CN101892184B - 一种胡椒果皮脱胶菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种胡椒果皮脱胶菌，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010184，分类命名为芽孢杆菌。本发明还提供所述胡椒果皮脱胶菌在胡椒果实脱皮中的应用。将所述胡椒果皮脱胶菌培养4-52h后，将其培养液离心后，取上清液浸泡胡椒果实，2天内可将胡椒果皮脱除干净。利用本发明所述胡椒果皮脱胶菌进行胡椒果实脱皮高效、节能、低污染，具有广泛的推广价值。

Description

一种胡椒果皮脱胶菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种胡椒果皮脱胶菌及其在胡椒果实脱皮中的应用。

背景技术

胡椒(Piper nigrum L.)属胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)多年生常绿藤本植物，原产于印度，是世界重要的热带香辛料作物，是人们喜爱的调味品，在镇痛、镇静、抗炎、抗惊厥、保肝、杀虫、抗癌等多方面存在活性，广泛用于医学工业和食品工业。

胡椒的初产品主要为黑胡椒和白胡椒，黑胡椒是由胡椒鲜果直接晒干而成，而传统的白胡椒生产方法是由胡椒鲜果经浸泡脱皮后晒干而成，白胡椒较之黑胡椒具有香辣味柔和，色泽淡雅等优势，目前世界市场对于白胡椒的需求正日益增长。目前白胡椒的加工技术仍以传统的水沤脱皮法为主，造成产品大小不均匀，外观差，不能满足胡椒加工产业化的发展要求，阻碍了我国胡椒的大规模出口，严重制约了国内胡椒种植业和加工业的可持续发展。

脱皮是胡椒初加工中的关键工序，通常采用水沤脱皮、机械脱皮，酶法脱皮和微生物法脱皮4种。传统的水沤法脱皮存在着加工周期长、占地面积大、耗水量大、劳动强度大等缺陷，易造成黑白胡椒粒的混杂和微生物的污染；机械脱皮法存在大量消耗化工原料和热量、成本高、胡椒受损和脱胶废液难以完全符合国家废水排放标准等问题；酶法脱皮总成本高，而微生物脱皮法具有“高产、优质、高效、节能、低污染”等特点是胡椒脱皮工艺的发展方向。

目前，专门针对胡椒脱皮进行的微生物筛选报道较少，参见Vaidyanatha LyerThankaman，Raghavan Nair Giridhar.Fermentativeproduction of white pepper using indigenous bacterial isolates.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2004，9：435-439；以及唐坚，刘四新，谭勇，等.胡椒果皮脱胶菌株的筛选.广东农业科学，2009，7：194-195.，但其筛选的菌株用于胡椒脱皮需4-5d才能将胡椒果皮脱除干净，还没有真正实现高效快捷。

发明内容

本发明目的在于针对目前胡椒脱皮周期长的缺陷，提供一种胡椒果皮脱胶菌，利用本发明所述胡椒果皮脱胶菌培养液的上清浸泡胡椒果实，2天内可将胡椒果皮脱除干净，方便快捷。

本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110是经分离培养基初筛、发酵培养基复筛和胡椒鲜果脱皮效果实验筛选出的菌株，已于2010年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2010184，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

对菌株WCZC0110进行16SrRNA基因序列分析，结果表明，菌株WCZC0110的16SrRNA基因序列与芽孢杆菌属(Bacillus)同源，其生物学特征为：菌体直杆状；大小约为0.6×3.6μm；菌株为革兰氏染色反应阳性菌，G⁺；好氧；V-P试验阳性；接触酶阳性；能分解果胶。

本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110在4h后进入对数生长期，12h后进入生长的稳定期；培养4-52h内产果胶酶量较高，在24h有一个产酶高峰值；在25-40℃下培养均能产较高活性的果胶酶，最适温度为30℃；培养液初始pH为6.0-9.0时所产果胶酶活性较高，其最适pH为7.5。

本发明所述胡椒果皮高效脱胶菌WCZC0110，其培养液可用于提高植物果实的脱皮效率，特别适用于胡椒鲜果的脱皮。其优选的脱皮方法是：将胡椒果皮高效脱胶菌WCZC0110进行培养，其培养条件为温度25-40℃，种龄6-12h，培养液初始pH6.0-9.0，发酵4-52h，培养液离心取上清用于胡椒脱皮，2d内可将胡椒果皮脱除干净，作为优选，所述离心为15000r/min离心5min。

