KR102131631B1 - 혼합된 박테리아 개체군에 의한 암모니아화를 통한 유기물로부터의 질소의 추출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 충분한 시간의 발효 조건 하에서 암모니아화시킬 수 있는 혼합된 박테리아 개체군의 존재 하에서 유기물을 포함하는 배지를 발효시켜 암모니아 또는 암모늄을 포함하는 발효 생산물을 제조하는 유기물로부터 암모니아 또는 암모늄을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 유기물은 암모니아 또는 암모늄으로의 전환에 바람직한 질소 화합물을 포함한다.

Description

혼합된 박테리아 개체군에 의한 암모니아화를 통한 유기물로부터의 질소의 추출{EXTRACTION OF NITROGEN FROM ORGANIC MATERIALS THROUGH AMMONIFICATION BY MIXED BACTERIAL POPULATIONS}
본 발명은 일반적으로 혼합된 미생물 개체군을 이용한 미생물의 발효 또는 배양 방법에 의해 유기 원료로부터 암모니아 및/또는 암모늄을 제조하는 새로운 방법에 관한 것이다.
암모니아(NH3)는 세계적으로 가장 많이 제조되는 화학 화합물 중 하나이다. 2010년에는, 전 세계 생산량이 131M 메트릭톤에 달했다(미국 지질 조사국, 2012). 제조된 암모니아의 대부분은 농작물의 생장에 필요한 질소를 제공하기 위해 화학 비료에 사용된다. 또한, 암모니아는 플라스틱, 합성 섬유 및 합성 수지, 폭발물, 및 수많은 기타 화학 화합물을 제조하는데 사용되어 왔다.
질소 순환(nitrogen cycle)은 질소를 다른 화학적 형태로 전환하는 방법이다. 유기 고분자 중의 질소의 무기질화, 즉 유기 질소의 암모늄 또는 암모니아로의 전환을 암모니아화(ammonification)라고 한다. 유기 질소의 암모니아로의 방출은 질소 순환의 일부이며, 암모니아화시키는 박테리아에 의해 행해진다.
암모니아화는 유기 폐기물 재료로부터 질소를 방출하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 그 전체를 참고자료로서 포함하는 미국 특허 출원 제13/722,228호는 암모니아화의 방법을 개시한다. 상기 미국 특허 출원 제13/722,228호의 방법에 있어서, 배지에 존재하는 유기물은 미생물의 발효 또는 배양에 적합한 가수분해된 유기물 또는 부분 가수분해된 유기물을 포함하는 배지를 제조하기 위해 가수분해 효소와 접촉된다. 상기 발효는 암모니아화시킬 수 있는 적어도 하나의 미생물의 존재 하에서 실시된다. 상기 미생물은, 예를 들면 아에로모나스(Aeromonas) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리디움(clostridium) 속 및 엔트로코쿠스(Entrococcus) 속에 속할 수 있다. 상기 방법은 최대 약 800mg/l의 암모니아 제조율을 제공한다.
미국 특허 공개 제US20110126455호는 수경 재배물을 제조하기 위한 무기질화(mineralization) 방법에 사용될 수 있는 접종물을 제조하는 방법을 개시한다. 상기 방법에서 생성되는 접종물은 최대 400mg/l의 농도로 질산염 이온을 제조할 수 있으며, 무기질화 방법을 완료하는데 필요한 시간은 통상 4~8일이다.
따라서, 유기물, 예를 들면 유기 폐기물 재료로부터 암모니아를 제조하는데 더욱 경제적인 방법이 당업계에서 지속적으로 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은,
충분한 시간 동안의 발효 조건 하에서 암모니아화시킬 수 있는 혼합된 박테리아 개체군의 존재 하에서 유기물을 포함하는 수성 배지를 호기성 조건 또는 혐기성 조건에서 발효시켜 암모니아 또는 암모늄을 포함하는 발효 생산물을 제조하는 공정을 포함하는 유기물로부터 암모니아 또는 암모늄을 제조하는 방법으로서,
상기 유기물은 암모니아 또는 암모늄으로의 전환에 적합한 질소 화합물을 포함하는 유기물로부터 암모니아 또는 암모늄을 제조하는 방법을 제공하고 있다. 바람직하게는, 상기 질소 화합물은 아민 또는 단백질이다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 30~60℃ 사이의 온도 범위에서 실시된다. 보다 바람직하게는, 상기 방법은 40~55℃ 또는 40~50℃의 온도 범위에서 실시된다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 약 5~약 11의 pH 범위에서 실시된다. 보다 바람직하게는, 상기 방법은 약 6~약 9의 pH 범위에서 실시된다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 상기 발효 공정은 상기 유기물의 효율적인 환원에 효과적인 온도 범위 및 시간 동안에, 적합한 반응 챔버 또는 용기에서 혐기성 조건 또는 호기성 조건 하에 실시될 수 있다.
바람직하게는, 상기 방법은 H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 및 FI1로 이루어지는 군에서 선택되는 혼합된 박테리아 개체군과 실질적으로 동일한 혼합된 박테리아 개체군을 포함하는 혼합된 박테리아 개체군을 이용하여 실시된다. 상기 실질적으로 동일한 혼합된 박테리아 개체군은 H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 및 FI1로 이루어지는 군에서 선택되는 혼합된 박테리아 개체군에 대하여 0.80의 상관 계수, 보다 바람직하게는 0.90의 상관 계수, 및 더욱 바람직하게는 0.95의 상관 계수를 갖는다.
특정 실시형태에 있어서, 상기 혼합된 박테리아 개체군은 상기 S1(CBS 수탁번호 136063)의 혼합된 박테리아 개체군과 실질적으로 유사하다. 상기 S1과 실질적으로 동일한 혼합된 박테리아 개체군은 상기 S1의 혼합된 박테리아 개체군에 대하여 바람직하게는 0.80의 상관 계수, 보다 바람직하게는 0.90의 상관 계수, 및 더욱 바람직하게는 0.95의 상관 계수를 갖는다.
대안적인 실시형태에 있어서, 상기 혼합된 박테리아 개체군에 있어서의 세포의 적어도 50%는 스포라나에로박터 아세티게네스(Sporanaerobacter acetigenes) 박테리아 및/또는 클로스트리디움 에스피피(Clostridium spp .) 박테리아를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 상기 혼합된 박테리아 개체군은 스포라나에로박터 아세티게네스 50~90% 및 클로스트리디움 에스피피 3~35%를 포함한다. 상기 스포라나에로박터 아세티게네스 및/또는 클로스트리디움 에스피피의 누적률은 70% 이상이다. 바람직하게는, 상기 혼합된 박테리아 개체군은 스포라나에로박터 아세티게네스 50~90% 및 클로스트리디움 에스피피 5~15%를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 스포라나에로박터 아세티게네스 및/또는 클로스트리디움 에스피피의 누적률은 85% 이상이다. 추가적인 실시형태에 있어서, 상기 혼합된 박테리아 개체군은 클로스트리디움 목에 속하는 박테리아를 적어도 90% 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 발효 생산물로부터 암모니아 또는 암모늄을 기계적으로 또는 침전에 의해 회수하는 방법을 더 포함한다.
상기 암모니아 또는 암모늄은,
(a) 고체 및 액체 발효 생산물을 분리하는 방법,
(b) 암모니아 또는 암모니아수를 포함하는 액체 발효 생산물을 수집하는 방법, 또는 상기 발효 공정 또는 상기 분리 방법(a) 동안에 방출되는 가스 혼합물을 수집하는 방법, 및
(c) 암모니아 또는 암모늄을 회수하는 방법에 의해 선택적으로 회수된다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 유기물은 다음 중 하나 이상인 것이 바람직하다: 육골분(MBM), 동물성 분말, 동물성 부산물, 도축장 폐기물, 훼이, 도시 폐기물, 식품 및 발효 산업 폐기물류, 및 그들의 혼합물. 상기 식품 산업 폐기물류는, 예를 들면 동물성 부산물, 동물성 분말 및 식품 폐기물이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명은 H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 및 FI1로 이루어지는 군에서 선택되는 혼합된 박테리아 개체군과 실질적으로 동일한 혼합된 박테리아 개체군을 포함한다. 바람직하게는, 상기 혼합된 박테리아 개체군은 S1의 혼합된 박테리아 개체군과 실질적으로 유사하다.
도 1은 실시예 1에 있어서의 혼합된 박테리아 개체군 A1, C1, H1, P1 및 S1에 의한 육골분("MBM") 단백질성 질소의 암모니아화를 위한 최적의 온도 범위의 측정을 나타낸다. 결과는 암모니아로 전환되는 질소의 백분율, 즉 다양한 온도에서 7일의 배양 후의 암모니아화 효율로서 나타내어진다. 에러 바(Error bars)는 2개의 생물학적 반복값 사이의 표준 편차를 나타낸다. A1, C1, H1 및 P1에 의한 암모니아화를 위한 최적의 온도 범위는 37~55℃이고, S1의 경우에는 37~60℃이다. "RT"는 실온을 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 있어서의 혼합된 박테리아 개체군 A1, C1, H1, P1 및 S1에 의한 MBM 단백질성 질소의 암모니아화를 위한 최적의 pH 범위의 측정을 나타낸다. 결과는 암모니아로 전환되는 질소의 백분율, 즉 50℃에서 7일의 배양 후의 암모니아화 효율로서 나타내어진다. 에러 바는 2개의 생물학적 반복값 사이의 표준 편차를 나타낸다. A1, C1, H1, P1 및 S1에 의한 암모니아화를 위한 최적의 pH 범위는 6~9이다. "N"은 NH3으로 전환되는 화합물 중의 질소를 나타낸다.
도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e, 도 3f, 도 3g 및 도 3h는 실시예 2에 있어서의 혼합된 박테리아 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1에 의한 다른 유기물에 대한 암모니아화 효율을 나타낸다. 에러 바는 각각 3개의 기술적 반복값을 갖는 2개의 생물학적 반복값 사이의 표준 편차를 나타낸다. 상기 유기물은 도 3a: 어류 부산물, 도 3b: 육계 부산물, 도 3c: 소/돼지 부산물, 도 3d: 바이오에탄올 마스크, 도 3e: 육골분 1, 도 3f: 육골분 2, 도 3g: 어분, 도 3h: 우모분이다. 결과는 암모니아로 전환되는 질소의 백분율, 즉 다양한 시간 동안 50℃에서 배양 후의 암모니아화 효율로서 나타내어진다. 개체군 S1은 도 3d 및 도 3g로 나타내어지는 재료를 효과적으로 암모니아화시키는 것이 분명하고, 반면에 H1은 도 3c, 도 3d 및 도 3e로 나타내어지는 재료를 신속하게 암모니아화시킨다. 요약하면, 5개의 개체군은 모두 비접종된 대조군과 비교해서 암모니아화 효율을 증가시킨다. 이 효과는 도 3c, 도 3d, 도 3e 및 도 3f로 나타내어지는 재료에서 특히 명백하다. "d"는 일(日)을 나타낸다.
