KR20080077390A

KR20080077390A - 만니톨 생성능이 우수한 내산성 류코노스톡 메센테로이드및 이를 이용한 김치의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080077390A
Application number: KR1020087016126A
Authority: KR
Inventors: 오지영; 양시영; 권민수; 이진혁; 한경호; 고의찬
Original assignee: 대상에프앤에프 주식회사
Priority date: 2008-07-02
Filing date: 2005-12-29
Publication date: 2008-08-22

Abstract

본 발명은 만니톨 생성능이 우수한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 유산균은 식품 첨가용 조성물 및 김치의 스타터로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치는 종래 김치에 비해 적정 숙성도가 오래 유지되며, 시원한 맛이 우수하고 신 냄새가 약하고 신맛의 질이 매우 부드러워 관능특성이 우수하다는 효과를 가진다.

Description

만니톨 생성능이 우수한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 김치의 제조 방법{ACID TOLERANT LEUCONOSTOC MESENTEROIDES WITH EXCELLENT MANNITOL PRODUCTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING A KIMCHI USING THE SAME}

본 발명은 만니톨 생성능이 우수한 내산성 유산균 및 이의 용도에 관한 것이다.

김치는 주원료인 절임 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 파 및 무 등을 혼합한 후, 제품의 보존성과 숙성도를 확보하기 위하여 저온에서 발효시킨 식품으로서, 우리나라 고유의 대표적인 전통발효식품이다. 1990년대까지만 해도 김치는 주로 가정에서 자체적으로 생산이 되어온 식품이었으나, 급속한 경제성장과 국민소득의 증가, 산업구조 및 생활환경의 변화에 의하여 1990년대 이후 본격적으로 상품화되기 시작하였다. 상품화되고 있는 김치의 경우, 김치의 발효를 주도하고 김치 특유의 맛을 내는 자연발생적 균주들이 원재료의 산지, 계절, 발효 조건에 따라 달라져 상품김치의 품질이나 맛을 원하는 상태로 일정하게 유지하기가 대단히 어려웠다. 따라서 품질과 맛이 일정하면서도 우수한 상품김치에 대한 개발이 요구되었다.

김치의 시원하고 깔끔한 맛을 내는 주된 요인은 김치 유산균 중 이상젖산발효균(heterofermentative lactic acid bacteria)인 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides)가 김치의 숙성시 증가하기 때문이다(So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):495-505, 1995; So M.H. and Kim Y.B., Korean J. Food Sci. Technol., 27(4):506-515, 1995). 이 류코노스톡 메센테로이드는 김치 제조시 초기부터 생육을 시작하여 이산화탄소, 젖산, 초산, 에탄올 및 만니톨 등의 대사산물을 생산함으로써 김치를 복합적이고 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한 생산된 이산화탄소로 하여금 김치내부를 혐기적 조건으로 유지시켜 호기성 세균의 번식을 강력히 억제시킴으로써 정상적인 김치발효가 되게 한다. 그러나 김치의 발효 중기에 이르면 류코노스톡 메센테로이드의 수가 급격히 감소되며 정상젖산발효균(homofermentative lactic acid bacteria)인 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarium)이 왕성히 증식하게 된다. 락토바실러스 플란타리움은 김치의 신맛을 내는 주된 균이며 산패에 관여한다고도 알려져 있다. 이 락토바실러스 플란타리움은 젖산을 다량으로 생성하고 pH 3.0의 산성 환경에서도 생육이 가능하다. 따라서 김치의 발효 말기부터는 상대적으로 산에 약한 유산균인 류코노스톡 메센테로이드의 생육은 감소되면서 신맛의 원인균인 락토바실러스 플란타리움의 생육이 증가되고 이에 따라 김치의 시원하고 깊은 맛이 사라지게 된다. 따라서 김치 내 류코노스톡 메센테로이드의 생육을 저장 기간 동안 유지시켜 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 재현하는 것이 품질과 맛이 좋은 김치를 생산할 수 있는 주요 관건이라 할 수 있다.

또한 김치 발효에 의해 생성되는 만니톨은 김치 원료에 유래되는 과당이 만니톨 디하이드로게네이즈(Mannitol dehydrogenase)에 의해 김치 숙성 적기 이후에 생성되는 것으로서 김치에 상쾌하고 부드러운 단맛을 부여하는 반면, 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하고 김치의 신 냄새와 신맛을 감소시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Hawer W.D., Ahn H.S. Report of Korea Food Research Institute, S9-3, Kang S.C., Yun J.W., Ro T.W., Korean J. Biotechnol. Bioeng., 11(2), 1996).

