CN101492706A

CN101492706A - 一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法

Info

Publication number: CN101492706A
Application number: CNA2008100690105A
Authority: CN
Inventors: 康冀川; 文庭池; 雷帮星; 李祝; 李光荣
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2008-11-25
Filing date: 2008-11-25
Publication date: 2009-07-29

Abstract

本发明公开了一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法；该方法包括(1)将菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；(2)将斜面母种制成孢子悬液，接于液体母种培养基中，摇瓶培养，得到液体母种；(3)发酵培养基高温灭菌后冷却，再将液体母种接入，摇瓶培养，得到含菌丝体的发酵液；(4)通过过滤将菌丝体及发酵液分离，纯净水冲洗菌丝，洗去培养基，收集菌丝体，烘至恒重，制得干菌丝体；技术关键是在发酵培养基中添加腺嘌呤和甘氨酸的复合物，添加浓度为腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％。本方法显著提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素的产量和效率、提高原料药蛹虫草菌粉中有效成分的含量；本方法易操作，虫草菌素产量高，成本低，适于工业生产。

Description

一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.)Link]又名北冬虫夏草

技术领域

本发明涉及真菌发酵工程，具体而言涉及蛹虫草液体发酵高产虫草菌素及高含虫草菌素菌丝体的生产方法。

背景技术，隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌纲、粪壳菌亚纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属，又名北虫草，北冬虫夏草。它是虫草属真菌的模式种，蛹虫草含有多种有效成分，包括虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、虫草菌素(cordycepin)、麦角甾醇过氧化物和虫草环肽等。

人们对蛹虫草的药理作用进行了大量的研究，证实其具有广泛的药理学活性及临床作用。蛹虫草菌粉及胶囊于2003年被批准为国家一类新药(中药)。产品标识其具有补肺益肾、止咳化痰之功效，能够调节机体免疫功能，提高机体综合抗病能力，主要用于慢性支气管炎、各种肿瘤及其它免疫系统疾病的治疗。经大量的研究证明，蛹虫草液体发酵生产的菌丝体与天然冬虫夏草的成份极相似，并证明了它与天然冬虫夏草有相似的药理作用与临床效果，甚至在某些方面优于天然的冬虫夏草(如毒性比天然的小)，可以代替冬虫夏草在临床广泛应用。

虫草菌素即3′-脱氧腺苷(3′-Deoxyadenosine)，又称蛹虫草菌素，由Cunningham等于1951年从蛹虫草的培养滤液中分离得到。虫草菌素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草菌素的分子式为C₁₀H₁₃N₅O₃，分子量251，碱性，针状或片状结晶，熔点230℃～231℃，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，蒽酮反应阳性，紫外光最大吸收波长为259nm。虫草菌素具有多种生物学活性，比如：抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制人体免疫缺陷病毒HIVI型病毒的作用、免疫调节作用、减肥和降血糖、降血脂作用。其中，降血脂方面的效果尤为明显，与市售的法国力博福尼制药公司生产的非诺贝特(力平之)效果相当或优于非诺贝特；在治疗白血病方面也在美国由FDA批准进入了临床研究(1997年11月美国癌症研究所，2008年7月美国OncoVista公司)。虫草菌素的结构式为：

近年来，蛹虫草的生产与应用受到了人们的关注，涉及蛹虫草的专利申请近百件。但是决大多数集中在固体培养的研究方面，涉及液体培养的很少，例如200610010482.4号“蛹虫草液体静置培养技术”、200510050531.2号“一种北冬虫夏草液体菌种营养基的制备方法及其应用”、01124109.8“发酵培养生产虫草素的方法”，但以上发明其单位产量很低，最高只有7.1mg/L；03135295.2“一种提高虫草菌素含量的方法”公开了一种提高虫草菌丝中虫草菌素含量的方法，但其采用752型分光光度计的检测方法不当，因最大吸收峰相近，未能将虫草菌素和其他核苷类物质(如腺苷)区分开。故只有通过工艺方法的改进才可克服现有缺点从而高效提高蛹虫草虫草菌素的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法，以克服现有技术蛹虫草菌丝体中虫草菌素含量低和发酵液中虫草菌素单位产量低的缺陷。

本发明所使用的菌株为蛹虫草(Cordyceps militaris)无性型蛹草拟青霉(paecilomyces militaris)PM-71菌株，已于2008年4月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCCNo.2459。

发明人经过系统的研究和试验后，提出了通过添加剂提高蛹虫草液体发酵虫草菌素的产量，以及高含虫草菌素蛹虫草菌丝体的生产方法，方法包括：

(1)将菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；

(2)将斜面母种制成孢子浓度适中的孢子悬液，接于液体母种培养基中，摇瓶培养，得到液体母种；

(3)在发酵培养基中，加入添加剂腺嘌呤和甘氨酸按照一定比例配成的复合物，高温灭菌后冷却，再将液体母种接入，摇瓶培养，得到含菌丝体(大部分为菌丝球)的发酵液；

(4)通过过滤将菌丝体及发酵液分离，用纯净水冲洗菌丝，洗去培养基后，收集菌丝体，烘至恒重，制得高含虫草菌素的干菌丝体。

在上述第二步的蛹虫草液体母种制作方法中，所用的培养基配方为蛋白胨1％，蔗糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，水1000mL，pH值自然；所用工艺条件是：液体母种培养基装液量为50mL/250mL三角瓶；液体母种于23℃、转速150r/min下培养4d。

