CN112662599A - 一株禽源贝莱斯芽孢杆菌cl-4及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株禽源贝莱斯芽孢杆菌CL‑4及其应用，属于农业畜牧应用领域，该菌株于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2020811。本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL‑4可应用在发酵玉米胚芽粕降解半纤维素和生产半纤维素酶方面。本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL‑4使用安全，且无毒副作用，具有降解玉米胚芽粕半纤维素、提高玉米胚芽粕中半纤维素酶产量和活性的作用，具有广阔的应用价值。

Description

一株禽源贝莱斯芽孢杆菌CL-4及其应用
技术领域
本发明属于农业畜牧应用技术领域，具体涉及一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4及其应用。
背景技术
近几十年以来，我国生猪饲料配方参照西方国家，以“玉米-豆粕”型日粮为主，包括饲料行业在内，根据国家粮油信息中心统计，2019年我国大豆总需求量达到10661万吨，其中，饲料行业中每年消耗豆粕约7000万吨，但国内大豆产量每年不超过2000万吨。由于国内蛋白源饲料严重缺乏，导致我国饲料行业过度依赖于大豆进口。因此，结合我国国情，大力研发和应用非常规蛋白质饲料资源可有效缓解我国饲料蛋白资源严重匮乏的现状。
吉林省玉米产量连续多年位居全国第一位，巨大的玉米产量带动着玉米深加工产业的深化改革与发展，丰富的玉米深加工副产物作为非常规饲料资源具有非常巨大的开发潜能。玉米胚芽粕(Corn germ meal，CGM)是从胚芽部分提取玉米油后得到的玉米工业副产品，具有中等能量和蛋白质的营养特性，粗蛋白约为22.6％。研究发现，纤维素和阿拉伯木聚糖是玉米胚芽粕的主要纤维成分，且纤维素的表观总消化低于50％。有研究表明，在日粮中添加高于30％的玉米胚芽粕会降低生长育肥猪的生长性能。此外，研究发现随着饲粮中玉米胚芽粕的添加量增加，粗蛋白的表观总消化率降低，即增加日粮中纤维含量对蛋白质消化率有负面影响。因而，玉米胚芽粕中高纤维含量和低消化率是在猪、家禽、反刍动物和鱼饲粮中应用的主要限制因素。此外，由于玉米深加工企业对玉米胚芽粕加工工艺的原因，玉米胚芽粕未经过脱溶脱臭处理，就会产生一种特别的异味，影响其适口性。由于玉米胚芽粕的生产过程中要经过泡酸这一道工艺，所以其成品的酸度值较低，其初始pH值约为4.0左右。如不经过调节pH处理，发酵菌株难以生长，进而导致发酵失败。
目前，动物营养学者们对玉米胚芽粕的相关科学研究，主要通过优化玉米胚芽粕在饲粮中的添加比例，代替饲粮中的部分玉米和豆粕组分，并且已经取得了一定的研究进展。但上述研究未从本质上解决玉米胚芽粕中高纤维含量的难题。
芽孢杆菌因易筛选，抗逆性强(耐酸，耐碱，耐高温)，有些芽孢杆菌可产生和分泌大量的胞外酶，有较高的生长速度和较短的发酵周期，而易于工业化生产。贝莱斯芽孢杆菌(B.velezesis)是芽孢杆菌属的一个新种，主要分离自植物根系及土壤，其可以通过分泌植物激素，如生长素和其他挥发性有机化合物促进作物生长；同时，B.velezesis能够分泌多种抗生素类物质和铁载体来抑制植物病原菌，其中部分菌株有望成为商业化的生防菌剂。
采用微生物发酵杂粕类饲料已成为近年来提高植物性蛋白质饲料利用率与饲喂效果的有效途径。但是在畜牧领域中，高产半纤维素酶的贝莱斯芽孢杆菌以及应用贝莱斯芽孢杆菌发酵玉米胚芽粕降解半纤维素的文章还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4及其应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2020811。
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4在发酵玉米胚芽粕降解半纤维素和生产半纤维素酶方面的应用。
作为优选的实施方式，本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CL-4在发酵玉米胚芽粕降解半纤维素和生产半纤维素酶方面的应用包括以下步骤：
(1)CL-4种子液的制备；
(2)玉米胚芽粕灭菌处理；
(3)发酵。
作为优选的实施方式，步骤(1)的具体操作过程如下：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4接种于LB斜面固体培养基上，37℃条件下培养24h；将培养好的CL-4斜面在无菌条件下用接种环接1环于100mL LB液体培养基中，于37℃、180rpm/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用。
作为优选的实施方式，步骤(2)的具体操作过程如下：将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min。
作为优选的实施方式，步骤(3)的具体操作过程如下：将灭菌处理后的玉米胚芽粕过50目筛，置于1000ml三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，按1×107CFU/g接菌量接入培养好的CL-4种子液，于37℃培养箱中需氧固体发酵24～120h，测定发酵玉米胚芽粕中半纤维素降解率为22.56～77.77％，半纤维素酶活性为20～70.81U/g。
本发明的有益效果是：
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，该菌株已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2020811。
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，对小鼠体态、四肢、体重、脾脏指数和肝体比均无显著影响，解剖后仔细观察小鼠肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。由此证实，本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4使用安全，且无毒副作用。