따라서, 최근에는 김치에서 유래되는 유산균을 분리한 후, 김치 제조시 스타터(starter)로 첨가함으로써 김치의 맛과 발효를 조절하려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 특히, 류코노스톡 메센테로이드를 이용하여 김치의 품질을 향상시키려는 연구가 계속 진행되고 있다. 대한민국 등록특허 제1989-4894호에 차아염소산나트륨과 류코노스톡 메센테로이드를 첨가하여 산패가 억제되고 보존성이 연장된 김치를 제조하는 방법이 개시되었다. 또한 대한민국 등록특허 제0181009호에 류코노스톡 파라메센테로이드와 류코노스톡 메센테로이드를 혼합 첨가함으로써 맛이 좋을 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주의 생육을 억제하여 산패가 지연되도록 한 김치의 제조방법이 개시되었다. 그러나, 류코노스톡 메센테로이드는 내산성이 약하기 때문에 김치의 발효가 점차 진행되면서 그 수가 감소되어 김치의 신선한 맛을 지속적으로 유지시킬 수 없다는 문제점이 있다.

이러한 문제점들을 극복하기 위하여 대한민국특허 제1996-1940호에서는 류코노스톡 속 균주의 내산성을 향상시키기 위하여 류코노스톡 속 균주를 자외선 처리하여 내산성 변이균주를 제조하였고, 이를 김치 제조시 스타터로 첨가한 결과 김치의 관능성을 향상시키고 김치의 산패를 지연시켰다. 그러나 이러한 내산성 변이균 주를 첨가하여 제조한 김치는 맛이 좋고 산패가 지연되기는 하였으나 김치의 신맛을 내는 주원인균이면서 강력한 내산성 균주인 락토바실러스 플란타리움의 생육이 억제됨을 보이지는 못했다.

이에 따라 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 오랫동안 유지하게 할 수 있는 유산균 스타터에 대한 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

기술적 과제

본 발명의 목적은 만니톨 생성능이 우수한 내산성 김치 유산균 스타터 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

기술적 해결방법

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 pH 3.5-5.0에서 내산성을 가지며 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(기탁번호 : KCTC 10882BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 첨가용 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 만니톨 생성능이 우수한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에서는 김치가 가장 맛있을 때 생육되는 내산성이 우수한 유산균을 분리하였고, 상기 분리된 유산균을 과당이 첨가된 배지에서 자연개량하여 내산성과 더불어 만니톨 생성능이 우수한 신 균주를 얻었다. 상기 균주를 동정한 결과, 류코노스톡 메센테로이드에 속함을 확인할 수 있었다. 상기 균주를 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512라 명명하였으며, 상기 균주를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 생물자원센터 유전자은행(Korean Collection for Type Culture)(대한민국 대전시 유성구 어은동 52번지 한국생명공학연구원)에 2005년 12월 14일자로 기탁번호 KCTC 10882BP로 기탁하였다. 상기 기탁물은 등록 특허(issued patent)의 전 기간 동안 한국생명공학원 생물자원센터 유전자은행에서 살아있는 상태로 유지될 것이고, 기탁물 관리법의 규정에 따라 제한 없이 비상업적 용도를 위해 모든 사람(any person or entity)이 입수할 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드는 DRC0512는 pH 3.5-5에서 내산성을 나타낸다. 일반적인 류코노스톡 메센테로이드가 산성 조건, 특히 pH 4.0 이하에서 증식이 급격히 저하되나, 본 발명의 유산균은 pH 3.5의 산성 조건에서도 활발하게 생육하여 내산성이 강한 것으로 나타났다(표 3 참조).

또한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 우수한 만니톨 생성능을 가진다(표 1 참조). 특히, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 종래 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291(N.V. Weymarn, M. Hujanen, M. Leisola,Process Biochemistry, 37, 1207-1213, 2002) 에 비해 당 함유 배지에서 30％ 정도 더 높은 만니톨 생성능을 나타낸다(도 1 참조).

