KR100945310B1 - 신경세포사 보호기작을 지니는 신규한 락토바실러스부취너리 ｍｓ와 이를 이용한 감마아미노부틸산의 생산방법 - Google Patents
신경세포사 보호기작을 지니는 신규한 락토바실러스부취너리 ｍｓ와 이를 이용한 감마아미노부틸산의 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치에서 분리된 신규한 락토바실러스 부취너리 MS(Lactobacillus buchneri MS)와 이를 이용하여 감마아미노부틸산(γ-aminobutyric acid) 즉, 가바(GABA)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명에 따른 락토바실러스 부취너리 MS(Lactobacillus buchneri MS)(KCTC 10922BP)는 가바의 생성능이 매우 우수하며 상기 균주의 이러한 특징으로 인해, 신경세포사 보호 및 신경세포 성장 촉진의 기능성을 가지는 상기 균주 및 균주의 배양물은 건강 기능성 식품 등의 다양한 산업적 분야에 이용될 수 있다.
락토바실러스 부취너리 MS, 배양액
Description
도 1은 락토바실러스 부취너리 MS의 16S rDNA 염기서열 목록이고,
도 2는 락토바실러스 부취너리 MS와 16S rDNA 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이며,
도 3은 락토바실러스 부취너리 MS로부터 생산된 가바의 TLC 분석 결과이고,
도 4는 MSG가 락토바실러스 부취너리 MS의 생장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며,
도 5는 MSG가 가바의 생산량과 전환율에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,
도 6은 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에서의 락토바실러스 부취너리 MS의 생육도와 가바의 생산량을 보여주는 그래프이며,
도 7은 MRS 액체배지와 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에서의 pH에 따른 생육도를 보여주는 그래프이고,
도 8은 배양배지의 초기 pH에 따른 락토바실러스 부취너리 MS의 생육도 및 가바의 생산량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이며,
도 9는 배양배지의 NaCl 농도에 따른 락토바실러스 부취너리 MS의 생육도 및 가바의 생산량에 미치는 영향을 보여주는 그래프이고,
도 10은 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에서 락토바실러스 부취너리 MS의 생육을 위한 최적의 조건으로 배양한 경우 락토바실러스 부취너리 MS의 생육도와 가바의 생산량을 보여주는 그래프이며,
도 11은 신경세포사 유발 독성물질에 대한 락토바실러스 부취너리 MS의 신경세포 보호기능을 보여주는 그래프이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 김치에서 분리된 신규한 락토바실러스 부취너리 MS(Lactobacillus buchneri MS)와 이를 이용하여 감마아미노부틸산(γ-aminobutyric acid) 즉, 가바 (GABA)를 생산하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
가바는 아미노산의 일종으로 사람에 있어서는 신경계 및 혈액에 함유되어 있고, 이의 대부분이 골수에 존재하여 신경전달 물질인 아세틸 콜린을 증가시켜 뇌 기능을 증가시켜 뇌 혈류개선, 뇌 대사증진작용, 정신안정, 뇌졸증 등에 효과가 있다고 알려지고 있다. 또한 고혈압 예방효과, 이뇨작용, 간 기능개선작용, 비만방지작용, 알콜대사 촉진작용 등이 알려져 있으며, 특히 뇌졸증 치료제로서 의약품에도 등록되어 있다.
가바는 각종 채소, 과일, 쌀, 콩 등에 널리 분포되어 있는 것으로 알려져 있으나 그 함량이 낮아 생리작용을 나타내기 어렵다. 기존의 가바는 화학 합성 제품이 대부분이어서 식욕부진, 변비, 설사 등 부작용이 우려된다.
