CN111334451A - 一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其应用。该菌株命名为HJ‑2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M 2019512，保藏日期为2019年7月3日。该菌株在PD、GM或CDM液体培养基中发酵萃取的产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均具有较高的抑菌活性，且其在中性条件下活性较高，还具有一定的耐热性。

Description

一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

传统中药黄精(Polygonatum sibiricum)有抗衰老(朱红艳，许金俊，1999)、抗炎和抗肿瘤(张峰等，2007)等多种生理功能，具有良好的药用开发价值。而在其内生真菌的研究方面目前仅见泰山黄精(Polygonatum sibiricum)内生真菌(李艳玲等，2013)和浙江多花黄精(Polygonatum cyrtonema)内生菌(汪滢等，2010)的研究；而本课题组首次报道了安徽黄精(Polygonatum cyrtonema) 内生菌的研究(柏晓辉等，2018)。本文在前期研究的基础上，对分离的第2 株具有抑菌活性的菌株HJ-2进行鉴定；并进一步探索其次级代谢产物的抑菌活性，以期为综合开发和利用黄精内生菌药用资源提供理论支持。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其在抑菌方面的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种黄精内生枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus sp. HJ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M 2019512，保藏日期为2019年7月3日。

一种黄精内生枯草芽孢杆菌在制备抑菌剂中的应用。

进一步的，所述抑菌剂具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的作用。

进一步的，所述抑菌剂为所述黄精内生菌经种子培养、PD、GM或CDM 液体培养基中发酵、乙酸乙酯萃取发酵液所得到的产物。

进一步的，所述抑菌剂耐酸碱值为7.0。

进一步的，所述抑菌剂耐热温度为25～65℃。

进一步的，所述抑菌剂制备方法包括以下步骤：

(1)将所述一种黄精内生枯草芽孢杆菌从保藏斜面上挑取少量菌种划线并28℃恒温培养；

(2)挑取活化后单克隆至新配制PD液体培养基28℃恒温培养12h 得到种子液；

(3)以1:100体积比取适量种子液至PD、GM或CDM液体培养基中 28℃恒温发酵7d；

(4)利用离心法对发酵7d后的培养液进行离心分离，采用乙酸乙酯萃取发酵液所得萃取物为所述抑菌剂。

本发明所达到的有益效果：本发明筛选获得一种新的一种黄精内生枯草芽孢杆菌，其在PD、GM或CDM液体培养基中发酵萃取的产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均具有较高的抑菌活性，且其在中性条件下活性较高，还具有一定的耐热性。

附图说明

图1是菌株HJ-2的菌体形态(放大倍数为5 000倍)；

图2是基于16S rDNA序列构建菌株HJ-2的系统进化树；

图3是GM、CDM和PD培养基发酵产物对A)大肠杆菌、B)金黄色葡萄球菌和C)绿脓杆菌的抑菌活性；

图4是PD发酵产物在不同pH值下对A)大肠杆菌、B)金黄色葡萄球菌和C)脓绿杆菌的抑制效果；

图5是PD发酵产物在不同温度下对A)大肠杆菌、B)金黄色葡萄球菌和C)脓绿杆菌的抑制效果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实验涉及的材料、试剂、设备等：

植物样品：本实验用黄精(Polygonatum cyrtonema)采自安徽省牯牛降自然保护区，挖取的黄精地下根状茎经自来水清洗后保存于4℃备用，并进行内生菌菌种分离(24h内完成)。

实验菌株：黄精内生枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus sp. HJ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M 2019512，保藏日期为2019年7月3日。抑菌实验所用菌种分别为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以上菌株均购于中国典型培养物保藏中心并保存于本学院微生物学实验中心。

实验仪器：ZHJH-C2109B超净工作台(上海智城)、ZGP-2050培养箱 (上海智城)、旋转蒸发仪(上海爱朗)、SQ510C灭菌锅(重庆雅马拓)、 S-3400N扫描电镜(日本日立)、MQD-B2R培养箱(上海旻泉)。