이와 같은 특성을 갖는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이의 배양액은 김치, 음료, 이유식 등의 식품에 대한 식품 첨가용 조성물(식품 첨가제)로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 식품 첨가용 조성물은 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이의 배양액 이외에 필요에 따라 담체, 부형제, 보존제, 향료 등 일반적인 식품 첨가용 조성물에 사용되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 발효제품 제조를 위한 스타터(starter)로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 발효생식제품, 치즈, 김치 등을 포함한다. 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이의 배양액을 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 발효생식제품의 경우에는 현미와 율무 등의 곡류 분말에 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 유산균을 처리하여 적정 온도에서 발효시킨 후, 백태, 찹쌀, 수수 등의 다양한 농산물을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이의 배양액을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다. 바람직하게는 소금으로 절인 배추에 고춧가루, 마늘, 생강, 대파, 무채, 설탕과 같은 일반적인 김치 양념들을 혼합한 후, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 이의 배양액을 첨가하여 김치를 제조할 수 있다.

본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가 속도가 완만할 뿐 아니라(도 2 참조), 김치 내 만니톨 함량이 높아서 김치가 숙성된 이후 신 냄새와 신맛이 약하고 전반적인 관능평가가 우수한 것으로 나타났다(도 3 및 표 5 참조). 특히, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 김치에 첨가될 경우 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도한다. 따라서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 첨가하여 제조된 김치는 산도 증가속도가 완만하여 김치의 적정 숙성도(산도 0.4-0.8％)를 오랫동안 유지할 수 있다. 또한 만니톨의 생성량이 높아 깔끔하고 시원한 맛을 낼 뿐만 아니라, 신맛이 억제되어 그 맛을 오래 보존할 수 있는 특징이 있다.

본 발명에서 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 이를 파쇄한 세포벽 분획, 생균, 사균, 건조균의 형태로 사용될 수 있다. 또한 본 발명에서 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 이것을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)을 포함한다. 또한 상기 배양액은 이를 건조(예: 동결건조)한 후 분말화한 것도 포함한다.

본 발명의 유산균을 이용하여 김치를 제조하는 경우, 균 자체를 직접 김치에 첨가할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 균의 배양액을 첨가할 수 있다. 본 발명의 김치 제조시 사용되는 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액은 상기 균주를 MRS 브로스(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10g, beef extract 10g, yeast extract 5g, glucose 2 0g, tween 80 1g, ammonium citrate 2g, dipotassium phosphate 2g, sodium acetate 5g, manganese sulfate 0.1g, magnesium sulfate 0.05g/D.W. 1L)에 1차 전배양하는 단계 ; 1차 전배양된 상기 균주를 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 2차 전배양하는 단계; 및 상기 2차 전배양액을 멸균된 배추즙에 0.5-1.0％(v/v) 접종한 후 25-30℃에서 18-24시간 동안 본 배양하는 단계를 거쳐 제조되는 것이 바람직하다. 또한 상기 배추즙은 다음과 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하다: 절임배추를 분쇄하고 착즙한 후, 효과적인 균주의 생육을 위하여 염농도를 2.0-3.0％, 바람직하게는 2.5％로 조정한다. 이후, 포도당을 1.0-3.0％(w/v), 바람직하게는 1.0％(w/v) 첨가한 후 멸균한다. 이와 같이 제조된 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액은 김치 전체 중량에 대해 0.5-3중량％로 첨가하는 것이 바람직하다. 상기에서 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액이 김치 전체 중량에 대하여 0.5중량％ 미만으로 첨가되면 균주에 의한 효과가 미미하고, 3중량％를 초과하여 첨가하게 되면 김치의 풍미가 저하되고 김치가 과숙성되는 문제점이 발생할 수 있기 때문에 상기 범위로 첨가하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 1중량％ 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 통상적인 류코노스톡 속 미생물의 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있으며, 예컨대, MRS(Man-Rogosa-Sharp) 배지 또는 김치 배지를 사용할 수 있다. 상기 김치 배지는 숙성된 김치, 바람직하게는 김치 제조 후 24시간 동안 4℃에서 숙성된 김치를 분쇄하고 착즙한 후, 멸균하여 사용할 수 있다. 미생물의 배양은 통상의 류코노스톡 속 미생물의 배양 조건상에서 가능하며, 예컨대, 20℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 40시간 정도 배양할 수 있다. 보다 바람직하게는 37℃에서 18시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

도 1은 당 함유 배지에서 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512와 종래 유산균의 만니톨 생성량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

DRC0512: 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512

ATCC12291: 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291

CH-3: 류코노스톡 메센테로이드 CH-3

OH-20: 류코노스톡 메센테로이드 OH-20

도 2는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 첨가하여 제조한 김치, 종래 공지된 유산균을 첨가하여 제조된 김치 및 유산균을 첨가하지 않고 제조된 김치의 숙성기간의 경과에 따른 산도 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.