도 4는 실시예 4에 있어서의 박테리아 접종없이, 또는 P1 박테리아 개체군을 이용하여 +50℃에서의 바이오리액터 중의 어류 부산물 배지 및 닭 부산물 배지의 암모니아화 효율을 나타낸다. 에러 바는 3개의 반복 암모니아 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 실시예 5에 있어서의 다른 2개의 제조사로부터 입수된 비멸균된 육골분("MBM")(MBM1 및 MBM2)으로부터 혼합된 개체군을 유도하기 위한 온도 범위의 측정을 나타낸다. 결과는 암모니아로 전환되는 질소의 백분율, 즉 다양한 온도에서 7일의 배양 후의 암모니아화 효율로서 나타내어진다. 에러 바는 각각 4개 및 7개의 반복값을 갖는 45℃ 및 55℃에서의 MBM1를 제외한 2개의 생물학적 반복값 사이의 표준 편차를 나타낸다. MBM2 개체군은 실온(RT)과 70℃ 사이에서 효율적으로 유도되고, 반면에 MBM1은 50℃에서 효율적인 질소 전환의 최적값을 갖는다. "RT"는 실온을 나타낸다.
도 6은 하기 토의 부분에 있어서의 도축장 부산물의 암모니아화 방법의 예를 나타낸다.
혼합된 박테리아 개체군에 의한 암모니아화를 통한 유기물로부터의 질소의 추출 방법이 제공된다. 유기물은 단백질이 풍부한 임의의 유기물, 예를 들면 동물 유래 또는 식물 유래의 유기물일 수 있다. 본 발명을 보다 명확하게 이해하기 위해서, 다음의 용어가 규정된다. 하기 열거된 용어는, 특별히 명시하지 않는 한, 사용될 수 있고 기재된 바와 같이 규정되는 것으로 의도된다. 본 명세서의 전체에 걸쳐서 다른 용어에 대한 규정이 발생할 수 있다. 또한, 모든 단수의 용어는, 특별히 명시하지 않는 한, 용어의 복수, 능동태 및 과거 시제 형태를 포괄하는 것으로 의도된다.
용어 "질소 화합물"은 본 발명의 방법에 의해 암모니아 또는 암모늄으로의 전환에 적합한 질소 화합물, 예를 들면 아민, 단백질 등을 포함하는 유기 질소를 의미한다. 이러한 유기물의 예로는, 예를 들면 육골분(MBM), 도축장 폐기물, 훼이, 도시 폐기물, 어분, 식품 산업 폐기물류 등의 단백질 재료, 예를 들면 육골분, 어분 및 우모분뿐만 아니라, 비트 루트, 콩류, 과일 및 제당 산업 폐기물을 포함하는 동물성 부산물 및 식물성 부산물을 함유하는 아민이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본원에 이용되는 용어 "MBM" "육골분"은 유럽 연합 위원회 규칙 제142/2011호 "육골분은 부록 IV의 III장에 제시된 방법 방법 중 하나에 따른 카테고리 1 또는 카테고리 2의 재료의 방법으로부터 유래되는 동물성 단백질을 의미한다."에 의해 규정된다.
본원에 이용되는 용어 "동물성 분말"은 동물성 재료(예를 들면, 도축장 폐기물)로부터 제조되는 분말이다. 하기 예에 있어서, "동물성 분말"은 파우더 형태의 재료이었다. 상기 분말을 제조하는 하나의 방법은 도축장 폐기물을 수거하여 수분을 제거하고(즉, 건조시킴), 이어서 상기 건조된 고형분을 제분하는 것이다.
상기 "식물 유래 재료"는 다음과 같이 정의된다. "바이오에탄올 마스크"(St1 Oy, Finland)는 바이오에탄올 생산물로부터 유래되는 발효 폐기물을 의미한다. "보리 브리켓"(Senson Oy, Finland)은 맥아즙 생산물의 부산물이고, "보리 마스크"(Senson Oy, Finland)는 보리 효소 생산물의 부산물이었다. "밀 브리켓"(CropEnergies AG, German) 및 "유채박"(Mildola Oy, Finland)은 동물에게 먹이기 위해 제조되는 재료이었다.
본원에 사용되는 용어 "동물 사료"는 동물에게 먹이를 주기 위해 조제되는 식품을 나타낸다.
용어 "발효 공정" 또는 "발효"는 유기 분자가 전자 공여체 및 수용체 양쪽으로서 기능하는 방법을 의미한다. 그것은 영양소 분자로부터 유래되는 전자가 산소(호기적 호흡), 또는 질산염, 황산염, 이산화탄소 또는 제2철 등의 다른 무기 분자/이온(혐기적 호흡)에 공여되는 호흡과는 구별된다. 발효에 있어서, 영양소 분자는 불안정한 지방산 및 알코올 등의 작은 유기 분자로 환원된다. 이것 이외에도, 용어 "발효"는 밀폐 용기, 즉 바이오리액터 또는 발효기 내의 증식 배지에서의 미생물 증식을 설명하는데 사용된다.
용어 "암모니아"는 배지, 예를 들면 수성 배지에 있어서 비이온화 형태로 용해되거나 또는 가스 형태로 발견되는 화합물 NH3을 의미한다. 용어 "암모늄"은, 예를 들면 수용액에서 발견되는 NH3의 이온 형태인 이온 NH4 +를 의미한다. 수용액에 있어서, 암모늄 및 암모니아는 온도 및 pH에 의존적인 평형 상태에서 발생되고, 예를 들면 온도 및 pH가 높을수록 암모니아 형태의 비율이 높아진다. 이 이유에 대해, 본 발명의 방법 및/또는 암모니아화 미생물 및 그들의 생산물과 관련하여 본 명세서의 "암모니아"에 대한 참조는, 특별히 명시하지 않는 한, 이 화합물의 NH3 및 NH4 + 형태의 양쪽에 대한 참조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, "암모니아 제조" 또는 "암모늄 제조"로서의 암모니아화 미생물의 토의는 특정한 배지에서 발견되는 NH3/NH4 + 평형에 따른 NH3 및/또는 NH4 +의 생산을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "암모니아화"는 유기 고분자에 있어서의 질소의 무기질화, 즉 유기 질소의 암모늄 또는 암모니아로의 전환을 의미한다. 그것은 암모니아화시키는 박테리아에 의해 행해지며, 단백질의 아미노산으로의 효소적 가수분해, 및 탈아민화와 제거 반응을 통한 질소의 암모늄/암모니아로의 방출로 이루어진다. 아미노산의 탄소 주쇄가 이산화탄소 및 수소를 동시에 방출하면서 유기산으로 발효된다.
용어 "통합된 형태"는 발효 생산물 또는 배양 생산물로부터의 암모늄 및 암모니아의 회수의 단락에서 본원에서 사용될 수 있는 바와 같이 화합물, 예를 들면 암모니아가 질산, 황산, 염산 또는 인산, 또는 다른 기타 화합물과 각각 반응함으로써 형성되는 화합물을 함유하는 비이온성 암모니아(NH3) 및/또는 임의의 공지된 질소 등의 다른 화학적 형태로의 암모늄 이온의 전환을 의미한다.
상기 암모니화시키는 혼합된 박테리아 개체군은 개체군 H1, C1, P1, S1, A1, PB-M, MF-M, FO1 및 FI1, 및 그 변형을 포함하고, 그들은 이하에 상세하게 설명된다.
혼합된 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1의 박테리아 군집 분석은 세포가 비드 비팅에 의해 파쇄된 박테리아 배양물로부터 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 추출에 의해 얻어지는 DNA에 대하여 행해졌다. 개체군은 멸균된 MBM 배지[물 1L당 육골분(MBM) 180g] 또는 동물 유래 재료에서 37℃, 50℃ 또는 55℃로 4일 동안 배양되었다. 태그-인코디드 FLX 앰플리콘 파이로시퀀싱(bTEFAP)에 의한 박테리아의 16S 유전자 어세이 및 박테리아 다양성 데이터 분석은 Dowd 등. 2008a 및 Wolcott 등. 2009에 기재된 바와 같이 리서치 앤드 테스팅 랩(Lubbock, Texas, USA)에 의해 행해졌다. 프라이머 28F 'GAGTTTGATCNTGGCTCAG'(SEQ ID NO: 1) 및 519R 'GTNTTACNGCGGCKGCTG'(SEQ ID NO: 2)(여기서, "N"은 A, T/U, G 또는 C이고, "K"는 T/U 또는 G임)는 16S 가변 영역 V1-3의 증폭을 위해 사용되었다.
박테리아 다양성 분석은 35개의 다른 속에 속하는 박테리아의 존재를 밝혀냈다(표 1). 총 53개의 결과물 중, 33개는 종의 레벨에서 동정되고, 20개는 속의 레벨에서 동정되었다. 표 2는 각 개체군에서 우점하는 박테리아의 종 및 속을 나타낸다. 6~8속에 속하는 박테리아가 전체 개체군의 대부분을 형성한다. 클로스트리디움 에스피피 및 스포라나에로박터 아세티게네스는 전체 개체군에서 우점한다. 55℃에서 배양된 S1에 있어서, 칼로라마터 에스피피(Caloramator spp.)는 클로스트리디움 에스피피만큼 흔하다.
상관 계수(표 3)는 표 1에 나타내는 데이터로부터 식[1]을 이용하여 산출되고, 여기서 X 및 는 상관 계수가 산출되는 2개의 매트릭스, 예를 들면 H1 및 C1을 의미하고, x 및 y는 매트릭스 내의 단일값이고, 또한
Figure 112015089546192-pct00001
및
Figure 112015089546192-pct00002
는 매트릭스 내의 모든 값의 평균값이다. 상기 개체군에 존재하지 않는 종(표 1에 있어서의 빈칸)은 값을 0으로 지정했다.
Figure 112015089546192-pct00003
여기에, 개시된 바와 같은 박테리아 개체군에 대한 용어 "실질적으로 동일한"은 박테리아 개체군이 표 1에 의해 규정되는 박테리아 개체군 중 하나 이상과 비교했을 때에 적어도 0.8의 상관 계수를 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 실질적으로 동일한 박테리아 개체군은 적어도 0.9의 상관 계수를 갖고, 보다 바람직하게는 실질적으로 동일한 박테리아 개체군은 표 1에 의해 규정되는 박테리아 개체군 중 하나 이상과 비교했을 때에 적어도 0.95의 상관 계수를 갖는다. 또한, 개체군을 비교하기 위한 다른 통계학적 방법이 이용될 수도 있다.
