CN114350529B

CN114350529B - 一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌及其应用

Info

Publication number: CN114350529B
Application number: CN202210108551.4A
Authority: CN
Inventors: 郑春英; 曾伟民; 吴桐; 许哲祥; 闫佳佳; 万璐; 尤梦瑶; 张赫
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang University
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114350529A

Abstract

一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株甘草内生真菌及其应用。是要解决现有甘草资源濒危，难以从甘草中提取查尔酮类成分的问题。甘草内生真菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HGC2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211683。其具有良好的抗菌活性和一定的抗氧化活性。且能够发酵产异甘草苷和异甘草素，节省药用植物甘草资源，为异甘草苷及异甘草素的生产提供新方法。本发明用于发酵产异甘草苷和异甘草素活性成分。

Description

一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株甘草内生真菌及其应用。

背景技术

甘草是豆科植物乌拉尔甘草(G.uralensis)、光果甘草(G.glabra)或胀果甘草(G.inflata)的干燥根和根茎，分布于我国东北、西北及华北等地。含有甘草黄酮、甘草皂苷等400多种化学成分，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗炎以及抗病毒等多种活性作用，现广泛应用于临床；此外，在现代食品加工生产中，甘草提取物经常被作为抗菌剂、抗氧化剂、甜味剂等而广泛应用。

异甘草苷和异甘草素是甘草中重要的两个查尔酮类成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。鉴于甘草资源的濒危现状，有必要寻找甘草活性成分生产的新方法。

发明内容

本发明是要解决现有甘草资源濒危，难以从甘草中提取查尔酮类成分的问题，提供一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌及其应用。

本发明提供一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)HGC2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M 20211683。

本发明甘草内生真菌HGC2的菌落呈现白色，菌丝中间较为密集，边缘较为稀疏，呈外扩姿态，菌落基质为紫色，中间颜色较深，外圈呈现乳白色；孢子略微弯曲，具有分枝，横隔较多。

将本发明的甘草内生真菌HGC2的ITS序列提交至NCBI数据库，进行GenBank分析，使用MEGA5.0软件对甘草内生真菌HGC2序列同源性较高的菌株序列进行分析，建立甘草内生真菌HGC2的系统发育树，甘草内生真菌HGC2与Fusarium oxysporum(MK424838.1)聚于同一分支，且两者同源性为99％。综合形态学鉴定以及ITS序列分析结果，将甘草内生真菌HGC2鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

本发明还提供甘草内生真菌HGC2在制备抑制细菌的药物中的应用。

本发明还提供甘草内生真菌HGC2在制备抗氧化药物中的应用。

本发明还提供甘草内生真菌HGC2在发酵产查尔酮类成分中的应用。

进一步的，所述查尔酮类成分为异甘草苷和异甘草素。

本发明的有益效果：

本发明在甘草中分离提纯一株甘草内生真菌HGC2，经鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。甘草内生真菌HGC2具有良好的抗菌活性，其中对铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌抑制效果最为显著，抑菌圈直径分别达到了18.6±0.1mm以及18.7±0.1mm。甘草内生真菌HGC2还具有一定的抗氧化活性。

甘草内生真菌HGC2能够发酵产甘草查尔酮类成分——异甘草苷和异甘草素。其中异甘草苷具有抗溃疡、抗炎、抗氧化、抗肿瘤血管新生、解毒等作用；异甘草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒和增强免疫、减轻炎症等作用。采用内生真菌HGC2发酵法生产异甘草苷及异甘草素，将会节省药用植物甘草资源，同时也为异甘草苷及异甘草素的生产提供新方法，因此，甘草内生真菌HGC2具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为甘草内生真菌HGC2的菌落形态；

图2为甘草内生真菌HGC2菌落基质形态；

图3为甘草内生真菌HGC2孢子显微形态；

图4为甘草内生真菌HGC2的系统发育树；

图5为甘草内生真菌HGC2对DPPH自由基的清除能力；

图6为内生真菌HGC2乙醚萃取部位HPLC分析；

图7为内生真菌HGC2乙酸乙酯萃取部位HPLC分析；

图8为化合物A的TLC检视结果；其中1表示异甘草苷对照品，2表示化合物A；

图9为化合物A的高效液相色谱分析结果；

图10为化合物B的TLC检视结果；其中1表示异甘草素对照品，2表示化合物B；

图11为化合物B的高效液相色谱分析结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

本实施例的甘草内生真菌HGC2为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HGC2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M 20211683。