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，固体发酵玉米胚芽粕时，半纤维素降解率高达65.67％，由此说明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CL-4发酵玉米胚芽粕能够在短时间内大大降低玉米胚芽粕中半纤维素的含量。
本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，固体发酵玉米胚芽粕时，72h半纤维素酶活性达到最高，为70.81U/g，之后半纤维素酶活性维持在一个相对稳定水平，由此说明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4发酵玉米胚芽粕能够提高半纤维素酶产量和半纤维素酶活性。
因此，本发明的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4具有广阔的应用价值。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4的菌落形态。
图2为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4的革兰氏染色结果。
图3为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4固体发酵玉米胚芽粕生产半纤维素酶曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4的分离、筛选与鉴定
1、培养基
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基：LB液体培养基中加15～20g琼脂粉，121℃高压灭菌20min。
LB斜面固体培养基：LB液体培养基中加15～20g琼脂粉，121℃高压灭菌20min。
木聚糖酶筛选培养基：木聚糖1g，大豆蛋白胨0.3g，胰蛋白胨1.7g，NaCl 0.5g，葡萄糖0.25g，磷酸二氢钾0.25g，琼脂2g，蒸馏水定容至100mL，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。
产酶发酵培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，麸皮10g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。
2、试验方法
(1)分离样品：吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所肉鸡盲肠内容物。
(2)芽孢杆菌筛选：称取肉鸡盲肠内容物，加入适量灭菌生理盐水充分震荡分散，于水浴锅中80℃，处理20min。采用十倍连续稀释法，将10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9这6个稀释度的菌悬液分别涂布于LB固体培养基平板上，三次重复。37℃静止培养。长出菌群后根据形态特征挑取单一菌落经反复划线纯化后，保存于LB斜面培养基。
(3)高产半纤维素酶芽孢杆菌的初筛
将纯化后的菌株分别点种于木聚糖酶筛选培养基，于37℃培养24～48h至长出单一菌落后，经刚果红染色30min后，用1mol/L的NaCl溶液脱色30min，挑选并记录透明圈直径与菌落直径比值(SI)较大的菌株用于后续试验。
(4)产半纤维素酶芽孢杆菌的复筛
将初筛所得到的候选菌株以LB液体培养基活化后按1％接种量接入100mL产酶发酵培养基中，在37℃条件下180r/min摇床培养48h；培养液在4℃，8000r/min离心20min，收集上清，将上清用0.22μm的微孔滤膜过滤，所得上清液即为粗酶液；采用DNS法检测粗酶液中半纤维素酶活性，综合选择酶活力较高的菌株。
半纤维素酶活性的测定方法如下：采用DNS法测定样品中半纤维素酶活性。半纤维素酶活定义为：在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)，以U/g表示。
菌株的分离筛选结果如下：将从肉鸡盲肠内容物中分离得到的形态特征不同的单菌落经纯化后并分别接种到木聚糖酶筛选平板上，共分离得到4株能够在初筛培养基上生长且SI值＞4.0的菌株；然后经过DNS法测定其半纤维素酶活力，得到高产半纤维素酶活力的1株候选菌株，编号为CL-4。
(5)菌株鉴定
①形态学鉴定
挑取半纤维素酶活力最高的菌株的纯培养物种接于LB固体培养基平皿上，37℃培养20h，观察菌落形态。
形态学鉴定结果如下：
菌株CL-4在37℃条件下培养20h，形成灰白色菌落，不透明，表面较粗糙，似火山口凸起，如图1所示。光学显微镜下观察，革兰氏阳性，杆状，如图2所示。
②分子生物学鉴定
将目的菌株接种于新鲜的LB液体培养基中培养20h，采用天根生化科技有限公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：
1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′；
27f：5′-agagttgatcctggctcag-3′。
PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定。
分子生物学鉴定结果如下：
菌株CL-4的16S rDNA PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1500bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致，并进行测序，序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示。将测序序列与http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上已登录的部分菌株的16S rDNA基因序列进行比对，结果表明，菌株CL-4与已报道的Bacillus velezensis(MT573877.1、CP053377.1和CP051463.1等)的序列同源性为100％。鉴定CL-4菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。上述获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCC NO：M2020811。