표 3은 4일의 경시 후의 모든 개체군 사이의 매우 높은 유사성을 나타낸다. 전체 개체군의 대부분은 모든 시험 조건 하에서 매우 유사하게 잔존하며, 동물 유래 재료에 존재하는 고유의 개체군을 우점하는 몇몇 종 및 속만이 개체군을 포함한다. P1은 비멸균된 MBM으로부터 생성되는 개체군의 8세대이고, 상기 개체군의 주요 특성이 유지되어 있는 것을 나타낸다.
시퀀싱 분자학적 방법에 기초하는 박테리아 다양성 분석은, 예를 들면 프라이머 특이성 및 보편성에 기인해 편향되어 있다(Dowd 등. 2008b). 따라서, 상술한 방법은 이하에 나타내는 혼합된 개체군과의 비교가 행해질 때에 표준으로서 이용되어야 한다.
표 1. 박테리아 다양성 분석 결과: 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1에 있어서의 속 및 종. 또한, S1 개체군은 37℃(S1-37로 표시), 50℃(S1-50으로 표시, S1의 생물학적 반복실험) 및 55℃(S1-55로 표시)에서 배양되었다. 또한, S1은 닭 부산물(CBP), 파쇄된 돼지 및 소 뼈(CB), 어류 부산물(MF), 돼지-소 부산물(PB) 및 닭 우모(FE) 20%(중량/체적)를 접종하는데 사용되었다. 모든 배양물로부터 유래된 세포는 4일의 경시 후에 DNA 추출을 위해 수확되었다. 하기 결과는 총 개체군의 백분율로서 나타내어진다.
Figure 112015089546192-pct00004
Figure 112015089546192-pct00005
표 2. 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1에 있어서의 우점하는 박테리아 속 및 종. 하기 결과는 총 개체군의 백분율로서 나타내어진다.
Figure 112015089546192-pct00006
표 3. 표 1에 나타내는 데이터로부터 식[1]을 이용하여 산출되는 혼합된 개체군의 박테리아 다양성 사이의 상관 계수.
Figure 112015089546192-pct00007
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 화합물을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 특정 실시형태에 따른 특이성을 설명하였지만, 하기 실시예는 본 발명의 예시 및 설명으로만 제공되고, 본 발명의 유효한 범위를 한정 또는 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
혼합된 개체군에 의한 암모니아화 를 위한 최적의 조건
혼합된 개체군에 의한 암모니아화를 위한 최적의 온도 범위를 측정하기 위해서, A1, C1, H1, P1 및 S1은 멸균된 MBM 배지[물 1L당 육골분(MBM) 180g]에서 3일(d)동안 통기없이 50℃(섭씨온도)에서 배양되었다. 이들 정지 증식 단계에 도달된 배양물은 총 60mL(밀리리터)의 체적으로 MBM 배지 중의 5%(v/v) 접종물로서 사용되었다. 비접종된 배양물은 7일 동안 통기없이 다양한 온도에서 배양되었다.
상기 혼합된 박테리아 개체군의 증식은 상기 개체군의 암모늄 생산량을 측정함으로써 모니터링되었다. 상술의 조건 하에서 배양 증식에 대해 약 8~10g/l의 최대 암모니아 레벨이 반복적으로 측정되었다. 따라서, 상기 암모니아 농도가 이 레벨에 도달되는 경우, 증식의 정지 단계로의 과도기로서 해석되었다. 상기 개체군의 다양한 성질은 세포 계수를 위한 배양 기초법의 이용을 제한했고, 상기 MBM 배지의 혼탁은 세포 밀도의 측정을 위한 광학 밀도 측정법의 이용을 방해했다. 모든 하기 실시예에 있어서, "혼합된 박테리아 개체군의 접종"은 정지 증식 단계에 도달된 박테리아의 배양을 의미한다.
상기 암모니아화의 정도는 상기 접종된 MBM 중의 암모니아 농도를 제조사의 지시에 따라서 암모늄 테스트 1.10024.0001(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 의해 측정함으로써 확인되었다. 결과는 암모니아 어세이 키트 AA0100(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라서 확인하였다.
MBM의 질소 함유량은 크옐달법(Kjeldahl method)을 이용하여 공인된 시험 기관(Novalab Oy, Karkkila, Finland)에 의해 측정되었다. 이것에 기초하여, 최대 암모니아 레벨, 즉 모든 단백질성 질소가 암모니아로 전환되는 농도가 산출되었다. 이어서, 질소 전환 백분율, 즉 단백질성 질소의 암모니아화의 정도는 샘플 중의 암모니아 농도를 기초로 하여 산출되었다. 결과는 도 1에 나타내어진다.
A1, C1, H1 및 P1에 의한 암모니아화를 위한 최적의 온도 범위는 37~55℃이고, S1에 의한 암모니아화를 위한 최적의 온도 범위는 37~60℃이다. 그러나, S1은 실온(RT, 23℃) 및 70℃에서도 소정의 암모니아화 효율을 유지하기 때문에 A1, C1, H1 및 P1보다 온도 내성이 있다.
혼합된 개체군에 의한 암모니아화를 위한 최적의 pH 범위를 측정하기 위해서, A1, C1, H1, P1 및 S1이 멸균된 MBM 배지[물 1L당 MBM 180g]에서 3일 동안 통기없이 50℃에서 배양되었다. 이들 배양물은 총 60mL의 체적으로 MBM 배지 중의 5%(v/v) 접종물로서 사용되었다. 이어서, 이들 배양물의 pH는 pH5~12의 범위의 값으로 매일 조정되었다. 배양물은 통기없이 7일 동안 50℃에서 배양되었다. 이어서, 암모니아로 전환되는 질소의 백분율은 후술하는 바와 같이 측정되었다. 결과는 도 2에 나타낸다.
A1, C1, H1, P1 및 S1에 의한 암모니아화를 위한 최적의 pH 범위는 약 pH6~약 pH9이다. C1, P1 및 S1은 모두 pH6~9의 최적값 이하 및 이상의 pH값에서 암모니아화 효율의 감소를 나타낸다. 그러나, 개체군 H1은 pH11에서 소정의 활성을 나타내어 다른 개체군보다 높은 pH에 대한 내성이 있고, 반면에 A1은 pH5에서 활성을 나타내어 낮은 pH에 내성이 있다.
혼합된 개체군에 의한 암모니아화를 위한 최적의 산소 조건을 측정하기 위해서, S1은 멸균된 MBM 배지[물 1L당 MBM 180g]에서 3일 동안 통기없이 50℃에서 배양되었다. 이들 배양물은 총 60mL의 체적으로 MBM 배지 중의 5%(v/v) 접종물로서 사용되었다. 상기 배양물은 혐기적으로(혐기성 균배양조(AnaeroGen, Oxoid)에서), 미세호기적으로(밀폐된 캡이 달린 병에서), 또는 호기적으로(속도 90rpm에서 진탕하면서 삼각플라스크에서) 7일 동안 +50℃에서 배양되었다. 각 조건에 대하여 2번의 반복 실험이 행해졌다. 상기 배양물의 암모늄 생산량은 3~7일의 배양 후에 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정되었고, 이어서 암모니아로 전환되는 질소의 백분율이 후술하는 바와 같이 측정되었다.
상기 S1개체군의 암모니아 생산량은 상기 배양물의 산소 레벨에 대하여 비의존적이었다. 7일의 배양 후에, 암모니아 수율은 모든 산소 조건에서 52.5~55.9%이었다(표 4). 결론적으로, 상기 S1 개체군의 암모늄 생산량은 상기 배지의 산소 레벨에 비의존적이었다.
표 4. 다른 산소 조건에서 배양된 S1 개체군에 의해 암모늄으로 전환되는 질소의 백분율. 하기 결과는 2개의 생물학적 반복 실험값의 평균값을 나타낸다. 2개의 생물학적 반복 실험값으로부터의 3개의 반복 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00008
결론. 혼합된 박테리아 개체군을 이용한 단백질성 재료의 암모니아화를 위한 작동 범위가 측정되었다. 본 명세서에 기재된 개체군을 이용한 박테리아의 암모니아화에 30℃~60℃, 보다 바람직하게는 37~55℃의 온도 및 pH5~11, 보다 바람직하게는 pH6~9가 가장 적합하였다. 암모니아화는 상기 혼합된 개체군을 이용하여 혐기성 조건, 미세호기성 조건 및 호기성 조건에서 작동한다.
실시예 2
유기물의 향상된 암모니아화
혼합된 박테리아 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1은 후술하는 바와 같이 각종 유기물, 즉 동물 유래 재료 및 식물 유래 재료 중의 단백질성 질소의 암마니아화 작용에 이용되었다.
동물 유래 MBM. 상기 MBM(이하, MBM1 및 MBM2로 표기함)은 각각 유럽 연합 위원회 규칙 142/2011에 기재된 방법에 따라서 동물성 부산물로부터 제조되고, 카테고리 3(유럽 연합 위원회 규정 1069/2009)의 저감염 위험 재료로 이루어진다. 구체적으로는, MBM1은 Findest Protein Oy, Finland로부터 입수되고, MBM2는 SARIA Bio-Industries AG & Co. KG, Germany로부터 입수되었다. 우모분은 Findest Protein Oy, Finland로부터 입수되고, 또한 어분은 Henry Teirs Ltd, Finland로부터 입수되는 폴란드산이었다.
신선한 동물 유래 재료. 육계 및 소/돼지 유래의 신선한 도축 부산물이 사용되었다. 상기 육계 부산물은 창자, 모래 주머니, 간, 심장, 머리, 혈액, 발가락, 뼈, 목뼈, 목의 피부 및 내장 지방으로 이루어진다. 상기 소/돼지 부산물은 돼지의 피부, 근육, 연골, 연골 뼈, 소장, 심장, 폐, 신장, 슈우트(suet); 및 소의 근육, 연골 뼈, 기관, 폐, 슈우트 및 반추위로 이루어진다. 어류 부산물은 뼈, 근육, 피부 및 내장을 포함하는 어류 폐기물로 이루어진다. 분쇄된 우모는 세정한 우모를 2cm 이하의 입자 사이즈로 분쇄하였다. 소 혈액은 식용 냉동 혈액이었다. 모든 어류, 가금류, 돼지 및 소 재료는 핀란드산이었다.
식물 유래 재료. 바이오에탄올 마스크(St1 Oy, Finland)는 바이오에탄올 생산물로부터 유래되는 발효 폐기물이고, 보리 브리켓(Senson Oy, Finland)은 맥아즙 생산물의 부산물이고, 보리 마스크(Senson Oy, Finland)는 보리 효소 생산물의 부산물이었다. 밀 브리켓(CropEnergies AG, Germany) 및 유채박(Mildola Oy, Finland)은 동물 사료의 재료이었다.