미생물에 의한 가바 생성은 이콜라이(E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas), 버섯류, 유산균 등에서의 보고가 있으며[Production of γ-Aminobutyric Acid by Lactic Acid Bacteria. Japan Seibutsu - kogaku . 75:239-244(1997)] 이 중 유산균에 서 가바 생성에 관한 연구로는 일본 소주에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) IFO-12005의 이용[Production of γ-Aminobutyric Acid from Alcohol Distillery Lees by Lactobacillus brevis IFO-12005. Japan Journal of Bioscience And Bioengineering. 93:95-97(2002)], 락토바실러스 카제이 시로타(Lactobacillus casei shirota)를 이용하여 발효요구르트를 개발, 김치에서 락토바실러스 힐가디(Lactobacillus hilgardii) [γ-아미노산을 다량으로 함유한 김치의 제조방법. 대한민국 특허 10-0418687], 류코노스탁 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) DRC0211를 이용한 GABA첨가 김치개발[김치에서 분리한 내산성 류코노스톡 메센테로이드 및 이를 이용한 맛있는 김치의 제조 방법. 대한민국 특허10-0536108] 등이 개발되었고 우리나라의 김치와 젓갈에서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 브레비스 가바 생산균주의 분리보고[A study on γ-Aminobutyric Acid Production by Lactobacillus sakei B2-16, Department of Biotechnolony, Graduate School, Yonsei University. 2002, PP:1-46, Isolation and Identification of Lactobacillus sp. Produced γ-Aminobutyric Acid(GABA) from Traditional Salt Fermented Anchovy. Korean J. Food & Nutr. 14:72-79(2004)] 및 그 외 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 플란타룸( Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lb . reuteri), 락토바실러스 컨퓨서스(Lb . confusus), 락토바실러스 카제이(Lb . casei), 락토코커스 락티 스(Lactococcus lactis), 스트렙토코커스 페이칼리스(Streptococcus faecalis)등으로부터 가바의 생산에 관한 보고가 있다. [유산균에 의해 감마-아미노부틸산이 강화된 발효물의 생산방법과 이를 이용하여 생산된 발효물 및 그의 이용. 대한민국 특허 10-0547018]
전술된 가바의 다양한 생리활성에 관한 선행기술은 주로 식품으로부터 유래된 가바의 생리활성에 관한 것으로 유산균에서 유래된 가바의 생리활성 규명에 관한 보고는 일본에서 보고된 가바 생산 유산균으로 가바 강화 발효유제품을 먹인 쥐에서 혈압강하 효과에 관한 보고와 [Effect of a γ-Aminobutyric Acid-enriched Dairy Product on The Blood Pressure of Spontaneously Hypertensive And Normotensive Wistar-Kyoto rats. Japan British journal of Nutrition. 92:411-417(2004)] 가바 생산 유산균으로 발효유를 만들어 39명의 환자에게 투여하여 혈압이 낮아지는 임상적 효과를 보고한 경우[Blood-Pressure-Lowering Effect of a Novel Fermented Milk Containing γ-Aminobutyric acid(GABA) in Mild Hypertensive. Japan European journal of clinical Nutrition 57:490-495(20 03)] 등이 있다.
이와 같이 가바는 고혈압 예방 및 뇌기능 촉진 등에 효과가 알려지고 건강기능성 식품에 대한 관심과 수요가 증가함에 따라 가바의 산업적 활용은 더 커질 것이며, 유산균에 의한 가바의 생산은 생산단가, 식품의 안전성 및 기호도 측면에서 실용화 및 시장성 가능성이 매우 클것으로 예측된다.
본 발명에서는 김치로부터 가바 생성능이 매우 우수하고 신규한 락토바실러스 부취너리를 분리, 동정하고 이의 최적 배양조건을 확립함과 동시에 본 발명에서의 락토바실러스 부취너리의 배양물은 높은 신경세포사 보호작용과 함께 신경세포 성장 촉진의 기능성을 나타냄을 규명하였다. 본 발명은 가바 생성능을 갖는 신규한 락토바실러스 부취너리(Lactobacillus buchneri) MS 균주 또는 그 배양액과 가바의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 가바(GABA,γ-aminobutyric acid)를 생성하는 신규한 락토바실러스 부취너리(Lactobacillus buchneri) MS 균주를 제공한다.
가바를 생성할 수 있는 다양한 유산균의 속과 종이 알려져 있으나, 락토바실러스 부취너리에 속하는 균주는 아직까지 보고된 바 없다. 그러므로 본 발명의 락토바실러스 부취너리 MS는 가바생성능을 지니는 최초의 락토바실러스 부취너리 균주이다.
본 발명인 락토바실러스 부취너리 MS는 대전광역시 유성구 어은동 52번지 305-333에 위치한 한국생명공학연구원에 2006년 3월 14일 자로 기탁되어, 수탁번호 KCTC 10922BP를 부여받았다.
락토바실러스 부취너리 MS는 김치로부터 분리된 유산균으로 그람양성의 막대형이며 크림색의 매끄럽지못한 집락을 나타내는 균이다. 상기균주의 API 50CHL Kit을 사용한 생화학적 대사 특성과 16S rDNA 염기서열 분석결과, 본 발명의 김치로부터 분리된 락토바실러스 부취너리 MS는 락토바실러스 부취너리( Lactobacillus buchneri) AB 205055와 99% 상동성을 나타내어 락토바실러스 속(species)의 부취너리 종(genus)에 해당하는 균으로 최종 동정되었다.
본 발명의 락토바실러스 부취너리 MS, 이의 배양액, 배양액의 농축액 또는 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) ATCC9341, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC29213, 스트렙토코커스 페이칼리스 ATCC29212, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC25175 등의 그람양성균에서 뿐 아니라 이콜라이 ATCC25922, 이콜라이 O-157, 슈도모나스 에어로기노사(Pseudomonas aeroginosa) ATCC27853, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) ATCC19430 등의 그람음성인 유해한 식중독균에 대하여 항균활성을 지닌다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리된 김치 유산균 락토바실러스 부취너리 MS로부터 가바의 전구체가 함유된 배지에서 가바를 최적 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 부취너리 MS를 이용한 최적 가바 생산 조건은 가바의 전구체인 모노소디움글루탐산(MSG: monosodium glutamic acid)의 농도는 5%이며 MRS(deMan Rogasa Sharpe)액체배지에서 배양시간은 48-72시간이며, 최적 pH는 5.0, 최적 NaCl농도는 1%(W/V), 배양온도는 30℃, 추가로 첨가된 당원(탄소원)으로는 1%(W/V) glucose에서였다.