本实施例甘草内生真菌HGC2的获取方法为：

取三年生健康乌拉尔甘草根(采自黑龙省大庆市)，清水冲洗，在无菌条件下，分别切成1.0cm小段，刮去外皮，并按下述程序进行表面消毒：首先将处理过的样品在75％酒精中浸泡1min，然后置于2％NaClO中漂洗15min，最后以无菌水冲洗3次。把最后一次漂洗消毒材料的漂洗液吸取0.3mL涂布于PDA平板上和液体培养基中，28℃培养，观察培养结果。

用无菌手术刀将上述消毒样品从中间切开，分别置于PDA培养基中，28℃恒温培养箱，待其边缘及顶端长出菌丝后，及时挑取菌落转接至新鲜PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出时间的不同，采用菌丝顶端纯化法挑取并接种到PDA培养基中，在28℃培养箱中培养数日后，分离得到甘草内生真菌HGC2。将纯化后的菌株进行斜面培养，4℃条件下保存备用。

实施例2：甘草内生真菌HGC2的鉴定

采用形态学观察及ITS序列分析法。

甘草内生真菌HGC2的菌落形态如图1所示，菌落基质形态如图2所示，孢子显微形态如图3所示。可以看出，甘草内生真菌HGC2菌落呈现白色，菌丝中间较为密集，边缘较为稀疏，呈外扩姿态，菌落基质为紫色，中间颜色较深，外圈呈现乳白色；孢子略微弯曲，具有分枝，横隔较多，参照《真菌鉴定手册》等文献，将该菌初步鉴定为镰刀菌。

甘草内生真菌HGC2基因组DNA PCR扩增后获得一条长度为518bp的特异性条带，将其测序，如序列表中SEQ ID NO：1所示。将测得的甘草内生真菌HGC2的ITS序列提交至NCBI数据库，进行GenBank分析，使用MEGA5.0软件对内生真菌HGC2序列同源性较高的菌株序列进行分析，建立甘草内生真菌HGC2的系统发育树，如图4所示，甘草内生真菌HGC2与Fusarium oxysporum(MK424838.1)聚于同一分支，且两者同源性为99％。综合形态学鉴定以及ITS序列分析结果，将甘草内生真菌HGC2鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

实施例3：甘草内生真菌HGC2抑菌活性分析：采用牛津杯法。

甘草内生真菌HGC2发酵液制备：无菌条件下，挑取甘草内生真菌HGC2菌丝体接种于PDB培养基(60mL)中，28℃、120r/min培养3d，待菌种活化后，将种子液以5％(V/V)的接种量转接至PDB培养基(300mL)中，28℃、120r/min发酵14d，得到甘草内生真菌HGC2发酵液。

取10株供试细菌，接种于含有NA培养基的试管斜面中，37℃培养1d；取1株供试真菌，接种于含有PDA培养基的试管斜面中，28℃培养3d，备用。将各试管加入5mL无菌水，震荡，将各菌株稀释为1×10⁷CFU/mL浓度的菌悬液，倒入各自培养基中，分装到放有牛津杯的无菌平板，待冷却后，取出牛津杯，备用。

取甘草内生真菌HGC2发酵液3L，浓缩至150mL后，加150mL甲醇超声提取30min，浓缩，冻干，取冻干粉2mg加入10mL甲醇溶解，即得200μg/mL供试品液。

向制备好的含菌平板的两孔中精密加入150μL供试品液，将含有细菌的平板放入37℃培养箱中，培养1d后测量抑菌圈直径；将含有真菌的平板放入28℃培养箱中，培养3d后测量抑菌圈直径，每组供试平板平行做三次，以甲醇为阴性对照，200μg/mL链霉素为阳性对照。抑菌实验结果见表1。

表1HGC2发酵液抗菌活性结果(mm)

注：试验菌株：A：枯草芽孢杆菌；B：大肠杆菌；C：肺炎克雷伯菌；D：屎肠球菌；E：鲍曼不动杆菌；F：粪肠球菌；G：单增李斯特菌；H：短小芽孢杆菌；I：铜绿假单胞菌；J：金黄色葡萄球菌；K：白假丝酵母；Str：链霉素

由表1可知，甘草内生真菌HGC2发酵液对11株供试菌均有一定的抑制效果，其中内生真菌HGC2发酵液对铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌抑制效果最显著，抑菌圈直径分别达到了18.6±0.1mm以及18.7±0.1mm，且阴性对照(甲醇)对抗菌结果无影响。上述结果表明，甘草内生真菌HGC2发酵液具有良好的抗菌活性。

