
れを顕微鏡観察し、その芽胞化率を判定した。ＣＳＬ添
加培地では、ほとんどのバチルス属細菌が芽胞化されて
いたが、イーストエキス添加培地では芽胞は認められな
かった。
殖の比較 試験例１において増殖性の良好であったイーストエキス
及びＣＳＬの培地組成濃度を増量し、バチルス属細菌の
増殖性への影響を検討した。また、このときバチルス属
細菌の芽胞化についても検討した。培地はグルコースを
１．０％、イーストエキス及びＣＳＬをそれぞれ１．０
％とし、その他の条件は試験例１と同様に培養を行っ
た。その結果、Ａ−１株は培養２４時間目でfull growt
hに達し、その時の生菌数はイーストエキスが８．３×
１０9／ml、ＣＳＬが６．０×１０9／mlであった。一
方、Ａ−２株は培養４８時間目でfull growthに達し、
その時の生菌数はイーストエキスが２．０×１０9／ml
で最も高く、次いでＣＳＬの１．１×１０9／mlであっ
た（図３、４）。また、full growth 後の培養液に通気
を継続し（Ａ−１株４８時間、Ａ−２株２４時間）、こ
れを顕微鏡観察し、その芽胞化率を判定した。ＣＳＬ添
加培地では、ほとんどのバチルス属細菌が芽胞化されて
いたが、イーストエキス添加培地では芽胞は認められな
かった。
【００３２】製造例１ 処理ＣＳＬの製造 以下のように処理ＣＳＬの製造を行った。まず、ＣＳＬ
（サンエイ糖化製、pH３．５）１kgに対して蒸留水６０
０mlを添加して希釈した。これを５Ｎ ＮａＯＨでpH
６．５に調整（５Ｎ ＮａＯＨを約３２０ml使用）し、
２Ｌにメスアップした。次いで、遠心分離機により沈殿
物を除去し、上清を回収し、処理ＣＳＬとした。このと
き、回収上清液量は約１９００ml、沈殿量は乾物重量で
約６５ｇであった（乾燥条件：１０５℃、８時間）。
（サンエイ糖化製、pH３．５）１kgに対して蒸留水６０
０mlを添加して希釈した。これを５Ｎ ＮａＯＨでpH
６．５に調整（５Ｎ ＮａＯＨを約３２０ml使用）し、
２Ｌにメスアップした。次いで、遠心分離機により沈殿
物を除去し、上清を回収し、処理ＣＳＬとした。このと
き、回収上清液量は約１９００ml、沈殿量は乾物重量で
約６５ｇであった（乾燥条件：１０５℃、８時間）。
【００３３】製造例２ 処理ＣＳＬの製造 クエン酸を使った製造 ＣＳＬ（サンエイ糖化製、pH３．５）１kgに対してクエ
ン酸１００ｇを添加して攪拌後、５Ｎ ＮａＯＨでpH
７．０に調整する（５Ｎ ＮａＯＨ約６５０ml使用）。
２Ｌにメスアップ後、７０℃で４５分間加熱処理を行
い、冷却後、遠心分離にて上清を回収すると、約５０％
濃度のＣＳＬ処理液が得られた。
ン酸１００ｇを添加して攪拌後、５Ｎ ＮａＯＨでpH
７．０に調整する（５Ｎ ＮａＯＨ約６５０ml使用）。
２Ｌにメスアップ後、７０℃で４５分間加熱処理を行
い、冷却後、遠心分離にて上清を回収すると、約５０％
濃度のＣＳＬ処理液が得られた。
【００３４】試験例３ ＣＳＬと処理ＣＳＬの比較（図
５） ＣＳＬ（サンエイ糖化製）及び製造例１の処理ＣＳＬを
用い、バチルス属細菌の増殖性を比較した。菌株として
バチルス・パミルスＡ−２株を用い、グルコース濃度は
１．５％とし、ＣＳＬ及び処理ＣＳＬ濃度は図５に示す
各種濃度に設定し、その他の条件は試験例１と同様にし
て培養を行った。結果を図５に示す。菌体増殖は２４時
間でfull growthに達し、その時の生菌数は、処理ＣＳ
Ｌ３％（ＣＳＬ１．５％）培地で１．２×１０10／ml、
５％（ＣＳＬ２．５％）培地で２．１×１０10／mlであ
った（図５）。このとき、グルコースは完全に消費され
ていた。
５） ＣＳＬ（サンエイ糖化製）及び製造例１の処理ＣＳＬを
用い、バチルス属細菌の増殖性を比較した。菌株として
バチルス・パミルスＡ−２株を用い、グルコース濃度は
１．５％とし、ＣＳＬ及び処理ＣＳＬ濃度は図５に示す
各種濃度に設定し、その他の条件は試験例１と同様にし
て培養を行った。結果を図５に示す。菌体増殖は２４時
間でfull growthに達し、その時の生菌数は、処理ＣＳ
Ｌ３％（ＣＳＬ１．５％）培地で１．２×１０10／ml、
５％（ＣＳＬ２．５％）培地で２．１×１０10／mlであ
った（図５）。このとき、グルコースは完全に消費され