본 발명의 신규한 락토바실러스 부취너리 MS는 상기의 최적생산조건에서 배양의 251mM(±0.333)의 가바를 생산하며 균주배양 배지에 투여된 가바의 전구체 MSG를 가바로 전환시키는 전환율은 94%로서 기본의 알려진 공지의 다른 가바 생성 균과 비교하여 높은 가바생산 능력을 갖는다.
본 발명인 락토바실러스 부취너리 MS를 이용하여 가바를 생산하는 방법에서 사용배지는 MRS 액체배지를 기본배지로 사용하였다. 본 발명의 방법에 있어서 배양온도는 30℃에서 시행하였고, 가바의 전구체인 MSG는 MRS배지에 1-10%(W/V) 범위에서 사용되었으며 동배지에서 균체증식, 가바의 생산량 및 전환율을 고려하여 MSG 5%농도가 가장 최적의 농도이다. 가바 생산에 필요한 상기균주 락토바실러스 부취너리 MS의 배양시간은 30℃에서 1일부터 7일동안 배양시 배양 48시간(2일)에 정지기에 이르렀고 가바의 생산량은 48시간 이후에 최대 생산을 기록하였으며, 그 이후 거의 같은 값을 유지하여 최적 배양시간은 48-72시간대 임을 알 수 있었다. 배양배지의 초기 pH가 가바생산에 미치는 영향은 초기 pH 5.0-8.0범위가 적당하나 최적 초기 pH는 pH 5.0이었다. NaCl이 가바생산에 미치는 영향은 MRS기본배지에 5% MSG를 첨가한 후 NaCl을 0-7%(W/V) 첨가하였을 때 0-5% NaCl 농도범위에서 가바생산이 잘 이루어졌으나 NaCl 1-3%에서 가바생산량이 보다 더 높았다. 최적 NaCl의 첨가농도는 NaCl 1%(W/V)였다.
본 발명의 방법에 있어, 락토바실러스 부취너리 MS가 가바생산을 증진시키는데 이용되는 탄소는 글루코스, 말토스, 갈락토스, 아라비노스, 락토스, 프락토스 등이며, 이때 사용되는 탄소원의 배지 내 농도에 따라 가바생산이 증진되기도 하지만 오히려 감소될 수도 있다. 즉 글루코스, 락토스는 1-2%(W/V), 말토스, 갈락토스는 2%(W/V), 프락토스는 0.5-1%(W/V), 아라비노스는 0.5-0.6%(W/V)가 가장 바람직한 배지 내 첨가 농도이다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으며 본 발명에서는 발효식품, 기능성 식품 및 가공식품을 포함하는 것을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 생균활성제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90중량 %로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100ml를 기준으로 0.02 내지 20g, 바람직하게는 0.5 내지 10g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젓갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다. 또한, 상기 생균활성제는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하게는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
이하 본 발명의 실시 예를 기재한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[실시 예]
<실시예 1> 김치로부터 가바생산 유산균 분리 및 동정
1-1.
가바
생성 균주의 분리
김치 유산균을 분리하기 위해 맛있기로 유명한 가정집, 식당 등에서 김치를 수집하였다. 유산균총이 변하지 않게 즉시 내용물 전체를 마쇄하고, 여과 후 적정 배율로 희석하여, 락토바실러스 MRS(Difco co., France)배지에 48시간 이상 배양하여 2% CaCO3(Calcium Carbonate, Amresco Inc., USA)가 첨가된 MRS 배지에 tooth picking하여 투명환을 형성하고, 그람양성(Gram stain kit BD Co., USA), 카탈라제(catalase)(Biomerieux., France) 음성인 집락을 유산균으로 잠정 분리하였다. 김치에서 GABA 생성 유산균을 분리하기 위해 1% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 접종하여 48시간 배양 후 TLC를 이용한 GABA 확인을 통하여 6종의 GABA생성균주를 분리하였다. 그 중 GABA 전환율이 가장 높은 최종 1종의 유산균을 선발하고, 이 균주를 MS라 명칭하였다.
1-2.
