CN113249290B - 一种提高金针菇赖氨酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高金针菇赖氨酸含量的方法，其特征在于：在金针菇液体发酵过程中，通过向发酵液中添加柠檬酸来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸含量；和/或者在子实体阶段，通过在子实体搔菌后喷洒柠檬酸溶液来诱导金针菇子实体提高赖氨酸含量。本发明所述的方法可显著提高金针菇菌丝体液体发酵及子实体赖氨酸含量，具有食品级安全，成本低，无污染，方法简单，易实现工厂化生产等优点，从而为工厂化生产高赖氨酸含量的金针菇奠定基础。

Description

一种提高金针菇赖氨酸含量的方法
技术领域
本发明公开了一种提高金针菇菌丝体及子实体赖氨酸含量的方法，金针菇生长过程分为两部分：(1)促进金针菇菌丝迅速生长；(2)在第一阶段后添加柠檬酸来诱导提高金针菇菌丝体赖氨酸含量或在搔菌后通过喷洒柠檬酸溶液来提高金针菇子实体中赖氨酸的含量。本发明方法可显著提高金针菇液体发酵菌丝体及子实体中赖氨酸含量，该方法简单、实用，成本低，安全无污染，对于金针菇品质有了进一步的提高。
背景技术
金针菇(Flammulina velutipes)学名毛柄金钱菌，又称冬菇、朴菇、构菌、青杠菌，是一种常见的食药用菌，隶属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口菇科、金钱菌属。金针菇营养价值极其丰富，富含多种氨基酸、蛋白质、维生素和矿质元素。其菌体含有18种氨基酸，且8种人体所需的必需氨基酸占总氨基酸含量的44.5％，远高于一般的食药用菌，其中赖氨酸的含量尤其丰富，并且能增强记忆，开发智力，特别对儿童智力开发有特殊功能，国外称之为“增智菇”。赖氨酸除了对促进幼儿智力发育有着不可替代的作用，此外还参与酶、激素、骨骼肌的形成，维持体内酸碱平衡，参与脂肪代谢，能够提高免疫力等等。因此，通过各种方法提高金针菇中赖氨酸的含量对于提高金针菇的品质来说具有深远的意义。
目前的研究表明，在水稻培养过程中添加脱落酸(ABA)，再培养过程中添加吲哚乙酸会增加水稻种子中赖氨酸的含量，在细菌发酵过程中利用基因工程的方法来提高菌体的发酵量等等，相较于前两种方法，本发明采用柠檬酸来提高金针菇菌丝体中赖氨酸的含量，既没有植物激素的价格昂贵，又没有基因工程的繁琐，并且在金针菇的工厂化栽培中操作简单，提高了金针菇的食用品质及安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高金针菇菌丝体及子实体中赖氨酸含量的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种提高金针菇赖氨酸含量的方法，在金针菇液体发酵过程中，通过向发酵液中添加柠檬酸来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸含量；和/或者在子实体阶段，通过在子实体搔菌后喷洒柠檬酸溶液来诱导金针菇子实体提高赖氨酸含量。
上述金针菇液体发酵的过程分为两个阶段发酵：第一阶段发酵，促进金针菇菌丝迅速生长；第二阶段发酵，通过向第一阶段发酵得到的发酵液中添加柠檬酸来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸含量。
上述金针菇液体发酵的过程具体包括以下步骤：
(1)向CYM培养基中接种金针菇液体菌种，进行第一阶段发酵，发酵时间为120～144小时；
(2)第一阶段发酵结束后，向发酵液中添加柠檬酸，继续进行第二阶段发酵，发酵时间为24～48小时。
优选的，所述第一阶段发酵的发酵条件为：在温度25℃，转速150r/min。
优选的：发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为50μM～200μM；进一步优选的，发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为50μM～150μM；进一步优选的，发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为100～150μM。
优选的：所述第二阶段发酵的发酵时间为36～48小时。
最优选的：发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为100μM，第二阶段发酵时间为48h。
优选的：在子实体搔菌后所喷洒1次柠檬酸溶液，柠檬酸溶液的浓度为1mM，每个栽培瓶中柠檬酸溶液的喷洒量为0.08～0.48L，处理时间为1～5天。
优选的：所述液体菌种的接种量为CYM培养基体积的3％～15％；进一步优选为3％～10％。
进一步优选的：1升所述CYM培养基的配方为：麦芽糖10克，葡萄糖20克，酵母提取物2克，蛋白胨2克，七水硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，用水定容至1升，115℃灭菌25～40分钟。
