CN103290065A

CN103290065A - 一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法

Info

Publication number: CN103290065A
Application number: CN 201310249414
Authority: CN
Inventors: 卢文清
Original assignee: ANHUI JIMIN MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI JIMIN MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-06-22
Filing date: 2013-06-22
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明涉及一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，所述方法依次包括：菌种的筛选与鉴定、菌种的诱导变异、龙脑的制备。本发明在成功分离了作用蒎烯的微生物-植生克雷伯氏菌，通过等离子和化学诱导；固态培养得到5×10⁸cfu/g的曲料，使之耐受底物及耐候和立体选择性提高，达到耐受底物浓度为10%，生成的乙酸龙脑酯，其中正龙脑酯含量为66%~75%。本发明所述的方法在国内首次利用蒎烯微生物法生成乙酸龙脑酯，然后水汽蒸馏去除未作用的蒎烯，皂化水解制龙脑的新工艺。该方法生产的龙脑接近天然龙脑，其正龙脑含量为66%-75%，高于现有化学法工艺产品品质，其综合成本优于现行工艺。

Description

一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法

技术领域

本发明涉及一种龙脑的制备方法，尤其是一种从自然界中分离出的能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物，并利用其制备龙脑的方法。

背景技术

我国是松节油和桉叶油等萜烯精油资源大国。近年，我国取消了松节油等天然精油原油的出口退税。这一政策的实施，有力地推进了天然精油手性化合物等高附加值产品的产业化进程。但是生产常采用硫酸、硼酐等作为催化剂，易燃易爆；草酸、醋酐为酯化剂，生产过程污染状况严重。因此，国内外很多研究人员，寄希望能从自然界微生物中分离出的能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物，用于工业生产。

1994年，南京林业大学采用一株自行分离筛选得到的桔青霉NFU-901及其诱变株UV(O1)对a-蒎烯进行生物转化，发现a-蒎烯的转化产物主要是马鞭草烯醇（75%），而龙脑的含量只有2.4%和4%；2008年，广西大学刘幽燕等用特氏克雷伯氏菌(klebsiella planticola)菌株SM08411. ZJ0802A 1和E0802a和2%蒎烯作用生成乙酸龙脑酯，乙酸龙脑酯在微生物作用下，进行水解反应可获龙脑，但是该工艺耐受底物浓度低，主要用于乙酸龙脑酯微生物转化制龙脑，工业利用价值低。

蒎烯是化学法合成龙脑时应用最广泛的原料。而以蒎烯为原料进行生物转化可以制备龙脑，说明自然界的微生物中存在能催化蒎烯转化生成龙脑的微生物。但是从现有文献报道中可以发现，龙脑往往只是作为转化产物中的一个副产物，因此产量都较低。若能寻找到能够专一性或选择性转化蒎烯生成龙脑的微生物，则以丰富的蒎烯为原料，通过生物转化的方法制备龙脑的产率将会大大地提高。

发明内容

本发明正是针对现有技术存在的不足，提供一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法。

为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：

一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，所述方法依次包括以下步骤：

步骤一：菌种的筛选与鉴定

原始菌株筛选：从自然界中取富含松节油的土壤和松树皮、叶样品，将分离得到的各纯菌株分别接种到经灭菌处理，盛有100份查氏培养基液的容器中，于30℃，150r/min条件下摇瓶培养48h，然后各加入2%蒎烯，在相同条件下发酵培养30h后，用气相色谱仪分析发酵产物情况，以乙酸龙脑酯为目标物对比选出最为理想的菌株作为试验菌株；富集培养结束后，取培养液1mL用无菌水依次稀释至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生长后，挑取不同的菌落进行平板划线分离纯化，并保藏纯化的单菌落菌株；

②菌株鉴定：根据菌株形态观察及生理生化试验结果以及16S rDNA序列同源性分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，确定菌株为革兰氏阴性菌，且与植生克雷伯氏菌最相似，结合分子生物学结果，确认菌株为植生克雷伯氏菌；

步骤二：菌种的诱导变异

步骤一所得的菌种依次采用下列等离子诱导和化学亚硝基胍诱变：

等离子诱导：取10mL菌液8000rpm/min离心10min，弃去上清液，用10mL生理盐水悬浮得菌悬液；取2ml菌悬液均匀涂布于等离子体装置的下电极介质上，电压24kV，电流1.7mA、间隙3mm的操作条件下照射0，10，15，20，30，50和70s，将处理过的菌液梯度稀释后，取1ml涂布于固体培养基平板上，37℃下蔽光培养2天，用平板菌落计数法进行活菌计数，绘制致死曲线，选取致死率70%~80%对应的时间为等离子体处理时间，进行一次冷等离子诱变，照射后立即稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，进行后续化学诱变；