ていた。
【００３５】実施例１ 処理ＣＳＬ培地における増殖と
芽胞化 下記組成の培地にバチルス・レンタスＡ−３株０．８％
を接種し、２５℃にて培養を行った（３Ｌ発酵槽で１．
５Ｌ培養、通気量０．５ＶＶＭ、３５０rpm）。培養２
４時間でfull growthに達したため、更に４８時間通気
攪拌し、得られた培養液を顕微鏡観察し、その芽胞化率
を判定した。また、菌体を分離し、人工海水に懸濁して
培養液量の７．８倍濃縮液を調製し、生菌数を測定し
た。
芽胞化 下記組成の培地にバチルス・レンタスＡ−３株０．８％
を接種し、２５℃にて培養を行った（３Ｌ発酵槽で１．
５Ｌ培養、通気量０．５ＶＶＭ、３５０rpm）。培養２
４時間でfull growthに達したため、更に４８時間通気
攪拌し、得られた培養液を顕微鏡観察し、その芽胞化率
を判定した。また、菌体を分離し、人工海水に懸濁して
培養液量の７．８倍濃縮液を調製し、生菌数を測定し
た。
【００３６】
【表２】（培地組成） 製造例１の処理ＣＳＬ ４０ｇ／Ｌ KH2PO4 ２ クエン酸ナトリウム １ NaCl ５ グルコース １５ 硫安 ４ MgSO4・7H2O ０．２ 消泡剤 １００μｌ
【００３７】結果を表３に示す。表３より、１×１０9c
fu／mlの生菌数を得ると共に、８０％以上の芽胞化を達
成できたことがわかる。
fu／mlの生菌数を得ると共に、８０％以上の芽胞化を達
成できたことがわかる。
【００３８】
【表３】
【００３９】実施例２ バチルス・パミルスＡ−１株、バチルス・レンタスＡ−
２株、バチルス・レンタスＡ−３株及びバチルス・パミ
ルスＡ−４株を培養し、生菌数及び芽胞化率を測定し
た。培地は処理ＣＳＬを用い、製造例１のものを２％、
製造例２のものを４％配合（併用）したものを用い、２
５℃で培養を行った。Ａ−１株、Ａ−３株、Ａ−４株は
培養後２４時間で、Ａ−２株は４８時間でfull growth
に達した。full growth後通気攪拌を４８時間（Ａ−２
株のみ２４時間）継続し、実施例１と同様に芽胞化率を
判定した。結果を表４に示す。表４よりすべての菌株で
少なくとも１×１０9cfu／ml以上の生菌数及び８０％以
上の芽胞化率が得られた。なお、full growth後通気攪
拌を７２時間を超えて継続したところ、Ａ−４株は細胞
から芽胞が脱落しているのが確認された。
２株、バチルス・レンタスＡ−３株及びバチルス・パミ
ルスＡ−４株を培養し、生菌数及び芽胞化率を測定し
た。培地は処理ＣＳＬを用い、製造例１のものを２％、
製造例２のものを４％配合（併用）したものを用い、２
５℃で培養を行った。Ａ−１株、Ａ−３株、Ａ−４株は
培養後２４時間で、Ａ−２株は４８時間でfull growth
に達した。full growth後通気攪拌を４８時間（Ａ−２
株のみ２４時間）継続し、実施例１と同様に芽胞化率を
判定した。結果を表４に示す。表４よりすべての菌株で
少なくとも１×１０9cfu／ml以上の生菌数及び８０％以
上の芽胞化率が得られた。なお、full growth後通気攪
拌を７２時間を超えて継続したところ、Ａ−４株は細胞
から芽胞が脱落しているのが確認された。
【００４０】
【表４】
【００４１】製造例３ 飼料の調製 通常養殖に用いる飼料１ｔに対し１０9cfu／mlのバチル
ス属細菌芽胞菌液を１Ｌ混合して調整した。
ス属細菌芽胞菌液を１Ｌ混合して調整した。
【００４２】製造例４ 硫化物発生抑制剤の調製 実施例２の方法で培養したバチルス・パミルスＡ−１
株、Ａ−４株及びバチルス・レンタスＡ−２株、Ａ−３
株の菌液を遠心分離して集菌し、３％ＮａＣｌ溶液で１
×１０8cfu／ml濃度に希釈した。希釈した菌液２００Ｌ
に火成岩等の固定化担体４００kgを１時間程度通気しな
がら浸漬した後、余剰菌液を分離し硫化物発生抑制剤
（５００kg）とした。
株、Ａ−４株及びバチルス・レンタスＡ−２株、Ａ−３
株の菌液を遠心分離して集菌し、３％ＮａＣｌ溶液で１
×１０8cfu／ml濃度に希釈した。希釈した菌液２００Ｌ
に火成岩等の固定化担体４００kgを１時間程度通気しな
がら浸漬した後、余剰菌液を分離し硫化物発生抑制剤
（５００kg）とした。