在上述第三步的蛹虫草液体发酵过程中，所用的培养基配方为腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％，蛋白胨1.5％，蔗糖2％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，水1000mL，pH值自然；所用工艺条件是：装液量100mL/500mL三角瓶，采用5％接种量将种子液接入发酵摇瓶中，在23℃下摇床以150r/min转速培养11d。

发明人指出，本发明的关键技术在于在发酵培养基中，同时加入腺嘌呤和甘氨酸作为添加剂可以提高蛹虫草液体发酵生产虫草菌素的产量和效率。腺嘌呤和甘氨酸能有效地协同作用，使虫草菌素产量明显提高。同时使用1g/L的腺嘌呤和8g/L的甘氨酸作为添加剂时，虫草菌素产量最高，发酵液中虫草菌素含量为1844.21mg/L，是对照培养基的5.26倍；菌丝体中虫草菌素含量达到了25.90mg/g，是对照培养基的2.82倍。经检测所生产的菌丝体里腺嘌呤和甘氨酸的含量并不高，大部分被转化成了目标产物。故本发明提高了有效成分虫草菌素的含量而不会影响菌丝体的质量。

虫草菌素含量的检测方法如下：采用HPLC分析发酵液和干菌丝体中虫草菌素的含量，HPLC测定用PC2000型HPLC分析仪(Scientific systems Inc.，PA，USA)；检测波长为259nm；柱温30℃；流动相为10mM KH₂PO₄溶于甲醇/双蒸水(15∶85)，流速为1ml/min；进样量为20μl。蛹虫草发酵液中虫草菌素含量测定：可先将发酵液稀释到适当浓度后经0.45μm滤膜过滤除杂后检测其中虫草菌素的含量；蛹虫草菌丝体中虫草菌素含量测定：先精密称取干菌丝粉0.2g置于具塞试管中，加入双蒸水10ml，超声处理30min，然后在5000g下离心15min，最后经0.45μm滤膜过滤除杂后检测其中虫草菌素的含量；若测定前样品经过稀释，则乘以稀释倍数。

本发明对提高蛹虫草液体发酵的产量和效率，以及提高原料药蛹虫草菌粉中有效成分的含量具有重要意义；生产的该菌丝可作功能食品，还可用作原料药；本方法易操作，虫草菌素产量高，成本低，适于工业生产。

具体实施方式

实施例1：将CGMCCNo.2459菌株转接于PDA斜面培养基上25℃下培养5d、活化2次，得到斜面母种；轻轻刮洗斜面母种并将之制成孢子悬液，然后用无菌棉过滤掉悬液里的菌丝，每瓶液体母种接入浓度适中的蛹虫草孢子，使制作的液体种的菌丝球细小而均匀，发酵液澄清透明。液体母种培养基配方为：蛋白胨1％，蔗糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，水1000mL，pH值自然；250mL三角瓶装液量为50mL，于23℃摇床以150r/min转速培养4d，得到液体母种；

使用最优化的发酵培养基：配方为腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.8％，蛋白胨1.5％，蔗糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，水1000mL，pH值自然，高温灭菌后冷却，再将液体母种按5％的量接入装液量为100mL的500mL三角瓶中，在23℃下摇床以150r/min转速培养11天，得到大部分菌丝体形态为菌丝球的发酵液；通过过滤将菌丝体及发酵液分离，再用纯净水冲洗菌丝，洗去培养基后，收集菌丝体，烘至恒重，采用HPLC分析发酵液和干菌丝体中虫草菌素的含量。检测结果显示：蛹虫草发酵液中虫草菌素含量在1.8g/L以上；干菌丝体中虫草菌素含量大于2.5％的。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种提高蛹虫草液体发酵虫草菌素产量的方法，该方法包括以下四步：(1)将菌株转接于斜面培养基上进行培养、活化，得到斜面母种；(2)将斜面母种制成孢子浓度一定的孢子悬液，接于液体母种培养基中，摇瓶培养，得到液体母种；(3)发酵培养基高温灭菌后冷却，再将液体母种接入，摇瓶培养，得到含菌丝体的发酵液；(4)通过过滤将菌丝体及发酵液分离，用纯净水冲洗菌丝，洗去培养基后，收集菌丝体，烘至恒重，制得虫草菌素的干菌丝体；其特征在于在液体发酵培养基中添加腺嘌呤与甘氨酸的复合物，添加浓度分别为腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第二步中，所用的液体母种培养基配方为蛋白胨1％，蔗糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄0.1％，水1000mL，pH值自然。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第二步中，所用工艺条件是：液体母种培养基装液量为50mL/250mL三角瓶；液体母种于23℃、转速150r/min下培养4d。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第三步中，所用的培养基配方为腺嘌呤0.1％，甘氨酸0.1％～1.6％，蛋白胨1.5％，蔗糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄ 0.1％，水1000mL，pH值自然。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法的第三步中，所用工艺条件是：装液量100mL/500mL三角瓶，采用5％接种量将种子液接入发酵摇瓶中，在23℃下摇床以150r/min转速培养11d。