②化学亚硝基胍诱变：作用剂量为300~500ppm，诱变在pH5.0，0.1M的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中静息培养3h，然后稀释涂布在固体琼脂培养基上，30℃恒温下培养2天，挑选30个单菌落，从挑选的30个单菌落中，选择3株产率最高的菌株，进行蒎烯发酵试验，进而再从其中选择1株产率最高的菌株；固态托盘培养制成原曲；

步骤三：龙脑的制备

原曲用0.02mo1/L的Na₂HP0₄-KH₂P0₄缓冲液洗涤2次，再用同一缓冲液制成浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，5%定量接种于含有3%蒎烯的无机盐培养基中，在150r/min，30℃进行转化；底物采用多次加入的方式，反应在一个相对密闭的摇床中进行，在反应刚开始时，于培养液中加入3%的底物，转化24h后再加入2%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液，再连续加入两次，最后一次加入1%底物和5%浓度2×10⁷cfu/ml菌悬液后继续反应需多于2d，生物转化反应共进行6d，发酵完成后，加入洗涤分离釜，上层蒸轻油，皂化蒸片，粗片重结晶即得龙脑。

作为上述技术方案的改进，所述步骤一原始菌株筛选中，查氏培养基液其成分按重量份为：

NaNO₃： 2g

K₂HPO₄： 1g

KCl： 0.5g

MgSO₄： 0.5g

FeSO₄ 0.01g

蔗糖 30g

琼脂 15~20g

水 1000g。

作为上述技术方案的改进，所述查氏培养基液，在自然pH值、气压1.05kg/cm²、121.3℃环境下灭菌20分钟。

作为上述技术方案的改进，所述步骤二等离子诱导中，将得到的植生克雷伯氏菌用无菌生理盐水制备成孢子菌悬液，其孢子数控制在1×10⁶~2×10⁶个/ml之间。

作为上述技术方案的改进，所述步骤二化学亚硝基胍诱变中，原曲植生克雷伯氏菌菌含量≥5×10⁸cfu/g。

本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：

本发明提供了一种利用自然界中分离出的酶制备龙脑的方法，在国内首次成功培养分离了作用蒎烯的微生物-植生克雷伯氏菌，通过等离子和化学诱导；固态培养得到5×10⁸cfu/克的曲料，使之耐受底物及耐候和立体选择性提高，达到耐受底物浓度为10%，生成的乙酸龙脑酯，其中正龙脑酯含量为66%~75%。本发明所述的方法首次利用微生物法生成乙酸龙脑酯，然后水汽蒸馏去除未作用的蒎烯，皂化水解制龙脑的新工艺，该方法生产的龙脑接近天然龙脑，其正龙脑含量为66%~75%，高于现有化学法工艺产品品质，其综合成本优于现行工艺。

附图说明

图1为本发明所述龙脑制备方法流程图。

具体实施方式

本发明所述的利用自然界中分离出的酶制备龙脑的方法，依次包括：菌种的筛选与鉴定、菌种的诱导变异、龙脑的制备等过程。本发明从富含松节油的环境中采集土壤、松树皮、松树叶等，通过建立适当的筛选模型进行微生物菌株的筛选，从自然界中筛选到一些能够利用蒎烯为底物生长并能转化蒎烯生成龙脑的微生物菌株，探索制备龙脑的新方法。生物转化包括酶法转化和微生物转化，微生物转化的本质实际上也是通过微生物体内的酶系进行的酶催化转化。下面将结合具体的实施例来说明本发明的内容。

步骤一：菌种的筛选与鉴定

（1）原始菌株筛选：分别从云南普洱三尖山松树林和安徽祁门县茶山公园取富含松节油的土壤和松树皮叶样品5份。加2%蒎烯进行富集培养，发现仅有5种菌株存活。将分离得到的各纯菌株分别接种到经灭菌处理，盛有100份查氏培养基液的容器中，于30℃，150r/min（转/分，下同）条件下摇瓶培养48h（小时，下同），然后各加入2%蒎烯，在相同条件下发酵培养30h后，用气相色谱仪分析发酵产物情况，以乙酸龙脑酯为目标物对比选出最为理想的菌株作为试验菌株。

查氏培养基液用来培养霉菌用，其成分按重量份为：

NaNO₃： 2g

K₂HPO₄： 1g

KCl： 0.5g

MgSO₄： 0.5g

FeSO₄ 0.01g

蔗糖 30g

琼脂 15~20g

水 1000g

在自然pH、气压1.05kg/cm²、121.3℃环境下灭菌20分钟，即可得查氏培养基液。

富集培养结束后，取培养液1mL用无菌水依次稀释至10倍、5倍、10倍、6倍后涂布平板，待菌落生长后，挑取不同的菌落进行平板划线分离纯化，并保藏纯化的单菌落菌株。

筛选结果：经过多次的富集驯化，一些微生物菌株对底物有了较强的耐受能力而避免了由于对底物“中毒”而无法生长；而通过直接涂布分离的筛选方法，一部分菌株对底物的适应性差，被“中毒”淘汰。

