CN108823126B - 一种黄精内生菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄精内生菌及其应用。所述黄精内生菌，命名为HJ‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2018159，保藏时间为2018年3月28日。研究表明，该菌株的发酵产物具有抗绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌的作用。

Description

一种黄精内生菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种黄精内生菌及其应用。

背景技术

黄精(Polygonatum sibiricum)又称鸡爪参、鸡头黄精等，为百合科黄精属(Polygonatum Mill)多年生草本植物；黄精是我国传统的中草药，以其根茎入药，具有补气养阴、润肺、健脾等功效。黄精属药用植物资源在我国分布广泛，约20余种可以入药。在我国分布的黄精有长梗黄精、多花黄精、滇黄精等，其中以多花黄精的品质和药效最佳。多花黄精产地主要集中在四川、湖南、湖北、安徽等省，其中安徽产药用黄精有11余种，主要分布在安徽南部的大别山和黄山山系；安徽琅琊黄精、金寨黄精和黄山黄精更是安徽黄精的特有品种。

现有文献研究表明中药黄精的活性成分主要有黄精多糖、生物碱和蒽醌类化合物、甾体皂苷等，此外还含有多种人体所需的氨基酸和维生素等化合物。药理学研究表明，黄精具有多种生理功能，如抗衰老、降血糖血脂和防动脉粥样硬化、抗炎和抗肿瘤等；因此黄精具有良好的药用价值和开发前景。随着黄精市场需求量的增高、人类长期以来的过度采挖，加上黄精自然繁殖率低等因素的影响，目前野生药用黄精面临严重的资源匮乏问题。

植物内生菌在与植物共进化的过程中，与宿主植物形成了和谐的共生关系，产生与宿主植物相似或新颖的化合物，成为发现新的活性药物分子和先导化合物的重要资源。然而，目前仅有少量文献报道黄精内生菌的研究，如李艳玲等报道了泰山黄精内生真菌的抑菌活性研究和汪滢等报道了浙江多花黄精内生真菌的抗菌代谢产物研究；目前尚未有文献报道安徽黄精内生菌的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄精内生菌以及所述菌株在抑菌方面的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的菌株分离自安徽省牯牛降自然保护区内的野生黄精根茎，通过多种培养基对一组菌株进行发酵，并用乙酸乙酯萃取发酵产物，采用纸片扩散法进行抑菌活性分析，最终筛选分离出一株黄精内生菌，经鉴定其属于芽孢杆菌属，命名为HJ-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2018159，保藏时间为2018年3月28日。该菌株的微生物学特征是：革兰氏染色显示该菌为阳性，且部分有芽孢，菌体呈直杆状、圆端，菌体大小为0.5～1.2μm×1.7～3.5μm；该菌株在MMB平板上形成的菌落干燥，类似荷包蛋状，菌落中间微黄、四周微白，且菌落边缘不圆润；该菌株在ME、PD或MMB培养基中获得的发酵产物对绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌均具有显著抑菌效果。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的黄精内生菌在制备抑菌剂中的应用。

其中，所述的抑菌剂具有抗绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌的作用。

具体的，所述抑菌剂的制备包括以下步骤：

(1)取保藏的斜面菌种，挑取少量菌种到PDA培养基上划线并于28℃恒温活化3～5d；

(2)将步骤(1)活化后的菌种接种到PD培养基中，于28℃恒温摇床中以180rpm的转数培养12小时得到种子液；

(3)将种子液以体积比1:40的比例放入ME、PD或MMB培养基中并于28℃恒温摇床中以180rpm的转数培养7d；

(4)将步骤3)获得的培养液过滤去除菌体得发酵液；

(5)将发酵液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，然后用旋转蒸发仪浓缩萃取液得到发酵产物粗浸膏；

(6)将发酵产物粗浸膏放入100％二甲基亚砜中配成溶液，即为抑菌剂溶液。

本发明的有益效果：本发明筛选获得的黄精内生菌HJ-1，其在MMB、ME和PD培养基中发酵的产物对绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌仍保持较高的抑菌活性。

