CN101735957A

CN101735957A - 山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用

Info

Publication number: CN101735957A
Application number: CN201010030818A
Authority: CN
Inventors: 文连奎; 边忠博; 赵薇; 王治同
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2010-01-08
Filing date: 2010-01-08
Publication date: 2010-06-16

Abstract

本发明涉及一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，其特征在于：采集葡萄园土壤和生产酒石酸工厂附近的土壤的土样加到无菌生理盐水中，加入玻璃珠，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的酒石酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，160r/min，摇床振荡培养，以72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对酒石酸具有较好降酸效果的菌种黑曲霉；其不需要特殊设备及原料，成本低，降酸操作过程容易控制，且降酸率能达到89％。

Description

山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用

技术领域：

本发明涉及一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，是一种利用微生物黑曲霉降低山葡萄酒中酒石酸含量的方法，属于食品加工领域。

背景技术：

山葡萄产于我国东北地区，与欧亚种酿酒葡萄相比存在较大差异，其含糖量很低，一般为130～150g/L，而含酸量却很高，其成熟果实的可滴定酸含量就在15～25g/L(以酒石酸计)之间。但是正常干型葡萄酒要求酸度在8g/L左右。而目前针对山葡萄酒的降酸问题还未提出有效的解决方法，因此，山葡萄酒的降酸方法有待进一步提高。

传统的降酒石酸方法是通过物理方法和化学方法处理达到降酸目的，但传统的方法需要借助冷冻设备及需要消耗大量的酒石酸钾，能源消耗和生产成本较大，并且口感不协调，降酸幅度达不到理想标准。虽然随着现代发酵工程技术和基因工程技术的发展，目前研究出了针对苹果酸的微生物降酸方法，而利用生物技术降低酒石酸在目前却没有报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，其采用生物技术筛选能降解酒石酸的微生物——黑曲霉菌，并利用该微生物降低山葡萄酒中的酒石酸含量，确定最佳的降酸参数，以解决葡萄酒中酒石酸的生物降解问题，从而达到降酸的目的，更好地控制并且容易操作，能更好地改善山葡萄酒的品质。

本发明的技术方案是这样实现的：一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法及应用，其特征在于：降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌为黑曲霉，具体的筛选方法如下：采集葡萄园土壤和生产酒石酸工厂附近的土壤的土样2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠(直径为3～5mm)，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的酒石酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，160r/min，摇床振荡培养，以72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对酒石酸具有较好降酸效果的菌种黑曲霉；

将筛选得到的降酸菌——黑曲霉用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YEPD斜面培养基上于28℃培养72h后4℃保存。

降酸应用过程如下：

将山葡萄原料进行破碎后加入0.05％的果胶酶和100mg/L的SO₂，浸汁12小时后用汁渣分离机进行分离压榨出汁，澄清后进行降酸发酵，在30～35℃条件下接入降酒石酸有效菌——黑曲霉后再对葡萄汁进行澄清处理，酒精发酵是在20～25℃条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行澄清、分离，最后进入陈酿工序。

菌种鉴定：通过对筛选后的菌落形态、个体显微形态和分子生物进行鉴定，如图1所示，对所筛选出的具有较高降酸效果的菌株F1进行菌落形态观察、显微形态观察、生理生化试验鉴定以及分子生物学鉴定试验。最终通过鉴定试验确定筛选所得到的具有降酒石酸能力的菌株(命名为F1)属于曲霉属[Aspergillus Micheli ex Fr.]中的黑曲霉组[A.niger]。