实施例2贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4发酵玉米胚芽粕的原料预处理及制备工艺
1、材料
(1)发酵基料：玉米胚芽粕，由公主岭黄龙食品工业有限公司提供。
(2)菌种：本发明实施例1筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，由吉林省农业科学院动物营养与饲料研究所分离保存，芽孢杆菌BLCC1-0157和芽孢杆菌BLCC1-0155由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院菌种保藏中心提供。
(3)试剂：碳酸氢钠。
2、试验方法
(1)玉米胚芽粕原料灭菌处理：将原始玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min。
(2)未处理原料组(不加入碳酸氢钠)：称取一定量高压灭菌的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，每个样品设3个平行，作为未处理原料组。按1×107CFU/g接菌量分别接入实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CL-4、芽孢杆菌BLCC1-0157和芽孢杆菌BLCC1-0155，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的空白料作为未处理对照组，于37℃培养箱中需氧发酵，分别于发酵24h和48h取样，测定发酵样芽孢杆菌活菌数和pH。
发酵未经预处理的玉米胚芽粕对芽孢杆菌活菌数和pH的影响结果如表1所示。由表1中的数据可知，在0h时，未经预处理的玉米胚芽粕pH均在4.1左右，接菌量为3×107cfu/g。在24h和48h时，各组玉米胚芽粕pH在4.1-4.5之间，芽孢杆菌活菌数均低于107cfu/g。
综上可知，未经预处理的玉米胚芽粕存在pH较低现象，影响芽孢杆菌活菌数。
表1
Figure BDA0002918852050000071
(3)预处理原料组(加入碳酸氢钠)：称取一定量经高压灭菌的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，每个样品设3个平行，作为预处理原料组。按1×107CFU/g接菌量分别接入实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4、芽孢杆菌BLCC1-0157和芽孢杆菌BLCC1-0155，每个样品设3个平行，以不接种任何菌株的预处理料作为预处理对照组，于37℃培养箱中需氧发酵，分别于发酵24h和48h取样，测定发酵样芽孢杆菌活菌数和pH。
上述指标的测定方法如下：
①pH的测定
准确称取2.00g样品溶于20.00mL蒸馏水中，室温150r/min震荡10min，静止1min后，测定上清液pH值。
②芽孢杆菌活菌数的测定
准确称取发酵玉米胚芽粕10.0g，用生理盐水10倍递增稀释，取适当稀释度的样品分别至LB固体培养基中，37℃条件下培养24h，根据菌落数计算样品中芽孢杆菌活菌数，结果用CFU/g发酵料表示。
发酵经预处理的玉米胚芽粕对芽孢杆菌活菌数和pH的影响结果如表2所示。由表2中的数据可知，在0h时，经预处理后玉米胚芽粕pH在7.0左右，接菌量为3×107cfu/g。与对照组相比，各菌株在发酵24h和48h，pH进一步上升，其中CL-4在发酵48h时pH最高可达7.51。芽孢杆菌活菌数方面，在24h时，芽孢杆菌活菌数可达109cfu/g，以CL-4最高，活菌数达到6.8×109cfu/g；在48h时，芽孢杆菌活菌数可达1011cfu/g，以CL-4最高，活菌数达到5.2×1011cfu/g，显著高于其余两株菌株。
综上可知，将碳酸氢钠加入水中形成小苏打水溶液，呈碱性，相当于中和了玉米胚芽粕中酸成分，使pH呈中性，有利于菌株发酵。玉米胚芽粕经小苏打水溶液预处理后，芽孢杆菌均能够成功发酵玉米胚芽粕，3株芽孢杆菌中以菌株CL-4活菌数最高。
表2
Figure BDA0002918852050000081
Figure BDA0002918852050000091
实施例3贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉的制备
1、基础培养基
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉的生产采用LB液体培养基为基础培养基。
2、菌种：选用本发明实施例1获得的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4。
斜面培养：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4接种于LB斜面固体培养基上，37℃条件下培养24h。
一级种子培养：将培养好的CL-4斜面，在无菌条件下用接种环接2环于100mL LB液体培养基中，在37℃条件下，180rpm/min培养24h，制得一级种子液。
3、50L种子罐发酵
(1)培养基
胰蛋白胨1％(质量百分数)、酵母提取物0.5％(质量百分数)、氯化钠1％(质量百分数)、葡萄糖0.2％(质量百分数)，初始pH 7.0，装量为35L。
(2)灭菌
空消，121℃、20min完成空消。
实消：夹层加温，121℃、20min完成实消。
(3)接种
待培养基温度降至40℃接种，按照1％(体积百分数)接种量接入一级种子液。
(4)发酵
接种后37℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速300rpm培养18h制得二级种子液。
4、500L发酵罐发酵
(1)培养基
胰蛋白胨1％(质量百分数)、酵母提取物0.5％(质量百分数)、氯化钠1％(质量百分数)、葡萄糖0.2％(质量百分数)，初始pH 7.0，装量为300L。
(2)灭菌