实施例4：甘草内生真菌HGC2抗氧化活性分析：采用DPPH自由基清除活性测定。

将11.8mg DPPH溶于甲醇并定容至200mL，即得浓度为0.15mmol·L^-1的DPPH溶液；称取2mg Vc，以10mL甲醇进行溶解，即得0.2mg/mL对照品溶液；取实施例2中的甘草内生真菌HGC2冻干粉2mg加入10mL甲醇溶解，即得200μg/mL供试品液。备用。

将上述对照品及供试品溶液分别稀释到100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL，量取2mL，加入4mL的DPPH溶液，以甲醇为阴性对照，避光反应30min，在517nm下测量吸光值(n＝3)。DPPH自由基清除率计算公式如下：

其中，Ai表示同时加入待测样品与DPPH溶液的吸光度值，Aj表示同时加入待测样品与空白对照的吸光度值；A0表示同时加入空白对照与DPPH溶液的吸光度值。

甘草内生真菌HGC2对DPPH自由基的清除能力见图5，其中A表示甘草内生真菌HGC2，B表示Vc。由图5可知，甘草内生真菌HGC2具有一定的抗氧化活性，且其抗氧化活性具有良好的量效关系。

实施例5：甘草内生真菌HGC2发酵液活性代谢物分析

一、供试品溶液的制备

取甘草内生真菌HGC2发酵液，低温浓缩后，分别采用3种不同极性的有机溶剂(水饱和正丁醇、乙酸乙酯、乙醚)萃取3次(3×100mL)，回收溶剂，以10mL色谱甲醇溶解，即得内生真菌HGC2发酵液水饱和正丁醇、乙酸乙酯、乙醚萃取部位。

二、对照品液的制备

分别精密称取适量的异甘草苷、异甘草素对照品，加入色谱甲醇，制成浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。

三、色谱条件见表2。

表2HPLC分析条件

四、甘草内生真菌HGC2发酵液次生代谢产物分析

采用表2中①号流动相，精密吸取各溶液20μL，对供试品、对照品及PDA溶液进行HPLC分析，对比分析(n＝3)。结果见图6及图7。图6中A表示HGC2乙醚萃取部位，B表示异甘草素对照品，C表示PDB。图7中A表示HGC2乙酸乙酯萃取部位，B表示异甘草苷对照品，C表示PDB。

由图6可知，在甘草内生真菌HGHC2发酵液乙醚萃取部位中，含有异甘草素，分离度较好，且PDB空白对照品无干扰。

由图7可知，在甘草内生真菌HGC2发酵液乙醚萃取部位中，含有异甘草苷，分离度较好，且PDB空白对照品无干扰。

实施例6：甘草内生真菌HGC2查尔酮类成分的分离

取甘草内生真菌HGC2发酵液15L，离心除去菌体，上清液通过D101大孔吸附树脂柱后，以不同浓度乙醇(30％，50％，70％，90％)依次洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，再通过聚酰胺柱，以不同浓度乙醇(30％，50％，70％，90％)依次洗脱，辅以TLC分析检测，对50％醇洗脱液中含有查尔酮类成分的部分进行合并后，回收溶剂，然后进行硅胶柱分离，采用石油醚:乙酸乙酯(2:2)进行洗脱，合并含有相同次生代谢产物部分，重结晶，得到化合物A。

对甘草内生真菌HGC2发酵液乙醚萃取部位进行硅胶柱分离，采用石油醚:乙酸乙酯(14:2)进行洗脱，辅以TLC分析检测，合并相同次生代谢产物部分，回收溶剂后，进行硅胶柱色谱分离，采用氯仿:甲醇(10:1)洗脱，合并相同次生代谢产物部分，重结晶得到化合物B。

化合物A为黄色粉末，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，以氯仿:甲醇(10:1)为展开剂，在紫外灯254nm下进行TLC检视，结果如图8所示。

由图8可知，化合物A在薄层色谱上呈现单一斑点，初步判定为单体物质，且与异甘草苷对照品的Rf值相同，因此推断化合物A疑似异甘草苷，需进一步鉴定确定其结构。

采用表2中②号流动相，以异甘草苷为对照品，采用标准加入法对化合物A进行HPLC分析，结果如图9所示，其中A表示样品，B表示异甘草苷对照品，C样品+对照品。

化合物A与异甘草苷对照品在保留时间13.090min处出现单一色谱峰，说明化合物A纯度较好，其纯度为97.33％，将化合物A与异甘草苷对照品进行混合，在保留时间13.090min处仅出现单一色谱峰，因此推测化合物A为异甘草苷，为进一步确定其结构，采用1H-NMR进行鉴别。