与现有技术相比，本发明所述胡椒果皮脱胶菌的培养液离心后的上清在25-40℃下，浸泡胡椒鲜果，脱皮30-48h，可使胡椒鲜果的果皮腐化；脱皮后的胡椒经漂白、干燥处理后，即得白胡椒粒。整个过程周期短，操作简单，可在2天以内加工出品质高的白胡椒，解决了我国在白胡椒加工中存在的周期长、劳动强度大，品质低等难题，为胡椒优质、高效、节能、低污染型加工技术体系提供技术支撑。

生物材料保藏信息：

保藏日期：2010年7月20日；

保藏机构：保藏于中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：武汉大学；

菌种保藏号：CCTCC NO：M 2010184；

分类命名：芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

附图说明：

图1示本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110生长曲线；

图2示本发明所述胡椒果皮脱胶菌WCZC0110产酶曲线。

具体实施方式：

本发明公开了保藏编号为CCTCC NO：M 2010184的胡椒果皮脱胶菌WCZC0110及其在胡椒果实脱皮中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下结合阐述实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：菌株的分离纯化

从海南文昌、琼海、海口、万宁等地的胡椒种植区采集土样及胡椒沤液样品，各称取20g或吸取20mL样品，置于含100mL无菌水的500mL三角瓶中，于30℃摇床中100r/min振荡培养1d；取上清或混合液1mL移入50mL富集培养基中富集培养1d，取1mL混合液加入盛有9ml无菌水的25mL试管中充分混匀，制成稀释度10^-1，10^-2，10^-3，10^-4、10^-5、10^-6的悬液；然后对10^-4、10^-5、10^-6三个梯度各取0.1mL涂牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度各做3块平板，30℃下培养3d。挑取平板上形态不同的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；将纯化后的菌转接至牛肉膏蛋白胨斜面上，30℃下培养3d，4℃下保存备用。

所述富集培养基配制方法：各组分含量(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6.0，KH₂PO₄ 4.5，K₂HPO₄ 10.5，酵母粉3.0，果胶2.0，用蒸馏水定容，调节pH值为7.5，121℃灭菌20min。

实施例2：菌株初筛

将实施例1中分离的菌落，点种于分离培养基上，选择在分离培养基上产生较大黄色变色圈的菌株。由于分离培养基中加入了1.6％溴甲酚紫乙醇溶液作为pH指示剂，果胶酶产生菌降解培养基中的果胶产生D-半乳糖醛酸，培养基即由原来的紫色变为黄色，产生变色圈。经过初筛，共筛选出菌株20株。

所述分离培养基配制方法：各组分含量(g/L)：(NH₄)₂SO₄ 6.0，KH₂PO₄ 4.5，K₂HPO₄ 10.5，酵母粉1.5，果胶2.0，琼脂20.0，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.0，加1.6％溴甲酚紫乙醇溶液3mL，121℃灭菌20min。

实施例3：菌株复筛

将实施例2中筛选的菌株20株，接种于种子培养基中，30℃培养18h，然后以3％的量接种于发酵培养基中，30℃、200r/min培养2-3d后，15000r/min离心5min，取上清，测定果胶酶活力，结果见表1。

表1菌株复筛酶活力测定结果

由表1可知，果胶酶活力较强的5株菌株分别是QH0017，WCZC0110，HK0041，QH0002和HK0036，其中菌株WCZC0110所产果胶酶活力最强，达466.3U/mL。

种子培养基为本领域中众所周知的牛肉膏蛋白胨培养基；果胶酶活力的测定方法是利用本领域的已知方法(参见王小敏，吴文龙，闾连飞，等.分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究[J].食品工业科技，2007，28(5)：227-229.)。所述发酵培养基配制方法：各组分含量(g/L)：硫酸铵10.0、酵母粉5.0、果胶2.0、NaCl 2.0、MgSO₄·7H₂O 1.0，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH值至7.0，121℃灭菌20min。

实施例4：胡椒鲜果脱皮效果实验

将实施例3中筛选出的5株菌QH0017，WCZC0110，HK0041，QH0002和HK0036，接入种子培养基，30℃、200r/min培养1d，按3％的接种量接种于含100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、200r/min好氧培养24h；培养液经1,5000r/min离心5min；取上清各5mL，加入到装有25g胡椒的250mL三角瓶中，各瓶中加蒸馏水100mL，30℃下静置脱皮，每隔6h取出观察脱皮效果，结果见表3。