空消：121℃、20min完成空消。
实消：夹层加温，121℃、20min完成实消。
(3)接种
待培养基温度降至40℃接种，按1％(体积百分数)接种量接入二级种子液。
(4)发酵及发酵过程控制
接种后37℃培养，罐压0.05MPa，搅拌转速300rpm，通气量20m3/h。发酵期间每2h取样一次，镜检，待芽孢率≥90％时放罐。
5、后处理
发酵结束后，立即喷雾干燥，即得贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉成品。
实施例4贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4的安全性试验
1、材料
(1)试验菌株：本发明实施例3制备的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉。
(2)试验动物：昆明系小白鼠，体重20±2g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
2、试验设计：选择体重20±2g健康昆明种小鼠100只，雌雄各半。基础日粮预饲一周后随机分为5组，每组20只，雌雄各10只，分笼喂养，其中一组为对照组，其余四组为试验组，分别灌胃1×106cfu/mL、1×108cfu/mL、1×1010cfu/mL和1×1012cfu/mL。
3、给药
给药方式为灌胃，各组小鼠禁食16小时后，对照组灌胃生理盐水，其余4个试验组分别灌胃生理盐水稀释好的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉，按照0.2mL/20g体重的受试样品量进行灌胃给样，连续灌胃两天，每次灌胃后密切观察2小时，2小时后常规饮食，连续观察14天，每天定时观察记录。
4、观察指标
①肉眼观察
详细记录被毛和皮肤、眼睛和粘膜，呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体活动和行为等改变。特别注意是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状。应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间。
②小鼠体重
于试验开始时、7天和14天分别对每组雌雄小鼠进行称重，比较其体重情况。
③病理学检查
14天时对各组小鼠取5只进行尸检，观察脏器器官病变，对观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。
5、试验结果
①贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉对各组小鼠生长和死亡情况的影响如表3和表4所示。由表3和表4中的数据可知，在14天观察期内，各组小鼠体态观察正常，四肢活动正常，对体重无显著性影响，各组均没有出现死亡情况。解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏，均无肉眼可见病变。
表3
Figure BDA0002918852050000111
Figure BDA0002918852050000121
表4
Figure BDA0002918852050000122
②贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉对各组小鼠器官指数的影响如表5所示。由表5中的数据可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉对各组小白鼠的脾脏指数和肝体比没有显著性影响。
表5
Figure BDA0002918852050000123
Figure BDA0002918852050000131
综上可知，本发明制备的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4菌粉使用安全，且无毒副作用。
实施例5贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4在发酵玉米胚芽粕降解半纤维素以及发酵玉米胚芽粕生产半纤维素酶方面的应用
1、不同固态发酵时间下，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4对玉米胚芽粕半纤维降解率的影响
(1)从CL-4斜面上挑取1环接种至装有100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、180r/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用。
(2)配料：称取一定量粉碎后可以过50目的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，每个样品设3个平行。按1×107CFU/g接菌量分别接入培养好的CL-4种子液，以不接种任何菌株的预处理料为对照组，置于37℃培养箱中需氧固体发酵，分别于发酵0、24h、48h、72h、96h和120h取样，测定发酵玉米胚芽粕中酸性洗涤纤维(NDF)含量、中性洗涤纤维(ADF)含量、半纤维素含量及半纤维素降解率。
上述指标的测定方法如下：
①中性洗涤纤维素(NDF)含量的测定
中性洗涤剂溶液(3％十二烷基硫酸钠溶液)：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)和6.8g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)，放人1000ml烧杯中，加适量蒸馏水加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠(C12H25NaSO4)和10ml乙二醇乙醚；称取4.56g无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)置于另一烧杯中，加蒸馏水加热溶解冷却后倒入第一个烧杯中，稀释至1000ml。
聚酯纤维滤网袋：用高质量的聚酯细丝(聚对苯二甲酸乙二醇酯，细丝的直径为34μm)织成孔径为20μm的均匀一致的聚酯超细网后，制成为5cm×6cm长方形的聚酯网袋，三面塑封口，一面开口，用特殊记号笔编号、称重。