신선한 동물 유래 재료는 호모게네이트 40%(중량/체적) 및 동물 유래 분말과 식물 유래 분말 재료 180g/L의 농도로서 적용되었다. 호모게네이트 및 용액은 총 60mL의 체적으로 수돗물로 조제되었다. 상기 호모게네이트 및 용액의 pH는 초기 pH가 7 이하인 경우에는 NaOH를 이용하여 pH7로 조정되었다. 또한, 이들 재료의 pH는 혼합된 개체군에 의한 암모니아화를 위한 최적의 범위 이하의 값으로 낮아지기 때문에, 식물 유래 재료, 보리 마스크, 유채박, 밀 브리켓 및 보리 브리켓은 접종 후에 매일 pH7로 조정할 필요가 있었다. 바이오에탄올 마스크 및 모든 동물 유래 재료는 접종 후에 pH 조정이 필요하지 않았다.
박테리아 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1은 3일 동안 통기없이 50℃에서 멸균된 배지[물 1L당 MBM 180g]에서 배양되었다. 이들 배양물은 유기물의 호모게네이트 및 용액에 5%(v/v) 접종물로서 사용되었다. 접종된 재료 및 비접종된 대조군은 통기없이 50℃에서 배양되었다.
상기 암모니아화의 정도는 접종된 유기물 중의 암모니아 농도를 암모늄 테스트 1.10024.0001(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)에 의해 제조사의 지시에 따라서 측정함으로써 확인되었다. 결과는 암모니아 어세이 키트 AA0100(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라서 확인되었다.
상기 유기물의 질소 함유량은 크옐달법을 이용하여 공인된 시험 기관(Novalab Oy, Karkkila, Finland)에 의해 측정되었다. 이것에 기초하여, 각 유기물에 대하여 최대 암모니아 레벨, 즉 모든 단백질성 질소가 암모니아로 전환되는 농도가 산출되었다. 이어서, 질소 전환 백분율, 즉 단백질성 질소의 암모니아화의 정도는 샘플 중의 암모니아 농도를 기초로 하여 산출되었다. 결과는 표 5에 나타낸다.
결론. 하기 결과는 혼합된 박테리아 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1에 의한 암모니아화가 비접종된 대조군과 비교해서 향상된 것을 나타낸다. 내인성 박테리아 개체군은, 특히 신선한 동물 유래 재료에 있어서의 암모니아화에 어느 정도 기여하지만, 상기 방법은 혼합된 개체군에 의해 가속화된다. 식물성 재료는 이용되는 조건에서 매우 적은 내인성 암모니아화 활성을 나타내며, 접종된 개체군으로부터는 상당히 이점이 있다.
개체군 H1 및 S1은 암모니아화에 있어서 가장 효율적인 개체군인 것으로 보여진다. S1 개체군은 어류 부산물, 어분 및 MBM2에 대해 최고의 암모늄 생산자이었다. H1은 돼지/소 부산물, MBM1 및 바이오에탄올 마스크에 대해 최고의 암모늄 생산자이었다. S1 및 H1 개체군은 임의의 재료에 대해 가장 취약한 암모늄 생산자는 아니었다.
도 3a~도 3h는 혼합된 개체군 H1, C1, P1, S1 및 A1에 의한 다른 유기물의 암모니아화 효율을 나타낸다. 상기 유기물은 도 3a: 어류 부산물, 도 3b: 육계 부산물, 도 3c: 소/돼지 부산물, 도 3d: 바이오에탄올 마스크, 도 3e: 육골분 1, 도 3f: 육골분 2, 도 3g: 어분, 도 3h: 우모분이다. 결과는 암모니아로 전환되는 질소의 백분율, 즉 다양한 시간 동안 50℃에서의 배양 후의 암모니아화 효율로서 나타내어진다. 개체군 S1은 각각 도 3a, 도 3d 및 도 3g의 재료를 효율적으로 암모니아화시키는 것이 분명하고, 반면에 H1은 각각 도 3a, 도 3c, 도 3d 및 도 3e의 재료를 신속하게 암모니아화시킨다. 전반적으로, 5개의 개체군은 비접종된 대조군과 비교해서 암모니아화 효율을 증가시킨다. 특히, 이 효과는 재료 3c, 3d, 3e 및 3f에 있어서 명백하다. 도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e, 도 3f, 도 3g 및 도 3h는 각각 도 3a, 도 3b, 도 3c, 도 3d, 도 3e, 도 3f, 도 3g 및 도 3h의 재료에 대한 결과를 나타낸다.
표 5. 암모니아로의 질소 전환의 효율을 최대값의 백분율로서 보고했다. 측정은 어류, 육계, 및 돼지/소 부산물 및 어분의 접종으로부터 24시간, 육골분의 접종으로부터 48시간, 및 우모분, 분쇄된 우모, 혈액 및 모든 식물 유래 재료의 접종으로부터 168시간(7일) 후에 행해졌다. 식물 유래 재료의 대조군은 pH 조정되지 않았다. n.d.=측정하지 않음.
Figure 112015089546192-pct00009
실시예 3
혼합된 유기물의 암모니아화 (탄수화물 함유량이 암모니아화에 미치는 영향)
당류. 40%(중량/체적) 닭 부산물 배지에서 글루코오스 또는 전분의 첨가가 S1 개체군의 개체군의 암모니아 생산에 미치는 영향을 시험하였다. 상기 배지에 글루코오스 또는 전분을 1%, 5% 및 10%의 농도로 첨가하였다. S1 개체군(180g/l MBM 배지에서 배양됨)은 60ml의 다른 배지에 5%(v/v) 접종물로서 첨가하고, 상기 배양물은 2일 동안 +50℃에서 배양되었다. 각 배지를 이용하여 2번의 반복 실험이 행해졌다. 암모늄 생산량은 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 이용하여 2일의 배양 후에 측정되었다.
결과. S1 개체군에 의한 암모니아 생산량은 배지에 당류를 첨가함으로써 네거티브적으로 영향을 받았다(표 6). 탄수화물을 첨가하지 않은 경우, 암모니아 수율은 2일의 배양 후에 60%이었다. 배지 중의 글루코오스의 첨가는 암모니아 수율을 34~48%로 감소시켰다. 1% 전분은 암모니아 수율을 감소시키지 않았지만, 5% 및 10% 전분의 첨가는 암모니아 수율을 각각 45% 및 37%로 감소시켰다. 암모니아의 수율 저하는 배지의 pH의 저하와 관련이 있다. 결론적으로, S1 개체군의 암모늄 생산량은 증식 배지 중의 당류의 첨가에 의해 네거티브적으로 영향을 받는다.
표 6. 40% 닭 부산물 배지에서 당류 또는 전분의 첨가가 S1 개체군의 암모니아 생산량에 미치는 영향을 시험하였다. 암모늄 생산량은 +50℃에서 2일의 배양 후에 측정되었다. 하기 결과는 2개의 생물학적 반복 실험값의 평균값이다. 상기 2번의 생물학적 반복 시험의 양쪽으로부터의 3번의 반복 측정의 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00010
혼합 유기물. S1 개체군은 식물 및 동물 유래의 재료의 혼합물을 암모니아화시키는데 사용되었다. 5% 건조중량의 배양 배지가 조제되었다. 배지는 하기 재료, 한번에 하나의 재료 또는 50%+50% 비율의 2개의 재료: 다진 닭 부산물(200g/l 단독, 50-50 혼합물 100g/l), 다진 어류 부산물(200g/l 단독, 50-50 혼합물 100g/l), 건조된 클로렐라(Chlorella) 조류 파우더(50g/l 단독, 50-50 혼합물 25g/l), 및 보리 브리켓(50g/l 단독, 50-50 혼합물 25g/l)을 함유한다. 또한, 보리 브리켓은 배지의 총 건조중량 함유량이 항상 5%가 되도록 닭 및 어류 부산물과 함께 다른 비율로 혼합되었다. 상기 재료는 질소를 다음과 같이 함유한다: 닭 22.2g/kg, 어류 30.4g/kg, 클로렐라 113.6g/kg 및 보리 24.6g/kg. MBM 배지(180g/l)에서 배양시킨 S1 개체군의 7.5ml은 각 배지 150ml에 접종되었다. 각 배지에 대해 2번의 반복 실험이 행해졌다. 상기 배양물은 +50℃에서 배양되고, 상기 배양물의 암모늄 생산량은 4일 또는 7일의 배양 후에 생물학적 샘플에 대해 제조사의 지시에 따라 암모니아의 정량분석용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정되었다.
결과(I). 시험된 모든 재료 및 그들의 혼합물에서 암모늄이 생산되었다. 질소는 동물성 재료, 즉 닭 및 어류(72~78%)를 함유하는 배지에서 가장 높은 레벨의 암모니아로 전환되었다. 식물성 재료, 즉 클로렐라 및 보리를 함유하는 배지에 있어서는 수율이 보다 낮았다(표 7). 모두 4개의 재료가 배지 중에 25%+25%+25%+25%의 비율로 혼합된 경우, 4일 후의 암모니아 수율은 67.5±6.7%이었다.
표 7. 다른 재료 및 그들의 혼합물을 함유하는 배지에 있어서의 4일 후의 S1 개체군의 암모니아 생산량. 하기 결과는 2개의 생물학적 반복 실험값의 평균값이다. 상기 2개의 생물학적 반복 실험값으로부터의 3개의 반복 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00011
보리를 함유하는 배지에 있어서의 수율은 배양 동안에 상기 배지에 염기를 첨가함으로써 증가되었다. 상기 배양물의 pH는 상기 배양물에 NaOH를 첨가함으로써 7~8로 유지된 경우(초기 및 1, 4, 5 및 6일의 배양 후), 4일의 배양 후의 암모니아 수율은 다음과 같았다: 닭 및 보리를 함유하는 배지에서는 54.5±9.0%, 클로렐라 및 보리를 함유하는 배지에서는 35.6±4.4%, 및 보리 배지에서는 61.2±7.1%(7일의 배양 후). 탄수화물 첨가가 암모니아화에 미치는 부정적 효과의 결과를 참고하면, 보리의 산성화 효과는 동물성 재료와 비교해서 높은 탄수화물 함유량을 야기할 수 있다.
결과(II). 또한, 보리의 산성화 효과가 충분한 양의 동물성 재료를 배지에 첨가함으로써 회피될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해서, 보리 브리켓이 다른 비율로 닭 부산물 및 어류 부산물과 함께 혼합되었다. 이들 실험은 60ml 체적에서 행해졌다.
표 8은 닭 부산물을 함유하는 배지에 있어서, 이 배지 중의 보리의 최대 비율은 30%이었고, 그 후 pH는 5 이하로 낮아졌으며, 암모니아 수율은 최대 21%이었던 것을 나타낸다. 어류 부산물을 함유하는 배지에 있어서, 배지 중에 40% 미만의 어류가 있는 경우, pH는 5 이하로 낮아지고, 또한 암모니아 수율이 유의적으로 감소되었다.