不同因素对菌株F1降解酒石酸情况的影响：考虑的因素主要有接种量、温度、酒石酸浓度、通气量和菌龄；其中温度和接种量对降酸率的影响较为明显。

产品标准：菌株耐酒精度4％以上；菌株耐SO2浓度为400mg/L；酒石酸降解率50％以上，可适应山葡萄酒的降酸要求。

检测方法：酸度检测采用氢氧化钠滴定法(以酒石酸计)。

本发明的积极效果是采用微生物——黑曲霉降解葡萄酒中的酒石酸，是在35℃温度下静止培养3d后，降酸率能达到70％以上，该菌株具有较高的耐SO₂能力，对酒精的耐受性能达到4％以上，该黑曲霉采用巴氏杀菌的方式在65℃、30min或85℃、5min即可达到杀菌的目的，并且通过毒性鉴定试验确定该黑曲霉菌株无任何毒副作用，可以运用到葡萄酒的生产工艺中；与以往的物理降酸方法和化学降酸方法相比，它不需要采用任何特殊设备及原料，成本低，降酸操作过程容易控制，也不会向葡萄酒中引入其他金属离子，且降酸率较高。试验得出将菌龄为4d的菌种以4％的接种量(孢子液浓度为8×10⁶个/ml)接入到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，在35℃、160r/min的条件下恒温振荡培养4d后，其降酸率能达到89％。

附图说明：

图1为本发明筛选得到的10株菌株对酒石酸的降解率的比较图表；

图2为本发明的温度对降解率的影响图；

图3为本发明的接种量对降解率的影响；

图4为本发明的通气量对降解率的影响；

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：

实施例1：

1、菌种筛选；

(1)富集培养：将采集的样品定量加到无菌生理盐水中，加数粒玻璃珠，充分振荡后静置取上清液分别加入到以酒石酸(酒石酸浓度为2g/L)为唯一碳源的液体富集培养基中，28℃，160r/min，摇床振荡培养72h。72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，连续转接培养多次。同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L。

(2)初筛：在富集培养后取一定量的富集菌液，用生理盐水稀释到10^-5，选择10^-3、10^-4、10^-5稀释度，分别吸取0.5mL稀释液涂布于含酒石酸浓度为10g/L的琼脂平板培养基上，28℃恒温培养72h。将所得的典型单菌落点植于分离培养基上，相同条件下培养。

(3)复筛：将初筛所得到的单菌落用平板划线法进行多次分离纯化，挑取单菌落接入YEPD斜面培养基于28℃培养72h后4℃保存。

2、菌种鉴定：

(1)菌落形态观察；将分离出的菌株分别接种于各种类型的培养基上，在30℃下培养3-4d，对形成的菌落进行特征观察并记录。

(2)显微形态观察；采用光学显微镜观察菌株的细胞形态。

(3)生化试验鉴定；对筛选出的菌株做淀粉水解试验、明胶液化试验、M R试验、硝酸盐还原试验等各种生化鉴定试验，观察菌株对各种碳源和氮源的利用情况。

(4)分子生物学鉴定；测定该菌株的ITS保守序列组成，并与Genbank中的相关序列进行比对，以确定该菌的具体种类。结果得出该菌株的ITS基因序列与黑曲霉的同源性和相似性分别为98％、99％，可鉴定该菌株为半知菌类[Fungi Imperfecti]、曲霉属[AspergillusMicheli ex Fr.]中的黑曲霉组[A.niger]。

3、菌种特性：

(1)菌种生长曲线的测定；将菌株以相同的接种量接入多瓶相同体积的培养液中，在30℃，160r/min条件下摇床培养，每隔24h取出三瓶培养液过滤菌丝体并称量菌丝体干重，取其平均值以确定菌株的生长曲线，结果得到该菌株的对数生长期为4～6d。

(2)最适生长温度；将菌株以相同的接种量接入多瓶相同体积的培养液中，分别在18℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃的条件下160r/min恒温摇床培养，每个温度做三个处理，培养3d后过滤称量菌丝体干重，结果得出该菌株的最适生长温度为30℃。

(3)最适生长pH值；将菌株以相同的接种量分别接入pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0的相同体积培养液中，在30℃，160r/min条件下恒温摇床培养，每个酸度做三个处理，培养3d后过滤称量菌丝体干重，结果得到该菌株的最适宜生长pH为3.0。

(4)最适生长通气量；将菌株以相同的接种量分别接入到50、100、150、200、250、300、350mL的液体培养基中，在30℃，160r/min条件下恒温摇床培养，每个通气量做三个处理，培养3d后过滤称量菌丝体干重，结果得出该菌株的最适生长通气量为300ml。。