样品称量：在已知质量(m1)的5cm×6cm聚酯纤维滤网袋(用特殊记号笔编号)中，装入样品，准确称取样品0.5～1.0g左右(m)，准确至0.0001g，用塑封机封口。每个样品做3个平行样测定。(样品脂肪含量大于10％，须预先脱脂：将装有样品的滤网袋用丙酮浸泡10～20min)。
中性洗涤剂处理：将20个样品滤网袋放入3L大烧杯中，加入2000ml配好的中性洗涤剂2000ml，煮沸60±1min。在煮沸期间要保持溶液浓度不变。煮沸完毕取出滤网袋，用水冲洗干净后把水挤压干。
丙酮处理：将滤网袋放烧杯中用丙酮浸泡10min去除剩余脂肪，取出纤维滤网袋并在通风橱凉干。
烘干：将滤网袋放在烘箱内105℃烘干1h，取出立即称重m2。如果NDF包含灰分，则此步骤不做；若NDF去除灰分，可按以下步骤测定残渣中的灰分含量)。将纤维滤网袋放入已知质量的坩埚中，把坩埚放在电炉上炭化至无烟，然后转移到马福炉中500℃灰化30min，取出在干燥器内冷却至室温，称重，测定灰分重(m3)。
中性洗涤纤维(NDF)(含灰分)的含量％＝(m2-m1)/m×100％或者中性洗涤纤维(NDF)(不含灰分)的含量％＝(m2-m1-m3)/m×100％。式中：m为试样质量，m2为中性洗涤纤维残渣和滤网袋的质量，m1为滤网袋的质量，m3为灰分质量。
②酸性洗涤纤维素(ADF)含量的测定
0.5mol/L硫酸(H2SO4)溶液：取27.9ml(约49g)浓硫酸，慢慢加入已装有500ml水的1000ml容量瓶中，冷却后定容。
酸性洗涤剂溶液(2％十六烷基三甲基溴化铵溶液)：称取20g十六烷基三甲基溴化铵，溶于1000ml 0.5mol/L硫酸溶液。
聚酯纤维滤网袋：同中性洗涤纤维素(NDF)含量的测定。
样品称量：在已知质量(m1)的5cm×6cm聚酯纤维滤网袋(用特殊记号笔编号)中，装入样品，准确称取样品1.000g左右(m)，用塑封机封口。每个样品做3个平行样测定。(样品脂肪含量大于10％，须预先脱脂：将装有样品的滤网袋用丙酮浸泡10～20min)。
酸性洗涤剂处理：将20个样品滤网袋放入3L大烧杯中，加入2000ml配好的酸性洗涤剂2000ml，煮沸60±1min。在煮沸期间要保持溶液浓度不变。煮沸完毕取出滤网袋，用水冲洗干净后把水挤压干。
丙酮处理：将滤网袋放烧杯中用丙酮浸泡10min去除剩余脂肪，取出滤网袋并在通风橱凉干。
烘干：将滤网袋放在烘箱内105℃烘干1h，取出室内冷却1min，立即称重m2。(如果ADF包括灰分，则此步骤不需要做；如果ADF去除灰分，则按下列步骤残渣中的灰分含量)将纤维滤网袋放入已知质量的坩埚中，把坩埚放在电炉上炭化至无烟，然后转移到马福炉中500℃灰化30min，取出在干燥器内冷却至室温，称重，测定灰分重(m3)。
酸性洗涤纤维(ADF)(含灰分)的含量％＝(m2-m1)/m×100％或者酸性洗涤纤维(ADF)(不含灰分)的含量％＝(m2-m1-m3)/m×100％。式中：m为试样质量，m2为酸性洗涤纤维残渣和滤网袋的质量，m1为滤网袋的质量，m3为灰分质量。
(3)不同固态发酵时间下，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4对玉米胚芽粕半纤维素组分的影响结果如表6所示。由表6中的数据可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CL-4固体发酵玉米胚芽粕24h时，半纤维素降解率为22.56％，且随着发酵时间延长，半纤维素降解率成增加趋势，发酵48h时半纤维素降解率达到65.67％。由此说明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4发酵玉米胚芽粕能够在短时间内大大降低玉米胚芽粕中半纤维素含量。
表6
0h 24h 48h 72h 96h 120h
中性洗涤纤维％ 35.19 35.06 27.08 27.01 25.07 25.13
酸性洗涤纤维％ 17.51 21.37 21.01 21.34 21.07 21.2
半纤维素含量％ 17.68 13.69 6.07 5.67 4.0 3.93
半纤维素降解率％ 0 22.56 65.67 67.93 77.38 77.77
注：半纤维素含量(％)＝中性洗涤纤维-酸性洗涤纤维，即：半纤维素降解率(％)＝(发酵前半纤维素含量-发酵后半纤维素含量)/发酵前半纤维素含量。
2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4固态发酵玉米胚芽粕对半纤维素酶的影响
(1)从CL-4斜面上挑取一环接种至装有100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，于37℃、180r/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用。
(2)配料：称取一定量粉碎后可以过50目的玉米胚芽粕于1000mL三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，每个样品设3个平行。按1×107CFU/g接菌量分别接入培养好的CL-4种子液，以不接种任何菌株的预处理料为对照组，置于37℃培养箱中需氧固体发酵，分别于发酵0、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h取样，测定发酵玉米胚芽粕中半纤维素酶活。
采用DNS法测定样品中半纤维素酶活性。半纤维素酶活定义：在37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)，以U/g表示。
(3)半纤维素酶活测定结果如图3所示，由图3可知，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)CL-4固态发酵玉米胚芽粕至12h，可以测得半纤维素酶活力，但活性低于10.0U/g，之后随发酵时间的延长半纤维素酶活性增加，72h半纤维素酶活性达到最高，为70.81U/g，之后半纤维素酶活性维持在一个相对稳定水平。由此说明，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4固态发酵玉米胚芽粕可在短时间内产生大量半纤维素酶，进而有效降解玉米胚芽粕中半纤维素组分。