本发明提高金针菇液体发酵菌丝体及子实体赖氨酸含量的方法，在金针菇菌丝体液体发酵时添加柠檬酸和子实体阶段采用搔菌“喷水”阶段喷洒柠檬酸溶液来诱导金针菇产生更多的赖氨酸。所使用的诱导剂柠檬酸安全，且价格低廉，可显著提高赖氨酸的产量。
本发明的有益效果
通过本发明的方法，可显著提高金针菇菌丝体液体发酵及子实体赖氨酸含量，且安全可靠，方法简单，成本低廉，常规方法培养液体发酵的金针菇菌丝体中赖氨酸的含量达到26.54～28.5mg/g DW(取三次平均值为27.41mg/g DW)，相比采用本发明方法可使赖氨酸含量达到32.1～33.49mg/g DW(取三次平均值为32.84mg/g DW)，提高了19.8％。金针菇栽培子实体中在赖氨酸的含量可达到8.31～8.52mg/g DW(取三次平均值为8.43mg/g DW)，采用本方法后，金针菇的含量为9.23～9.41mg/g DW(取三次平均值为9.34mg/g DW)，提高了10.8％。
附图说明
图1为响应面3D结果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步详细说明：
实施例一
1.配置CYM培养基，配方为：麦芽糖10克，葡萄糖20克，酵母提取物2克，蛋白胨2克，七水硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，用水定容至1升，灭菌条件为115℃灭菌30分钟。
2.以5％(v/v)的接种量向配置好的CYM培养基中接入金针菇液体菌种，在温度25℃，转速150r/min条件下，进行第一阶段的发酵，发酵时间为120小时。
3.分别在第一阶段发酵结束后，在无菌条件下分别向发酵液中添加最终浓度为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM的柠檬酸，进行第二阶段发酵，发酵时间为48h。
4.第二阶段发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5～6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定赖氨酸含量。取烘干的菌丝粉0.50g左右，置于2mL离心管中加2mL去离子水，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液12000r/min离心10min，取上清液0.10mL于10mL具塞试管中，依次加入pH＝2.2的柠檬酸缓冲液0.1mL，50％(v/v)的乙二醇乙醚水溶液0.20mL，2％(m/v)CuCl2水溶液0.2mL，1％(m/v)茚三酮水溶液0.3mL，沸水浴水浴35min，取出立即冷却，于480nm处测定吸光度，根据赖氨酸标准品测得线性方程换算后得到相应的赖氨酸含量。设置三组平行重复试验，检测结果见表1。
表1不同浓度柠檬酸处理后赖氨酸含量(mg/g DW)
Figure GDA0003502373580000031
Figure GDA0003502373580000041
由表2看出，金针菇发酵过程中，第二阶段处理48h后，处理浓度为100μM后赖氨酸的含量相较于对照组(0μM)增加了19.8％。
实施例二
1.配置CYM培养基，配方为：麦芽糖10克，葡萄糖20克，酵母提取物2克，蛋白胨2克，七水硫酸镁0.5克，磷酸二氢钾1克，用水定容至1升，灭菌条件为115℃灭菌30分钟。
2.以5％(v/v)的接种量向配置好的CYM培养基中接入金针菇液体菌种，在温度25℃，转速150r/min条件下，进行第一阶段的发酵，发酵时间分别为96-168小时。
3.分别在第一阶段发酵结束后，在无菌条件下分别向发酵液中添加最终浓度为100μM的柠檬酸，进行第二阶段发酵，发酵时间分别为0，12，24，36，48，60，72小时。控制金针菇发酵处理的总时间是7天，共计168小时。根据(第二阶段)柠檬酸处理(第二阶段发酵)时间长短，相应的调整第一阶段发酵时间变化以确保金针菇总的发酵时间稳定在168小时。
4.第二阶段发酵结束后，用铜滤网收集菌丝球，并用蒸馏水冲洗5～6次，于60℃烘箱中烘干至恒重，分光光度法测定赖氨酸含量。取烘干的菌丝粉0.50g左右，置于2mL离心管中加2mL去离子水，在超声波破碎仪中超声破壁2小时后，取超声提取液12000r/min离心10min，取上清液0.10mL于10mL具塞试管中，依次加入pH＝2.2的柠檬酸缓冲液0.1mL，50％的乙二醇乙醚水溶液0.20mL，2％CuCl2水溶液0.2mL，1％茚三酮水溶液0.3mL，沸水浴水浴35min，取出立即冷却，于480nm处测定吸光度，根据赖氨酸标准品测得线性方程换算后得到相应的赖氨酸含量。设置三组平行重复试验，检测结果见表2。
表2不同柠檬酸处理时间后赖氨酸含量(mg/g DW)