표 8. 3일 후, 다른 재료 및 그들의 혼합물을 함유하는 배지에 있어서의 S1 개체군 암모니아 생산량. 하기 결과는 2개의 생물학적 반복 실험값의 평균값이다. 상기 2개의 생물학적 반복 실험값으로부터의 3번의 반복 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00012
동물성 재료와 식품 폐기물의 암모니아화. 또한, 다진 어류 폐기물과 다진 식품 폐기물의 혼합물은 S1 개체군에 의해 암모니아화되었다. 100ml 체적 중에 40g 원재료를 함유하는 배지는 27.1g/kg의 질소 함유량을 갖는 어류 폐기물 및 10.1g/kg의 질소 함유량을 갖는 식품 폐기물로부터 조제되었다. 상기 식품 폐기물은 식물성 재료 및 동물성 재료의 양쪽을 함유하였다. 배지는 중성 pH7로 조정되었다. MBM 배지(180g/l)에서 배양되는 S1 개체군은 각 60ml의 배지에 5%(v/v)의 접종물로서 첨가되었다. 상기 배양물은 +50℃에서 배양되었고, 상기 배양물의 암모늄 생산량은 3일의 배양 후에 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정되었다.
결과. S1 개체군은 적어도 60%의 어류 폐기물 및 최대 40%의 식품 폐기물을 함유하는 배지에 있어서, 상기 배지 중의 질소가 암모늄으로 55~72% 전환되었다(표 9). 상기 배지 중에 50% 이하의 어류 폐기물이 있는 경우, 상기 배양물의 pH는 pH 5 이하로 낮아지고, 상기 암모니아 수율은 8~16%로 감소되었다. 또한, 실시예 3에 있어서 상기 배지 중으로의 탄수화물의 첨가는 상기 배지의 산성화를 야기하고, 또한 암모니아화에 네거티브적인 영향을 미쳤다. 상기 식품 폐기물의 높은 탄수화물 함유량은 상기 배지 중에서 그 비율이 지나치게 높은 경우, 즉 40%이상인 경우, 관찰되는 배지의 산성화의 원인일 수 있다.
표 9. 3일 후, 어류 및 식품 폐기물을 다른 비율로 함유하는 배지에서 배양되는 S1 개체군의 암모니아 생산량 및 pH. 3개의 반복 측정값의 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00013
결론. 각종 재료의 혼합물을 S1 개체군을 이용하여 암모니아화시켰다. 통상, 식물성 재료는 동물성 재료보다 덜 효율적으로 암모니화되었다. 본 발명의 임의의 가설 또는 이론에 의해 제한되고자 하지 않지만, 이 결과는 배양 동안의 배지의 산성화에 의해 설명되는 것이 가능하다. 배지의 산성화는 배양물에 염기를 첨가함으로써 회피될 수 있다. 또한, 식물 및 동물성 재료가 적절한 비율로 혼합된 경우, 산성화가 회피되어 보다 높은 암모니아 수율이 달성되었다.
실시예 4
파일럿 규모에서의 암모니아화
신선한 동물성 재료의 암모니아화에 있어서의 S1 박테리아 개체군의 힘은 20~25L 규모로 나타내어진다. 이들 발효 또는 배양 방법에 온도 제어 시스템 및 교반 매커니즘을 각각 함유하는 스틸로 제조된 30L의 밀폐 용기가 사용되었다. 증식 배지는 육계 부산물 또는 어류 부산물로 제조된 20%의 현탁액이었다. 상기 실험의 일부에 있어서, 상기 배양물에 180g/l MBM 배지에서 배양된 S1 개체군의 2.5% 또는 5%(v/v) 접종물이 첨가되었다. 상기 배양물은 2~3일 동안 +37℃ 또는 +50℃에서 적당히 일정하게 교반되면서 배양되었다. 암모니아 생산량은 매일 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 이용하여 측정되었다.
결과. 닭 부산물이 20L 체적에서 +50℃에서 배양되었을 때에, 상기 배양물 중으로의 5% S1 접종물의 첨가는 40.5시간 후의 암모니아 수율을 5%~72%로 유의적으로 증가시키는 것으로 나타났다(도 4). 어류 부산물에 25L 체적으로 2.5% S1 접종물의 첨가는 상기 배양물이 +50℃에서 배양된 경우, 39.5시간 후의 암모니아 수율을 71%~91%로 증가시켰다.
S1 개체군을 이용한 어류 부산물 발효 또는 배양 방법에 있어서, 배양 온도 +37℃와 +50℃를 비교하였다. 24시간의 배양 후에, 상기 암모니아 수율은 +50℃에서 80±6%로 높아졌고, +37℃에서 58±6%로 낮아졌다. 이것은 +50℃가 S1 박테리아 개체군을 이용한 단백질성 재료의 암모니아화를 위한 양호한 온도인 것을 확인시킨다.
결론. 20~25L 규모에서 달성된 이들 결과는 동물 유래 재료를 함유하는 배지 중으로의 박테리아 개체군의 첨가가 암모니아 수율을 증가시키는 것을 나타내는 실시예 2의 결과를 확인시킨다.
실시예 5
육골분으로부터의 혼합된 개체군의 유도
A1 개체군은 다음과 같이 생성되었다: 아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae) CECT 2095(ATCC 배지 336, 제조법은 다음과 같다: 잘게 썬 포테이토를 500ml의 물에서 완전히 조리될 때까지 삶는다. 여과하고, 여과물에 1,000ml의 물을 첨가한다. 20g 글루코오스 및 15g 아가를 첨가하고 121℃에서 오토클레이브함.)는 포테이토 덱스트로오스 아가(potato dextrose agar)에서 약 7일 동안 배양되었다. 포테이토 덱스트로오스 액상 배지(포테이토 덱스트로오스 아가로 조제되지만, 아가를 첨가하지 않음) 3ml를 아스페르길루스 오리제(A. oryzae) 아가 배양물에 넣고, 그 현탁액을 포테이토 덱스트로오스 배지 100ml에 옮겼다. 상기 배양물을 3일 동안 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 배양하였다. 이어서, MBM1의 고체 상태 배지는 수돗물 50ml과 비멸균된 MBM1 36g을 혼합함으로써 조제되었다. 아스페르길루스 오리제 액상 배양물 10ml을 상기 고체 상태 배지에 접종시키고, 상기 배양물을 16일 동안 +30℃에서 배양하였다. 이어서, 상기 배양물에 물을 첨가하여 물 1L당 MBM 180g의 농도를 얻었다. 이 액 배양물을 4일 동안 +50℃에서 배양하였다.
C1 개체군은 냉각된 수돗물과 비멸균된 MBM1을 물 1L당 MBM 180g의 비율로 혼합함으로써 생성되었다. MBM은 NH3 농도가 평형을 유지할 때까지 50℃에서 통기없이 배양되어 실시예 1에서 설명된 바와 같이 정지 증식 단계에 도달하였다.
H1 개체군은 끓인 수돗물과 비멸균된 MBM1을 물 1L당 MBM 180g의 비율로 혼합함으로써 생성되었다. 상기 혼합물은 실온에서 냉각시켰다. MBM은 NH3 농도가 평형을 유지할 때까지 50℃에서 통기없이 배양되어 실시예 1에서 설명된 바와 같이 정지 증식 단계에 도달하였다.
P1 개체군은 냉각된 수돗물과 비멸균된 MBM1을 물 1L당 MBM 45g의 비율로 혼합함으로써 생성되었다. 상기 혼합물은 20mM MOPS를 이용하여 pH9로 완충되고, 50℃에서 통기없이 배양되었다. 이어서, 상기 정지 증식 단계에 도달된 배양물은 멸균된 MBM1 배지에 접종되는데 사용되고, 정지 단계까지 50℃에서 통기없이 배양되었다. 접종 및 배양은 7회 반복되었다. 따라서, P1은 초기의 MBM1 개체군의 8번째 세대를 나타낸다.
S1 개체군은 냉각된 수돗물과 비멸균된 MBM2를 물 1L당 MBM 180g의 비율로 혼합함으로써 생성되었다. MBM은 NH3 농도가 평형을 유지할 때까지 50℃에서 통기없이 배양되어 실시예 1에서 설명된 바와 같이 정지 증식 단계에 도달하였다.
All 개체군은 상기 액상 배양물을 +4℃에서 저장함으로써 유지되었다. 이 배양물은 실시예 1~실시예 6에서 사용된 상기 배양물을 접종하는데 사용되었다.
온도의 영향. 비멸균된 MBM으로부터의 암모니아화시키는 박테리아 개체군의 농화를 위한 최적의 온도를 결정하기 위해서, 비멸균된 MBM 배지(냉각된 수돗물 1L당 MBM1 또는 MBM2 180g)를 조제하고, 20mM MOPS을 이용하여 pH7.5~8로 완충시켰다. 상기 배지는 통기없이 7일 동안 실온과 80℃ 사이의 다양한 온도에서 배양되었다. NH3 농도는 실시예 1에 설명된 바와 같이 측정되었다. 결과는 도 5에 나타내어진다.
결과. MBM1에 개체군을 유도하기 위한 최적의 온도는 50℃이었다(도 5). 약간 낮은 온도, 45℃는 이 온도에서의 결과 사이의 높은 편차로부터 알 수 있는 바와 같이 중온성 개체군과 호열성 개체군 사이에 위치하는 것으로 보인다. 상기 생물학적 반복 샘플 중 일부에서는 높은 질소 전환 효율이 있었고, 반면에 일부는 낮은 회수율을 나타냈다. 상기 호열성 개체군은 55℃에서 모든 생물학적 반복 샘플에서 개체군이 유도되지 않았으므로 확실한 최적의 온도를 갖는다. MBM2는 광범위한 온도, RT~70℃에서 개체군 유도에 대해 높은 가능성을 갖는다. MBM2 개체군은 MBM1 개체군보다 광범위한 온도에서 암모니아화가 활성화된다.
pH의 영향. 비멸균된 MBM으로부터의 암모니아화시키는 박테리아 개체군의 농화를 위한 최적의 pH를 측정하기 위해, 비멸균된 MBM 배지(물 1L당 MBM 180g)를 조제하고, 그들의 pH를 다른 레벨(pH5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12)로 조정하거나 또는 조정하지 않았다. 이들 배지는 통기없이 7일 동안 +50℃에서 배양되었다. 배양 동안에, 하나의 실험에 있어서 pH를 1일, 2일, 3일 및 4일에 초기의 레벨로 조정하였다. 또 다른 실험에 있어서, pH를 배양 동안에 조정하지 않았다. 2개의 다른 제조사로부터 입수된 육골분 사료(MBM1 및 MBM2)가 시험되었다.
