KR101660847B1 - 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법 - Google Patents

류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한국전통발효식품으로부터 분리한 류코노스톡 속의 만니톨 생성 신규 균주, 이를 포함하는 유산균 스타터, 상기 균주를 이용한 김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 김치에 관한 것으로, 본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 만니톨 생성능이 우수하여 발효식품의 제조를 위한 유산균 스타터로서 유용하게 사용할 수 있고, 상기 스타터를 첨가한 김치는 관능미가 우수할 뿐만 아니라 만니톨 함량이 높고 상기 균주의 우점율이 우수한 김치를 제공할 수 있다.

Description

류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주 및 이를 이용한 김치의 제조방법 {Leuconostoc mesenteroides WiKim33 strain and method for preparing kimchi using the strain}
본 발명은 류코노스톡의 만니톨 생성 신규 균주, 이를 포함하는 유산균 스타터, 상기 균주를 이용한 고함량의 만니톨이 함유된 김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 고함량의 만니톨이 함유된 김치에 관한 것이다.
만니톨(mannitol)은 백색의 결정성 분말로 버섯, 포도 등의 과일이나 해조류 등에 광범위하게 존재하는 6탄소 당알코올이며, 항산화 능력, 증점제, 항고착제, 보습제 등의 기능이 있어 식품의 저장수명을 연장하는데 도움을 주어 식품이나 의약품 등의 제조에 많이 사용되고 있다. 또한, 만니톨은 감미도가 설탕의 0.4 내지 0.5배이고, 열량은 설탕의 열량인 4.2kcal/g의 1/3 정도인 1.6kcal/g으로 낮아 대체 감미료로 사용되고 있다. 특히, 김치의 발효 과정 중 과당으로부터 젖산균이 함유하는 만니톨 디하이드로게나아제(mannitol dehydrogenase)라는 효소에 의해 적숙기 이후 생성되는 만니톨은 상쾌하고 부드러운 단맛이 있으므로 김치에서 청량감을 주고 신맛을 억제하여 김치가 과도하게 시어지는 현상을 억제하기 때문에 김치의 맛을 향상시키는데 도움이 된다고 보고되어 있다(비특허문헌 1).
한편, 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 균주는 이형젖산발효균(heterofermentative lactic acid bacteria)으로, 김치의 숙성시 증가하여 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 내는 주된 요인 중 하나이다. 상기 류코노스톡 메센테로이드 균주는 김치 제조시 초기부터 생육을 시작하여 이산화탄소, 젖산, 초산, 에탄올 및 만니톨 등의 대사산물을 생산함으로써 김치를 복합적이고 독특한 풍미를 지닌 상태로 발효시킨다. 또한 생산된 이산화탄소로 하여금 김치 내부를 혐기적 조건으로 유지시켜 호기성 세균의 번식을 강력히 억제시킴으로써 정상적인 김치 발효가 되게 한다고 알려져 있다.
Falguni Patra et al 2011; Seung Hoon Song et al 2009
본 발명의 목적은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주, 상기 균주를 포함하는 유산균 스타터, 상기 균주를 이용한 김치의 제조방법 및 상기 제조방법에 따른 고함량의 만니톨이 함유된 김치를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 고함량의 만니톨이 함유된 김치를 제조하기 위하여 다양한 연구를 진행하던 중 김치로부터 분리한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주가 만니톨 생성능이 우수함을 확인하였고, 김치의 제조방법에 있어서 상기 균주를 스타터로써 첨가하여 상기 제조방법에 따른 김치가 기존의 김치와 비교하여 관능미가 우수할 뿐만 아니라 김치 내 만니톨의 함량과 상기 균주의 생존율이 우수한 김치를 제조할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명의 구성을 상세하게 설명한다.
본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주는 전통발효식품 유래의 류코노스톡 메센테로이드 신규 균주이다. 비록 본 발명에서의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주를 김치에서 분리, 동정하기는 하였으나, 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예를 통해 김치로부터 분리한 만니톨 생성능이 우수한 유산균 균주는 미생물이 동정 및 분류를 위한 16S rRNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 1의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 상기 핵산서열은 NCBI GenBank(http://www.ncbi.nin.gov)에서 제공하는 블라스트 서치 프로그램(blast search program)을 통해 상동성(homology)을 확인해 본 결과, 류코노스톡 메센테로이드 CP000574와 99% 동일함을 확인할 수 있었다.
따라서, SEQ ID NO: 1의 16S rRNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33)로 명명하였으며, 미생물보존센터에 2015년 12월 16일자로 기탁하였다(수탁번호 KFCC11640P).
본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33는 그람양성균이며, 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultive anaerobe)이고, 구균의 형태를 취하고 있다.