가바생성
균주의 동정
GABA를 생성하는 분리유산균주 MS를 그람 염색하여 현미경 관찰과 고체배지에 streaking 후 집락 관찰을 통한 형태학적 특성, 당대사능 검증을 통한 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 분자생물학적 특성을 살펴보았다. 16S rDNA 서열결정시 16S rDNA 증폭용 프라이머(primer)는 Forward: 5'-GCGGCGTGCCTAA TACATGCAAGTCG-3', Reverse: 5'-GACCCGGGAACGTATTCACCGCGGC-3'의 프라이머 서열로 사용하였다. 그람 염색결과와 같이 분리균주 MS는 그람 양성의 막대형으로서 카탈라제 음성, 크림색의 매끄럽지못한 집락의 모양을 보였다(표 1). 생화학적 특성은 API 50CHL kit을 사용하여 균체를 30℃에서 24-48시간 동안 배양한 후 양성반응을 보이는 것은 "+"로 음성 반응을 보이는 것은 "-"로 표시하고 반응결과가 양성인지 음성인지 확실하지 않은 경우는 "?"로 나타내었다(표 2). 또한 분리균주의 총 1,384 bp의 16S rDNA 염기서열 상동성 분석 결과 락토바실러스 부취너리 AB 205055와 99% 상동성을 나타내어 최종 락토바실러스 부취너리 MS라 명명하였다. 도 1은 락토바실러스 부취너리 MS의 16S rDNA 염기서열이며 도 2에 분리균주 MS의 16S rDNA 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내었다.
| Characteristics | Isolate MS |
| Gram stain | + |
| Morphology | bacillus |
| Colony | circular |
| Colony surface | rough |
| Colony color | cream |
| Colony opacity | opaque |
| Catalase reaction | - |
| Characteristics | Isolate MS | Characteristics | Isolate MS |
| control | - | esculin | ? |
| glycerol | - | salicine | - |
| erythritol | - | cellobiose | - |
| D-arabinose | + | maltose | + |
| L-arabinose | + | lactose | + |
| ribose | + | melibiose | + |
| D-xylose | + | saccharose | - |
| L-xylose | - | trehalose | ? |
| adonitol | - | inuline | - |
| β-methyl-D-xyloside | - | melezitose | - |
| galactose | + | raffinose | + |
| glucose | + | amidon | - |
| fructose | + | glycogen | - |
| mannose | - | xylitol | - |
| sorbose | - | gentiobiose | - |
| rhamnose | - | D-turanose | + |
| dulcitol | - | D-lyxose | - |
| inositol | - | D-Tagatose | - |
| mannitol | + | D-fucose | - |
| sorbitol | - | L-fucose | - |
| α-methyl-D-mannoside | - | D-arabitol | - |
| α-methyl-D-glucoside | + | L-arabitol | - |
| glucosamine | - | gluconate | + |
| amygdalin | - | 2-keto-gluconate | - |
| arbutine | - | 5-keto-gluconate | + |
<실시예 2> 락토바실러스 부취너리 MS에 의한 가바의 생산 및 특성
2-1.
가바의
정성분석 및 정량분석
분리균주에 의해 생성된 가바의 정성분석은 TLC(Thin Layer Chromatography) 방법을 사용하여 확인하였다. 분리된 균을 1%(W/V) MSG(monosodium-L-glutamate, Yakuri co., Japan)가 첨가된 MRS 배지에 접종하여 30℃에서 48시간 정치배양하였다. 배양액을 원심분리(9,950xg, 3min, 4℃)하여 상징액을 TLC 판(Sigma-Aldrich co., Germany)에 4μl 점적 한 후 acetic acid(Merck co., Germany) : 1-butanol (Junsei co., Japan) : 3차 증류수의 비율을 1 : 4 : 5 (V/V)로 조정한 전개용매에 7 cm씩 두 번 전개하였다. TLC 전개가 끝난 후 분리균주에 의해 GABA가 생산된 경우는 GABA 표준물질(래인 1)과 같은 위치에 점이 나타나게 된다(도 3). 래인(lane) 1은 GABA 표준물질이며, 래인 2는 본 실험에서 사용된 GABA 생산용 배지로서 5% MSG가 첨가된 MRS배지이며, 래인 3은 래인 2의 배지에 김치에서 분리된 균주 AF1을 키운 상징액, 래인 4는 또다른 분리균주 Y3를 키운 상징액, 래인 5는 또다른 분리균주 MS, 래인 6은 또다른 분리균주 S3, 래인 7은 또다른 분리균주 S4, 래인 8은 또다른 분리균주 S5를 키운 상징액을 TLC판에 전개시킨 것이다. TLC 전개가 끝난후 TLC판은 실온에서 건조 후 0.5% 닌하이드린(ninhydrin)(Lancaster co., England) 용액에 담가 가열하여 표준물질 MSG와 GABA spot(standard:γ-aminobutyric acid, Sigma-Aldrich co., Germany)에 대비하여 같은 위치에 GABA spot를 보이는 균주를 GABA 생성 균주로 확인하였다. 도 3에서와 같이 분리균주 MS가 가장 높은 가바 생성 균주로 확인되었으며, 다른 유산균들은 미약하게 GABA를 생산하거나 아예 생성하지 못하는 것으로 나타냈다. 그러므로 이후의 실험은 GABA 생산능이 가장 우수한 락토바실러스 부취너리 MS로 시험하였다.