결과. 상기 배양물의 pH를 매일 조정한 경우, MBM1로부터의 암모니아화시키는 개체군의 농화(enrichment)를 위한 최적의 pH 범위는 7~9이었다(표 10). 상기 배양의 초기에만 pH를 조정한 경우, 최적의 pH 범위는 8~11이었다. MBM2에 있어서, pH를 매일 조정한 경우, 최적의 pH는 6~9이었다. 상기 실험의 초기에만 pH를 조정한 경우, 5~11의 pH가 암모니아화시키는 박테리아의 농화에 대해 모두 동등하게 양호하였다.
표 10. 배양물의 pH가 비멸균된 MBM1 및 MBM2로부터의 암모니아화시키는 박테리아 개체군의 농화에 미치는 영향. 배양 pH는 실험의 초기에 조정되거나 또는 매일 조정되었다. 2개의 생물학적 반복 실험값 및 각 샘플의 3개의 기술적 반복 측정값에 대한 표준 편차를 나타낸다.
Figure 112015089546192-pct00014
결론. 혼합된 개체군은 2개의 다른 제조사로부터 입수된 육골분으로부터 유도될 수 있다. 개체군은 다양한 온도에서 유도되지만, 최적의 온도는 MBM에 따라 가변적이다. pH가 6 이하 또는 9 이상으로 유지되는 경우, 개체군의 유도가 MBM 양쪽에서 억제된다.
실시예 6
아스페르길루스 오리제를 이용한 암모니아화를 위한 식물 유래 재료의 전처리
혼합된 박테리아 개체군을 이용한 탄수화물이 풍부한 식물성 재료의 암모니아화는 실시예 2 및 실시예 3에서 설명된 바와 같이 배양물의 산성화를 야기할 수 있다. 이 실험에 있어서, 암모니아화에 있어서의 식물성 재료의 암모니아화 효과를 감소시키기 위해 식물성 재료는 아스페르길루스 오리제로 전처리되었다.
먼저, 유채박, 밀 브리켓, 보리 브리켓, 보리 매쉬, 및 식품 폐기물(주로 식물성 재료를 함유하지만, 또한 육류를 함유하는 경우가 있음)은 아스페르길루스 오리제 CECT 2095를 이용하여 가수분해되었다. 유채박 또는 밀 브리켓 36g, 및 90ml 수돗물을 함유하는 배지는 1L 체적의 삼각플라스크에서 조제되었다. 보리 브리켓 18g 및 수돗물 45ml을 함유하는 배지, 보리 매쉬 18g 및 수돗물 20ml을 함유하는 배지, 또는 식품 폐기물 32g 및 수돗물 43ml을 함유하는 배지가 500ml 체적의 삼각플라스크에 조제되었다. 유채박 및 밀 브리켓 배지는 상기 배지를 멸균시키기 위해 +121℃에서 오토클레이브되거나 또는 비멸균된 상태로 방치되었다. 보리 배지 및 식품 폐기물 배지는 비멸균된 상태로 방치되었다.
먼저, 아스페르길루스 오리제 CECT 2095는 실온에서 3~7일 동안 포테이토 덱스트로오스 아가 플레이트(잘게 썬 포테이토 300g을 500ml의 물에서 완전히 조리될 때까지 삶고, 상기 액을 여과하고, 1,000ml의 물을 첨가하고; 글루코오스 20g 및 아가 15g을 첨가하고; 상기 배지를 121℃에서 오토클레이브하고, 플레이트 상에 붓는다)에서 배양되었다. 이어서, 아스페르길루스 오리제는 포테이토 덱스트로오스 액상 배지(포테이토 덱스트로오스 아가로 조제되지만, 아가는 없음)에 접종되고, 3~5일 동안 부드럽게 진탕시키면서 실온에서 배양되었다. 상기 액상 배양물의 10ml 및 5ml을 각각 1L 및 500ml 삼각플라스크의 배지에 접종시켰다. 상기 배지의 최종 농도는 다음과 같다: 유채박, 밀 브리켓 및 보리 브리켓 360g/l, 보리 매쉬 720g/l 및 식품 폐기물 400g/l.
상기 배양물은 모두 14일 동안 +30℃에서 배양되었다. 이어서, 상기 배양물을 칭량하고, 배양 동안에 상기 배양물로부터 물이 증발된 만큼 상기 배양물에 물을 첨가하였다. 아스페르길루스 오리제에 의해 가수분해된 배지는 혼합된 박테리아 개체군 S1을 이용하여 암모니아화시켰다. 먼저, 수돗물을 상기 배양물에 첨가하여 물 1L당 식물성 재료 90g의 농도의 배지를 얻었다. 식품 폐기물 배지는 초기의 40% 농도로 유지되었다. 5%(v/v) S1 접종물을 40ml 또는 60ml의 배지에 첨가하고, 상기 배양물을 7일 동안 +50℃에서 배양하고, 상기 배양물 중의 암모늄 생산량을 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다.
대조군으로서, 유채박, 밀 브리켓, 보리 브리켓, 보리 매쉬 및 식품 폐기물은 임의의 전처리없이 S1 개체군에 의해 암모니아화시켰다. 물 1L당 밀 브리켓, 유채박, 보리 브리켓 또는 보리 매쉬 180g/l를 함유하는 배지 및 식품 폐기물의 40% 현탄액을 수돗물로 조제하였다. S1 개체군의 5% 접종물은 40ml 또는 60ml의 배지에 첨가되었고, 상기 배양물은 7일 동안 +50℃에서 배양되었다. 상기 배양물의 pH는 조정되지 않거나, 또는 이어서 매일(0, 1, 2, 3, 및 4일에) NaOH를 이용하여 중성 레벨로 조정되었다. 상기 배양물의 암모늄 생산량은 암모니아용 효소 측정 키트(암모니아 어세이 키트 AA0100; Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정되었다.
결과. 아스페르길루스 오리제를 이용한 14일의 전처리 후, 상기 배양물의 pH는 7~9이었다. 모든 비전처리 식물 배지에 있어서, pH는 산성이었다. 아스페르길루스 오리제를 이용한 식물 유래 재료의 전처리는 비전처리된 식물성 재료와 비교했을 때에 암모니아 수율이 1.7~8배 증가되었다(표 11). NaOH를 이용하여 배양물 pH를 매일 조정함으로써, 암모늄 생산량에 있어서의 마찬가지의 증가가 얻어졌다. 따라서, 상기 아스페르길루스 오리제를 이용한 식물성 재료의 전처리는 탄수화물이 풍부한 식물성 재료가 암모니아화에 미치는 산성화 영향을 극복하기 위한 대체 수단이다. 식물성 재료는 아스페르길루스 오리제의 전처리 전에 멸균되거나 또는 비멸균된 상태로 방치될 수 있다.
표 11. pH 조정 또는 pH 미조정(비멸균된 배지가 사용되었음), 또는 아스페르길루스 오리제를 이용한 14일의 전처리(상기 배지는 비멸균되거나 또는 아스페르길루스 오리제의 접종 전에 멸균되었음)의 다른 식물성 재료에서의 S1 개체군의 암모니아 생산량. 암모늄 생산량은 7일 동안 질소로 전환되는 N의 백분율로 나타내어진다. 하기 결과는 2개의 생물학적 반복 실험값 및 각 샘플의 3개의 반복 측정값의 평균값이다. 아스페르길루스 오리제를 이용한 실험에 있어서, 2개의 생물학적 반복 아스페르길루스 오리제 배양물 및 2개의 생물학적 반복 S1 배양물이 생성되었다.
Figure 112015089546192-pct00015
실시예 7
천연의 개체군 및 암모니아화시키는 군집으로서 접종되는 육골분 유래 개체군
육계 닭 부산물(CBP-M), 돼지/소 부산물(PB-M), 닭 우모(FE-M), 어류 부산물(MF-M) 및 파쇄된 돼지/소 뼈(CB-M)의 천연의 개체군에 대한 박테리아 군집 분석은 세포가 비드 비팅에 의해 파쇄된 배양물로부터의 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 추출에 의해 얻어지는 DNA에 대하여 행해졌다. 배양된 개체군은 생육되어 4일 동안(FE는 8일 동안) 50℃에서 배양되는 20%(중량/체적)의 재료로부터 수확되었다. 태그-인코디드 FLX 앰플리콘 파이로시퀀싱(bTEFAP)에 의한 박테리아 16S 유전자 어세이 및 박테리아 다양성 데이터 분석은 Dowd 등. 2008a 및 Wolcott 등. 2009에 기재된 바와 같이 리서치 앤드 테스팅 랩(Lubbock, Texas, USA)에 의해 행해졌다. 프라이머 28F 'GAGTTTGATCNTGGCTCAG'(SEQ ID NO: 1) 및 519R 'GTNTTACNGCGGCKGCTG'(SEQ ID NO: 2)는 16S 가변 영역 V1-3의 증폭에 사용되었다.
결과. 천연의 군집 및 접종된 군집의 박테리아 다양성 분석은 58개의 다른 속에 속하는 박테리아의 존재를 밝혀냈다(표 12). 총 115개의 결과 중, 79개는 종의 레벨에서 동정되고, 36개는 속의 레벨에서 동정되었다. 표 13은 각 개체군에서 우점하는 박테리아 종 및 속을 나타낸다. 5~9의 다른 속에 속하는 박테리아가 상기 개체군의 대부분을 형성한다. 클로스트리디움 에스피피 및 스포라나에로박터 아세티게네스는 PB-M 및 MF-M의 천연의 개체군뿐만 아니라 S1이 접종된 재료로부터 유래된 개체군에서도 우점한다. 다른 3개의 천연의 개체군은 보다 다양성을 나타낸다: 우점적으로 엔테로코쿠스 에스피피(Enterococcus spp.) 및 페디오코쿠스 에스피피(Pediococcus spp.)로 이루어지는 CBP-M, 우점적으로 페트로박터 숙시나티만덴스(Petrobacter succinatimandens), 쇤네게니아 사카롤리티카(Soehngenia saccharolytica ), 티시에렐라 에스피(Tissierella sp.), 및 클로스트리디움 에스피피로 이루어지는 FE-M 개체군, 및 우점적으로 렙토트릭스 에스피(Leptothrix sp .) 및 쉴레겔렐라 에스피피(Schlegelella spp.)로 이루어지는 CB-M 개체군.
상관 계수(표 14)는 표 12에 나타내는 데이터로부터 식[1]을 이용하여 산출되고, 여기서 X 및 Y는 상관 계수가 산출되는 2개의 매트릭스, 예를 들면 CBP-M 및 CBP를 의미하고, x 및 y는 매트릭스 내의 단일값이고, 또한
Figure 112015089546192-pct00016
및
Figure 112015089546192-pct00017
는 매트릭스 내의 모든 값의 평균값이다. 상기 개체군에 존재하지 않는 종(표 12에 있어서의 빈칸)은 값을 0으로 지정했다.