본 발명은 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33) 균주를 포함하는 유산균 스타터(starter)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 “스타터(starter)”란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말한다. 본 발명에 있어서, 스타터란 발효식품의 맛을 일정하게 조절하고 우수한 관능미를 가질 수 있을 뿐만 아니라 발효식품 내 만니톨이 고함량으로 함유되도록 제공하는 미생물, 즉 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주를 필수적으로 포함하는 제제를 의미한다.
한 구체예에서, 상기 유산균 스타터는 발효식품의 제조를 위해 사용될 수 있다. 상기 발효식품으로는 김치, 치즈 등의 발효식품이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 김치의 제조시 유산균 스타터로 사용될 수 있으며, 이를 이용하는 경우 김치의 숙성을 일정하게 도와주면서 잘 숙성된 김치의 맛을 장기간 유지할 수 있을 뿐만 아니라 김치 내 만니톨의 함량이 높도록 도와준다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균 스타터는 액상 제제, 분말 제제 등으로 제형화할 수 있으며, 예를 들면 분말 제제로 사용할 수 있다. 분말 제제는 배양된 균주를 원심분리 등의 방법으로 수집하여 동결 건조시켜 수득할 수 있다. 스타터 균주를 발효식품에 첨가하는 경우, 균 배양액에서 분리한 젖은 형태의 균체를 첨가하는 것이 일반적이지만 액상 제형은 보관이 어렵고 유통 중 품질 유지가 어려워 이를 상품으로 유통시키기 어려운 단점이 있다. 반면에, 분말 제제는 공급, 품질 유지 및 사용이 용이하다는 장점이 있다. 상기 스타터는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주 뿐만 아니라, 콩가루, 탈지유(skim milk), 아미노산류, 당류, 당알코올류, 전분 등 통상적으로 스타터에 첨가되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 김치 제조시, 김치 양념소에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroids WiKim33) 균주를 첨가하는 단계를 포함하는, 고함량의 만니톨이 함유된 김치의 제조방법을 제공한다.
상기 김치의 제조방법에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 균주 자체로 첨가되거나 배양물로 첨가될 수 있다. 상기 배양물은 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 농축한 농축액 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 김치라 함은 통상의 김치의 주재료에 양념을 첨가하여 제조되는 당해 분야에서 일반적으로 알려진 것을 통칭하는 것이다. 상기 김치의 주재료와 양념은 제조하고자 하는 김치의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 김치의 주재료는 배추, 무, 갓 또는 열무 등일 수 있고, 양념은 파, 마늘, 생강, 액젓, 설탕, 소금, 고춧가루 등과 같은 재료를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 주재료에 양념이 더해져 제조되는 김치는 배추김치, 갓김치, 무김치, 깍두기 등일 수 있으나, 상기와 같이 김치의 종류를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 따른 김치의 제조방법은 당해 분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의해 제조되는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 김치 양념소는 통상적으로 사용되는 재료를 포함하는 김치 양념소라면 모두 적용할 수 있는 것으로, 포함되는 재료에 제한이 있는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 한 구체예에서, 김치의 제조시 김치의 주 재료를 배추로 한정하였으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 김치의 주 재료는 통상적으로 사용되는 모든 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 김치의 제조방법에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 접종 초기 균수를 기준으로 유산균 수가 105 CFU/g 내지 1011 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있고, 바람직하게는 106 CFU/g 내지 109 CFU/g, 107 CFU/g 내지 108 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있다.
상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 일반적으로 류코노스톡 메센테로이드 균주는 김치의 시원하고 깔끔한 맛을 내는 주된 요인으로, 젖산, 만니톨 등의 대사산물을 생산함으로써 김치의 풍미를 우수한 상태로 발효시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 균주를 김치의 제조에 사용할 경우, 균주가 첨가되지 않은 김치와 비교하여 산도 증가 속도가 완만하고 관능미가 우수할 뿐만 아니라 고함량의 만니톨이 함유된 김치를 제조할 수 있다.
구체적으로, 하기 실시예에서는 김치 제조시 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주를 접종한 김치와 그렇지 않은 김치를 비교한 결과, 상기 균주는 균주를 접종한 김치에서 우점종(dominant species)으로서 발효를 주도하여 산도 값이 낮으면서 만니톨의 함량을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 김치 제조시 상기 균주를 첨가하면 김치의 숙성 초기부터 상기 균주가 발효주도균으로 존재함으로써 김치 내의 만니톨 함량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 우수한 관능미와 고함량의 만니톨 함유 효과를 나타내기 위해 김치 양념소에 분말 제제 또는 액상 제제로 첨가될 수 있다. 상기 균주가 분말 제제로 포함되는 경우, 상기 균주는 김치 양념소 중량 대비 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 배양물과 같은 액상 제제로 포함되는 경우, 김치 양념소 중량 대비 접종 초기 균수 기준으로 105 CFU/g 내지 1011 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있고, 바람직하게는 106 CFU/g 내지 109 CFU/g, 107 CFU/g 내지 108 CFU/g가 되도록 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법으로 김치를 제조할 경우, 앞서 설명한 김치 양념소를 김치의 주 재료인 배추, 무 등에 버무려 통상적인 김치의 제조방법을 통해 고함량의 만니톨이 함유된 김치를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 김치를 제공한다.
