CN113061555B - 一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程技术领域。本发明从动物粪便中筛选到了一株枯草芽孢杆菌，其在摇瓶水平上发酵生产纤维素酶活力达118.67U/mL，并且具备良好的传代稳定性。利用所述枯草芽孢杆菌生产纤维素酶的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

Description

一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用
技术领域
本发明涉及一株产纤维素酶的芽孢杆菌菌株筛选及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
饲料益生菌除去本身的益生特性还能够通过产出各种化学物质，对动物消化吸收和肠道健康起到积极的作用。例如，针对动物难以吸收饲料中富含的粗纤维引起的腹泻，饲用益生菌能够生产纤维素酶，将动物不能直接吸收的粗纤维转化为动物机体易吸收利用的单糖，促进动物吸收，丰富其营养价值。因此，纤维素酶在饲料中有极大的应用。
与传统微生物代谢改造或发酵优化方法相比，利用饲用益生菌发酵生产纤维素酶，既能够降低成本、保护环境，特定的物质能够得到更高的产量，益生菌又能够很好的定植在肠道，不会对动物机体造成任何损害，且能够生产有益物质、丰富肠道菌群，促进了动物的健康，对于现代饲料产业具有重要的现实意义和应用价值。
曲霉和木霉是纤维素酶主要的高产菌株，但其需要通过复杂的基因过程手段改造和优化，如组成型过表达转录因子，能够有效的促成纤维素酶和半纤维素酶的生成，酶活可达90.38IU/mL，但其成本和操作难度较高，而且纤维素酶的生产通常会受到菌体生长以及纤维素诱导及碳源的阻遏，所以极大的阻遏其工业化生产纤维素酶，不适于工业化。从而，研究者将研究转向了操作更简单的益生菌，以期通过益生菌来达到纤维素酶的高产。目前产纤维素酶的芽孢杆菌报道较多，如李豪等从川南地区腐殖质土壤中分离筛选得到一株高产纤维素酶的枯草芽孢杆菌，并对其进行发酵条件优化，最终该菌种通过3天的发酵最高产酶水平可达到85.48U/mL(李豪等高产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及产酶特性研究.中国畜牧兽医.2019,46(03):711-8)。但是其发酵时间仍较长、产酶水平仍无法很好适应工业化的生产需求。
发明内容
为了解决目前纤维素酶产量低或生产效率低、操作难度大问题，本发明从动物粪便中筛选得到了一株枯草芽孢杆菌，其能够高效生产纤维素酶，快速分解纤维素，并且其本身所具备的益生功能也能有利于动物肠道的健康。
本发明的第一个目的是提供一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2021168，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021168。
本发明提供了一种菌剂，所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌。
在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
本发明提供了一种生产纤维素酶的方法，利用所述枯草芽孢杆菌生产纤维素酶。
在一种实施方式中，将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌添加至反应体系中，并调节OD600为0.02～0.05。
在一种实施方式中，反应体系中含有氯化钠、牛肉膏和蛋白胨。
在一种实施方式中，所述发酵体系中含有牛肉膏10g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
在一种实施方式中，在25-35℃，150-250rpm下培养。
在一种实施方式中，反应时间不低于48h。
本发明提供了所述菌株在生产纤维素酶中的应用。
本发明提供了所述菌株在制备饲料中的应用。
本发明的有益效果：本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002具有较好的传代稳定性，在传代数代之后，其纤维素酶的生产能力均能够稳定在一定水平；在摇瓶水平上发酵生产纤维素酶活力达118.67U/mL，且具备良好的传代稳定性。将其应用于饲料的制备中，能够降低成本、保护环境，且益生菌能够很好的定植在肠道，促进动物的健康，对于现代饲料产业具有重要的现实意义和应用价值。本发明发酵生产纤维素酶的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。
生物材料保藏
本发明所提供的枯草芽孢杆菌，分类命名为Bacillus subtilis FMME ZK002，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2021168，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌的菌落形态图。
图2为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FMME ZK002的生长曲线。
图3为枯草芽孢杆菌在摇瓶水平发酵过程纤维素酶活力及菌体浓度变化曲线图。
具体实施方式
(1)培养基：
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基(g/L)：CMC-Na 10，(NH4)2SO4 4，蛋白胨1，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1，121℃灭菌15min；
固体活化培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，琼脂20，蒸馏水1.0L。
液体种子培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。
液体发酵培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。
(2)纤维素酶的测定：
按照行标QB 2583-2003，采用羧甲基纤维素酶(CMC)酶活性测定法测定羧甲基纤维素酶酶活。酶活力单位规定：60℃条件下，以1mL纤维素酶粗酶液在1min内水解CMC成1μg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。
