CN106591282A - 快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，其特征在于，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH‑Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。本发明方法简单，所需试剂均为常见，本发明采用低pH抗性平板，通过两者双重指标大大提高了筛选的效率，扩大筛选范围，提高筛选到高产突变菌株的几率，使生长出的菌株更具代表性，通过细胞生长代谢液经处理后直接配制筛选培养基，筛选底物耐受性菌株，提高细胞对底物的反抑制作用，增强细胞的生长和代谢性能，获得的菌株更具有优势。本发明所述复筛步骤可以对初筛平板生长的所有菌株进行一步到位复筛，避免漏筛，有效降低筛选工作量。

Description

快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法

技术领域

本发明涉及高产乳酸链球菌素的菌株的筛选方法。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)，由某些乳酸乳球菌(Lactococus Lactis)在代谢过程中合成、分泌的具有很强杀菌作用的小肽，又称乳球菌肽或乳链菌肽。

Nisin能够抑制大部分革兰氏阳性菌及其芽孢的生长和繁殖，如葡萄球菌属、链球菌属、乳酸球菌属、梭装芽孢杆菌属和芽孢杆菌属的细菌，特别对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、肉毒杆菌抑制作用明显。因此，Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间，在乳制品、肉制品、罐头食品及植物蛋白食品等的保藏于防腐方面都有很好的作用。

目前，Nisin研究中存在的主要问题之一是，从自然界中获得的乳酸乳球菌产Nisin的能力普遍较低，要达到工业化应用必须大幅度提高菌株发酵的效价。主要是通过常规的微生物育种或基因工程技术来提高效价。常规育种主要采用紫外线照射、亚硝酸盐处理、低能离子注入及有毒害的化学诱变剂处理。

诱变筛选过程中由于正突变的几率很低，要在筛选过程中避免错筛和漏筛，就要建立快速准确高通量的筛选方法。而原有的方法存在工作量大，范围小，等因素，制约了其在大规模筛选高产Nisin的乳酸乳球菌乳酸链球菌株方面的应用。

中国专利，ZL.2011100251152，公开了一种高产葡萄糖苷酶的黑曲霉素的筛选方法，但是，该专利提供的技术，可靠性较低，难以工业化应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明所述筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH-Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。

具体的，包括以下步骤：

(1)初筛；(2)复筛；(3)精筛；(4)摇瓶验证实验；

所述的步骤(1)的初筛，指的是选择诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种；

所述的诱变包括：物理诱变方法，化学诱变方法，或者是物理诱变方法和化学诱变方法结合的方法；

所述的乳酸乳球菌是公知的，如保藏号为ATCC11454的乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)；或者是食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献报道的菌种；

并将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液；

所述的初筛步骤(1)还包括：a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备、b.乳酸细菌培养基母液的制备、c.高浓度Nisin母液的配制、d.低pH-Nisin抗性平板的制备和e.涂布；

所述的a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，包括如下步骤：将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养6h-48h，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸，调节pH1.5-3.0，静置5-30min，6000-12000rpm离心5-30min，通过0.1-22μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；

所述的乳酸细菌培养基包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄ 0.2～1％

乙酸钠 0.3～0.8％

M_gSO₄7H₂0 0.02～0.2％

柠檬酸氨 0.2～0.8％

蔗糖 4～10％

蛋白胨 0.6～1.0％

酵母粉 0.6～1.0％

水 余量

所述的b.乳酸细菌培养基母液的制备：所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄0.6～1.0％，乙酸钠0.9～1.2％，M_gSO₄7H₂0 0.06～0.1％，柠檬酸氨0.6～1.2％，蔗糖12～24％，蛋白胨3～6％，酵母粉3～6％，琼脂粉6～8％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；

制备方法：将K₂HPO₄、乙酸钠、M_gSO₄7H₂0、柠檬酸、蔗糖、蛋白胨、酵母粉和琼脂粉与步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液混合，步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液的重量用量为乳酸乳球菌发酵代谢液总重量的75～85％，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸调节pH4.0-5.5，补加余量的所述的步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液至100％，即可获得乳酸细菌培养基母液；

c.高浓度Nisin母液的配制，包括如下步骤：将pH2.0～4.0的水做溶剂，配制Nisin浓度为15mg/mL～50mg/mL(pH2.0～4.0)的溶液，获得高浓度Nisin母液；

d.低pH-Nisin抗性平板的制备，包括如下步骤：分别取b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液混合，获得混合物，倒在平板上，如表面皿中，获得含有10.5mgNisin/mL～35mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板；b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液的混合比例，可根据上述的浓度，方便的得到；