本发明公开了一株禽源贝莱斯芽孢杆菌CL-4及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一株禽源贝莱斯芽孢杆菌CL-4及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1450
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggctggct ccataaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120
tagcgattcc agcttcacgc agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt 180
gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt 240
gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300
caccggcagt caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 360
tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420
gtcactctgc ccccgaaggg gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct 480
ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg 600
ttagctgcag cactaagggg cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta 720
cagaccagag agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct 780
acacgtggaa ttccactctc ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc 840
ccggttgagc cgggggcttt cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc 900
caataattcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960
ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt 1020
ccctaacaac agagctttac gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc 1080
agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140
tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct acgcatcgtc gccttggtga 1200
gccgttacct caccaactag ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc 1260
caccttttat gtctgaacca tgcggttcag acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc 1320
ggagttatcc cagtcttaca ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac 1380
atcagggagc aagctcccat ctgtccgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg 1440
ttcgtcctga 1450

Claims (6)

1.一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4，其特征在于，该菌株已于2020年11月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2020811。
2.如权利要求1所述的一株禽源贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4在发酵玉米胚芽粕降解半纤维素和生产半纤维素酶方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)CL-4种子液的制备；
(2)玉米胚芽粕灭菌处理；
(3)发酵。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)的具体操作过程如下：将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CL-4接种于LB斜面固体培养基上，37℃条件下培养24h；将培养好的CL-4斜面在无菌条件下用接种环接1环于100mL LB液体培养基中，于37℃、180rpm/min摇床培养24h，取样镜检，待芽孢率≥95％时备用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)的具体操作过程如下：将玉米胚芽粕原料于121℃高压灭菌20min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)的具体操作过程如下：将灭菌处理后的玉米胚芽粕过50目筛，置于1000ml三角瓶中，每毫升水中添加0.07g碳酸氢钠，含水量为50％，装量100g/瓶，搅拌均匀后，按1×107CFU/g接菌量接入培养好的CL-4种子液，于37℃培养箱中需氧固体发酵24～120h，测定发酵玉米胚芽粕中半纤维素降解率为22.56～77.77％，半纤维素酶活性为20～70.81U/g。
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