CN106434794A - 一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，蛹虫草作为产虫草素的主要菌株，其液态深层发酵液中虫草素的含量要比菌丝体及其子实体中的高。本发明优化了发酵培养基配方，使蛹虫草发酵液中虫草素含量达到1g/L以上。通过大孔吸附树脂对发酵液中的虫草素进行提取，提供大孔树脂H103对发酵液中虫草素的吸附及解吸条件，可以得到较好的分离纯化效果，吸附率达到90%以上。利用蛹虫草发酵液提取虫草素发酵周期短、可控性好、虫草素含量高、同时大孔吸附树脂可以重复利用，因此适合工厂化生产。

Description

一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法
技术领域
本发明具体涉及一种从蛹虫草液体发酵液中提取虫草素的方法。
背景技术
虫草素(Cordycepin)，即3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine)，又名虫草菌素、蛹虫草菌素。是蛹虫草中起抗菌杀毒作用的主要活性物质。近50多年的研究发现虫草素有抑制肿瘤、抗真菌和增强免疫力的作用。
蛹虫草作为产虫草素的主要菌株，其液态深层发酵液中虫草素的含量要比菌丝体及其子实体中的高，但现有技术蛹虫草发酵液中虫草素含量较低、分离纯化效果不理想。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供一种从蛹虫草液体发酵液中提取虫草素的方法。本发明优化了发酵液培养基配方，能够显著提高蛹虫草发酵液中虫草素含量，使蛹虫草发酵液中虫草素含量达到1g/L以上。本发明通过大孔吸附树脂对发酵液中的虫草素进行提取并纯化，提供大孔树脂H103对发酵液中虫草素的吸附及解吸条件，可以得到较好的分离纯化效果，吸附率达到90％以上。同时大孔吸附树脂可以重复利用，节约了成本，适合工厂化生产。
本发明为达到上述目的，其技术方案包括如下步骤：
(1)菌种活化：将蛹虫草(Cordyceps militaris)的菌丝接种到PDA固体培养基上进行活化，得菌苔；
(2)制备种子液：取1～2块面积5—10mm2大小的上述菌苔接入种子培养基，装液量为100/250mL，于温度20～25℃、摇床转速为150r/min条件下，培养3～5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；
(3)制备发酵液：将上述蛹虫草的种子液按10％接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、通气1.5～2.0L/(L·min)、搅拌速度100～150r/min条件下，培养7d，得发酵液；
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将上述发酵液进行离心获得上清液，并将上清液浓缩获得浓缩液，将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。
本发明的优点效果如下：
本发明利用大孔吸附树脂对发酵液中的虫草素进行提取纯化，效果好。从蛹虫草液体发酵液中提取虫草素，发酵周期短、可控性好、虫草素含量高、发酵成本低、适合工厂化生产等优点，是目前生产天然虫草替代品的最好方法。该方法为实现珍贵虫草资源的可持续利用创造了条件，市场推广潜力巨大。
附图说明
图1为不同培养基配方发酵液中虫草素含量曲线图。
图中，常规培养基：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、和硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g；
优化培养基：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、和硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、甘氨酸8g、腺嘌呤1g。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种活化：将蛹虫草的菌丝接种到PDA固体培养基上，培养温度22℃，避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部完成转色，得到活化的菌苔。
(2)制备种子液：配制种子培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g，混匀并补水至1000mL，pH自然，装液量为100/250mL，121℃高压灭菌20min。种子培养基降到室温后，取2块面积8mm2大小的菌苔接入种子培养基中，于温度22℃、摇床转速为150r/min条件下，培养5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀。
(3)制备发酵液：配制发酵培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、甘氨酸6g、腺嘌呤1g，混匀投入到发酵罐中灭菌。将蛹虫草种子液按10％接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度22℃、通气1.5L/(L·min)、搅拌速度150r/min条件下，培养7d。
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将发酵液进行离心，离心速度为6000r/min，离心20min获得上清液，并将上清液浓缩至原体积的1/3。将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。1.5BV/h吸附流速，洗脱时先用水洗去杂，40％乙醇2BV/h洗脱富集。经干燥即得虫草素产品。
实施例2
(1)菌种活化：将蛹虫草的菌丝接种到PDA固体培养基上，培养温度22℃，避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部完成转色，得到活化的菌苔。
(2)制备种子液：配制种子培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g，混匀并补水至1000mL，pH自然，装液量为100/250mL，121℃高压灭菌20min。种子培养基降到室温后，取2块面积8mm2大小的菌苔接入种子培养基中，于温度23℃、摇床转速为150r/min条件下，培养5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀。
(3)制备发酵液：配制发酵培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4 7H2O)1.0g、甘氨酸8g、腺嘌呤1g，混匀投入到发酵罐中灭菌。将蛹虫草种子液按10％接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度23℃、通气1.5L/(L·min)、搅拌速度150r/min条件下，培养7d。
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将发酵液进行离心，离心速度为8000r/min，离心20min获得上清液，并将上清液浓缩至原体积的1/4。将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。2BV/h吸附流速，洗脱时先用水洗去杂，50％乙醇2BV/h洗脱富集。经干燥即得虫草素产品。
实施例3
(1)菌种活化：将蛹虫草的菌丝接种到PDA固体培养基上，培养温度20℃，避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部完成转色，得到活化的菌苔。
(2)制备种子液：配制种子培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g，混匀并补水至1000mL，pH自然，装液量为100/250mL，121℃高压灭菌20min。种子培养基降到室温后，取1块面积10mm2大小的菌苔接入种子培养基中，于温度20℃、摇床转速为150r/min条件下，培养5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀。
(3)制备发酵液：配制发酵培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、甘氨酸6g、腺嘌呤1g，混匀投入到发酵罐中灭菌。将蛹虫草种子液按10％接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20℃、通气1.8L/(L·min)、搅拌速度100r/min条件下，培养7d。
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将发酵液进行离心，离心速度为7000r/min，离心20min获得上清液，并将上清液浓缩至原体积的1/4。将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。1.8BV/h吸附流速，洗脱时先用水洗去杂，30％乙醇2BV/h洗脱富集。经干燥即得虫草素产品。
实施例4
(1)菌种活化：将蛹虫草的菌丝接种到PDA固体培养基上，培养温度25℃，避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部完成转色，得到活化的菌苔。
(2)制备种子液：配制种子培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g，混匀并补水至1000mL，pH自然，装液量为100/250mL，121℃高压灭菌20min。种子培养基降到室温后，取2块面积5mm2大小的菌苔接入种子培养基中，于温度25℃、摇床转速为150r/min条件下，培养5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀。
(3)制备发酵液：配制发酵培养基(g/L)：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、甘氨酸8g、腺嘌呤1g，混匀投入到发酵罐中灭菌。将蛹虫草种子液按10％接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度25℃、通气2.0L/(L·min)、搅拌速度120r/min条件下，培养7d。
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将发酵液进行离心，离心速度为8000r/min，离心20min获得上清液，并将上清液浓缩至原体积的1/5。将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。2BV/h吸附流速，洗脱时先用水洗去杂，50％乙醇2BV/h洗脱富集。经干燥即得虫草素产品。
附表：大孔树脂对蛹虫草发酵液虫草素吸附效果