术语“10.5mg/mL～35mg/mL Nisin”，其中：mg指的Nisin的重量，mL指的是混合物的体积；

e.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，30-35℃培养55-72h，同时，涂布普通平板(平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板)，做对照；

所述步骤(2)的复筛方法，包括以下步骤：

a.复筛平板的制备：将步骤(1)中，b步骤的乳酸细菌培养基母液补水稀释2～4倍，优选3倍，采用重量浓度为10％-100％的乳酸或者20％NaOH调节pH至4.5～6.8，冷至40-50℃，加入重量浓度为1％～2％的藤黄微球菌悬液，混匀，倒制固体平板，自然冷却固化，获得复筛平板；

所述的藤黄微球菌悬液，将藤黄微球菌加入重量浓度为0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有藤黄微球菌的菌悬液；所述藤黄微球菌在藤黄微球菌悬液中的浓度为1×10⁶～3×10⁷cfu/mL；

b,在a步骤获得的所述的复筛平板底部，画上边长5-10mm的方格；

c,将步骤1中，e步骤获得的低pH-Nisin抗性平板中生长的菌株，接种至复筛平板，30-35℃培养15-24h，同时，接入未经诱变的菌株做对照；

本发明中，步骤(2)c中所述接种的方法为牙签点种法，通过灭菌牙签将单菌落逐个接入5-10mm方格中，培养后，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程，并斜面保藏；

所述步骤(3)的精筛方法，包括以下步骤：

a.将液体发酵培养基分装至10mL离心管，每支装5mL；

所述的液体发酵培养基，包括如下重量百分比的组分：K₂HPO₄ 0.2～0.5％，乙酸钠0.3～0.6％，M_gSO₄7H₂0 0.02～0.04％，柠檬酸氨0.2～0.6％，蔗糖4～10％，蛋白胨0.6～1.2％，酵母粉0.6～1.2％，余量为水，将上述组分混合，即可获得所述的液体发酵培养基；

b.将复筛得到的高产菌株，分别接种至a步骤的液体发酵培养基，同时，以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150rpm培养15-24h；

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000-12000rpm离心10-25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价，根据效价大小完成精筛步骤，并对优势菌株进行甘油冷冻保藏；

所述步骤(4)摇瓶验证实验的方法，是对精筛得到的高产优势菌株进行摇瓶重复发酵验证实验，同时，以未经诱变的菌株做对照，包括以下步骤：

a.将液体发酵培养基，分装至50mL锥形瓶，每瓶装10mL，所述的液体发酵培养基即为步骤(3)中的液体发酵培养基；

b.将精筛得到的高产菌株接种至锥形瓶发酵培养基中，同时以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150～250rpm培养15-24h。

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000-12000rpm离心10-25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价。

d.连续传代培养5次，重复步骤a、b、c，检测并比较每代发酵效价，最后甘油冷冻保藏传代稳定的菌株。

本发明利用Nisin基因特性和代谢机理发明了一种基于双重筛选指标的高产Nisin突变菌株的快速筛选方法，实现快速准确的筛选目的，所述双重筛选指标是Nisin抗性指标，耐受低pH指标。

其机理如下：

Nisin产生菌对Nisin具有免疫抗性，而结构基因与免疫基因联锁表达，一般抗Nisin能力增强，其表达Nisin的能力也得到增强，由此以抗性增强为指标筛选高产Nisin突变菌株。同时Nisin发酵代谢过程由于乳酸的产生，pH是不断下降的，pH下降对细胞生长和代谢均产生强烈抑制，pH低于6.0产Nisin细胞生长速率即开始减慢，pH低于4.5细胞停止生长，初始培养pH低于5.5细胞不生长，由此筛选耐受低pH的突变菌株，细胞生长和代谢性能均将得到加强，目标产物表达也将得到提高。同时，本发明中采用细胞生长发酵代谢液作为溶剂配制培养基，在这种含有底物产物和其他副产物成份的培养基生长的突变菌株，对底物产物和其他副产物均有不同程度的耐受性，这将提高其对代谢底物的反抑制作用能力，进一步增强其生长和代谢性能。将上述特点结合建立一个双重筛选指标，构建一种快速准确的初筛方法，从亿万菌株中快速高效获得潜在高产突变菌株。结合单菌落抑菌圈大小进行高效复筛，由于本发明方法复筛步骤简单容易操作，可以实现对初筛获得的所有菌株进行全复筛，避免漏筛。最后通过琼脂扩散法检测发酵液效价确定高产菌株，工作量得到极大的简化，从而提高筛选效率。