发酵液预处理：于4℃，5000rpm下离心10min，上清液即为粗酶液。
在25mL试管中加入0.4mL浓度为1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，再加入0.4mL粗酶液，空白管不加酶液，60℃精确反应30min，取出后加入0.5mL DNS溶液，迅速100℃沸水浴10min，快速冷却至室温后定容至5mL，利用紫外线分光光度计测定吸光值A540，计算酶活。
纤维素酶葡萄糖标准曲线的绘制：精确称取分析纯无水葡萄糖0.5g，以蒸馏水配置成0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取各浓度标准溶液2.5mL，分别置于5只试管，以水代替葡萄糖溶液作空白对照，各加入2.5mL DNS溶液，100℃水浴10min，取出用流水迅速冷却至室温。再用蒸馏水定容至5mL，充分摇匀后，在波长540nm测定各管中吸光值。以各浓度的标准葡萄糖浓度作横坐标，吸光值作纵坐标绘制标准曲线。
酶活力计算公式：X＝(W×N×1000×12.5)/(κ×T×M)
(式中：X，酶活力(U/mL)；W，测得的吸光度值(试验组减去空白组)；N，酶样所稀释的倍数，此时N＝1；κ，葡萄糖标准曲线的斜率，为2.9407；T，反应时间，此时T＝30min；M，酶样体积，此时M＝0.4mL；1000，mg转化成μg；12.5为样品稀释倍数。)
CMC底物溶液：称羧甲基纤维素钠(CMC—Na)1g，用磷酸盐缓冲液(pH＝6)定容至100mL。121℃灭菌25min，4℃保存。
磷酸盐缓冲液(pH＝6)：磷酸氢二钠21.04g，磷酸二氢钠4.26g，配制完成后标定溶液pH值，最后定容至1L。
饲料中粗蛋白检测：具体方式参见GB/T6432-94。
饲料中粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维测定：具体方式参见张崇玉,王保哲,张桂国,尹朋辉,路绪明.饲料中的粗纤维、NDF、ADF和ADL含量的快速测定方法[J].山东畜牧兽医,2015,36(09):20-22.
实施例1：菌株的筛选
(1)产纤维素酶的枯草芽孢杆菌筛选
初筛过程：取适量动物粪便样品，溶解于已灭菌的100mL蒸馏水中，放入摇床，30℃，200r/min震荡30min进行富集培养。取上清液进行十倍比稀释，吸取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8分别涂布于CMC-Na筛选平板，30℃恒温箱培养24h。由于不产纤维素酶菌株不产生透明圈，产纤维素酶菌株会出现透明圈。因此，根据是否存在纤维素降解透明圈，确定潜在菌株范围；
复筛过程：利用基础培养基对具有潜在纤维素降解能力的菌株进行分离挑选。由于透明圈直径与菌落直径比(H/d)正相关于菌株产酶活力大小。因此，分别点种已分离菌株至CMC-Na筛选平板，计算透明圈直径与菌落直径比值。选取比值最大者菌株，-80℃保藏备用。
产纤维素酶菌株会出现透明圈，而不产纤维素酶菌株不产生透明圈。在5个梯度筛选平板上共得到204个菌落，其中产纤维素酶菌株疑似10株。将初筛得到的10株菌株分别点板于CMC-Na筛选平板，测量其透明圈/水解圈与菌落直径的比值(H/d值)，进行3次平行实验，大部分菌株的H/d值低于1.5，其中菌株1号的H/d值达到1.8，具有较好的纤维素降解能力，因此选取1号菌株保藏备用。
表1不同菌株H/d值
菌株编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H/d值 1.8 1.4 1 1 1.2 1.1 1 1.1 1.2 1.4
(2)产纤维素酶的枯草芽孢杆菌的鉴定
菌株形态鉴定：将筛选获得的菌株接种于种子培养基平板上，30℃条件下倒置培养24h，观察其菌落生长状态。同时使用接种环挑取单菌落菌株，进行革兰氏染色处理，在光学显微镜下观察菌株显微形态。
菌株种属鉴定：
(1)DNA的提取：将筛选获得的单菌落接种到含50mL种子液的500mL摇瓶中，200r/min、30℃条件下培养12h，6000rpm冷冻离心10min，收集菌体。严格按照TaKaRa试剂盒提供的操作进行细菌总DNA的提取。
(2)16S rRNA基因的扩增：PCR的上、下游引物分别为实验室存储的通用引物27F，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。热循环参数为95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃延伸10min。PCR产物由苏州GENEWIZ生物科技有限公司测序。
(3)序列及系统发育分析：通过BLAST工具将菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析。多序列比对使用软件Clustal 1.83，最后用Mega 3.1软件的最大相似法(maximumlikelihood)和邻位相连法(neighbor-joining)构建系统进化树(Kimura 2-parameter模式)。
菌株1的菌落和菌体形态表明，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，有芽孢，周生鞭毛，能运动，菌落呈圆形，表面粗糙不透明，微黄色，略有臭味(图1)。
按照细菌基因组提取试剂盒说明，提取1号菌株的基因组，并进行PCR扩增获得该菌16S rRNA。通过测序获得序列后，于NCBI数据库中序列进行BLAST比对后，利用MEGA 7软件构建进化树。菌株1与Bacillus subtilis相似性达到99.42％，结合菌株1菌落形态特性及16S rRNA分析鉴定其为枯草芽孢杆菌，并将其命名为Bacillus subtilis FMME ZK002。已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2021168。
实施例2：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002摇瓶发酵
步骤1：配制培养基
羧甲基纤维素钠(CMC-Na)筛选培养基(g/L)：CMC-Na 10，(NH4)2SO4 4，蛋白胨1，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1，121℃灭菌15min；