【００４３】試験例４ 以下２通りの方法で調製したバチルス・レンタスＡ−３
株を、４℃で２週間密封保存した後飼料を作製し、その
生残性を比較した。 （調製法１）実施例１で調製したバチルス・レンタスＡ
−３株を３％ＮａＣｌ溶液で１×１０9cfu／mlまで希釈
した。この菌液１Ｌを４℃で２週間密封保存した後、通
常養殖に用いる飼料１ｔに混合し、飼料を調製した。 （調製法２）バチルス・レンタスＡ−３株をブイヨン培
地（日水）で２８℃、４８時間培養し、遠心分離して集
菌し、３％ＮａＣｌ溶液で１×１０8cfu／mlまで希釈し
た。この菌液１Ｌを４℃で２週間密封保存した後、通常
養殖に用いる飼料１ｔに混合し、飼料を調製した。表５
に示す通り、製造例１の飼料では２週間後でも１×１０
6cfu／ｇの生菌数が維持されていたが、比較例１の飼料
では１×１０3cfu／ｇ程度まで菌数が低下していた。
株を、４℃で２週間密封保存した後飼料を作製し、その
生残性を比較した。 （調製法１）実施例１で調製したバチルス・レンタスＡ
−３株を３％ＮａＣｌ溶液で１×１０9cfu／mlまで希釈
した。この菌液１Ｌを４℃で２週間密封保存した後、通
常養殖に用いる飼料１ｔに混合し、飼料を調製した。 （調製法２）バチルス・レンタスＡ−３株をブイヨン培
地（日水）で２８℃、４８時間培養し、遠心分離して集
菌し、３％ＮａＣｌ溶液で１×１０8cfu／mlまで希釈し
た。この菌液１Ｌを４℃で２週間密封保存した後、通常
養殖に用いる飼料１ｔに混合し、飼料を調製した。表５
に示す通り、製造例１の飼料では２週間後でも１×１０
6cfu／ｇの生菌数が維持されていたが、比較例１の飼料
では１×１０3cfu／ｇ程度まで菌数が低下していた。
【００４４】
【表５】
【００４５】試験例５ 硫化物発生抑制剤の投与試験 全国２４箇所の水産養殖場に、製造例４で製造した硫化
物発生抑制剤を一定量継続的に（３回以上又は合計１ｔ
以上）散布した。養殖期間中の底質（ヘドロ状の黒色物
質の堆積）、臭気（異臭）の発生等に関し、表５に示す
４段階の評価を行った。
物発生抑制剤を一定量継続的に（３回以上又は合計１ｔ
以上）散布した。養殖期間中の底質（ヘドロ状の黒色物
質の堆積）、臭気（異臭）の発生等に関し、表５に示す
４段階の評価を行った。
【００４６】
【表６】
【００４７】その結果、７８％以上で有効性が認めら
れ、散布時の投与菌数も１×１０9cfu／ml以上に保持さ
れていた。効果がどちらともいえない事例は、ウイルス
発症により効果の判定ができなかったので途中で使用を
打ち切ったなどの理由によるものであり、効果の得られ
なかった２例は養殖終了近くになって投与を開始した場
合、投与を途中で中止した場合であった。
れ、散布時の投与菌数も１×１０9cfu／ml以上に保持さ
れていた。効果がどちらともいえない事例は、ウイルス
発症により効果の判定ができなかったので途中で使用を
打ち切ったなどの理由によるものであり、効果の得られ
なかった２例は養殖終了近くになって投与を開始した場
合、投与を途中で中止した場合であった。
【００４８】
【発明の効果】本発明によれば、１×１０9cfu／ml以上
の高濃度の芽胞化バチルス属細菌を得ることができる。
また、本発明の芽胞化方法により得られるバチルス属細
菌芽胞は、製剤化、飼料への添加時等の集菌、固定化等
の工程においても高い生残性を保ち、菌濃度の高い飼料
とすることができる。
の高濃度の芽胞化バチルス属細菌を得ることができる。
また、本発明の芽胞化方法により得られるバチルス属細
菌芽胞は、製剤化、飼料への添加時等の集菌、固定化等
の工程においても高い生残性を保ち、菌濃度の高い飼料
とすることができる。
【図１】窒素源の違いによる生菌数の経時変化（バチル
ス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
ス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
【図２】窒素源の違いによる生菌数の経時変化（バチル
ス・レンタスＡ−２株）を示す図である。
ス・レンタスＡ−２株）を示す図である。
【図３】イーストエキスとＣＳＬによる菌体の増殖比較