试剂：基因组抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯和75％酒精等均为分析纯，购于上海国药集团；胰蛋白胨、葡萄糖和酵母膏等生化试剂均购于上海生工公司。

培养基：LB(Luria-Bertani)平板、马铃薯葡萄糖平板(PDA)等参见以下文献1中配方：柏晓辉,刘孝莲,刘娣,等.2018.一株黄精内生菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J].天然产物研究与开发,30(5):777-78，麦芽培养基 (ME)、马铃薯葡萄糖培养基(PD)、高氏一号培养基(GM)、改良的马丁培养基(MMB)和査氏培养基(CDM)等配制方法参考以下文献2：张应烙.2008.昆虫肠道真菌的新活性物质研究[D].博士学位论文,南京大学, 导师:谭仁祥,pp.63-64。

内生菌分离、纯化以及鉴定：

根据文献1中组织块培养法对黄精内生菌进行分离与纯化：取4℃冰箱保存的黄精根茎，用无菌剪刀剪下直径约为6mm的根须后用5％(v/v) 次氯酸钠浸泡5min；无菌水清洗3次后残留无菌水用灭菌滤纸吸去；用75％(v/v)乙醇处理5min后再次用无菌水清洗3次并用灭菌滤纸吸去残留水。用无菌刀片将灭菌处理的根须切成4mm左右小段后种植于分离平板培养基上，从切下的根须片段中随机选取几段用酒精灯对切口进行灭菌作为对照组也种植在分离平板培养基上；将平板培养基置于恒温培养箱28℃恒温培养。待内生菌长出后，进行多次纯化，将纯化后的纯种转接至斜面培养基上保存备用。

对菌株HJ-2进行常规的菌落形态观察和利用扫描电镜观察菌体形态；同时对该菌株进行革兰氏染色和依据《常见细菌系统鉴定手册》中的部分生理生化指标进行初步鉴定。该菌株在PDA培养基上形成的菌落表面干燥，菌落中心部分微黄、四周泛白，且菌落边缘呈发散状。利用扫描电镜观察菌体的形态特征，发现菌体呈短杆状、圆端，0.55～0.60μm×1.0～1.2μm(图 1)。生化检测表明该菌株可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖产酸但不产气；能水解明胶、淀粉，革兰氏染色发现该菌株呈阳性。

用试剂盒提取菌株HJ-2基因组DNA，委托GENEWIZ(苏州)利用引物 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:

5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行扩增和测序。测序结果显示该菌株16S rDNA序列长度约为1 387bp。依据文献1的方法利用软件Clustal X 2.1和MEGA 6.06(Tamura etal.,2013)对测序结果进行分析和构建发育进化树。利用BLAST工具(NCBI数据库)对该测序所得序列进行同源性分析，结果显示与菌株HJ-2同源性较高的菌株来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。从序列比对结果中选择序列一致性均在99.3％以上的菌株序列，用ClustalX 2.1进行比对，并参照文献1描述的方法构建系统发育树(如图2所示)。比对结果显示菌株HJ-2与Bacillus subtilis strain JCM 1465等5株枯草芽孢杆菌位于同一个发育树分支上。结合以上菌体和菌落特征以及16S rDNA序列分析结果，将菌株HJ-2鉴定为枯草芽孢杆菌HJ-2(Bacillus sp.HJ-2)。

菌株HJ-2发酵产物的提取：

菌株HJ-2发酵产物的提取参考文献1的方法：从菌株HJ-2斜面上挑取少量菌种划线并28℃恒温培养，挑取活化后单克隆至新配制PD液体培养基28℃恒温培养12h得到种子液；分别取5mL种子液至500mL新制备的ME、PD、GM、MMB和CDM液体培养基中28℃恒温发酵7d，并注意代谢产物积累。