본 발명에 따른 김치는 6±0.5℃의 온도 조건에서 28일 동안 발효시킨 경우, 김치 내 만니톨 함량이 2.1%(w/v) 이상일 수 있고, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주의 우점율은 75% 이상일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 김치는 관능미가 우수하고, 김치 내에서 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주가 우점종으로서 존재하며, 김치 내 만니톨 함량이 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 만니톨 생성능이 우수하여 발효식품의 제조를 위한 유산균 스타터로서 유용하게 사용할 수 있고, 상기 스타터를 첨가한 김치는 관능미가 우수할 뿐만 아니라 만니톨 함량이 높고 상기 균주의 우점율이 우수한 김치를 제공할 수 있다.
도 1은 분리 균주 WiKim33의 모양을 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주의 서열목록을 나타낸 것이다.
도 3은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주의 용혈성 여부를 투명환의 생성 여부를 통해 확인한 결과이다.
도 4는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 저장기간에 따른 pH 및 산도 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 미생물 집락을 확인한 결과이다.
도 6은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 저장기간에 따른 김치 내 미생물 군집 변화를 파이로시퀀싱을 시행하여 확인한 결과이다.
도 7은 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주가 첨가된 김치와 첨가되지 않은 김치의 발효기간에 따른 김치 내 만니톨 생성량을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주의 분리
1-1. 유산균주의 분리
전국 6개 지역(경기도, 강원도, 충청도, 전라도, 경상도 및 제주도)에서 담금 직후의 다양한 김치(배추김치, 무김치, 물김치, 기타 등등) 115종을 수집하였으며, 수집된 김치는 6±0.5℃의 조건에서 0주부터 5주까지 저장하면서 유산균 분리를 위한 김치시료로 사용하였다. 상기 김치 500g을 핸드 블렌더(hand blender; Hanil Co, Korea)로 마쇄하여 멸균거즈로 거른 김치액에 멸균수를 추가하여 적정배율로 희석하여, 탄산칼슘(CaCO3)이 2% 첨가된 MRS 배지(Difco Co., France)에 도말하고, 30℃에서 2일간 배양한 다음, 투명환을 형성한 균주를 분리하였다. 상기 분리된 균주에 대해 그람양성(Gram strain kit, BD Co., USA)과 카탈라제 테스트(Biomerieux Co., France)를 수행한 결과, 그람양성이고, 카탈라제 음성인 집락을 유산균으로 잠정적으로 확인하였다. 상기 분리된 유산균주들은 MRS 액체배지에 접종한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 글리세롤이 25%(v/v)가 되게 첨가하여 글리세롤 stock을 만들어 -70℃에서 보관하며 사용하였다.
1-2. 만니톨 생성능이 우수한 유산균주의 선발
1-1에서 분리된 유산균주들은 4%의 과당(fructose)를 첨가한 5mL의 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리(10,000×g, 5min)하여 얻은 상등액을 100℃에서 5분간 가열하였다. 열처리한 상등액은 0.45㎛ syringe filter로 여과하여 배지 내 만니톨(mannitol) 생성량을 분석하는데 사용하였다.
배양액 내 과당 잔존율 및 만니톨 생성율은 HPLC(Waters 2695 eAlliance, Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 당 분석 검출기는 Waters RI detector를 사용하였고, column은 Sugar-pak column (Waters, USA)을 사용하였다. 시료는 20㎕를 주입하였으며, 이동상으로는 H2O(HPLC-grade, Fisher)를 사용하여 0.5mL/min의 속도로 흘려주었다. 만니톨(Mannitol), 포도당(glucose), 과당(fructose)의 표준물질은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 각각 100mg/mL의 농도가 되도록 계산하여 용량 플라스크에 정밀히 취하고 물을 첨가하여 정용하였으며, 물로 희석하여 0.4mg/mL, 0.8mg/mL, 1.6mg/mL, 3.2mg/mL 용액을 검량선 작성용 표준용액으로 이용하였다. 시료 중의 당 농도는 표준물질의 성분과 머무름 시간이 일치하는 피크의 면적값을 해당 표준물질의 표준곡선에 대비하여 정량하였다.
MRS 액체배지 내에 함유된 4%의 과당이 만니톨로 전환되는 양을 측정하고 전환율을 환산하여 만니톨 생성능이 우수한 94개의 균주를 선발하였다.