附图说明

图1为本发明电镜下菌株HJ-1菌体形态(放大倍数为7 000倍)。

图2为本发明不同培养基发酵产物对受试菌的抑菌活性。其中：A为绿脓杆菌，B为伤寒沙门氏菌，C为苏云金芽孢杆菌；1表示DMSO对照组，3表示麦芽(ME)，5表示改良的马丁(MMB)，6表示马铃薯葡萄糖(PD)培养基

图3为本发明中不同培养基发酵产物对三种受试菌的抑菌浓度。

图4为本发明中基于16S rRNA基因序列构建的菌株HJ-1与芽孢杆菌属相关菌株的系统进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

本发明中涉及到的主要原辅料、试剂和仪器设备：

受试菌株：抑菌实验所用菌株为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、变形杆菌(Proteus vulgaris)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，以上菌株均购于中国典型培养物保藏中心并保存于黄山学院生命与环境科学学院微生物学实验中心。

所用仪器和试剂：ZGP-2050型恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)、SW-CJ-ICU型超净工作台(上海新苗有限公司)、DSX-280B型高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械有限公司)、OSB-2100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)、MQD-B2R型振荡培养箱(上海旻泉仪器有限公司)、S-3400N型扫描电镜(日本日立公司)。

基因组抽提试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、乙酸乙酯、丙酮和75％酒精等试剂均为分析纯，购自上海国药集团；蛋白胨、酵母提取物、琼脂等生化试剂均购于上海生工生物工程有限公司。

所述的培养基：内生菌分离培养基有PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加双蒸水定容至1000mL)和LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，调节pH值为7.2后加双蒸水定容至1000mL)。发酵培养基参考张应烙博士论文[13]配方，主要有：麦芽培养基(ME)、马铃薯葡萄糖培养基(PD)、高氏一号培养基、改良的査氏培养基和改良的马丁培养基(MMB)。

实施例1：本发明菌株的分离及鉴定

一种黄精内生菌，该菌株分离自安徽省牯牛降自然保护区内的野生黄精根茎，通过多种培养基对一组菌株进行发酵，并用乙酸乙酯萃取发酵产物，采用纸片扩散法进行抑菌活性分析，最终筛选分离出一株黄精内生菌，具体黄精内生菌的分离及纯化参照Schulz方法并改善，概述如下：取新鲜根茎，用自来水洗净后，取直径约为5mm根茎用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理5min；无菌水漂洗4次后用无菌滤纸吸去残留无菌水；再用75％(v/v)乙醇溶液处理根茎5min；然后用无菌水漂洗4次并吸去残留无菌水。用无菌刀片将处理后的根茎切成长度为3mm左右的片段，并分别种植在PDA和LB培养基上，作为实验组；同时随机选取切下的根茎片段，将其两端切口在酒精灯上烧一下后也种植于上述两种培养基作为对照组。将培养基于28℃恒温培养3～5d，所述对照组切口处无菌落长出，所述实验组黄精根茎切口处长出菌落，用接种环挑取菌体转接至新鲜PDA和LB培养基上进行纯化，至3次纯化后得到一组纯种菌落；将该组纯种菌转接到PDA和LB斜面培养基上作为斜面菌种保存备用。

将上述获得的一组斜面菌种进行发酵培养获得各菌种的发酵产物。用新配制LB液体培养基将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、变形杆菌和苏云金芽孢杆菌分别培养至OD₆₀₀为0.2～0.3，分别移取100μL菌液至新配制LB固体培养基上并涂布均匀；将此平板均分为4部分，并贴上直径6mm的无菌滤纸片。用DMSO将保存的100mg/mL发酵产物分别稀释至3.00mg/mL并用0.22μm无菌过滤器除菌，移取10μL浓度为3.00mg/mL的发酵产物分别滴加在上述无菌滤纸片上，以DMSO为对照，将此LB培养基于37℃培养12～14h，检测不同发酵产物对上述7种受试菌的抑菌活性，经对比分析，从而获得一株抑菌效果最好的黄精内生菌，将其命名为HJ-1。