-◆- : 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 첨가하여 제조된 김치

-■- : 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291을 첨가하여 제조된 김치

-━- : 류코노스톡 메센테로이드 CH-3를 첨가하여 제조된 김치

-●- : 류코노스톡 메센테로이드 OH-20을 첨가하여 제조된 김치

-▲-: 유산균을 첨가하지 않고 제조된 김치

도 3은 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 첨가하여 제조한 김치, 종래 공지된 유산균을 첨가하여 제조된 김치 및 유산균을 첨가하지 않고 제조된 김치의 만니톨 함량 변화를 비교하여 나타낸 그래프이다.

-▲- : 유산균을 첨가하지 않고 제조된 김치

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞

내산성 및 만니톨 생성이 우수한 유산균의 제조

＜1-1＞ 유산균 분리 김치시료의 제조 및 이로부터 유산균의 분리

통상적인 김치 제조방법으로 제조된 여러 종류의 김치들을 대상으로 관능평가를 실시하여 가장 맛이 좋은 것으로 평가되는 김치를 선택하였다. 상기 김치를 -1℃의 저온에서 숙성시키면서 관능평가를 실시하여 가장 풍미가 우수한 시점의 김치를 유산균 분리 김치시료로 사용하였다. 상기 김치시료를 0.85％ 식염수로 10배 희석하였고, 0.1 ㎖씩 PES 아가 배지(Phenylethyl alcohol sucrose agar; tryptone 5 g, yeast extract 0.5 g, sucrose 20 g, ammonium sulfate 2 g, dipotassium phosphate 1 g, magnesium sulfate 0.244 g, phenylethyl alcohol 2.5 ㎖, agar 15 g/D.W. 1ℓ) 플레이트에 접종한 후, 유리막대로 도말하였다. 이후, 플레이트를 25 ℃의 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 생성된 각각의 콜로니를 PES 아가 플레이트에 획선 접종하였고, 25℃에서 1일 동안 배양하여 유산균 콜로니들을 분리하였다.

＜1-2＞ 내산성 유산균의 선별

상기 실시예 ＜1-1＞에서 분리된 유산균 콜로니들을 젖산(lactic acid)으로 pH 3.0, 3.5, 4.0, 5.0으로 각각 조정한 MRS 브로스(MRS broth, Difco.; bacto peptone 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 5 g, glucose 2 0 g, tween 80 1 g, ammonium citrate 2 g, dipotassium phosphate 2 g, sodium acetate 5 g, manganese sulfate 0.1 g, magnesium sulfate 0.05 g/D.W. 1ℓ) 5 ㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 동안 배양하면서 생육유무를 관찰하여 상기 pH 범위에서도 가장 생육이 활발한 내산성 균주를 선별하였다. 선별된 내산성 유산균은 pH 3.5- 5.0에서 생육이 활발하여 내산성이 강한 것으로 나타났다.

＜1-3＞ 만니톨 생성량이 우수한 균주로의 개량

상기 실시예 ＜1-2＞에서 선별된 내산성 유산균을 만니톨 생성량이 우수한 균주로 개량하기 위해, 상기 유산균을 MRS 브로스 5 ㎖에 2차에 걸쳐 계대배양하였다. 이후, 상기 유산균을 과당이 1-9％(w/v)까지 각각 첨가된 영양배지(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g∼90g/D.W. 1L) 5㎖에 1.0％(v/v)로 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 생성된 만니톨의 양을 측정하여 만니톨이 많이 생성된 순서로 1-5위까지의 균주를 선별하였다. 선별된 5 종의 균주를 다시 1-9％(w/v)의 과당이 첨가된 배지에 각각 재접종하여 다시 만니 톨 생성량을 측정하였다. 만니톨 생성량의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다: 각 배양액을 13,000rpm, 3분간 원심분리 한 후 0.22μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였다. 80℃에서 초순수 H₂O(0.5ml/min) 용매를 사용하여 여과된 시료 20㎕를 HPLC(High performance liquid chromatography)로 분석하였다.