GABA의 정량분석은 효소 분석 방법을 이용하였다. GABA 트랜스아미나아제(transaminase)는 GABA와 알파케토글루타민산(α-ketoglutarate)을 글루탐산 (glutamate)과 숙신산 세미알데하이드(succinic semialdehyde)로 전환시키고, 생성된 숙신산 세미알데하이드와 NADP+는 숙신산 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinic semialdehyde dehydrogenase)에 의해 숙신산(succinate)과 NADPH가 생성된다. 효소 GABA 트랜스아미나아제, 숙신산 세미알데하이드 디하이드로게나제를 첨가하고, 각각 필요한 기질 알파케토글루타민산, NADP+를 첨가시켜 효소반응 후 생성된 NADPH 양으로 GABA의 양을 측정하였다.
배양 상징액 중에 남아있는 GAD 효소의 불활성화를 위해 메탄올(Methanol, DC chemical, Korea)를 가했다. 흡광도에 영향을 주는 수용성 페놀성 색소는 LaCl3 (Lanthanum Chloride, Sigma-Aldrich Co., Germany)로 침전시켜 제거했고, KOH (Potassium Hydroxide, Junsei Chemical Co., Japan)로 LaCl3를 침전시켜 전처리하였다.
GABA는 알파케토글루타민산(Sigma-Aldrich Co., Germany), NADP (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, Sigma-Aldrich Co., Germany)와 반응하여 NADPH를 생성한다. 한 시간 반응 후 생성된 NADPH를 340nm에서 흡광도를 측정하여 그 증가 값으로 GABA의 함량을 계산하였다. 표준곡선의 공식은 Abs= 0.0030*x(mM)+0.0069 이었으며, R=0.999를 보였다.
2-2. 배양 배지의
MSG
농도에 따른 균체 증식과
가바의
생산
MRS 배지에 첨가한 MSG의 양이 균체의 증식과 그에 따른 GABA 생성에 미치는 영향을 플라스크 정치배양으로 검토하였다. MSG를 각각 1%(W/V)에서 10%(W/V)까지 첨가한 MRS 배지에 30-48시간 전 배양한 분리유산균주를 1% 접종한 후 72시간 배양하여 각각의 흡광도를 600nm(Ultra spec 2100 pro, Amersham Biosciences Co., England)에서 측정하여 균체의 증식을 확인하고, 배양액 중 생성된 GABA를 효소 분석법으로 정량하였다. 실험은 3회씩 2번 반복하여 총 6번의 결과를 평균하여 실험 결과값은 평균값 ± 표준오차로 나타내었다. 도 4에 나타난 것과 같이 MSG 농도에 균체의 증식이 큰 영향을 미치지는 않았지만, 균체 증식은 MSG 3%첨가 시 가장 높았다. GABA의 생산은 MSG 9%첨가 배양에서 가장 높았으나, 첨가해 준 MSG 양에 대비 생산된 GABA의 전환율로 보았을 때 1%에서 전환율은 가장 높고, 차츰 감소하는 경향을 보였다(도 5). 따라서 전체적인 균체의 증식과 GABA의 생산량과 전환율을 고려하여 효과적인 MSG 농도는 5%로 하였다.
2-3. 균체의 생육시기에 따른
가바생산
GABA를 생성하는 분리 유산균주의 성장 단계에 따른 GABA 생성량을 조사하기 위하여 30℃에서 48시간 전배양한 분리유산균주를 5%(W/V) MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 1% 접종한 후 30℃에서 7일간 정치배양하면서 24시간마다 흡광도를 측정하여 균체의 증식을 확인하였다. 배양액은 원심분리하여 상징액을 GABA 정량에 사용하였다. 실험은 4회 반복하여 평균값 ± 표준오차로 표시하였다. 락토바실러스 부취너리 MS를 30℃에서 7일간 정치배양하면서 흡광도와 GABA 생성량을 측정하였을때 (도 6), 생육초기 유도기에서 GABA 생성량은 거의 없었으나, 16시간부터 대수기가 시작되면서 GABA 생성이 시작되었다. 36시간에 정지기에 이르고 48시간 이후 사멸기에 균의 응집현상이 나타나면서 흡광도 값이 약간 감소하였다. 그러나 GABA는 GAD 효소에 의해 MSG가 전환되어 생성되므로 정지기 이후에도 지속적으로 증가하여 48-72시간에 GABA 생성량이 최대가 되면서 그 값을 7일 동안 유지하였다. 균주마다 GAD 활성의 출현 시기가 다른데 락토바실러스 부취너리 MS의 경우 대체로 GABA 생성이 빠른 편이다.
2-4.