筛选所得菌株的结果：从（菌株编号为HSQ-3系列、YNP-6系列）采集的土样筛选得到的菌株数量较多，生长及活性也较好。

（2）菌株鉴定：

菌株HSQ-3、YNP-6在营养琼脂平板上的菌落呈奶酪色，表面光滑，不透明，边缘整齐，中间微突起。菌落呈乳黄色，表面光滑，边缘整齐，菌落紧贴培养基。根据菌株形态观察及生理生化试验结果以及16S rDNA序列同源性分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，确定菌株HSQ-3、YNP-6均为革兰氏阴性菌，且与植生克雷伯氏菌最相似。结合分子生物学结果，确认菌株HSQ-3、YNP-6为植生克雷伯氏菌（klebsiella planticola）。

下表为菌株HSQ-3、YNP-6的生理生化特征结果。

步骤二：菌种的诱导变异

上述两种植生克雷伯氏菌菌株，由于耐受底物（蒎烯）浓度低（≤2%），难以进行工业化应用，因此，本发明依次采用了等离子诱导和化学亚硝基胍诱变。

（1）等离子诱导

将得到的植生克雷伯氏菌用无菌生理盐水制备成孢子菌悬液，其孢子数控制在1×10⁶~2×10⁶个/ml之间。

取10mL菌液8000rpm离心10min，弃去上清液，用10mL生理盐水悬浮得菌悬液；取2ml以菌悬液均匀涂布于等离子体装置的下电极介质上，电压24kV，电流1.7mA、间隙3mm的操作条件下照射0，10，15，20，30，50和70s。将处理过的菌液梯度稀释后，取1ml涂布于固体培养基平板上，37℃蔽光培养2d，用平板菌落计数法进行活菌计数，绘制致死曲线，选取致死率70%~80%对应的时间为等离子体处理时间。进行一次冷等离子诱变，照射后立即稀释涂布在固体琼脂培养基上，恒温培养2天，挑选30个单菌落，进行后续化学诱变。

（2）化学亚硝基胍诱变

NTG（亚硝基胍）是一种强有力的致变剂，能直接作用于植生克雷伯氏菌孢子内的DNA，诱变作用承受PH的升高而增强。

作用剂量为300~500ppm（即300~500μg/ml）。诱变后在醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH5.0，0.1M）中静息培养3小时，然后稀释涂布在固体琼脂培养基上，恒温培养2天，挑选30个单菌落。从挑选的30个单菌落中，选择3株产率最高的菌株，进行蒎烯发酵试验，进而再从其中选择1株产率最高的菌株。固态托盘培养制成原曲，原曲植生克雷伯氏菌菌含量≥5×10⁸cfu/g。

步骤三：龙脑的制备

如图1所示，为发明所述龙脑制备方法流程图。本发明采用微生物法制备乙酸龙脑酯，然后用化学法回收未作用萜烯，加碱皂化，水汽蒸龙脑。

原曲用0.02mo1/L的Na₂HP0₄-KH₂P0₄缓冲液洗涤2次，再用同一缓冲液制成浓度（2×10⁷cfu/ml）菌悬液，定量（5%）接种于含有3%蒎烯的无机盐培养基中（装液量300L/2500L），在150r/min，30℃进行转化。

由于蒎烯具有难溶于水，极易挥发，饱和蒸气压的特点，为了解决底物（蒎烯，下同）挥发快导致损失过大的问题，底物采用多次加入的方式。反应在一个相对密闭的摇床中进行，在反应刚开始时，于培养液中加入3%（重量百分比，下同）的底物，转化24h后再加入2%底物和5%浓度（2×10⁷cfu/ml）菌悬液，再连续加入两次，最后一次加入1%底物和5%浓度（2×10⁷cfu/ml）菌悬液后继续反应需多于2d，生物转化反应共进行6d，发酵完成后，加入洗涤分离釜，上层按现有龙脑生产工艺蒸轻油，皂化蒸片，粗片重结晶即得龙脑。

Claims

1.一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤：

步骤一：菌种的筛选与鉴定

步骤二：菌种的诱导变异

步骤三：龙脑的制备

2.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤一原始菌株筛选中，查氏培养基液其成分按重量份为：

NaNO₃： 2g

K₂HPO₄： 1g

KCl： 0.5g

MgSO₄： 0.5g

FeSO₄ 0.01g

蔗糖 30g

琼脂 15~20g

水 1000g。

3.如权利要求2所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述查氏培养基液，在自然pH值、气压1.05kg/cm²、121.3℃环境下灭菌20分钟。

4.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的酶制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤二等离子诱导中，将得到的植生克雷伯氏菌用无菌生理盐水制备成孢子菌悬液，其孢子数控制在1×10⁶~2×10⁶个/ml之间。

5.如权利要求1所述的一种利用自然界中分离出的微生物制备龙脑的方法，其特征是，所述步骤二化学亚硝基胍诱变中，原曲植生克雷伯氏菌菌含量≥5×10⁸cfu/g。