Figure GDA0003502373580000042
由表1看出，金针菇发酵过程中，在100μM柠檬酸的处理下，处理时间为24h、36h、48h后，赖氨酸的含量相较于对照组(处理0h)分别增加2.5％、6.9％、16.1％。其中，处理时间为48h后赖氨酸的含量增加最高。
实施例三
在不同处理时间和浓度的基础上，我们应用响应面分析的方法，对于柠檬酸不同处理时间和浓度对金针菇菌丝体赖氨酸含量的影响，得出分析结果见表3和图1：
表3 CCD设计和响应
Figure GDA0003502373580000051
赖氨酸含量为因变量(Y)，而柠檬酸处理时间和处理浓度作为独立变量(X)，分析结果得出最佳的柠檬酸处理时间和浓度为33.18h和138.26μM，得到的理论赖氨酸的含量为33.93mg/g DW，对此结果进行了验证，得到的数据分别为32.44、33.46、33.79mg/g DW，与理论结果相差不大，理论结果较为准确。
实施例四
在工厂中进行金针菇子实体阶段的柠檬酸处理效果实验。当金针菇菌种培养22-30天，菌种刚长满为宜。挑选无杂菌、已经发满成熟的栽培种进行搔菌，搔平料面。搔菌后“喷水”促进原基生成，保持湿度达到90％左右。同时，将1mM(0.021％m/v)柠檬酸应用于各试验区。每组均给予自来水作为对照。当原基形成菇盖分化完全，降低生育室温度至4-8度。当小菇长出瓶口2cm左右，生育室控制在5度左右，套袋抑制，菇柄长到一定长度及时采收。采收后，对于收获的金针菇在105℃下进行杀青，然后在60℃下烘干，用小型粉碎机进行粉碎，最后用研钵研细，过60目筛，最后采用与实施例一相同的方法对于子实体中赖氨酸含量进行测定。
试验包括两个处理：处理a(未处理对照)和处理b(柠檬酸处理)。在一个完全随机的设计中，每个处理方案都有3组重复样品。在收获后，对金针菇子实体的赖氨酸的含量进行测定，并记录。
采用800mL的栽培瓶，需要在“喷水”阶段，分别添加0、0.08L、0.16L、0.24L、0.36L、0.48L的1mM的柠檬酸处理48小时促进金针菇原基的形成，每组重复样品包含12瓶，实验结果见表4；另外，选择0.36L的1mM的柠檬酸分别在搔菌后第1-5天处理时间，每组重复样品包含12瓶，实验结果见表5。
表4不同浓度柠檬酸处理后金针菇子实体中赖氨酸含量(mg/g DW)
Figure GDA0003502373580000061
表5 0.36L的1mM的柠檬酸处理不同时间后金针菇子实体中赖氨酸含量(mg/g DW)
Figure GDA0003502373580000062

Claims (10)

1.柠檬酸在提高金针菇赖氨酸含量中 的应用，其特征在于：在金针菇液体发酵过程中，通过向发酵液中添加柠檬酸来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸含量；和/或者在子实体阶段，通过在子实体搔菌后喷洒柠檬酸溶液来诱导金针菇子实体提高赖氨酸含量。
2.根据权利要求1 所述的应用，其特征在于：所述金针菇液体发酵的过程分为两个阶段发酵：第一阶段发酵，促进金针菇菌丝迅速生长；第二阶段发酵，通过向第一阶段发酵得到的发酵液中添加柠檬酸来诱导金针菇菌丝体提高赖氨酸含量。
3.根据权利要求2 所述的应用，其特征在于：所述金针菇液体发酵的过程具体包括以下步骤：
（1）向CYM 培养基中接种金针菇液体菌种，进行第一阶段发酵，发酵时间为120~144小时；
（2）第一阶段发酵结束后，向发酵液中添加柠檬酸，继续进行第二阶段发酵，发酵时间为24~48 小时。
4.根据权利要求1、2 或3 所述的应用，其特征在于：发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为50 μM~200 μM。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为50 μM~150 μM。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：发酵液中所述柠檬酸的添加浓度为100 ~150μM。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述第二阶段发酵的发酵时间为36~48 小时。
8.根据权利要求1 所述的应用，其特征在于：在子实体搔菌后所喷洒1 次柠檬酸溶液，柠檬酸溶液的浓度为1 mM，每个栽培瓶中柠檬酸溶液的喷洒量为0.08~0.48 L。
9.根据权利要求3 所述的应用，其特征在于：所述液体菌种的接种量为CYM 培养基体积的3%~15%。
10.根据权利要求3 所述的应用，其特征在于：1 升所述CYM 培养基的配方为：麦芽糖10克，葡萄糖20 克，酵母提取物2 克，蛋白胨2 克，七水硫酸镁0.5 克，磷酸二氢钾1 克，用水定容至1 升，115℃灭菌25~40 分钟。
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