CN107475172B - 一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法，包括以下步骤：将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种于液体种子培养基中，培养得到种子液；将所述种子液接种于液体产芽孢诱导培养基中进行诱导培养，诱导产生芽孢。本发明中，种子细胞的培养和芽孢的诱导均在液体培养中进行，大大提高了培养和诱导的效率，缩短了时间，并且减少了人工操作，在36‑48小时内即能得到高芽孢数和高芽孢得率。

Description

一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法
技术领域
本发明涉及有芽孢细菌培养领域，更特别地，涉及一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法。
背景技术
嗜热脂肪地芽孢杆菌最佳生长温度55～60℃，其所产芽孢无致病性、无热原、无毒，且对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物中最强，因此常被用作检查高压蒸汽灭菌消毒效果的指标菌。
目前现有技术中制备嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢悬液的方法有固体和半固体培养法，芽孢悬液通过固体或半固体培养基培养、洗脱、热处理、分离和定容而制得。该法存在诸多缺陷，如获得芽孢的培养时间较长，芽孢的提取费工费时，步骤较多，操作复杂。另外，在固体或者半固体培养基中，菌体生长空间有限，分布不均匀，生长缓慢，芽孢得率较低；现有技术中液体发酵方式操作步骤多，培养方式复杂。
因此，需要一种新的获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法，包括以下步骤：
S1：将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种于液体种子培养基中，培养得到种子液；
S2：将所述种子液接种于液体产芽孢诱导培养基中进行诱导培养，诱导产生芽孢。
本发明中，种子细胞的培养和芽孢的诱导均在液体培养中进行，大大提高了培养和诱导的效率，缩短了时间，并且减少了人工操作，在36-48小时内即能得到高芽孢数和高芽孢得率。
在一个优选实施方案中，S1中所述液体种子培养基的成分为酪蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，胰蛋白胨10g/L。该培养基配方可快速培养种子细胞，在18-24h内，细胞浓度能达到7.9×108cfu/mL。
在一个实施方案中，所述液体种子培养基的pH为7.3±0.1。研究发现，嗜热脂肪地芽孢杆菌在这个pH下生长最好。
在一个实施方案中，S1包括以下步骤：
S11：按1-2×106cfu/mL的浓度将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种至液体种子培养基中；
S12：将所述接种了嗜热脂肪地芽孢杆菌的液体种子培养基置于55-65℃下摇床振荡培养18-24h，得到所述种子液。
1-2×106cfu/mL的接种浓度能让嗜热脂肪地芽孢杆菌在18-24小时内达到最大活菌数，并且维持生长状态良好。
在一个优选实施方案中，S2中，所述液体产芽孢诱导培养基的成分为胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.005g/L。该培养基配方可高效诱导种子细胞形成芽孢，诱导培养得到的活菌数最高，并且芽孢占活菌的比率也最高达到96％，达到2.0×109cfu/mL。
在一个实施方案中，所述液体产芽孢诱导培养基的pH为7.3±0.1。
在一个实施方案中，，S2包括以下步骤：
S21：将S1得到的所述种子液接种于所述液体产芽孢诱导培养基中；
S22：将所述接种了所述种子液的液体产芽孢诱导培养基置于55-65℃下摇床振荡培养18-24h，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。
在一个优选实施方案中，所述种子液与所述液体产芽孢诱导培养基的体积比5-10:100。
附图说明
图1为嗜热脂肪地芽孢杆菌在营养肉汤中的生长曲线；
图2为不同种子培养基培养嗜热脂肪地芽孢杆菌的活菌数统计图；
图3为不同产芽孢培养基培养嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢数及芽孢率统计图；
图4为不同培养方式培养嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢数和芽孢率统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.确定菌浓度相关吸收光谱
将嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC7953)接种到营养肉汤培养基中，55～60℃摇床振荡过夜培养，至培养液浑浊时，以营养肉汤培养基为空白对照，对嗜热脂肪地芽孢杆菌菌液吸光度进行330-620nm波长段扫描测定。结果如表1所示，嗜热脂肪地芽孢杆菌在360nm处的吸收度最大。
表1嗜热脂肪地芽孢杆菌菌液吸光度波长扫描测定
Figure BDA0001393954410000031
Figure BDA0001393954410000041
2.确定嗜热脂肪地芽孢杆菌的最优培养时间