1-3. 김치액 배지에서 스타터(starter) 가능성 균주의 선발
1) 김치액 배지 제조 및 유산균 첨가 조건
상기 1-2에서 선발된 만니톨 생성능이 있는 유산균주 94종을 대상으로 김치액 배지에 접종하여 6±0.5℃에서 14일간 발효 후 김치액의 발효특성을 조사하였다. 김치액 배지는 하기 표 1의 배합비로 제조된 김치를 블렌더(blender)로 마쇄하여 멸균거즈로 여과하여 얻은 김치액을 사용하였다. 하기 표 1의 절임배추는 배추를 4등분하여 천일염(Shinan, Korea) 염수 16.7%(w/v)에서 5 내지 7시간 동안 실내온도에서 절이고 흐르는 물에 3회 세척하여 4℃에서 12시간 탈수하여 사용하였다.
만니톨 생성 유산균주 94종은 MRS 액체배지에 1% 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 김치액 배지에 각각 1%씩 접종하여 6±0.5℃에서 14일간 배양하면서 유산균 첨가에 따른 김치액의 발효특성을 조사하였다. 대조구로는 유산균을 첨가하지 않은 동일 김치액을 같은 조건으로 발효한 것을 사용하였다.
재료명 중량(g)
절임배추 100
고춧가루 3.75
무 3.75
마늘 3.13
생강 1
파 3.13
멸치액젓 3.75
찹쌀풀 1
설탕 1
물 4.5
2) 유산균 첨가에 따른 김치액 발효특성 분석
만니톨 생성균주 94종의 김치 스타터로서의 가능성을 확인하기 위하여 상기 균주들이 김치 발효에 미치는 영향을 조사하였다. 즉, 94종의 유산균을 각각 첨가하여 6±0.5℃에서 14일간 배양한 김치액의 pH, 산도 및 김치액 내 균총 및 첨가 유산균이 차지하는 비율(우점율)을 확인하였다.
상기 김치액의 pH 측정은 pH meter(Orion 3-star, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 측정하였고, 산도는 AOAC법에 의하여 김치액 10mL를 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3이 될 때까지의 NaOH 용액의 소비량으로 정의하였으며, 이것을 젖산함량으로 환산하여 총산함량으로 표시하였다.
[계산식]
총산량(%) = 0.1N NaOH 용액의 소비량(mL) × 0.1N NaOH 용액의 factor × 0.1N NaOH 용액의 1mL에 상당하는 유기산 계수(젖산의 경우 0.009)
김치액 배지에 첨가한 유산균의 김치 미생물 환경 내 차지하는 우점율을 확인하기 위해 2% CaCO3-MRS 고체배지에서 형성된 유산균 콜로니의 형태 관찰 및 그람 염색하여 광학현미경으로 선별한 후 API kit을 이용한 당 대사능 확인 및 16S rRNA 염기서열의 비교를 통하여 유산균 중 첨가한 유산균의 점유율을 측정하였다.
김치액 발효특성
pH 산도(%) 만니톨 생성량
(mg/mL) 		우점율(%)
대조구
(유산균 비첨가)		 4.10 0.94 10.25 -
WiKim33 4.27 0.87 20.34 92.30
상기 방법으로 만니톨 생성균주 94종을 각각 첨가한 김치액의 발효특성을 확인한 결과, 상기 표 2와 같이 6±0.5℃에서 14일 발효 후 유산균을 첨가하지 않은 대조구 김치액에 비해 산도 값이 낮으면서 김치 내 만니톨 생성량이 많고, 우점율이 높은 유산균 1종(WiKim33)을 최종 선정하였다.
1-4. 김치 내 생존율이 높은 만니톨 생성 유산균주의 동정
상기 1-1 내지 1-3에서 최종 선정된 유산균 WiKim33은 그람염색(Gram stain kit, BD Co., USA), 주사전자현미경(SEM)을 이용한 형태학적 특성 분석, API 50CHL kit(Biomerirux Co., France)을 이용한 생화학적 특성분석 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
상기 형태학적 특성에 대한 분석은 WiKim33의 콜로니의 모양 및 색을 관찰하고, 상기 균주를 그람염색한 후에 광학현미경으로 모양을 관찰하였으며, 그 결과를 표 3 및 도 1에 나타내었다.
특성 WiKim33
그람염색(Gram-stain) 여부 +(양성)
콜로니 형태(Colony morphology) 구균(coccus) & 구형(circular)
콜로니 표면(Colony surface) 매끈함(smooth)
콜로니 색깔(Colony color) 연한 아이보리색(light-ivory)
콜로니 불투명도(Colony opacity) 불투명함(opaque)
상기 표 3 및 도 1에서 보는 바와 같이, 분리 균주인 WiKim33은 그람양성 균주이고, 광학현미경 관찰 결과 구균 형태이며, 콜로니 색깔이 연한 아이보리색을 나타내는 것을 확인하였다.