本发明具有如下优点：

1)本发明方法简单，所需试剂均为常见。

2)本发明初筛步中所需的低pH抗性平板，通过两者双重指标大大提高了筛选的效率，这对于进行大范围筛选非常有利，且工作量大幅度降低。

3)本发明初筛步骤能够很大程度上扩大筛选范围，提高筛选到高产突变菌株的几率，同时能够通过低pH及抗性的联合作用，使生长出的菌株更具代表性。

4)通过细胞生长代谢液经处理后直接配制筛选培养基，筛选底物耐受性菌株，提高细胞对底物的反抑制作用，增强细胞的生长和代谢性能，获得的菌株更具有优势。

5)本发明所述复筛步骤可以对初筛平板生长的所有菌株进行一步到位复筛，避免漏筛，且结果非常直观，有效降低筛选工作量。

具体实施方式

实施例1

(1)初筛；将乳酸乳球菌，紫外诱变30s，获得乳酸乳球菌乳酸亚种，作为筛选出发菌株，将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.75％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液；

a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养6hh，然后采用重量浓度为10％的乳酸，调节pH1.5，静置5min，6000rpm离心5min，通过0.1μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；

乳酸细菌培养基，包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄ 0.2％

乙酸钠 0.3％

M_gSO₄7H₂0 0.2％

柠檬酸氨 0.8％

蔗糖 4％

蛋白胨 0.6％

酵母粉 1.0％

水 余量

b.乳酸细菌培养基母液的制备，所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄ 0.6％，乙酸钠0.9％，M_gSO₄7H₂0 0.1％，柠檬酸氨1.2％，蔗糖12％，蛋白胨3％，酵母粉6％，琼脂粉6％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；

制备方法：将K₂HPO₄、乙酸钠、M_gSO₄7H₂0、柠檬酸、蔗糖、蛋白胨、酵母粉和琼脂粉与步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液混合，步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液的重量用量为乳酸乳球菌发酵代谢液总重量的75％，然后采用重量浓度为10％的乳酸调节pH4.0，补加余量的所述的步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液至100％，即可获得乳酸细菌培养基母液；

c.高浓度Nisin母液的配制，将pH2.0的水做溶剂，配制Nisin浓度为15mg/mL(pH2.0)的溶液，获得高浓度Nisin母液；

d.低pH-Nisin抗性平板的制备，分别取b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液混合，倒在平板上，获得含有10.5mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板；

e.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，30℃培养72h，同时，涂布普通平板(平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板)，做对照；

(2)复筛：

a.复筛平板的制备：将步骤(1)中，b步骤的乳酸细菌培养基母液补水稀释2倍，采用重量浓度为10％乳酸调节pH至4.5，冷至40℃，加入重量浓度为1％的藤黄微球菌悬液，混匀，倒制固体平板，自然冷却固化，获得复筛平板；

所述的藤黄微球菌悬液，为将藤黄微球菌加入重量浓度为0.75％的氯化钠溶液，获得含有藤黄微球菌的菌悬液；所述藤黄微球菌在藤黄微球菌悬液中，浓度为：1×10⁶cfu/mL；

b,在a步骤获得的所述的复筛平板底部，画上边长5mm的方格；

c,将步骤1中，e步骤获得的低pH-Nisin抗性平板中生长的菌株，接种至复筛平板，30℃培养24h，同时，接入未经诱变的菌株做对照；

步骤(2)c中所述接种的方法为牙签点种法，通过灭菌牙签将单菌落逐个接入所述5方格中，培养后，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程，并斜面保藏；

(3)精筛：

a.将液体发酵培养基分装至10mL离心管，每支装5mL；

所述的液体发酵培养基，为如下重量百分比的组分：K₂HPO₄ 0.2％，乙酸钠0.3％，M_gSO₄7H₂0 0.04％，柠檬酸氨0.6％，蔗糖4％，蛋白胨0.6％，酵母粉1.2％，余量为水，将上述组分混合，即可获得所述的液体发酵培养基；

b.将复筛得到的高产菌株，分别接种至a步骤的液体发酵培养基，同时，以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150rpm培养15-24h；