固体活化培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，琼脂20，蒸馏水1.0L。
液体种子培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。
液体发酵培养基(g/L)：氯化钠5，牛肉膏10，蛋白胨10，蒸馏水1.0L。
步骤2：种子制备
蘸取菌株的菌悬液，在固体培养基上划线，在30℃恒温培养箱中培养24h左右得到单菌落，挑取单菌落接入含25mL液体种子培养基的100mL锥形瓶中，在30℃，200rpm摇床中过夜培养16h(至对数生长期)制成种子液。
步骤3：摇瓶发酵培养
将制得的种子液按1％的接种量接入含100mL液体发酵培养基的500mL锥形瓶中，需要调整发酵起始OD600为0.035。在30℃，200rpm摇床中培养3天，12h取一次样。取发酵液离心，收集粗酶液测定发酵液中的纤维素酶含量。结果如图2所示，在发酵0h、12h、24h、36h、48h时，酶活力分别为9.56U/mL、35.07U/mL、87.97U/mL、106.62U/mL、110.75U/mL，在发酵至60h时，酶活力达到118.67U/mL(图3)。
实施例3：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002传代稳定性
具体实施方式参见实施例2，将筛选得到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMMEZK002进行12代的传代培养，将每一代的菌株接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵。发酵结束后测定纤维素酶活力，传代培养后纤维素酶活力见表2，酶活力维持在108-118.67U/mL，从而表明Bacillus subtilisFMME ZK002具有很高传代稳定性。
表2传代菌株的纤维素酶活力
Figure BDA0003029131930000051
Figure BDA0003029131930000061
实施例4：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002菌剂的制备
取300-500μL的枯草芽孢杆菌接种于25mL液体种子培养基中，25-35℃下活化2至3代，待枯草芽孢杆菌达到1.0×108cfu/mL以上活菌数时，8000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水)和冷冻保护剂(15～20g/100mL的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于107cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到微生物菌剂。
实施例5：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002在饲料制备中的应用
将筛选得到的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002制得的微生物菌剂加入到含有经过粉碎处理过的玉米粉、玉米皮和玉米秸秆纤维素质量比为1:2:2的饲料中，添加水，将水含量调整为40％，将实施例4中制备的菌剂按照0.1％(w/w)的接种量接种于饲料中，经过35℃发酵6-7天，pH值为4.5时结束发酵，检测粗蛋白、粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维测定，发现发酵后饲料中的粗蛋白含量增加了5.7％，而粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量分别降低了7.84％、16.9％和7.6％，进一步检测发酵后的饲料中的活菌数达到3.6×108cfu/mL。因此，利用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisFMME ZK002的生物菌剂在发酵玉米加工副产物为原料制成的饲料，能有效降低饲料中纤维素含量，有利于畜禽类消化吸收，同时发酵后饲料中的活菌数显著提高，枯草芽孢杆菌随着发酵饲料进入动物肠道后定殖在动物肠道内，能够更强力地调节动物肠道微生态平衡，有效补充动物体内的内源纤维素酶的不足，促进动物的消化吸收，提高饲料的利用率。
表3微生物菌剂发酵对饲料中成分的影响
Figure BDA0003029131930000062
Figure BDA0003029131930000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株FMME ZK002，已于2021年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021168。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株FMME ZK002。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株FMME ZK002的含量不低于1.0×106 cfu/mL或1.0×106 cfu/g。
4.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株FMMEZK002生产纤维素酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将培养至对数生长期的枯草芽孢杆菌菌株FMME ZK002添加至反应体系中，并调节OD600为0.02~0.05。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中含有氯化钠、牛肉膏和蛋白胨。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在25-35℃，150-250 rpm下培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，反应时间不低于48h。
9.权利要求1所述菌株在生产纤维素酶中的应用。
10.权利要求1所述菌株在制备饲料中的应用。
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