상기 형태학적 분석에 추가로 생화학적 특성에 대한 분석을 API 50CHL kit을 이용하여 당 대사능을 검토하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
특성 WiKim33 특성 WiKim33
대조구(Control) - Esculine +
Glycerol - Salicine +
Erythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose + Lactose +
Ribose + Melibiose +
D-Xylose + Sucrose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inuline -
β-Methyl-xyloside - Melezitose -
Galactose + Rafinose +
D-Glucose + Startch -
D-Fructose + Glycogen -
D-Mannose + Xylitol -
L-Sorbose - β-Gentiobiose +
Rhamnose + D-Turanose +
Dulcitol - D-Lyxose -
Inositol - D-Tagatose -
Manitol + D-Fucose -
Sorbitol - L-Fucose -
α-Methyl-D-mannoside - D-Arabitol -
α-Methyl-D-Glucoside + L-Arabitol -
N-Acetyl glucosamine + Gluconate +
Amygdaline + 2-Keto-Gluconate -
Arbutin + 5-Keto-Gluconate -
상기 표 4에서 분리 균주 WiKim33의 당 대사능을 확인한 결과, 상기 균주는 과당(fructose)를 당원으로 이용할 수 있는 것을 확인하였다.
또한, 상기 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 동정을 수행하였다. 분리 균주 WiKim33은 순수분리한 후 MRS plate 상태로 냉장택배를 이용하여 마크로젠(서울)에 의뢰하여 primer로 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', SEQ ID NO: 2)와 92R(5'-GGA TACCTTGTTACGACTT-3', SEQ ID NO: 3)의 universal primer set를 사용하여 16S rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.
그 결과, 상기 분리 균주 WiKim33의 16S rRNA로 총 1,480bp의 염기서열을 결정하였으며, 그 결과를 도 2에 SEQ ID NO: 1로 나타내었다.
상기 수행한 염기서열을 기초로 염기서열의 상동성 검사는 GeneBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(http://www.ncbi.nlm.nhi.gov)에 의해 실행하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 CP000574(Leuconostoc mesenteroides CP000574)와 99%의 상동성을 나타내는 것을 통해 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)로 최종 동정하였다.
상기 균주의 형태학적 특성, 당 대사능 및 16S rRNA 염기서열 분석 결과, 만니톨 생성능 및 김치액 내 생존율(우점율)이 우수한 WiKim33 균주는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)로 동정되었고, 그 결과 분리 균주인 WiKim33을 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 2015년 12월 16일자로 기탁하여 수탁번호 KFCC11640P를 부여 받았다.
[실시예 2] 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주의 식품 적용을 위한 안전성 평가
식품 제조 및 발효에 미생물을 식품원료 또는 첨가물로 적용하기 위해서는 안전성이 확보되어야 하며, 이에 안전성 실험으로 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33에 대한 용혈성과 항생제 내성을 확인하였다.
2-1. 용혈성 독성 확인
상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33이 식품에 원료 또는 첨가물로 활용되기 위해서는 인체에 대한 용혈성 독성이 없는 안전성이 요구된다. 따라서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33이 적혈구의 파괴 또는 분해를 유도할 수 있는지의 여부와 관련하여 용혈성 여부를 검사하였다.
상기 용혈성 확인은 7% horse blood(Oxoid, England)가 첨가된 blood 고체배지에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후 균체 주위에 투명환의 생성 여부로 용혈성을 판단하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33은 용혈성 검사에서 균체 주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환이 전혀 생성하지 않아 용혈 반응을 유도하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33은 용혈성과 같은 인체에 대한 유해작용은 없는 것으로 확인되므로 식품에 적용시 안전성이 있는 것으로 확인되었다.
2-2. 항생제 내성 확인
항생제 내성을 지닌 균주는 항생제 저항성 유전자(horizontal transfer)를 플라즈미드에 보유하는 경우가 있고, 이럴 경우 항생제 저항성 유전자의 수평이동이 가능하다. 즉, 항생제 저항성을 가지는 유전자를 보유한 균주를 식품 발효의 스타터나 생균 활성제, 프로바이오틱스로 사용시 항생제 저항성 유전자가 인간에게 이동되거나, 또는 저항성 유전자가 숙주 내의 병원성 균에게 전달되어 숙주의 건강에 해로운 영향을 미치게 된다는 보고에 따라, 최근에는 GRAS 등급의 유산균이라 하더라도 신규 개발 균주의 경우 항생제 내성 특성 조사가 요구되고 있다.