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000rpm离心25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价，根据效价大小完成精筛步骤，并对优势菌株进行甘油冷冻保藏；

步骤(4)摇瓶验证实验：

a.将液体发酵培养基，分装至50mL锥形瓶，每瓶装10mL，所述的液体发酵培养基即为步骤(3)中的液体发酵培养基；

b.将精筛得到的高产菌株接种至锥形瓶发酵培养基中，同时以未经诱变的菌株做对照，30℃，250rpm培养24h。

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000rpm离心5min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价。

d.连续传代培养5次，重复步骤a、b、c，检测并比较每代发酵效价，最后甘油冷冻保藏传代稳定的菌株。

实施例2

(1)初筛；将乳酸乳球菌，亚硝酸钠诱变1min，获得乳酸乳球菌乳酸亚种，作为筛选出发菌株，将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.9％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液；

a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养48h，然后乳酸，调节pH3.0，静置30min，12000rpm离心30min，通过22μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；

乳酸细菌培养基，为如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄ 1％

乙酸钠 0.8％

M_gSO₄7H₂0 0.02％

柠檬酸氨 0.2％

蔗糖 10％

蛋白胨 1.0％

酵母粉 0.6％

水 余量

b.乳酸细菌培养基母液的制备，所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄.0％，乙酸钠1.2％，M_gSO₄7H₂0 0.06％，柠檬酸氨0.6％，蔗糖24％，蛋白胨6％，酵母粉3％，琼脂粉8％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；

制备方法：将K₂HPO₄、乙酸钠、M_gSO₄7H₂0、柠檬酸、蔗糖、蛋白胨、酵母粉和琼脂粉与步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液混合，步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液的重量用量为乳酸乳球菌发酵代谢液总重量的85％，然后采用乳酸调节pH5.5，补加余量的所述的步骤a获得的乳酸乳球菌发酵代谢液至100％，即可获得乳酸细菌培养基母液；

c.高浓度Nisin母液的配制，将pH4.0的水做溶剂，配制Nisin浓度为50mg/mL(pH4.0)的溶液，获得高浓度Nisin母液；

d.低pH-Nisin抗性平板的制备，分别取b步骤的乳酸细菌培养基母液与c步骤的高浓度Nisin母液混合，倒在表面皿中，获得含有35mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板；

e.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，35℃培养55h，同时，涂布普通平板(平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板)，做对照；

(2)复筛：

a.复筛平板的制备：将步骤(1)中，b步骤的乳酸细菌培养基母液补水稀释2～4倍，采用20％NaOH调节pH至6.8，冷至50℃，加入重量浓度为2％的藤黄微球菌悬液，混匀，倒制固体平板，自然冷却固化，获得复筛平板；

所述的藤黄微球菌悬液，为将藤黄微球菌加入重量浓度为0.9％的氯化钠溶液，获得含有藤黄微球菌的菌悬液；所述藤黄微球菌在藤黄微球菌悬液中，浓度为：3×10⁷cfu/mL；

b,在a步骤获得的所述的复筛平板底部，画上边长10mm的方格；

c,将步骤1中，e步骤获得的低pH-Nisin抗性平板中生长的菌株，接种至复筛平板，35℃培养15h，同时，接入未经诱变的菌株做对照；

步骤(2)c中所述接种的方法为牙签点种法，通过灭菌牙签将单菌落逐个接入所述5方格中，培养后，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程，并斜面保藏；

(3)精筛：

a.将液体发酵培养基分装至10mL离心管，每支装5mL；

所述的液体发酵培养基，为如下重量百分比的组分：K₂HPO₄ 0.5％，乙酸钠0.6％，M_gSO₄7H₂0 0.02％，柠檬酸氨0.2％，蔗糖10％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.6％，余量为水，将上述组分混合，即可获得所述的液体发酵培养基；

b.将复筛得到的高产菌株，分别接种至a步骤的液体发酵培养基，同时，以未经诱变的菌株做对照，35℃，150rpm培养15h；

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，12000rpm离心10min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价，根据效价大小完成精筛步骤，并对优势菌株进行甘油冷冻保藏；