Claims (7)

1.一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌种活化：将蛹虫草(Cordyceps militaris)的菌丝接种到PDA固体培养基上进行活化，得菌苔；
(2)制备种子液：取1～2块面积5—10mm2大小的上述菌苔接入种子培养基，装液量为100/250mL，于温度20～25℃、摇床转速为150r/min条件下，培养3～5d，得到种子液，种子液中的菌丝球形态规则、颗粒均匀；
(3)制备发酵液：将上述蛹虫草的种子液按10％体积接种量转接到发酵罐的发酵培养基中，发酵罐的装液系数0.75，在温度20～25℃、通气1.5～2.0L/(L·min)、搅拌速度100～150r/min条件下，培养7d，得发酵液；
(4)虫草素提取、纯化：发酵结束后，将上述发酵液进行离心获得上清液，并将上清液浓缩获得浓缩液，将浓缩液经H103大孔树脂进行分离虫草素。
2.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，接种到PDA固体培养基上菌丝，培养温度20～25℃，避光培养5d，菌丝长满培养基平面，转到见光条件下，培养5d，菌丝全部完成转色，得到活化的菌苔。
3.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，种子培养基(g/L)为：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g，混匀，pH自然，121℃高压灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，发酵培养基为(g/L)为：蛋白胨20g、葡萄糖40g、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.5g、磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0g、甘氨酸4-8g、腺嘌呤1g，混匀。
5.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，蛹虫草发酵液离心速度为6000-8000r/min，离心20-30min。
6.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，获得的上清液浓缩至原体积的1/3-1/5。
7.根据权利要求1所述的一种从蛹虫草发酵液中提取虫草素的方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，采用H103大孔树脂为吸附树脂，1.5-2BV/h吸附流速，洗脱时先用水洗去杂，30-50％乙醇2-3BV/h洗脱1-3小时富集，经干燥即得虫草素产品。
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