이에, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33에 대해 항생제 종류 별로 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 측정하여 항생제 내성을 조사하였다. 항생제 내성 기준은 EFSA(European Food Safety Authority)의 breakpoint를 기준으로 여러 항생제에 대한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33의 감수성 또는 내성을 판정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
항생제 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC; μg/mL)
Break point for Leuconostoca 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33
앰피실린(Ampicillin) 2 1
반코마이신(Vancomycin) n.r.* >512
젠타마이신(Gentamycin) 16 1
카나마이신(Kanamycin) 16 16
스트렙토마이신(Streptomycin) 64 32
에리트로마이신(Erythromycin) 1 0.125
클린다마이신(Clindamycin) 1 1
테트라사이클린(Tetracyclin) 8 4
클로람페니콜(Chloramphenicol) 4 2
n.r*: 불필요
항생제에 대한 감수성 또는 내성을 EFSA에서 제시한 Leuconostoc에 대한 break point를 기준으로 판정한 결과, 상기 표 5와 같이 항생제 9종에 대하여 감수성을 나타내는 농도는 서로 다르게 나타났으나 EFSA breakpoint보다 낮거나 또는 같은 농도에서 감수성을 보이는 것을 통해 숙주의 건강에 위험을 나타내지 않는 기준의 항생제 저항성을 나타내어 숙주 내 항생제 내성이 없으므로 안전한 것으로 판단되었다.
실시예 3. 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치 제조
3-1. 균주 준비
류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 MRS 액체배지에서 24시간 본 배양한 후 원심분리(10,000×g, 10min)하여 얻은 균체를 멸균수로 2회 세척하여 김치용 스타터로 사용하였다.
3-2. 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치의 제조
실시예 1-1 내지 1-3의 방법으로 절임배추를 제조하고, 표 1과 같이 배합비를 사용하여 김치를 제조하였다. 표 1의 배합비로 제조한 김치양념에 3-1에서 준비한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주를 김치 1g당 107CFU가 되도록 첨가하여, 절임배추와 혼합함으로써 균주 첨가 김치를 제조하였다.
3-3. 균주 비첨가 김치의 제조
대조구로는 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 것을 제외하고는 상기 3-2와 동일한 조건으로 김치를 제조하였다.
[실시예 4] 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치의 발효특성
상기 실시예 3에서 제조된 김치들은 500g씩 pouch pack(polyethylene resin)에 담아 6±0.5℃에서 56일 간 저장하면서 7일 간격으로 발효특성을 확인하였다. 상기 제조된 김치를 이용한 하기 실험은 상기 김치를 7일 간격으로 수득하여, 핸드 블렌더로 2분간 마쇄한 후, 멸균거즈로 여과한 김치액을 이용하여 수행하였다.
4-1. 김치의 pH 및 산도 분석
상기 실시예 3의 방법으로 제조한 김치의 6±0.5℃에서의 발효기간에 따른 김치의 pH 및 산도 변화를 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4는 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 스타터로 사용하여 제조한 김치와 스타터를 사용하지 않은 대조군(균주 비첨가 김치)의 저장기간에 따른 pH 및 산도 변화에 관한 것이다.
도 4에서 보는 바와 같이, 대조군(균주 비첨가 김치)의 pH 및 산도는 발효 0일에 pH 5.67과 산도 0.30%이었으며, 발효 28일과 56일에는 각각 pH 4.15, pH 4.09와 산도 0.96%, 1.05%를 나타내었다. 반면, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 스타터로 첨가한 김치의 pH 및 산도는 발효 0일에 pH 5.67과 산도 0.30%를, 발효 28일과 56일에는 각각 pH 4.25, pH 4.13과 산도 0.86%, 0.98%를 나타내었다. 또한, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 스타터로 첨가한 김치는 발효 28일의 pH와 산도가 균주 비첨가 김치의 발효 56일된 김치와 비슷하였으며, 이를 통해 균주 비첨가 김치에 비해 김치 품질 유지기한 연장효과(약 28일 증가)가 있는 것을 확인하였다.
4-2. 균수 및 우점율 분석
상기 실시예 3에서 제조한 균주 첨가 김치를 6±0.5℃에서 56일간 저장하면서 7일 간격으로, 상기 실시예 1-1 내지 1-3의 방법으로 김치 내 총균수 및 유산균수를 측정하였고, 상기 유산균 중 스타터로 사용한 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33의 우점율을 분석하여 하기 표 6 및 도 5에 나타내었다.