将16S rRNA测序获得的序列在NCBI数据库上做BLAST序列比对分析发现，菌株HJ-1与菌株Bacillus tequilensis strain10b(序列号NR_104919.1)及菌株Bacillussubtilis strain JCM 1465(序列号NR_113265.1)序列的相似度均高达99.93％。利用软件MEGA6.06中的Kimura 2-Parameter模型计算进化距离，用邻接法Neighbor-Joining构建系统进化树，随机抽样1 000次，自展法(bootstrap)计算自引导值评估系统进化树的置信度，得到其系统发育树(图4)，进化分析显示菌株HJ-1与Bacillus subtilis strain JCM 1465在系统发育树上处于同一个分支。综合菌落、菌体形态和16S rRNA序列分析等结果，将该菌株鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus spp.)；命名为HJ-1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2018159，保藏时间为2018年3月28日。该菌株的微生物学特征是：革兰氏染色显示该菌为阳性，且部分有芽孢，菌体呈直杆状、圆端，菌体大小为0.5～1.2μm×1.7～3.5μm；该菌株在MMB平板上形成的菌落干燥，类似荷包蛋状，菌落中间微黄、四周微白，且菌落边缘不圆润；该菌株在ME、PD或MMB培养基中获得的发酵产物对绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌均具有显著抑菌效果。

依据常规方法对内生菌HJ-1进行菌落形态特征观察，并用扫描电镜进行菌体观察；同时利用染色和部分生理生化指标，结合东秀珠等编写的《常见细菌系统鉴定手册》进行初步鉴定。

用细菌基因组抽提试剂盒提取HJ-1菌株全基因组DNA，并将其寄至苏州金唯智生物科技有限公司，利用细菌通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行扩增和测序。将测得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，检索其同源序列。选择与目标菌株同源性较高的菌株序列，用软件Clustal X 2.1进行比对，并用软件MEGA 6.06[17]进行系统发育分析，以自展法(bootstrap)循环1 000次进行检测，构建系统发育进化树。

实施例2：内生菌发酵产物的制备

取保藏HJ-1斜面菌种，挑取少量菌种到新鲜PDA培养基上划线并于28℃恒温活化3～5d。将活化的单菌落转接至新鲜配制的PD培养基中，于28℃恒温摇床中180rpm培养12h得到种子液。分别移取10mL种子液至400mL新配制的ME、PD、高氏一号、改良的查氏和MMB培养基中并于28℃恒温摇床中180rpm培养7d，观察代谢产物的产生情况。实施例1中各纯种菌落的发酵方法同上。

取发酵7d后的培养液，用6～8层纱布过滤除去菌体后再用中速滤纸过滤，并按发酵液:乙酸乙酯为1:1.5(v/v)加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次；结果如表1所示。

表1黄精内生菌HJ-1发酵产物的质量

由表1结果可知，PD培养基发酵产物最多为0.2516g；ME和MMB培养基发酵产物次之，分别为0.2393g和0.2240g；高氏一号和改良的查氏培养基发酵产物较少，分别为0.1536g和0.1546g。从发酵产物产量分析可以发现，发酵培养基的种类对内生菌HJ-1发酵产物的产量有较大影响。

用旋转蒸发仪浓缩萃取液得到发酵产物粗浸膏；用丙酮洗脱粗浸膏并转至干净的小玻璃瓶内，将此发酵产物于通风橱内自然蒸发干燥，得到固态发酵产物。用100％二甲基亚砜(DMSO)将上述粗发酵产物分别配成100mg/mL，4℃保存备用。

实施例3：发酵产物的抑菌特性

将上述提取的发酵产物分别稀释至3.00mg/mL，检测其对7种受试菌体的抑菌活性，结果如图2所示。从图2的检测结果可知，该内生菌在ME、MMB和PD培养基中产生的发酵产物对绿脓杆菌(图2A)、鼠伤寒沙门氏菌(图2B)和苏云金芽孢杆菌(图2C)的抑菌效果非常明显；而高氏一号和查氏培养基中产生的发酵产物对上述7种受试菌体没有明显的抑菌活性(未展示)。因此，选取ME、MMB和PD培养基产生的发酵产物进一步探究其抑菌浓度。