그 중에서 만니톨 생성량이 많은 1∼3위까지의 균주를 재선별하고 이들을 다시 1-9％(w/v)의 과당이 첨가된 배지에 2차 재접종하여 만니톨 생성량을 측정하였다. 그 중 6％(w/v)의 과당이 첨가된 배지에서 만니톨 생성량이 가장 높게 유지되는 것으로 나타났다. 따라서 6％(w/v)의 과당이 첨가된 배지에서 상기 균주들을 10회 걸쳐 계대배양하고, 이 중 만니톨 생성량이 가장 우수한 1종의 균주를 최종 선발하였다(표 1 참조).

표 1

＜실시예 2＞

상기 실시예 1에서 분리 및 개량한 유산균의 동정

＜2-1＞ 버지스의 분류 세균학 매뉴얼에 따른 분석

상기 실시예 1에서 최종 선발된 유산균(개량균주 2)를 단일 콜로니로 분리한 후, 버지스의 분류 세균학 매뉴얼(Bergy's manual of systematic bacteriology)에 준하여 형태학적 및 생화학적 특성을 조사하였고, 그람 염색을 수행하였다. 그 결과, 상기 분리된 균주는 그람 양성 균주이며 간균의 형태를 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

＜2-2＞ API 시스템을 이용한 분석

상기 균주를 API 시스템(API system; La Balme-les-Grottes, France)으로 동정하였다. 우선, 멸균 백금이로 균 콜로니를 취한 후 멸균 증류수 2 ㎖에 부유시켰다. 다시 상기 균액을 멸균 증류수 5 ㎖에 API 50CH 키트(BioMerieux, France)에서 제공되는 맥팔란드 표준 용액 No.2(MccFaland Standard Solution No.2)의 농도로 균액을 부유시켰다. 상기 부유액을 API 50CH 키트의 액체배지에 첨가하여 균질화시킨 후, API 50CH 키트의 50개 각 튜브에 200 ㎕씩 접종하였다. 미네랄 오일로 튜브 위를 엎어준 후, 30℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액을 API 시스템으로 분석하여 49종의 탄수화물 발효패턴을 확인한 후, 이 결과를 ATB 동정 컴퓨터 시스템에 입력하여 동정하였다. 그 결과, 상기 실시예 1에서 분리 및 개량한 유산균은 하기 표 2의 탄수화물 발효패턴을 갖고 있는 류코노스톡 메센테로이드에 속하는 균주인 것으로 판명되었다.

표 2

본 발명에 따른 유산균의 탄수화물 발효패턴 분석 결과

＜2-3＞ 16S rDNA 염기서열 분석

당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 상기 선별된 유산균의 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 유산균의 16S rDNA 염기서열은 류코노스톡 메센테로이드의 16S rDNA 염기서열과 99％ 동일함을 확인할 수 있었다(결과 미도시).

따라서, 본 발명자들은 상기 유산균을 "류코노스톡 메센테로이드 DRC0512"로 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행에 2005년 12월 14일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 10882BP).

＜실시예 3＞

본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 내산성 정도 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512와 종래 유산균과의 내산성 정도를 비교하였다. 종래 유산균(대조군)으로는 류코노스톡 메센테로이드(KCCM-11325)와 류코노스톡 속 균주(KFCC-10774)를 사용하였다.

각 유산균을 젖산으로 pH 3.2, 3.5, 4.0, 5.0으로 조정한 MRS 브로스 10 ㎖에 각각 접종하였다. 25℃에서 72시간 배양하면서 생육유무를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

표 3

내산성 비교 결과

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 종래 류코노스톡 속 균주에 비하여 내산성이 현저히 강하고, pH 3.5-5.0에서 생육이 활발하게 유지됨이 확인되었다.

＜실시예 4＞

본 발명의 유산균과 종래 유산균과의 만니톨 생성량 비교

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512와 종래 유산균과의 만니톨 생성량을 비교하였다. 종래 유산균(대조군)으로는 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291과 김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드 CH-3 및 OH-20을 사용하였다. 상기 유산균들을 2％(w/v) 과당이 첨가된 영양배지(Nutrient broth; peptone 5g, yeast extract 2.5g, fructose 10g∼90g/D.W. 1L) 5 ㎖에 1.0％(v/v)로 접종하여 10℃에서 5-10일 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 ＜1-3＞에 기재된 방법과 동일한 방법으로 배양액 내 만니톨 생성량을 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균은 종래 김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드 균주들(CH-3 및 OH-20)에 비해 현저히 높은 수준으로 만니톨을 생성하였다. 또한 본 발명의 유산균은 종래 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291에 비해서도 더 높은 수준으로 만니톨을 생성하였다.