김치 항목 6±0.5℃, 발효기간(일)
0 7 14 21 28 56
균주비첨가 김치 총균 5.22±0.11 7.68±0.04 8.95±0.01 9.09±0.07 8.91±0.07 7.29±0.28
유산균 4.01±0.62 7.69±0.09 8.63±0.44 8.92±0.19 8.65±0.06 7.25±0.21
효모 2.22±0.17 2.03±0.04 1.50±0.28 2.20±0.23 3.50±0.14 3.05±0.64
대장균군 2.66±1.33 3.04±1.85 ND ND ND ND
WiKim33 첨가김치 총균 7.55±0.07 8.73±0.06 8.45±0.44 8.76±0.03 9.27±0.48 7.63±0.04
유산균 7.24±0.05 8.52±0.41 8.45±0.46 8.83±0.02 9.28±0.18 7.39±0.49
효모 2.20±0.17 1.04±0.06 ND ND 0.45±0.21 0.15±0.21
대장균군 2.66±1.33 2.43±0.00 ND ND ND ND
우점율(%) 94.24±0.69 89.26±2.12 94.92±1.25 86.80±3.43 80.19±2.28 81.69±2.38
(단위: log CFU/mL)
ND: 불검출
상기 표 6과 도 5에서 보는 바와 같이, 상기 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치 내 총균수 및 유산균수는 발효 0일에 각각 7.55 log CFU/mL, 7.24 log CFU/mL이었고, 발효 28일에 9.27 log CFU/mL, 9.28 log CFU/mL로 증가한 후, 감소하여 발효 56일에는 7.63 log CFU/mL, 7.39 log CFU/mL를 나타내었다. 상기 유산균 중 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33의 점유율은 6±0.5℃에서 발효 0일에 94.24%를 나타내었으며, 발효 56일까지 81.69%를 유지함으로써 발효기간 내 발효 주도균으로 나타냄을 확인하였다. 한편 균주 비첨가 김치 내 총균수 및 유산균수는 발효 0일에 각각 5.22 log CFU/mL, 4.01 log CFU/mL이었고, 발효 21일에 9.09 log CFU/mL, 4.01 log CFU/mL로 증가한 후, 감소하여 발효 56일에는 7.29 log CFU/mL, 7.25 log CFU/mL를 나타내었다. 상기 도 5 와 같이 균주 비첨가 김치에는 다양한 모양의 집락이 보이는 반면, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치에는 단일 모양의 집락이 존재하는 것을 확인하였다.
4-3. 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 통한 김치 내 미생물 군집 확인
류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치의 저장기간에 따른 김치 내 미생물 군집 변화는 차세대염기서열 분석법(Next Generation Sequencing, NGS)으로 파이로시퀀싱을 시행하여 확인하였다. 즉 김치의 저장기간에 따른 김치 내 미생물 군집 변화를 분석하기 위하여, 김치를 핸드 블렌더로 마쇄하여 김치여액 1mL을 취하고 원심분리(13,000×g, 10min)하여 얻은 균체를 멸균된 생리 식염수로 2회 세척한 후, DNA Prep kit (Quiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 (주)마크로젠에 의뢰하여 454 GS FLX Titanium Sequencing System (Roche, Germany)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다.
파이로시퀀싱 결과는 RDP(version 11)과 이용하여 분석하였다. 파이로시퀀싱 데이터는 예비 여과과정을 통해 서열의 길이가 짧거나 프라이머의 불일치가 있는 시퀀스를 제거한 후, 프라이머의 바코드 서열을 이용하여 시료 별로 분류하였다. 그 다음, RDP pipeline의 키메라 확인(chemera check) 기능을 이용하여 키메라 서열을 제거하고, 분류 결과를 통해 진핵생물, 고세균, 식물 유래 16S rRNA 유전자 서열(클로로플라스트, 미토콘드리아) 들을 각 샘플 별로 제거하였다. 정리된 서열들은 속(genus) level로 분류하여 도 6에 그래프로 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 파이로시퀀싱을 수행한 결과 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 스타터로 첨가하지 않은 김치에는 다양한 군집을 보인 반면, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 스타터로 첨가한 김치는 발효기간이 경과할수록 스타터로 사용한 류코노스톡 속 균주가 우점으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
4-4. 관능평가
상기 실시예 3에서 제조한 김치에 대해 20명을 대상으로 김치의 외관, 향, 맛, 조직감 및 전반적인 기호도를 9점 척도법을 사용하여 평가하였다. 테스트 결과의 유의성 검증은 t-test(p<0.05)에 의해 실시하였다.
김치(6±0.5℃, 14일) 외관 향 맛 조직감 전반적인 기호도
WiKim33 첨가 김치 5.72±1.18* 5.72±1.64* 5.72±1.45* 6.28±1.49* 6.28±1.56*
균주 비첨가
김치		 5.12±1.15 5.45±0.86 5.58±1.26 6.06±1.18 5.78±1.17
상기 표 7과 같이 균주 비첨가 김치와 WiKim33 첨가 김치의 관능평가 결과, 향의 기호도는 비슷하였으나, 조직감, 맛, 외관, 전반적인 기호도는 WiKim33 첨가 김치가 균주 비첨가 김치에 비해 관능적 특성이 더 우수한 것으로 평가되었다.