가바생산이
락토바실러스
부취너리
MS
생육에 미치는 영향
GABA의 생산이 분리유산균주의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 유산균 배양 배지인 MRS 배지와 5% MSG를 첨가한 MRS 배지에 각각 48시간 전 배양한 락토바실러스 부취너리 MS를 1%씩 접종하여 30℃에서 48시간 배양하면서 4시간마다 균체생육 정도를 측정하였고, 동시에 배양액의 pH를 측정하였다(도 7).
실험은 4회 반복하여 평균값을 사용하였다. 도 7에서 A는 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 부취너리 MS의 균체 생육을 스펙트로포토메타(spectro photometer, Amersham Biosciences)를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정한 것이고, B는 5% MSG를 함유한 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 부취너리 MS의 균체생육을 측정한 것이다. C는 MRS 액체배지에서 락토바실러스 부취너리 MS를 배양시킨 배지의 pH값이고, D는 5% MSG를 함유한 MRS 액체배지에서 배양된 락토바실러스 부취너리 MS를 배양시킨 배지의 pH값이다. 균체 생육정도는 MRS 배지에서나 5% MSG를 첨가한 배지에서나 최종 흡광도 값은 큰 차이가 없었으나, MSG를 첨가하지 않은 배지보다 5% MSG를 첨가한 경우 대수기가 조금 더 빨리 시작되어 급격한 균체의 증식을 보였다. 또한 정지기도 GABA 생성의 경우 28시간으로 약 4시간 정도 빨리 도달하였다. 유산균은 대사과정에서 탄수화물을 혐기적으로 발효하여 젖산을 생성하며 pH를 저하시킨다. 일반적으로 유산균은 균체의 증식과 함께 젖산이 생성되어 대수기 말기부터 정지기 때 배양액의 pH는 약 pH 3.9-4.5 정도까지 내려가는데, 락토바실러스 부취너리 MS를 MRS 배지에 배양하면서 pH를 측정한 결과 대수기가 시작되면서 젖산이 생성되어 pH가 저하되기 시작하여 정지기에 이르러서 pH 4.48로 유지되었다. 그러나 특이하게도 5% MSG를 첨가한 MRS 배지의 배양에서는 균체 배양에 따라 초기 pH 6.25에서 조금씩 감소하여 12시간에 pH 6.07로 최저값을 나타내었고, 그 이후부터는 오히려 pH가 증가하여 48시간에는 pH 7.06에 이르렀다. 이러한 결과는 유산균 배양에서 일반적으로 관찰되는 배양후기의 젖산 등의 유기산 생산에 따라 pH가 계속 감소하는 현상과 상반된 것이다. MSG 첨가 배양 시 GABA 생산균주 배양액의 pH가 상승하는 것은 생산된 GABA 때문인 것으로 생각된다. 즉 산성을 나타내는 글루탐산(glutamate)이 상대적으로 염기를 나타내는 GABA로 다량 전환되어 배지로 유입되어서 배양액에 축적되기 때문에 pH가 상승하는 것으로 생각된다.
2-5.
락토바실러스
부취너리
MS
의 항균 활성
분리유산균주의 항균물질 생산여부를 조사하기 위하여 균체를 직접가하는 direct method[Bacteriocins of gram-positive bacteria. U.S.A American society for microbiology. 40(3):722-56(1976)]와 조항균물질을 paper disk에 가하여 생육저지환을 관찰하는 agar diffusion method[Assay system for bacteriocin, Australia Appl Microbiol. 21(5):943(1971)]를 병행하였다.
Direct method는 지시균이 유산균인 경우 5ml MRS 액체배지에 혐기적으로 전배양된 분리유산균주를 MRS 고체배지에 그은 후 105~6 CFU/ml의 지시균이 함유된 0.75% soft-agar 8ml로 덮은 후 30℃에서 24시간 동안 혐기배양하면서 지시균주에 대한 저지환을 관찰하였다. 호기적인 유해균주를 지시균으로 사용한 경우에는 LB 고체배지 위에 지시균을 105~6 CFU/ml 농도로 도말한 후 직경 5mm로 구멍을 내고 그 구멍에 분리유산균을 105~6 CFU/ml로 soft-agar와 함께 섞어넣었다.
Agar diffusion method는 상기의 방법으로 제조한 조항균물질을 paper disk(diameter 8.00mm, Advantec Co., Japan)에 점적하였다. 지시균이 함유된 soft-agar로 덮은 후 30℃에서 24시간 배양하여, 지시균주에 대한 저해환을 검토하면서 항균생성력의 여부를 관찰하였다. 분리된 유산균의 항균물질 생산능 검증용 지시균으로 유산균으로는 락토바실러스 에시도필러스 KFRI150, 락토바실러스 플란타룸 KFRI464, 류코노스톡 메센테로이드 KFRI218, 류코노스톡 메센테로이드 KCTC1628을 사용하였다. KFRI 균주들은 한국식품연구원(Korea Food Research Institute)으로부터, KCTC는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Biological Resource Center)의 유전자은행으로부터 각각 분양받아 사용하였다. 유해균주로는 바실러스 속, 마이크로코커스 속, 스타필로코커스 속, 살모넬라 속, 슈도모나스 속, 리스테리아 속 등을 사용하였다.