将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种到营养肉汤培养基中，55-60℃摇床振荡培养，每隔2h测定一次OD360，绘制生长曲线，从第10h开始，每次还取样时测定活菌数。结果如表2和图1所示，培养物在培养至18-24h时进入稳定期，并且活菌数最多，故选择18-24h为后期的培养时间。
表2嗜热脂肪地芽孢杆菌培养物中OD360和活菌数随培养时间的变化
Figure BDA0001393954410000042
3.种子培养基的选择
将嗜热脂肪地芽孢杆菌分别接种于6种培养基中，55-60℃摇床振荡培养18-24h后，用稀释涂布法计数，比较各种培养基菌液的活菌数。这6种种子培养基的成分如表3所示，并且均调节pH至7.3±0.1。培养结果如表3和图2所示，使用Ⅲ号培养基培养18-24h后，活菌数最高，达到7.9×108cfu/mL，因此，选用Ⅲ号培养基进行培养，得到种子液。
表3不同种子培养基的组分及培养效果
Figure BDA0001393954410000043
Figure BDA0001393954410000051
4.产芽孢诱导培养基的选择
将嗜热脂肪地芽孢杆菌种子液按比例分别接种于10种不同的产芽孢诱导培养基中，55-60℃摇床振荡培养18-24h后，取样制片，用芽孢染色法染色，在显微镜下观察并计算芽孢率；菌液离心收集菌体，煮沸处理，用稀释涂布法计芽孢数，比较各种培养基所得的芽孢数。这10种产芽孢诱导培养基的组分如表4所示，并且均调节pH至7.3±0.1。诱导培养结果如表4和图3所示，使用⑩号培养基培养18-24h后，得到的活菌数最高，并且芽孢占活菌的比率也最高达到96％，达到2.0×109cfu/mL，因此，选用⑩号培养基进行诱导培养，得到芽孢。
表4产芽孢诱导培养基组分及其培养诱导效果
Figure BDA0001393954410000052
Figure BDA0001393954410000061
5.培养方式的优化
以筛选出的种子培养基和产芽孢培养基为基础，用不同的方式培养，选择出最佳培养方式。采用以下几种不同的方式55-60℃振荡培养嗜热脂肪地芽孢杆菌，取样制片并用芽孢染色法染色，在显微镜下观察芽孢生成情况，计算芽孢率。收集芽孢，煮沸处理后用稀释涂布法计芽孢数。培养方式如表5所示。培养结果如表5和图4所示，采用方式L培养嗜热脂肪地芽孢杆菌时，芽孢数和芽孢率最大。
表5不同培养方法的步骤及培养效果
Figure BDA0001393954410000062
Figure BDA0001393954410000071
其中所述种子培养基的成分为：酪蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨10g，蒸馏水1000mL；含无机盐的种子培养基成分为：酪蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨10g，硫酸锰0.005g，蒸馏水1000mL；产芽孢培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，硫酸锰0.005g，蒸馏水1000mL；不含无机盐的产芽孢培养基成分为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；以上所述培养基均调节pH至7.3±0.1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种获得嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种于液体种子培养基中，培养得到种子液；
S2：将所述种子液接种于液体产芽孢诱导培养基中进行诱导培养，诱导产生芽孢；
S1中所述液体种子培养基的成分为酪蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨5g/L，胰蛋白胨10g/L；所述液体产芽孢诱导培养基的成分为胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠5g/L，硫酸锰0.005g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体种子培养基的pH为7.3±0.1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：
S11：按1-2×106cfu/mL的浓度将嗜热脂肪地芽孢杆菌接种至液体种子培养基中；
S12：将所述接种了嗜热脂肪地芽孢杆菌的液体种子培养基置于55-65℃下摇床振荡培养18-24h，得到所述种子液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体产芽孢诱导培养基的pH为7.3±0.1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，S2包括以下步骤：
S21：将S1得到的所述种子液接种于所述液体产芽孢诱导培养基中；
S22：将所述接种了所述种子液的液体产芽孢诱导培养基置于55-65℃下摇床振荡培养18-24h，得到嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S21中，所述种子液与所述液体产芽孢诱导培养基的体积比为5-10:100。
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