＜실시예 5＞

류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 이용한 김치의 제조 및 제조된 김치의 특성 분석

＜5-1＞ 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 김치첨가 배양액 제조

먼저 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 MRS 브로스 5㎖에 접종 하여 25℃에서 24시간 동안 1차 전배양을 하였다. 이후, 상기 1차 전배양을 배추즙에 1.0％(v/v) 접종하여 25℃에서 24시간 동안 2차 전배양을 하였다. 이 때 상기 배추즙은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 절임배추를 브랜드로 분쇄, 착즙 후 재제염을 사용하여 염도가 2.5％가 되도록 조정하였다. 여기에 포도당을 1.0％(w/v) 첨가한 후, 멸균하여 배추즙을 제조하였다. 이후, 상기 2차 전배양액을 다시 멸균된 배추즙에 1.0％ 접종하여 25℃에서 18시간 동안 본배양하였다.

＜5-2＞ 김치의 제조

먼저, 배추를 소금으로 절여 배추의 염도가 2.3％가 되도록 하였다. 절인 배추(82.5중량％)에 고춧가루(2.5중량％), 마늘(2중량％), 생강(0.5중량％), 대파(2중량％), 무채(9중량％), 설탕(0.5중량％)의 김치 양념을 혼합하였다. 이후, 스타터로서 상기 실시예 ＜5-1＞에서 제조한 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액을 김치 전체 중량에 대하여 1.0％(w/w)로 첨가하였다. 이 때 양성 대조군으로는 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291(양성 대조군 1), 그리고 종래 김치에서 분리된 류코노스톡 메센테로이드 CH-3(양성 대조군 2)과 류코노스톡 메센테로이드 OH-3(양성 대조군 3)을 각각 사용하였다. 또한 음성 대조군으로는 유산균 스타터를 첨가하지 않고 동일한 방법으로 제조한 김치를 사용하였다. 이후, 제조된 각 김치를 김치의 일반적인 숙성 온도인 10℃에서 저장하면서 산도, 유산균수 및 만니톨 생성량을 측정하고 관능평가를 실시하였다.

＜5-3＞ 김치의 산도 측정

상기 실시예 ＜5-2＞에서 제조한 각 김치를 대상으로 산도를 측정하여 비교하였다. 각 김치 100 g을 마쇄한 후 거즈로 여과하여 김치액을 제조하였다. 김치액 20 ㎖를 0.1N NaOH을 사용하여 pH 8.1이 되도록 중화적정한 후, 소비된 NaOH의 양을 하기의 식에 따라 젖산 함량(％)으로 환산하여 산도를 구하였다.

산도(％)= {0.00908× F( 0.1 N NaOH factor)× 0.1N NaOH 첨가량}/시료무게

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 숙성 초기에는 각 김치의 산도 차이가 별로 크지 않았으나, 숙성기간이 길어질수록 산도의 차이가 벌어졌다. 본 발명에 따른 유산균을 이용하여 제조된 김치의 경우 산도 증가 속도가 다른 김치에 비해 완만함을 보였다. 또한 본 발명의 유산균이 첨가된 숙성 20일 이후에도 김치의 적정 숙성도(산도 0.4-0.8％)를 유지하였다. 반면, 다른 유산균이 첨가된 김치들은 모두 숙성 20일째에 산도 0.8％를 초과하였으며 25일째에는 산도가 더욱 증가하는 것으로 나타났다. 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 종래 류노코스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291을 이용하여 제조된 김치의 경우(양성 대조군 1)에는 초기 산도는 가장 낮았으나 5일째 이후로 급상승하여 20일째에는 적정 숙성도를 벗어났다.