步骤(4)摇瓶验证实验：

a.将液体发酵培养基，分装至50mL锥形瓶，每瓶装10mL，所述的液体发酵培养基即为步骤(3)中的液体发酵培养基；

b.将精筛得到的高产菌株接种至锥形瓶发酵培养基中，同时以未经诱变的菌株做对照，35℃，150rpm培养15h。

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，12000rpm离心10min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价。

d.连续传代培养5次，重复步骤a、b、c，检测并比较每代发酵效价，最后甘油冷冻保藏传代稳定的菌株。

实施例3

采用本发明方法进行初筛，与现有方法相比，具有较高的工作效率，工作量明显减少，提高筛选概率。目的性更强，获得目标突变菌株的概率更高。

表1现有筛选方法与本发明筛选初筛效率比较

由结果可知，以含48000U/mL的Nisin抗性平板为例，现有初筛平板，100uL菌悬液最后每块平板可获得430个潜在菌株，后续需要对430个潜在菌株进行逐一发酵，然后测定效价，最后根据效价大小比较，筛选高产菌株。而本发明方法初筛平板，来自同一种菌悬液最后每块平板可获得17个潜在菌株，后续仅需要对这17个菌株进行发酵测定效价，工作量得到极大的缩小，且获得的潜在菌株目的性更强，菌株生长和代谢性能更强。

表2初筛可覆盖诱变菌悬液体积比较

由于初筛平板效率提高，则可以选择更多的出发菌悬液进行筛选，这将显著提高筛选到高产菌株的概率。由结果可知，获得同样个潜在菌株可覆盖诱变菌悬液体积，本发明初筛方法是现有初筛方法的25倍，即如果每100ul中正突变的菌株数量是一样的，那么本发明初筛方法可获得正突变菌株的概率是现有初筛方法的25倍。

实施例4

本实施例是对实施例1初筛获得的100株潜在菌株进行复筛做进一步的说明，结果见下表：

表3 100株潜在菌株复筛结果

根据复筛指示平板抑菌圈大小可以很直观地从中筛选到抑菌圈明显较大的单菌落15株，然后需要对这15株进行液体发酵小试培养检测效价。而现有方法是初筛完成后，需要对初筛平板中生长的100株潜在菌株进行液体发酵并检测效价。如果初筛平板菌株较多一般只能选择部分菌落进行液体发酵检测，由此会造成漏筛。本发明方法中，增加复筛指示平板筛选步骤，通过直观地单菌落抑菌圈大小可以从大量初筛菌种复筛出高产更加明显的潜力菌株，且可以对所有初筛菌株进行一步复筛，不会漏筛。工作量显著减少，复筛到的菌株高产Nisin更为明确。

实施例5

本实施例是对实施例2中经过精筛获得的5株优势菌株，对这5株优势菌株进行生长和代谢性能的考察，并与未经诱变的对照菌株比较。

表4 5株优势菌株生长和Nisin产量结果

参数	对照菌株	Y024	Y065	Y078	Y095	Y124
							OD600(nm)	2.51	3.54	3.48	3.83	3.98	3.88
pH	4.51	4.23	4.26	4.18	4.15	4.20
							Nisin(U/mL)	563	2042	2156	2371	2450	2310

由结果可知，筛选获得的突变菌株生长性能都比对照菌株要好，OD600是对照菌株的1.4倍。代谢性能也得到显著提高，突变菌株目标产物Nisin积累量是对照株的4.4倍。

下表是对突变菌株Y095的生长性能和代谢过程的进一步分析，由结果可知，随着发酵时间的推进，环境pH低于4.5后，OD₆₀₀仍缓慢增高，说明菌株仍在生长，而对照菌株在pH到达4.5附近已不再生长。说明通过本发明方法筛选到的突变菌株其对pH的耐受得到提高。与生长状况同步，代谢Nisin的过程也得到延长，最终Nisin积累量得到有效提高。由此可知，通过本发明方法可以高效准确筛选到高产Nisin突变菌株，且获得的菌株其生长性能和代谢性能得到提高。

表5突变菌株Y095与对照菌株的生长和代谢性能比较

Claims (10)

1.快速高效筛选乳酸链球菌素高产菌株的方法，其特征在于，是以诱变后的乳酸乳球菌作为起始菌种，以低pH-Nisin抗性平板作为初筛的菌株育选载体进行的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)初筛；(2)复筛；(3)精筛；(4)摇瓶验证实验。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将含有诱变后的乳酸乳球菌加入重量浓度0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有乳酸乳球菌的菌悬液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的初筛步骤(1)还包括：a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备、b.乳酸细菌培养基母液的制备、c.高浓度Nisin母液的配制、d.低pH-Nisin抗性平板的制备和e.涂布；