Figure 112015089546192-pct00018
표 14는 모두 5개의 접종된 재료의 개체군 PB-M과 천연의 개체군 MF-M 사이의 높은 유사성을 나타낸다. 나머지 천연의 개체군 CBP-M, FE-M 및 CB-M은 다른 개체군에 대해서뿐만 아니라 상호간에 낮은 유사성을 나타낸다. 표 3의 결과에 기초하여 상술한 바와 같이, S1은 동물 유래 재료에 존재하는 천연의 개체군을 경쟁에서 앞선다. 그러나, 사용되는 조건 하에서 S1과 유사한 개체군이 동물 유래 재료(PB-M 및 MF-M)에서 유발될 수 있다. 이것은 육골분, S1의 공급원 및 기타 효율적으로 암모니아를 생성하는 개체군 A1, C1, H1 및 P1(실시예 5 참조)이 각종 동물종의 도축 부산물로부터 제조되기 때문일 가능성이 있다. 그러나, 천연의 개체군과 CBP, FE 및 CB의 접종된 개체군의 비교는 박테리아 군집이 유사한 조건 하에서 다른 조성으로 진화될 수 있는 것을 나타낸다. 또한, 표 14는 DNA 추출을 위해 상기 개체군을 수확할 때의 암모늄 수율, 즉 암모니아로 전환되는 동물 유래 재료 중의 질소의 백분율을 나타낸다. 상기 수율은 접종된 개체군과 천연의 개체군의 유사성과 관련이 있다. 40% 이상의 수율은 상관 계수가 0.9 이상, 바람직하게는 0.95 이상인 경우에만 달성된다.
표 12. 박테리아 다양성 분석 결과: 동물 유래 재료와 천연의 개체군의 속 및 종: 육계 닭 부산물(CBP-M), 돼지/소 부산물(PB-M), 닭 우모(FE-M), 어류 부산물(MF-M) 및 파쇄된 돼지/소 뼈(CB-M). 또한, 다양성 분석은 육골분 유래 개체군 S1 5%(체적/체적)가 접종된 동일한 재료에 대하여 행해졌다. 이들 결과는 CBP, PB, FE, MF 또는 CB로 표기하고, 표 1에 나타낸 것과 동일하다. 하기 결과는 총 개체군의 백분율로서 나타내어진다.
Figure 112015089546192-pct00019
Figure 112015089546192-pct00020
Figure 112015089546192-pct00021
Figure 112015089546192-pct00022
Figure 112015089546192-pct00023
표 13. 개체군 CBP-M, CBP, PB-M, PB, FE-M, FE, MF-M, MF, CB-M 및 CB에 있어서의 우점하는 박테리아 속 및 종. 하기 결과는 총 개체군의 백분율로서 나타내어진다.
Figure 112015089546192-pct00024
표 14. 표 12에 나타내는 데이터로부터 식[1]을 이용하여 산출되는 혼합된 개체군의 박테리아 다양성 사이의 상관 계수. 수율(마지막 행)은 DNA 추출을 위해 상기 개체군을 수확할 때에 암모니아로 전환되는 동물 유래 재료 중의 질소의 백분율이다.
Figure 112015089546192-pct00025
실시예 8
토양 및 육골분으로부터 유래된 개체군에 의한 암모니아화의 효율
박테리아 군집 조성 및 육골분 및 기타 공급원로부터 유래된 개체군의 암모니아 작용의 성능을 비교하기 위해서, 천연의 개체군을 숲 및 들의 토양으로부터 배양하였다.
FO1 및 FI1 개체군은 물 1L당 토양 180g의 비율로 냉각된 수돗물과 비멸균된 숲 토양 또는 대지 토양을 혼합함으로써 생성되었다.
상기 혼합물은 50℃에서 통기없이 배양되었다. FO2 및 FI2 개체군은 끓인 수돗물과 비멸균된 숲(FO) 또는 들(FI) 토양을 물 1L당 토양 180g의 비율로 혼합함으로써 생성되었다. 상기 혼합물은 실온에서 냉각되었다. 모든 혼합물은 50℃에서 통기없이 배양되었다. 7일의 배양 후, 5ml의 각 배양물은 물 1L당 MBM1 180g을 함유하는 100ml의 멸균된 MBM1 배지에 접종되었다. 상기 배양물은 7일 동안 50℃에서 배양되었다.
토양 개체군의 박테리아 군집 분석은 세포가 비드 비팅에 의해 파쇄된 배양물로부터 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올 추출에 의해 얻어지는 DNA에 대하여 행해졌다. 태그-인코디드 FLX 앰플리콘 파이로시퀀싱(bTEFAP)에 의한 박테리아 16S 유전자 어세이 및 박테리아 다양성 데이터 분석은 Dowd 등. 2008a 및 Wolcott 등. 2009에 기재된 바와 같이 리서치 앤드 테스팅 랩(Lubbock, Texas, USA)에 의해 행해졌다. 프라이머 28F 'GAGTTTGATCNTGGCTCAG'(SEQ ID NO: 1) 및 519R 'GTNTTACNGCGGCKGCTG'(SEQ ID NO: 2)는 16S 가변 영역 V1-3의 증폭에 사용되었다.
결과. 토양 유래 개체군 및 MBM 유래 개체군의 박테리아 다양성 분석은 45개의 다른 속에 속하는 박테리아의 존재를 밝혀냈다(표 15). 총 85개의 결과 중, 66개는 종의 레벨에서 동정되고, 19개는 속의 레벨에서 동정되었다. 표 16은 각 개체군에서 우점하는 박테리아 속 및 종을 나타낸다. 6~7개의 다른 속에 속하는 박테리아가 개체군의 대부분을 형성한다. 클로스트리디움 에스피피 및 스포라나에로박터 아세티게네스는 FO1 및 FI1뿐만 아니라 MBM 유래 개체군에서 우점한다. 다른 2개의 토양 개체군은 보다 다양성을 나타낸다: 우점적으로 바실루스 에스피피(Bacillus spp .), 테르모아나에로박테리움 에스피피(Thermoanaerobacterium spp .) 및 클로스트리디움 에스피피로 이루어지는 FO2, 및 클로스트리디움 에스피피, 티시에렐라 에스피 및 칼로라마터 에스피로 이루어지는 FI2.
상관 계수(표 17)는 표 15에 나타내는 데이터로부터 식[1]을 이용하여 산출되고, 여기서 X 및 Y는 상관 계수가 산출되는 2개의 매트릭스, 예를 들면 A1 및 C1을 의미하고, x 및 y는 매트릭스 내의 단일값이고, 또한
Figure 112015089546192-pct00026
및
Figure 112015089546192-pct00027
는 매트릭스 내의 모든 값의 평균값이다. 상기 개체군 내에서 존재하지 않는 종(표 15에 있어서의 빈칸)은 값을 0으로 지정했다.
Figure 112015089546192-pct00028
표 17은 토양 개체군 FO1 및 FI1뿐만 아니라 모든 5개의 MBM 유래 개체군 사이의 높은 유사성(상관 계수>0.9)을 나타낸다. 따라서, MBM 유래 개체군과 유사한 개체군이 토양으로부터 유발될 수 있다. FO2와 FI2의 상관 계수는 0.2 미만이어서 낮은 유사성을 나타낸다. 따라서, 끓는 물에 토양을 용해시키는 것은 암모니아화에 중요한 박테리아에게는 치명적이다. 또한, 표 17은 DNA 추출을 위해서 상기 개체군을 수확할 때에 암모니아로 전환되는 MBM 중의 질소의 백분율을 나타낸다. 상기 수율은 접종된 개체군과 천연의 개체군의 유사성에 관련된다. 40% 이상의 수율은 상관 계수가 0.9 이상인 경우에만 달성된다.
표 15. 박테리아 군집 다양성 분석 결과: 토양 유래 개체군 및 육골분 유래 개체군 A1, C1, H1, P1 및 S1에 있어서의 속 및 종. 상기 육골분 유래 개체군 A1, C1, H1, P1 및 S1의 하기 결과는 표 1에 나타내는 것과 동일하다. 하기 결과는 총 개체군의 백분율로서 나타내어진다.
Figure 112015089546192-pct00029
Figure 112015089546192-pct00030
Figure 112015120613193-pct00048
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암모니아 생산은 반추 동물에 있어서 영양학적으로 매우 비효율적이다. 아미노산을 대사하여 암모니아를 생산하는 반추위의 활성의 대부분은 하이퍼 암모니아화시키는 박테리아(HAB)(Russell 등. 1988; Chen 및 Russell 1989; Krause 및 Russell 1996, Eschenlauer 등. 2002)라고 명명된 특정 미생물에 기인한다. 따라서, 반추위는 효율적으로 암모니아를 생성하는 박테리아의 공급원일 수 있다.
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암모니아화 개체군의 농화는 멸균된 MBM1에서 소 반추위 박테리아를 배양하는 연속적인 라운드에 의해 시도되었다. 소 반추위 내용물은 누공 형성 암소(fistulated cow)로부터 얻어졌고, 여과하여 고체로부터 액체를 분리하였다. 상기 액체는 멸균된 MBM1 배지[물 1L당 육골분 180g]에 25%(체적/체적) 접종물로서 첨가되고, 37℃에서 통기없이 배양되었다. 각 농화 사이클은 암모니아화 반응이 최대 한도에 도달하도록 7일 동안 지속되었다.
결과. 암모니아 수율, 즉 암모니아로 전환되는 질소의 백분율은 초기의 3 농화 사이클 동안에 12.3%±6.6%에서 24.7%±3.1%로 증가되었지만, 이어서 하기 4 사이클 동안에 동일한 레벨로 유지되었다. 실시예 1에 있어서의 도 1에 나타낸 바와 같이, MBM 유래 개체군은 37℃에서 37.9%±2.3%에서 58.8%±13.9%로 보다 높은 암모니아 수율을 생산한다. 따라서, 농화에도 불구하고, 상기 반추위 개체군은 MBM 유래 개체군보다 암모니아화에 있어서 덜 효율적으로 유지되었다.
상기 농화된 반추위 개체군은 군집 다양성 분석을 실시하지 않았다. Fouts 등. 2012은 종 레벨에서 동정되는 박테리아의 80%가 클로스트리디움(Clostridiales) 목, 박테로이데스( Bacteroidales ) 목, 에리시펠로트릭스(Erysipelotrichales) 목, 및 분류되지 않은 TM7에 속한다는 것을 12마리의 암소의 반추위 개체군에 대한 연구에서 보고하였다. 이 조성은 MBM 유래 개체군 A1, C1, H1, P1 및 S1(표 2)의 조성과 다르고, 그들 중 94~98%는 클로스트리디움(칼로라마터 속, 클로스트리디움 속, 스포라나에로박터 속, 가르시엘라(Garciella) 속 및 티시에렐라 속) 목에 속하는 박테리아로 이루어진다.