락토바실러스 부취너리 MS로부터의 항균물질은 락토바실러스 에시도필러스 KFRI150, 락토바실러스 델브루에키(Lb . delbrueckii) KFRI347, 락토바실러스 플란타룸 KFRI236, 락토바실러스 플란타룸 KFRI464, 류코노스톡 메센테로이드 KFRI218 그리고 류코노스톡 메센테로이드 KCTC1628 등의 같은 유산균에 대해서뿐만 아니라 식품오염 미생물인 마이크로코커스 루테우스, 슈도모나스 에어로기노사와 분변오염의 지표가 되는 이콜라이속 등에 대해서도 항균활성이 뛰어나 그람 양성, 음성균에서 항균활성을 나타내었다(표 3). 표 3에서 Direct method를 사용하였을 때 항균활성이 있는 경우는 "+"로, 활성이 없는 경우는 "-"로 표시하였다. Disk assay에서는 생육저해환이 보이지 않으면 "-"를 생육저해환의 크기가 9.0-11.9mm 범위이면 "+"로, 12.0-20.0mm 범위이면 "++"로 표시하였다.
락토바실러스 부취너리 MS으로부터의 항균물질은 그람 양성, 음성균에 대해 광범위한 항균활성을 나타내어 식품가공의 이용에 있어서 통조림식품에서의 포자형성균(Bacillus 속)의 제어나 발효유, 발효알콜음료, 유제품 등 여러가지 식품 및 사료에 천연보존제로 사용함으로써 저장성 향상뿐만 아니라 열처리량 감소에 의한 영양적 가치, 맛, 조직감 향상 및 저온성 균, 병원성 균 그리고 부패미생물의 제어에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
| Group | Sensitive indicator | Antimicrobial activity | |
| Direct method | Disk assay | ||
| lactic acid bacteria | Lactobacillus acidophillus KFRI150 | + | ++ |
| Lactobacillus delbrueckii KFRI347 | + | + | |
| Lactobacillus plantarum KFRI236 | + | + | |
| Lactobacillus plantarum KFRI464 | + | ++ | |
| Leuconostoc mesenteroides KFRI218 | + | + | |
| Leuconostoc mesenteroides KCTC1628 | + | + | |
| gram (+) | Bacillus subtilis ATCC6633 | + | ++ |
| Listeria monocytogenes ATCC19113 | - | - | |
| Micrococcus luteus ATCC9341 | + | + | |
| Staphylococcus aureus ATCC29213 | + | + | |
| Streptococcus faecalis ATCC29212 | + | + | |
| Streptococcus mutans ATCC25175 | + | + | |
| gram (-) | Escherichia coli ATCC25922 | + | + |
| Escherichia coli O-157 | + | + | |
| Pseudomonas aeroginosa ATCC27853 | + | ++ | |
| Salmonella typhimurium ATCC19430 | + | + | |
<실시예 3> 가바의 최적 생산 조건
3-1. 배양 배지의 초기
pH
의 영향
배지의 초기 pH가 분리유산균주의 성장과 GABA 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 1N NaOH 또는 1N HCl로 pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0으로 보정한 5%(W/V) MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 분리균주를 1%(V/V) 접종하여 72시간 정치배양 후 흡광도를 측정하고, 생성 GABA를 정량하였다. 실험은 3회 반복하여 평균내었다.
1N NaOH 또는 1N HCl로 pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0으로 보정한 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 30℃에서 3일간 정치배양하여 락토바실러스 부취너리 MS의 생육도와 GABA 생성능을 검토하였다. 실험은 3회 반복하여 평균낸 값이다. 락토바실러스 부취너리 MS는 pH 5.0부터 8.0까지의 범위에서 균체는 잘 생육하였으며, 생육최적 pH는 5.0임을 알 수 있었다. 균의 생육이 높아지거나 낮아지면 이에따라 GABA의 생성도 높아지거나 낮아지게 나타났다(도 8). 넓은 범위의 초기 pH범위에서 균체생육과 함께 높은 GABA생성을 보인 락토바실러스 부취너리 MS는 산업적 활용면에서 가치가 있다.