化合物A的1H-NMR：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.99(d，J＝8.9Hz，1H)，7.82(d，J＝15.3Hz，1H)，7.76–7.66(m，3H)，7.17(d，J＝8.7Hz，2H)，6.43(dd，J＝8.9，2.4Hz，1H)，6.30(d，J＝2.4Hz，1H)，3.91(dd，J＝12.0，2.2Hz，1H)，3.72(dd，J＝12.1，5.5Hz，1H)，3.59–3.34(m，5H)。

综合TLC、HPLC以及1H-NMR结果，化合物A理化性质及1H-NMR结果与异甘草苷完全一致，故将化合物A鉴定为异甘草苷，其化学式为C₂₁H₂₂O₉，化学结构如下所示。

单体化合物B为黄色结晶，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，以氯仿:甲醇(10:1)为展开剂，在紫外灯254nm下进行TLC检视，结果如图10所示。

根据TLC结果可知，化合物B在薄层色谱上呈现单一斑点，初步判断其为单体物质，且与异甘草素的Rf值相近，斑点颜色相同，因此推断化合物B疑似异甘草素，但还需进一步鉴定以确定其结构。

采用表2中②号流动相，以异甘草素为对照品，采用标准加入法对化合物B进行HPLC分析，结果如图11所示，其中A表示样品，B表示异甘草素对照品，C样品+对照品。

由图11可知，化合物B与异甘草素对照品均在保留时间12.972min处出现单一色谱峰，其纯度为97.11％，将化合物B与异甘草素对照品进行混合，在保留时间12.972min处仅出现单一色谱峰，因此推测化合物B为异甘草素，为进一步确定其结构，采用1H-NMR进行鉴别。

化合物B的1H-NMR：1H NMR(400MHz，Methanol-d4)δ7.97(d，J＝8.9Hz，1H)，7.80(d，J＝15.3Hz，1H)，7.68–7.55(m，3H)，6.90–6.79(m，2H)，6.42(dd，J＝8.8，2.5Hz，1H)，6.30(d，J＝2.5Hz，1H)。

根据TLC、HPLC和1H-NMR，化合物B理化性质及1H-NMR结果与异甘草素完全一致，因此将单体化合物B鉴定为异甘草素，化学式：C₁₅H₁₂O₄，化学结构如下所示。

甘草内生真菌HGC2能够产甘草查尔酮类成分，具体为异甘草苷和异甘草素。采用甘草内生真菌HGC2发酵法生产异甘草苷及异甘草素，将会节省药用植物甘草资源，同时也为异甘草苷及异甘草素的生产提供新方法。因此，甘草内生真菌HGC2具有广阔的应用前景。

序列表

<110> 黑龙江大学

<120>一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 518

<212> DNA

<213>镰刀菌属（Fusarium）

<220>

<223>尖孢镰刀菌HGC2的ITS序列

<400> 1

tgatatgctt aagttcagcg ggtattccta cctgatccga ggtcaacatt cagaagttgg 60

ggtttaacgg cgtggccgcg acgattacca gtaacgaggg ttttactact acgctatgga 120

agctcgacgt gaccgccaat caatttgagg aacgcgaatt aacgcgagtc ccaacaccaa 180

gctgtgcttg agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc ccgccagaat actggcgggc 240

gcaatgtgcg ttcaaagatt cgatgattca ctgaattctg caattcacat tacttatcgc 300

attttgctgc gttcttcatc gatgccagaa ccaagagatc cgttgttgaa agttttgatt 360

tatttatggt tttactcaga agttacatat agaaacagag tttaggggtc ctctggcggg 420

ccgtcccgtt ttaccgggag cgggctgatc cgccgaggca acaagtggta tgttcacagg 480

ggtttgggag ttgtaaactc ggtaatgatc cctccgca 518

Claims

1.一株产查尔酮类成分的甘草内生真菌，其特征在于所述甘草内生真菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)HGC2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2021年12月27日，保藏编号为CCTCC NO：M 20211683。

2.如权利要求1所述的甘草内生真菌在制备抑制细菌的药物中的应用；所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、单增李斯特菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。

3.如权利要求1所述的甘草内生真菌在制备抗氧化药物中的应用。

4.如权利要求1所述的甘草内生真菌在发酵产查尔酮类成分中的应用；所述查尔酮类成分为异甘草苷和异甘草素。