4、菌种耐受性试验：

(1)耐SO₂试验；SO₂添加剂为固体偏重亚硫酸钾，其理论SO₂含量为57％。将纯化的菌种培养至对数期后分别接种到SO₂浓度为50～500mg/L不等的固体培养基上，30℃恒温培养，得出该菌株能耐受的SO₂浓度为400mg/L。

(2)菌种耐酒精试验；将纯化的菌种培养至对数期后接种到含1％无水乙醇的100mL液体培养基中，于30℃、160r/min恒温振荡培养72h后，在依次转入无水乙醇含量分别为2％、3％、4％、5％(体积比)的装有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，在相同条件下培养，得出该菌株对酒精的耐受情况能达到4％以上。

5、降解参数测定：

(1)不同接种量对降酸效果的影响；将培养生长至对数期的F1孢子用无菌水洗下制成孢子液后，分别以1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量接种到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，于30℃、160r/min恒温振荡培养4d后，采用氢氧化钠滴定法测降酸量，结果得到当接种量为4％(孢子液浓度为8×10⁶个/ml)时，降酸效果明显。

(2)不同菌龄对降酸效果的影响；将培养3d、4d、5d、和6d的菌种F1以相同的接种量接入到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，于30℃、160r/min恒温振荡培养4d后，采用氢氧化钠滴定法测降酸量，结果得到菌龄为4d的菌株降酸效果好。

(3)不同温度对降酸效果的影响；如图2所示，将菌种F1以相同的接种量接种到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，分别在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和37℃的温度下培养4d后，采用氢氧化钠滴定法测降酸量，结果得到在35℃条件下降酸幅度大。

(4)不同酒石酸浓度对降酸效果的影响；如图3所示，将菌种F1以相同的接种量接种到以酒石酸为唯一碳源的培养液中，酒石酸浓度分别为1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L和13g/L，于30℃、160r/min恒温振荡培养4d后，采用氢氧化钠滴定法测降酸量，结果得到酒石酸浓度的大小对该菌株的降酸效果无明显影响。

(5)不同通气量对降酸效果的影响；如图4所示，将菌种F1以1ml的接种量分别接种到以酒石酸为唯一碳源装液量分别为50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml和350ml的液体培养基中，于30℃、160r/min恒温振荡培养4d后，采用氢氧化钠滴定法测降酸量，结果得出菌株在通气量为100ml的条件下降酸效果好。

Claims

1.一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于：降解山葡萄酒中酒石酸的有效菌为黑曲霉，具体的筛选方法如下：采集葡萄园土壤和生产酒石酸工厂附近的土壤的土样2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠(直径为3～5mm)，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的酒石酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，160r/min，摇床振荡培养，以72h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时酒石酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对酒石酸具有较好降酸效果的菌种黑曲霉；将筛选得到的降酸菌——黑曲霉用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YEPD斜面培养基上于28℃培养72h后4℃保存。

2.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的降酸应用过程如下：

将山葡萄原料进行破碎后加入0.05％的果胶酶和100mg/L的SO₂，浸汁12小时后用汁渣分离机进行分离压榨出汁，澄清后进行降酸发酵，在30～35℃条件下接入酒石酸降解菌——黑曲霉后再对葡萄汁进行澄清处理，酒精发酵是在20～25℃条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行澄清、分离，最后进入陈酿工序。

3.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的初筛过程如下：在富集培养后取一定量的富集菌液，用生理盐水稀释到10^-5，选择10^-3、10^-4、10^-5稀释度，分别吸取0.5mL稀释液涂布于含酒石酸浓度为10g/L的琼脂平板培养基上，28℃恒温培养72h。将所得的典型单菌落点植于分离培养基上，相同条件下培养。

4.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的复筛过程如下：将初筛所得到的单菌落用平板划线法进行多次分离纯化，挑取单菌落接入YEPD斜面培养基于28℃培养72h后4℃保存。

5.根据权利要求1所示的一种山葡萄酒中酒石酸降解菌的筛选方法，其特征在于所述的菌种鉴定方法如下：

(2)显微形态观察；采用光学显微镜观察菌株的细胞形态。

(3)生化试验鉴定；对筛选出的菌株做淀粉水解试验、明胶液化试验、MR试验、硝酸盐还原试验等各种生化鉴定试验，观察菌株对各种碳源和氮源的利用情况。