所述的a.乳酸乳球菌发酵代谢液的制备，包括如下步骤：将所述的诱变后的乳酸乳球菌在乳酸细菌培养基中，培养6h-48h，然后采用重量浓度为10％-100％的乳酸，调节pH1.5-3.0，静置5-30min，6000-12000rpm离心5-30min，通过0.1-22μm孔径的过滤膜，滤除残余细菌细胞后的过滤液，获得乳酸乳球菌发酵代谢液；

所述的乳酸细菌培养基包括如下重量百分比的组分：

K₂HPO₄ 0.2～1％

乙酸钠 0.3～0.8％

M_gSO₄7H₂0 0.02～0.2％

柠檬酸氨 0.2～0.8％

蔗糖 4～10％

蛋白胨 0.6～1.0％

酵母粉 0.6～1.0％

水 余量；

所述的乳酸细菌培养基母液，包括如下重量百分比的组分：K₂HPO₄ 0.6～1.0％，乙酸钠0.9～1.2％，M_gSO₄7H₂0 0.06～0.1％，柠檬酸氨0.6～1.2％，蔗糖12～24％，蛋白胨3～6％，酵母粉3～6％，琼脂粉6～8％，余量为步骤a获得的乳酸链球菌发酵代谢液；

所述的高浓度Nisin母液，为Nisin浓度为15mg/mL～50mg/mL(pH2.0～4.0)的溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的d步骤中，所述的低pH-Nisin抗性平板，为含有10.5mgNisin/mL～35mgNisin/mL的低pH-Nisin抗性平板。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的e步骤的.涂布，包括如下步骤：将步骤(1)初筛获得的乳酸乳球菌菌悬液，取100ul涂布于低pH-Nisin抗性平板，30-35℃培养55-72h，同时，涂布普通平板，平板中不含Nisin，且pH为6.8的固体平板，做对照。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的复筛方法，包括以下步骤：

a.复筛平板的制备：将步骤(1)中，b步骤的乳酸细菌培养基母液补水稀释2～4倍，采用重量浓度为10％-100％的乳酸或者20％NaOH调节pH至4.5～6.8，冷至40-50℃，加入重量浓度为1％～2％的藤黄微球菌悬液，混匀，倒制固体平板，自然冷却固化，获得复筛平板；所述的藤黄微球菌悬液，为将藤黄微球菌加入重量浓度为0.75-0.9％的氯化钠溶液，获得含有藤黄微球菌的菌悬液，所述藤黄微球菌在藤黄微球菌悬液中的浓度为1×10⁶～3×10⁷cfu/mL；

b,在a步骤获得的所述的复筛平板底部，画上边长5-10mm的方格；

c,将步骤1中，e步骤获得的低pH-Nisin抗性平板中生长的菌株，接种至复筛平板，30-35℃培养15-24h，同时，接入未经诱变的菌株做对照。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)c步骤中所述接种的方法，为牙签点种法，通过灭菌牙签将单菌落逐个接入5-10mm方格中，培养后，通过比较单菌落抑菌透明圈的大小完成复筛过程，并斜面保藏。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的精筛方法，包括以下步骤：

a.将液体发酵培养基分装至离心管，所述的液体发酵培养基，包括如下重量百分比的组分：K₂HPO₄ 0.2～0.5％，乙酸钠0.3～0.6％，M_gSO₄ 7H₂00.02～0.04％，柠檬酸氨0.2～0.6％，蔗糖4～10％，蛋白胨0.6～1.2％，酵母粉0.6～1.2％，余量为水；

b.将复筛得到的高产菌株，分别接种至a步骤的液体发酵培养基，同时，以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150rpm培养15-24h；

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000-12000rpm离心10-25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价，根据效价大小完成精筛步骤，并对优势菌株进行甘油冷冻保藏。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)摇瓶验证实验的方法，包括以下步骤：

a.将权利要求7中所述的液体发酵培养基分装；

b.将精筛得到的高产菌株接种至锥形瓶发酵培养基中，同时以未经诱变的菌株做对照，30-35℃，150～250rpm培养15-24h；

c.测定发酵结束时的pH、OD₆₀₀。20％稀盐酸调节发酵液pH至2.5，静置15min，8000-12000rpm离心10-25min，留上清液，按照琼脂扩散法测定发酵效价；

d.连续传代培养5次，重复步骤a、b、c，检测并比较每代发酵效价，最后甘油冷冻保藏传代稳定的菌株。