利用离心法对发酵7d后的培养液进行离心分离，分离出菌体和发酵液，并用甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯分别萃取菌体和发酵液产物，萃取方法参考文献1的方法，发酵液产物分别用100％二甲基亚砜 (DMSO)配成100mg/mL保存于4℃冰箱。菌体发酵产物的提取参考以下文献3(陈涛风,王开梅,万中义,等.2008.拮抗放线菌WS-03030的分类鉴定及其抗菌成分的初步研究[J].湖北农业科学,47(4):427-429.)方法并改善：将菌体等份后用20mL不同极性的有机溶剂甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯浸泡，并于28℃恒温摇床振荡浸提24h；将浸提液5 000r/min 离心5min后得到上清即为菌体发酵产物，将此发酵产物自然蒸发干燥后用 100％二甲基亚砜配成100mg/mL保存于4℃冰箱备用。

基于以下抑菌实验发现生物活性物质存在乙酸乙酯萃取物中，故统计乙酸乙酯萃取不同培养基培养菌株HJ-2的菌体和发酵液产物(表1)，菌体中提取的发酵产物ME培养基最多为1.567g；PD和GM次之，分别为1.553g 和1.012g；MMB和CDM较少，分别为0.853g和0.536g。从培养基发酵液中提取的发酵产物ME发酵液最多为1.214g；PD和MMB发酵液产物量次之，分别为1.014g和0.869g；CDM和GM发酵液产物量较少，分别为 0.437g和0.141g。从发酵液产物量分析可以发现，ME、PD和MMB培养基适合用于菌株HJ-2的培养并积累发酵产物。

表1菌株HJ-2发酵产物的质量

实施例1：菌株HJ-2发酵产物的抑菌活性

参照文献1的方法分别检测菌株HJ-2菌体发酵产物和发酵液发酵产物对7种受试菌绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的抑制活性，对于抑菌效果良好的发酵产物进一步稀释成3.00mg/mL、0.30mg/mL和0.03mg/mL测定其最低抑菌浓度。

分别将上述提取自菌体和发酵液的发酵产物稀释为3.00mg/mL，并按纸片扩散法检测其对受试菌株：金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和变形杆菌的抑制活性。从测试结果可知，用甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯从不同发酵培养的菌株HJ-2菌体提取的发酵产物对以上7种受试菌体均没有明显的抑制效果。

从GM、CDM和PD发酵液中提取的发酵产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌均具有显著的抑制效果(图3)，对其余4种受试菌抑菌效果不明显；从ME和MMB发酵液中提取的发酵产物对7种受试菌株均没有显著的抑制效果。以上数据说明，菌株HJ-2抑菌活性物质主要产生于发酵液中。

由图3的抑菌结果知，CDM和PD发酵液产物对大肠杆菌(图3A)、金黄色葡萄球菌(图3B)和绿脓杆菌(图3C)的抑菌效果最佳，抑菌圈直径可达14mm；GM发酵液产物对上述3种受试菌的抑菌效果次之，抑菌圈直径也达12mm以上。为进一步探究发酵产物的抑菌浓度，分别将提取自GM、CDM和PD发酵液的产物稀释至0.30mg/mL和0.03mg/mL，检测其对上述3种菌株的抑菌效果(图3)。从图3抑菌效果可知，当发酵产物浓度降为0.30mg/mL，其对大肠杆菌(图3A)、金黄色葡萄球菌(图3B) 和绿脓杆菌(图3C)的抑制活性均显著降低，抑菌圈直径最低为9mm左右；而当发酵产物浓度进一步降为0.03mg/mL，其对上述3种受试细菌的抑制效果非常微弱(图3)。

实施例2：菌株HJ-2发酵产物酸碱稳定性

菌株HJ-2在PD发酵液中产生的发酵产物不仅产量多，而且抑菌效果显著；因此选取PD发酵液发酵产物分别用酸和碱调成不同的pH值，检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑制效果(图4)。