将ME、MMB和PD培养基产生的发酵产物分别稀释至3.00、0.30和0.03mg/mL检测其对绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌的抑菌活性，结果如图3所示。从图3A结果可知，从MMB、ME和PD培养基提取的发酵产物浓度为3.00mg/mL时对绿脓杆菌的抑菌效果非常明显，抑菌圈直径可达15～18mm；当发酵产物浓度降至0.30mg/mL时抑菌圈直径仍可达12mm左右，其中ME培养基发酵产物抑菌活性较好；当发酵产物浓度降至0.03mg/mL时抑菌效果则不明显。

图3B结果显示以上三种培养基发酵产物对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性与绿脓杆菌类似，当发酵产物浓度为3.00mg/mL时对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径可达16mm左右，其中ME培养基发酵产物抑菌效果最佳；当发酵产物浓度降至0.30mg/mL时抑菌圈直径可达10mm左右，其中仍是ME培养基发酵产物抑菌活性最好；而当发酵产物浓度降至0.03mg/mL时抑菌效果非常微弱。

图3C结果显示以上发酵产物对苏云金芽孢杆菌的抑菌活性与绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌略有不同，当发酵产物浓度为3.00mg/mL时对苏云金芽孢杆菌的抑菌圈直径只有14mm左右，其中MMB培养基发酵产物抑菌效果最佳；当发酵产物浓度降至0.30mg/mL时抑菌圈直径仅达9mm左右，抑菌效果减弱明显；而当发酵产物浓度降至0.03mg/mL时抑菌效果很弱。参照文献[16]方法进一步测得上述发酵产物的最低抑菌浓度介于0.06～0.10mg/mL之间。

以上实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。故在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，均应落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 黄山学院

<120> 一种黄精内生菌及其应用

<141> 2018-06-14

<150> 2018103243179

<151> 2018-04-12

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1400

<212> DNA

<213> 黄精内生菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60

cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120

tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg 180

gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240

cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300

gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360

atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420

ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt 540

ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780

gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat 960

cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac 1200

aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tgaggtaacc 1400

Claims (7)

1.一种黄精内生菌，命名为HJ-1，该菌株鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus spp.），保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址 ：中国武汉武汉大学，保藏号为 CCTCC No ：M2018159，保藏时间为 2018 年 3 月 28 日。

2.如权利要求1所述的黄精内生菌在制备抑菌剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的抑菌剂具有抗绿脓杆菌、伤寒沙门氏菌和苏云金芽孢杆菌的作用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂的制备包括以下步骤：

（1）取保藏的斜面菌种，挑取少量菌种到PDA培养基上划线并于28 ˚C恒温活化3~5 d；

（2）将步骤（1）活化后的菌种接种到PD培养基中，于28 ˚C恒温摇床中以180 rpm的转数培养12 小时得到种子液；

（3） 将种子液以体积比1:40的比例放入ME、PD或MMB培养基中并于28 ˚C恒温摇床中以180 rpm的转数培养7 d；

（4）将步骤（3）获得的培养液过滤去除菌体得发酵液；

（5）将发酵液中加入乙酸乙酯进行多次萃取，然后用旋转蒸发仪浓缩萃取液得到发酵产物粗浸膏；

（6）将发酵产物粗浸膏放入100%二甲基亚砜中配成溶液，即为抑菌剂溶液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（4）通过6~8层纱布过滤除去菌体得发酵液。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（5）中发酵液与乙酸乙酯的体积比为1:1.5，萃取次数为3次。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤（6）中发酵产物粗浸膏先用丙酮洗脱，然后置于通风处干燥得固态发酵产物，将固态发酵产物放入100%二甲基亚砜中配成溶液，制得浓度为100 mg/mL的抑菌剂溶液。

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