胡椒的选择应符合《胡椒栽培技术规程》(NY-T 969-2006)的成熟果穗，即至少有2-4粒果变红或整穗果变黄的果穗。

胡椒鲜果脱皮程度分5级：0级不脱皮；1级少量脱皮；2级半脱皮；3级大部分脱皮；4级完全脱皮。胡椒经脱胶菌所产酶液脱皮后，清洗、护色、晾晒后得白胡椒产品，对其进行感官评价，评价标准见表2。

表2.感官评价表

表3.胡椒鲜果脱皮实验结果

由表2、3可知，采用对照组CK方法(传统水沤法脱皮)脱皮，周期长，脱皮程度低，为3级，感官评价为中，且白胡椒比例低；而菌株WCZC0110，HK0041和QH0002不仅脱皮完全，均达4级，而且白胡椒比例高；从脱皮时间看，WCZC0110最短为2d，感官评价最好，达到优等。

综合上述实验结果，确定菌株WCZC0110为高效胡椒果皮脱胶菌。

菌株WCZC0110已于2010年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号：CCTCC NO：M 2010184，鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。

实施例5：对菌株WCZC0110进行16SrRNA基因序列分析

对菌株WCZC0110进行16SrRNA基因序列分析，结果表明，WCZC0110的16SrRNA基因序列与芽孢杆菌属(Bacillus)同源性达99％，结合生理生化特性实验，将WCZC0110鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其主要生物学特征为：菌体直杆状；大小约为0.6×3.6μm；革兰氏染色反应阳性；好氧；V-P试验阳性；接触酶阳性；能分解果胶。

实施例6：菌株WCZC0110生长曲线的确定

挑取单菌落接种于10mL的种子培养基中，在30℃下，200r/min培养，每隔2h，用723分光光度计测定600nm下的吸光度值。结果如图1，菌株WCZC0110在4h后进入对数生长期，在6-12h为其对数生长期末期，12h后进入生长的稳定期。在菌株WCZC0110处于对数生长期的中后期接种，有利于缩短发酵周期和较高的接种量，因而确定其种龄为6-12h，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供依据。

实施例7：菌株WCZC0110产酶曲线的确定

按照实施例6所确定的种龄，按照3％的接种量接种于100mL发酵培养基中，30℃、200r/min培养，利用本领域的已知方法每隔4h测定果胶酶的活性，果胶酶活力的测定方法参见(王小敏，吴文龙，闾连飞，等.分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究[J].食品工业科技，2007，28(5)：227-229.)。结果如图2所示，菌株WCZC0110的产酶曲线为先上升后下降，在4-52h范围内产酶量较高，在24h有一个产酶高峰值，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供依据。

实施例8：温度对菌株WCZC0110产酶活性的影响

设定发酵温度分别为4℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，按照实施例6所确定的种龄，种子液按照3％的接种量接种于100mL发酵培养基中，在200r/min培养，发酵24h后，分别测定果胶酶的活性，研究温度对菌株WCZC0110产酶活性的影响。结果显示，菌株WCZC0110在25-40℃下均能产较高活性的果胶酶，最适温度为30℃，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供依据。。

实施例9：初始pH值对WCZC0110产酶活性的影响

设定培养液初始pH值分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，按照实施例6所确定的种龄，种子液按照3％的接种量接种于100mL发酵培养基中，在30℃，200r/min下培养，发酵40h后，分别测定果胶酶的活性，研究初始pH值对菌株WCZC0110产酶活性的影响。结果显示，菌株WCZC0110在培养液初始pH为6.0-9.0均能产较高活性的果胶酶，产果胶酶的最适pH为7.5，可为其在胡椒鲜果脱皮工艺中的应用提供依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种胡椒果皮脱胶菌，属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010184。

2.根据权利要求1所述胡椒果皮脱胶菌在胡椒果实脱皮中的应用。

3.一种胡椒果实脱皮的方法，其特征在于，取处于对数生长期的胡椒果皮脱胶菌CCTCC NO：M 2010184在初始pH为6.0-9.0的发酵培养基中25-40℃培养4-52h，取培养液离心，取上清液浸泡胡椒果实30-48h，所述发酵培养基配制方法：硫酸铵10.0g/L、酵母粉5.0g/L、果胶2.0g/L、NaCl 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，121℃灭菌20min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养温度为30℃。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基初始pH值为7.5。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为24h。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心为15000r/min离心5min。 

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