（バチルス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
（バチルス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
【図４】イーストエキスとＣＳＬによる菌体の増殖比較
（バチルス・レンタスＡ−２株）を示す図である。
（バチルス・レンタスＡ−２株）を示す図である。
【図５】ＣＳＬと処理ＣＳＬにおける菌体の増殖比較
（バチルス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
（バチルス・パミルスＡ−１株）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 三沢 宏 東京都港区東新橋１丁目１番19号 株式会 社ヤクルト本社内 Ｆターム(参考） 2B005 GA01 GA02 MB02 2B150 AA01 AA05 AA07 AA08 AB02 AB03 AB20 AC02 DD12 DD26 4B065 AA15X AC13 BB01 BB02 BB03 BB15 BB23 BB26 BB29 BC01 BC02 BC03 BC05 BC08 BC11 BC13 BC26 BC50 BD15 BD50 CA43
Claims (5)
- 【請求項１】 １〜５重量％のコーンスティープリカー
及び炭素源を含有する培地において、バチルス属細菌を
炭素源が消費し尽くされるまで培養し、その後２４〜７
２時間通気することを特徴とするバチルス属細菌の芽胞
化方法。 - 【請求項２】 １〜５重量％のコーンスティープリカ
ー、０．０５〜２．５重量％のイーストエキス及び炭素
源を含有する培地において、バチルス属細菌を炭素源が
消費し尽くされるまで培養し、その後２４〜７２時間通
気することを特徴とするバチルス属細菌の芽胞化方法。 - 【請求項３】 コーンスティープリカーが、その不溶物
を除去したものである請求項１又は２記載のバチルス属
細菌の芽胞化方法。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３記載の芽胞化方法に
より得られたバチルス属細菌を含有する動物又は魚介類
の飼料。 - 【請求項５】 請求項１、２又は３記載の芽胞化方法に
より得られたバチルス属細菌を含有する魚介類の養殖場
への添加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11022898A JP2000217567A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | バチルス属細菌の芽胞化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11022898A JP2000217567A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | バチルス属細菌の芽胞化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000217567A true JP2000217567A (ja) | 2000-08-08 |
Family
ID=12095480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11022898A Pending JP2000217567A (ja) | 1999-01-29 | 1999-01-29 | バチルス属細菌の芽胞化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000217567A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009232793A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-10-15 | Genichiro Soma | 飼料添加剤、飼料、その製造方法、斃死予防剤、及び飼育方法 |