(토의)
상기 실험에 기초하여, 규정된 혼합된 개체군을 이용한 암모니아화는 종래 개술과 비교하여 우수한 수율을 야기한다. 상술의 개체군을 이용하여, 사용된 초기 재료/배지의 단백질 함유량에 따라 최대 12g/l의 암모니아 농도가 달성되었다. 이것은 종래 기술과 비교해서 암모니아 수율이 15~30배 증가된 것이다. 통상, 24~48시간 내에 상기 배지 중의 총 질소의 50~80%가 암모니아로 전환되는 것을 발견하였다. 도축장 부산물/폐기물의 암모니아화 방법의 실시예(100)를 도 6에 나타낸다. 상기 유기물(부산물)은 컨테이너(106)에 저장된다. 상기 컨테이너(106)의 폐기물은 바이오리액터(104)로 공급된다. 물은 물 공급원(102)으로부터 상기 바이오리액터(104)로 첨가된다. 접종물은 공급원(116)으로부터 상기 바이오리액터(104)로 첨가된다. 상기 접종물의 타입은 H1, C1, P1, S1 및 A1의 군에서 선택된다. 바람직하게는, 접종물은 S1의 혼합된 개체군으로부터 유래된다. 상기 바이오리액터는 혼합/교반 수단(105) 및 가열/온도 제어 수단(110)을 가질 수 있다. 실시형태에 따르면, 가열 장치(110)는 약 50℃(개체군 S1에 대해서는 55℃)에서 상기 바이오리액터(104)의 내용물을 가열하는데 사용된다. 필요하다면, pH는 pH를 유지시키기 위해 상기 바이오리액터(104)에 염기(NaOH 등)를 첨가함으로써 6 초과의 레벨로 제어될 수 있다. 발효 시간은 약 16~48시간이 바람직하다.
혼합된 박테리아 개체군을 이용한 발효 공정 동안에, 암모늄/암모니아는 발효 액체로 방출된다. 상기 바이오리액터(104)로부터의 액체의 샘플은 방법의 진행 후에 수시로 수거될 수 있다. 그 다음의 파라미터는 액체 내의 암모니아/암모늄 농도이다. 예를 들면, 본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 상기 발효 공정은 2개의 연속적인 샘플 사이에 암모니아/암모늄 농도의 변화가 유의적 증가를 나타내지 않을 때에 완료 또는 충분한 상태이다.
상기 바이오리액터(104) 내의 상기 액체의 전부 또는 일부는 암모늄/암모니아가 상기 액체로부터 암모니아(NH3)로 추출되는 스트리핑 단계(108)로 이어질 수 있다. 상기 암모니아는 비료 생산의 일부 등의 이후의 사용을 위해 컨테이너(112)에 저장될 수 있다. 대안적으로, 상기 액체의 일부 또는 전부가 컨테이너(113)로 이어져서 직접 비료로 사용될 수 있다.
상기 액체의 전부 또는 일부를 제거한 후에, 나머지 고체 및/또는 액체는 이후의 사용을 위해 저장고(114)에 수집될 수 있다. 또한, 저장고(114)의 재료 중 일부는 바이오리액터(104)로 다시 공급되어 다음 배치의 접종물로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 액체 및/또는 고체 중 일부는 다음 배치를 위한 기반을 형성하기 위해 상기 바이오리액터(104)에 잔존될 수 있다.
높은 탄수화물 함유량을 갖는 식물성 재료의 암모니아화는 상기 발효 공정 동안에 배지의 산성화에 의해 억제될 수 있다. 배지의 산성화는 배양물에 염기(NaOH 등)를 첨가함으로써 회피될 수 있다. 또한, 식물성 재료 및 동물성 재료를 적절한 비율로 혼합하는 경우, 산성화가 회피되어 보다 높은 암모니아 수율이 달성될 수 있다.
다른 단백질성 재료의 암모니아화는 혼합된 박테리아 개체군의 적당한 선별에 의해 최적화될 수 있다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 각 재료의 암모니아화 효율은 사용되는 박테리아 개체군에 의존적이다. 예를 들면, 돼지/소 부산물은 개체군 H1을 이용하여 가장 효율적으로 암모니아화되고, 반면에 어류 부산물은 S1 개체군을 이용하여 가장 효율적으로 암모니아화된다. 평균적으로, 개체군 H1 및 S1은 모든 다른 단백질성 재료에 대해 가장 효율적인 암모니아화제이고, 또한 H1 또는 S1은 어느 것이나 임의의 재료의 암모니아화에 사용되는 개체군으로서 선택될 수 있다.
S1 및 다른 MBM 유래 개체군은 각종 동물 유래 재료의 암모니아화에 효율적이다. 이들 재료 중 일부는 상기 MBM 유래 개체군을 생성하기 위해 이용된 조건과 유사한 조건 하에서 배양된 경우에 고유의 개체군의 암모니아화를 효율적으로 상승시킬 수 있다. 그러나, 모든 동물 유래 재료가 암모니아화 개체군을 갖는 것은 아니다. 반추위는 하이퍼 암모니아 생산 박테리아 종의 공지된 공급원이지만, MBM 유래 개체군과 유사한 효율을 갖는 암모니아화시킬 수 있는 혼합된 개체군의 농화는 불가능하다. 또한, 토양 샘플은 사용되는 조건에 따라서 효율적으로 암모니아화시키는 개체군 및 비효율적으로 암모니아화시키는 개체군을 유발할 수 있다.
30℃~60℃, 보다 상세하게는 37~55℃의 온도, 및 pH5~11, 보다 상세하게는 pH6~9는 본원에 기재된 개체군에 의한 박테리아의 암모니아화에 가장 적합하였다. 구체적으로는, S1과 실질적으로 동일한 박테리아 개체군과 함께 유기물을 접종하는 것은 양호한 암모니아화 수율을 야기한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 유기물을 총 개체군 중의 스포라나에로박터 아세티게네스 53~91% 및 클로스트리디움 에스피피 8~34%를 구성하는 박테리아 개체군과 접촉시키는 것은 양호한 암모니아화 수율을 야기한다. 암모니아화는 혼합된 개체군을 이용하여 혐기성 조건, 미세호기성 조건, 및 호기성 조건 하에서 작동한다.
(참조에 의한 포함)
본 발명의 전체에 걸쳐 다수의 참고자료가 인용되고 있으며, 각각 그 전체가 본원에 참고자료로서 포함된다.
(수탁증명서)
다음의 생물학적 재료의 배양은 특허 절차상의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약을 충족하는 조건 하에서 다음의 국제 기탁기구에 수탁되었다:
네덜란드
우트레흐트 3584 씨티
웁살랄란 8
센트라알부레아우 보오르 쉼멜쿨투레스(씨비에스)
(국제 수탁번호)
수탁된 혼합된 박테리아 개체군 CBS 수탁번호 수탁일자
S1 CBS 136063 2013년 8월 22일
(참고문헌)
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Dowd, S.E., Sun, Y., Secor, P.R., Rhoads, D.D., Wolcott, B.M., James, G.A., Wolcott, R.D. 2008b. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology 8: 43.
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Fouts, D.E., Szpakowski, S., Purushe, J., Torralba, M., Waterman, R.C., MacNeil, M.D., Alexander, L.J., Nelson, K.E. 2012. Next generation sequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the bovine rumen. PLoS One 7(11): e48289.
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센트라알부레아우 보오르 쉼멜쿨투레스 CBS136063 20130822
SEQUENCE LISTING <110> Ductor Oy <120> EXTRACTION OF NITROGEN FROM ORGANIC MATERIALS THROUGH AMMONIFICATION BY MIXED BACTERIAL POPULATIONS <130> 44545-1002-W <150> 61/789,062 <151> 2013-03-15 <150> 14/066,089 <151> 2013-10-29 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Universal 16S RNA Bacteria Primer <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gagtttgatc ntggctcag 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Universal 16S RNA Bacteria Primer <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> k is t or g <400> 2 gtnttacngc ggckgctg 18

Claims (22)

  1. 충분한 시간 동안의 발효 조건 하에서 암모니아화시킬 수 있는 혼합된 박테리아 개체군의 존재 하에서 유기물을 포함하는 수성 배지를 발효시켜 암모니아 또는 암모늄을 포함하는 발효 생산물을 제조하는 공정을 포함하는 유기물로부터 암모니아 또는 암모늄을 제조하는 방법으로서,
    상기 유기물은 암모니아 또는 암모늄으로의 전환에 바람직한 질소 화합물을 포함하고, 또한
    상기 혼합된 박테리아 개체군은 S1(CBS 수탁번호 136063)의 혼합된 박테리아 개체군에 대하여 적어도 0.90의 상관 계수를 갖는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효 공정은 30℃~60℃ 사이의 온도 범위 및 5~11의 pH 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효 공정은 40℃~50℃ 사이의 온도 범위 및 6~9의 pH 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 혼합된 박테리아 개체군은 S1(CBS 수탁번호 136063)의 상기 혼합된 박테리아 개체군에 대하여 적어도 0.95의 상관 계수를 갖는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효 공정은 40℃~55℃의 온도 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효 생산물로부터 암모니아 또는 암모늄을 회수하는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 암모니아 또는 암모늄은 기계적으로 회수되거나 또는 침전되는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 암모니아 또는 암모늄은,
    (a) 고체 및 액체 발효 생산물을 분리하는 단계,
    (b) 암모니아 또는 암모니아수를 포함하는 상기 액체 발효 생산물을 수집하는 단계, 또는 상기 발효 공정 또는 상기 분리 단계(a) 동안에 방출되는 가스 혼합물을 수집하는 단계, 및
    (c) 암모니아 또는 암모늄을 회수하는 단계에 의해 회수되는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 질소 화합물은 아민 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 유기물은 육골분(MBM), 동물성 분말, 동물성 부산물, 도축장 폐기물, 훼이, 도시 폐기물, 어분, 식품 및 발효 산업 폐기물류, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 식품 산업 폐기물은 동물성 부산물, 동물성 분말 및 식품 폐기물로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효 공정은 호기성 조건 또는 혐기성 조건에서 행해지는 것을 특징으로 하는 유기물로부터의 암모니아 또는 암모늄의 제조 방법.
  13. S1(CBS 수탁번호 136063)의 혼합된 박테리아 개체군에 대하여 적어도 0.95의 상관 계수를 갖는 것을 특징으로 하는 혼합된 박테리아 개체군.
  14. CBS 수탁번호 136063 하에서 네덜란드의 국제 기탁기구에 수탁된 S1의 혼합된 박테리아 개체군인 것을 특징으로 하는 혼합된 박테리아 개체군.
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