4-5. 김치 내 만니톨 생성량 분석
상기 실시예 3에서 제조한 김치 내 만니톨 생성량을 분석하여 도 7에 나타내었다. 김치 내 과당 잔존율 및 만니톨 생성율은 HPLC(Waters 2695 eAlliance, Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 김치시료는 6±0.5℃에서 0일, 14일, 28일된 김치를 대상으로 하였으며, 김치를 마쇄하여 얻은 김치여액을 100℃에서 5분간 가열한 후 원심분리(10,000×g, 5min)하고 이로부터 얻은 상등액을 0.45μm syringe filter로 여과한 것을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 상기 실시예 1과 같다.
도 7의 결과와 같이, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치와 균주 비첨가 김치 모두 6±0.5℃에서 발효 0일에는 만니톨이 검출되지 않았으나, 발효기간이 경과함에 따라 만니톨 생성량이 증가하는 경향을 나타내었다. 발효 14일된 김치 내 만니톨량은 균주 비첨가 김치와 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치 모두 약 10mg/mL로 비슷하였으나, 28일된 김치의 만니톨 생성량은 균주 비첨가 김치가 13.38mg/mL가 검출된 반면, 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33을 첨가한 김치 내 만니톨량은 22.4mg/mL로 균주 비첨가 김치에 비해 약 1.7배 높게 생성된 것을 확인할 수 있었다.
한국미생물보존센터(국내) KFCC11640P 20151216
<110> Korea Food Research Institute <120> Leuconostoc mesenteroides WiKiM33 strain and method for preparing kimchi using the strain <130> P16R10C0562 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1480 <212> RNA <213> Leuconostoc mesenteroides WIKIM33 <400> 1 atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg cacagcgaaa ggtgcttgca 60 cctttcaagt gagtggcgaa cgggtgagta acacgtggac aacctgcctc aaggctgggg 120 ataacatttg gaaacagatg ctaataccga ataaaactta gtgtcgcatg acaaaaagtt 180 aaaaggcgct tcggcgtcac ctagagatgg atccgcggtg cattagttag ttggtggggt 240 aaaggcctac caagacaatg atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga 300 ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg ctgcagtagg gaatcttcca caatgggcga 360 aagcctgatg gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaaggcttt cgggtcgtaa agcactgttg 420 tatgggaaga acagctagaa taggaaatga ttttagtttg acggtaccat accagaaagg 480 gacggctaaa tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg tcccgagcgt tatccggatt 540 tattgggcgt aaagcgagcg cagacggttt attaagtctg atgtgaaagc ccggagctca 600 actccggaat ggcattggaa actggttaac ttgagtgcag tagaggtaag tggaactcca 660 tgtgtagcgg tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg 720 gactgcaact gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt 780 agtccacacc gtaaacgatg aacactaggt gttaggaggt ttccgcctct tagtgccgaa 840 gctaacgcat taagtgttcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900 tgacggggac ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960 ttaccaggtc ttgacatcct ttgaagcttt tagagataga agtgttctct tcggagacaa 1020 agtgacaggt ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttatt gttagttgcc agcattcaga tgggcactct agcgagactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggcggggacg acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat ggcgtataca acgagttgcc aacccgcgag ggtgagctaa 1260 tctcttaaag tacgtctcag ttcggattgt agtctgcaac tcgactacat gaagtcggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcacgcgggg ggaaaatgct tcttccgggt tctgtgaaaa 1380 cacccggccc gtcaccacca tgggagtttg taatgcccaa agcccggtgg cctaaccttt 1440 taggaaggag ccgtctaagc aggacagatg actggggtga 1480 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 92R primer <400> 3 ggataccttg ttacgactt 19

Claims (7)

  1. 수탁번호 KFCC11640P의 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33{Leuconostoc mesenteroides WiKim33} 균주.
  2. 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P)균주로 이루어진 것을 특징으로 하는 유산균 스타터.
  3. 김치 제조시,
    김치 양념소에 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주 또는 이의 배양물을 첨가하는 단계를 포함하고,
    상기 김치는 6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 후 2.1%(w/v) 이상의 만니톨을 함유하는 김치의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    류코노스톡 메센테로이드 WiKim33 균주는 접종 초기 균수 기준으로 유산균 수가 105 CFU/g 내지 1011 CFU/g가 되도록 첨가되는 것인 김치의 제조방법.
  5. 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 제조방법에 따른 김치로,
    상기 김치는 6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 후 2.1%(w/v) 이상의 만니톨을 함유하는 김치.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    6±0.5℃에서 28일 동안 발효시킨 김치 내 류코노스톡 메센테로이드 WiKim33(Leuconostoc mesenteroides WiKim33; 수탁번호 KFCC11640P) 균주의 우점율은 75% 이상인 김치.
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