| JP2010082590A (ja) * | 2008-10-01 | 2010-04-15 | Sumiju Kankyo Engineering Kk | バチルス属細菌の簡易測定法 |
| WO2015093428A1 (ja) * | 2013-12-16 | 2015-06-25 | 京都府 | バイオ肥料 |
| KR20170135888A (ko) | 2015-04-09 | 2017-12-08 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | 바실루스속 세균 아포의 제조 방법 |
| KR20190056414A (ko) | 2016-10-07 | 2019-05-24 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | 아포 형성 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법 |
| CN110537505A (zh) * | 2019-10-08 | 2019-12-06 | 西藏自治区农牧科学院水产科学研究所 | 一种拉萨裂腹鱼放流苗种培育方法 |
| CN114395503A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-26 | 湖北工业大学 | 一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法 |
-
1999
- 1999-01-29 JP JP11022898A patent/JP2000217567A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2009232793A (ja) * | 2008-03-27 | 2009-10-15 | Genichiro Soma | 飼料添加剤、飼料、その製造方法、斃死予防剤、及び飼育方法 |
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| WO2015093428A1 (ja) * | 2013-12-16 | 2015-06-25 | 京都府 | バイオ肥料 |
| KR20170135888A (ko) | 2015-04-09 | 2017-12-08 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | 바실루스속 세균 아포의 제조 방법 |
| US11008545B2 (en) | 2015-04-09 | 2021-05-18 | Idemitsu Kosan Co., Ltd. | Sporulation method of Bacillus bacterium |
| KR20190056414A (ko) | 2016-10-07 | 2019-05-24 | 이데미쓰 고산 가부시키가이샤 | 아포 형성 세균의 배양 방법 및 유용 물질의 제조 방법 |
| US11512280B2 (en) | 2016-10-07 | 2022-11-29 | Sds Biotech K.K. | Method for culturing spore-forming bacteria, and method for producing useful substance |
| CN110537505A (zh) * | 2019-10-08 | 2019-12-06 | 西藏自治区农牧科学院水产科学研究所 | 一种拉萨裂腹鱼放流苗种培育方法 |
| CN114395503A (zh) * | 2021-12-06 | 2022-04-26 | 湖北工业大学 | 一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法 |
| CN114395503B (zh) * | 2021-12-06 | 2023-08-22 | 湖北工业大学 | 一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法 |
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