参照以下文献4(肖顺,张婷婷,卢云彬,等.2014.藤黄轮丝链霉菌T0907-107抑菌活性研究[J].农业生物技术学报,22(11):1226-1329.)方法并改进：分别取1.0mL发酵产物到1.5mL Eppendorf管中，用HCl或NaOH 分别将发酵产物pH值调至5.0、6.0、7.0、8.0和9.0；25℃放置30min后，再将pH值调回初始值，参照文献1方法检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑制活性，重复3次。

从图4A结果可知，当pH值为7.0时，发酵产物对大肠杆菌的抑制效果最好；pH值为6.0和8.0时，发酵产物对大肠杆菌的抑制活性有明显降低；当pH值为5.0和9.0时，发酵产物对大肠杆菌的抑制活性进一步降低，这表明该抑菌活性物质对大肠杆菌的抑制效果在中性条件下比较稳定。发酵产物pH值的变化同样也会影响其对金黄色葡萄球菌(图4B)和绿脓杆菌(图4C)的抑菌效果，且变化规律与其对大肠杆菌的影响基本一致。

实施例3：菌株HJ-2发酵产物热稳定性

同样选取PD发酵液发酵产物在不同温度下保温30min后对3种受试菌株的抑菌活性结果(图5)。参照文献4方法并改进：分别取0.5mL发酵产物到1.5mL Eppendorf管中，并分别于25、35、45、55和65℃恒温处理 30min；取出发酵产物冷却至室温后参照文献1方法检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的抑制活性，重复3次。

从该实验结果可知，当温度为25℃时，发酵产物对大肠杆菌(图5A)、金黄色葡萄球菌(图5B)和绿脓杆菌(图5C)的抑制效果最好，抑菌圈直径为13mm左右；而随着保温温度的升高，发酵产物对此3种受试菌株的抑菌活性均呈现下降趋势，但抑菌圈直径仍维持在11mm左右，实验结果表明此发酵产物对热具有一定的稳定性。

以上试验对该菌株种属进行了鉴别，并公开了其代谢产物活性成分主要在发酵液中，并对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌 (Escherichia coli)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)均具有显著抑菌活性，且最大抑菌浓度可达0.03mg/mL左右，且其稳定性试验表明，该发酵产物在中性条件下活性较高，而酸碱度的改变会明显改变其抑菌活性，说明该发酵产物对酸碱的耐受能力较弱。而发酵产物虽随着温度的升高，抑菌活性有所降低，但仍可维持在比较高的水平，表明该活性物质具有一定的耐热性。以上实验结果表明，该发酵产物中存在潜在药物开发价值的化合物，值得进一步开展诸如活性物质分离与纯化，结构鉴定等工作，该研究结果为综合开发利用菌株HJ-2提供了理论依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黄山学院

<120> 一种黄精内生枯草芽孢杆菌及其应用

<130> 20190705

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> HJ-2 Bacillus sp.

<400> 1

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420

gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960

tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080

ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200

caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260

gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380

cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag 1410

Claims (7)

1.一种黄精内生枯草芽孢杆菌，命名为HJ-2，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M 2019512，保藏日期为2019年7月3日。

2.根据权利要求1所述的一种黄精内生枯草芽孢杆菌在制备抑菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的作用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂为所述黄精内生菌经种子培养、PD、GM或CDM液体培养基中发酵、乙酸乙酯萃取发酵液所得到的产物。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂耐酸碱值为7.0。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂耐热温度为25～65℃。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂制备方法包括以下步骤：

(1)将所述黄精内生枯草芽孢杆菌从保藏斜面上挑取少量菌种划线并28℃恒温培养；

(2)挑取活化后单克隆至新配制PD液体培养基28℃恒温培养12h得到种子液；

(3)以1:100体积比取适量种子液至PD、GM或CDM液体培养基中28℃恒温发酵7d；

(4)利用离心法对发酵7d后的培养液进行离心分离，采用乙酸乙酯萃取发酵液所得萃取物为所述抑菌剂。

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