＜5-4＞ 유산균 수 측정

상기 실시예 ＜5-2＞에서 제조된 각 김치의 유산균 수를 측정하였다. 10℃에서 10일 동안 숙성시킨 각 김치를 0.85％ 식염수로 10배 희석하여 김치 희석액을 제조하였다. 이후, 총 유산균 수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 MRS 아가 배지 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 또한, 류코노스톡 균수의 측정을 위해서는 상기 김치 희석액 0.1 ㎖씩을 PES 아가 배지(tryptone 5 g, yeast extract 0.5 g, sucrose 20 g, ammonium sulfate 2 g, dipotassium phosphate 1 g, magnesium sulfate 0.244 g, phenylethyl alcohol 2.5 ㎖, agar 15 g/D.W. 1ℓ) 플레이트에 접종한 후 유리막대로 도말하였다. 김치 희석액이 도말된 각 아가 플레이트를 25℃의 항온배양기에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 집락의 수를 각각의 균수로 계수하였다. 또한 우점율(％)은 총 유산균 균수 중 유산균 스타터(PES 아가 플레이트에 나타나는 류코노스톡 속 균주 중 유산균 스타터와 형태학적 타입이 일치하는 균)의 균수의 비율로 계산하였다(하기 식 참조). 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

우점율(％)=(유산균 스타터와 형태학적 타입이 일치하는 류코노스톡 속 균주의 수/총 유산균 수)×100

표 4

본 발명의 유산균을 이용하여 제조된 김치의 유산균 수 측정 결과

그 결과, 상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 유산균을 스타터로 첨가하여 제조된 김치의 경우, 종래 유산균들을 첨가하여 제조된 김치들(양성 대조군 1 내지 3)에 비해 류코노스톡 속 균주의 수가 현저히 많았다. 또한 우점율을 조사한 결과, 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치에서 본 발명에 따른 스타터 유산균의 우점율이 72.5％로 가장 높게 나타났다. 이와 같이 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512는 내산성이 강하여 생육이 우수할 뿐 아니라 김치 내에서 우점종으로서 발효를 주도하여 김치의 신선한 맛을 지속적으로 유지시킬 수 있다.

＜5-5＞ 만니톨 함량 측정

상기 실시예 ＜5-2＞에서 제조한 각 김치를 대상으로 만니톨 함량을 측정하여 비교하였다. 상기 실시예 ＜5-2＞에 기재된 방법과 동일한 방법으로 각 김치로 부터 김치액을 제조한 후, 이를 13,000rpm, 3분간 원심분리 한 후 0.22 μm 시린지 필터(syringe filter)로 여과하였다. 80℃에서 초순수 H₂O(0.5ml/min) 용매를 사용하여 여과된 시료 20㎕를 HPLC(High performance liquid chromatography)로 분석하였다.

그 결과, 도 3에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512를 이용하여 제조된 김치의 만니톨 함량이 가장 높았으며, 이는 숙성시간 경과함에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 김치는 종래 만니톨 생성능이 우수하다고 알려진 류코노스톡 슈도메센테로이드 ATCC12291를 이용하여 제조된 김치(양성 대조군 1)보다도 더 높은 만니톨 함량을 나타내었다.

＜5-6＞ 관능검사

상기 실시예 ＜5-2＞에서 제조한 각 김치(산도 0.6-0.7％)에 대하여 훈련된 검사요원 50명에 의하여 관능검사를 수행하였다. 5점을 만점으로 기호도 척도법에 의해 실시하였으며, 유의성 검증은 t-test에 의해 실시하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

표 5

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 유산균이 첨가된 김치가 대조군 김치들에 비해 전반적으로 가장 우수한 것으로 평가되었다. 특히 본 발명에 따라 제조된 김치는 시원한 맛이 우수하고, 신 냄새가 더욱 약하고 신맛의 질이 매우 부드러운 것으로 평가되었다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 유산균은 내산성과 만니톨 생성능이 우수하다. 따라서 본 발명의 유산균은 식품 첨가용 조성물 및 김치의 스타터로서 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조된 김치는 종래 김치에 비해 적정 숙성도가 오래 유지되며, 시원한 맛이 우수하고 신 냄새가 약하고 신맛의 질이 매우 부드러워 관능특성이 우수하다는 효과를 가진다.

Claims

김치에서 분리된 pH 3.5-5.0에서 내산성을 가지며 만니톨 생성능이 우수한 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512(Leuconostoc mesenteroides DRC0512)(기탁번호 : KCTC 10882BP).
제1항의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 그의 배양액을 함유하는 식품 첨가용 조성물.
제1항의 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512 또는 그의 배양액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 DRC0512의 배양액은 김치 제조 시 김치 전체 중량에 대해 0.5-3중량％로 첨가하는 것을 특징으로 하는 김치의 제조방법.