3-2. 배양 배지의
NaCl
농도의 영향
배지의 NaCl 농도가 균주의 성장과 GABA 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 NaCl을 0, 1, 3, 5, 7%(W/V) 첨가한 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 분리균주를 1%(V/V) 접종하여 72시간 배양 후 균체 생육도를 측정하고 생성된 GABA를 정량하였다. 실험은 3회 반복하여 평균내었다. 락토바실러스 부취너리 MS는 NaCl 0-5%(W/V) 범위에서 잘 생육하였으며 GABA의 생성량도 높았으며, NaCl 1% 첨가시 균체생육과 GABA 생성량이 가장 높았다(도 9). 기존의 대량 GABA 생산 균주의 NaCl 첨가에 의한 영향을 볼 때, 락토바실러스 브레비스의 GAD는 NaCl 첨가에 영향 없고, 락토바실러스 사케이는 첨가한 NaCl 농도에 비례하여 균체량 및 GABA 생성량이 감소하였다는 보고가 있다. 락토바실러스 부취너리 MS의 경우 5% NaCl 첨가 시에도 세포의 성장과 GABA생성량에 크게 영향을 받지 않아 내염성이 우수하다고 볼 수 있다. 그러므로 김치류와 같이 염장처리가 되는 발효식품 등에 적용시 안정적인 GABA 생성을 기대할 수 있다.
3-3.배양 배지의
탄소원의
종류 및 농도의 영향
분리유산균주의 GABA 생산을 위한 최적 탄소원을 선정하기 위하여 대사능이 있는 6가지 당을 0-2%(W/V) 농도로 5% MSG가 첨가된 MRS 액체배지에 첨가하였다. 탄소원이 첨가된 배지에 GABA 생성 분리 균주를 1%(V/V) 접종하여 30℃에서 72시간 정치배양 후 균체생육도를 측정하였고 배양상징액으로 생성 GABA를 정량하였다. GABA의 생성량은 10회이상 실험하여 평균내었다.
락토바실러스 부취너리 MS의 최적 탄소원을 선정하기 위하여 대사능이 있는 6가지 당을 5% MSG를 첨가한 MRS 배지에 0-2%(W/V)범위로 첨가하여 3일간 배양 후 균체증식과 GABA 생성량을 실험하였다. 이때 대조구는 6가지 당 중 어떤것도 첨가하지 않고(0%) MRS배지에 5% MSG만 첨가된 것으로 삼았다(표 4). 균체증식에 가장 큰 효과가 있는 탄소원은 아라비노스였다. 아라비노스를 첨가할수록 균체증식은 월등히 증가하였으나, 특이하게도 GABA의 생성은 반대로 급격히 감소하였다. 나머지 당들의 균체의 증식은 1% 당 첨가 시 말토스 > 글루코스 > 갈락토스 > 프락토스 > 락토스 순이었으며, 2% 첨가 시 증가율은 각각 차이가 있었으나 순서는 1% 경우와 같았다. 또한 GABA의 생성은 1% 당 첨가시 글루코스 > 갈락토스 > 말토스 > 프락토스 > 락토스 순이었으며, 2% 첨가 시 글루코스 > 말토스 > 갈락토스 > 락토스 > 프락토스 순으로 1% 첨가와는 약간 다른 GABA 증가율을 보였다. 이상의 결과로부터 배지에 당을 첨가하여 배양하면 균체의 증식과 GABA의 생성에 여러영향을 미친다는 결과를 얻을 수 있었다.
| 탄소원 | 첨가농도(%) | A 600 ( 균체생육 ) | GABA 함량( mM ) | GABA 전환율(%) | |
| 대조구 | 0.0 | 4.32 | 212.74±10.89 | 79.7 | |
| 아라비노스 | 0.5 | 6.41 | 227.59±3.25 | 85.2 | |
| 0.6 | 6.62 | 231.18±5.24 | 86.6 | ||
| 1.0 | 6.42 | 134.92±25.44 | 50.5 | ||
| 2.0 | 7.26 | 9.48±3.34 | 3.5 | ||
| 프락토스 | 0.5 | 5.09 | 223.64±2.52 | 83.5 | |
| 1.0 | 5.20 | 224.63±12.16 | 84.1 | ||
| 2.0 | 5.54 | 208.67±8.32 | 78.2 | ||
| 갈락토스 | 1.0 | 5.40 | 227.36±9.26 | 85.2 | |
| 2.0 | 6.64 | 232.20±5.69 | 87.0 | ||
| 글루코스 | 1.0 | 5.56 | 234.81±3.76 | 87.9 | |
| 2.0 | 6.70 | 234.61±3.74 | 87.9 | ||
| 락토스 | 1.0 | 4.51 | 219.55±4.00 | 82.2 | |
| 2.0 | 4.25 | 220.00±13.52 | 82.4 | ||
| 말토스 | 1.0 | 5.78 | 225.10±9.88 | 84.3 | |
| 2.0 | 7.04 | 233.86±6.90 | 87.6 | ||
3-4. 최적 배양 조건에서
가바의
생산
상기의 실시 예에 의하여 락토바실러스 부취너리 MS의 최적 가바 생산조건은 5%(W/V)의 MSG, 배양초기 pH는 5.0, 1%(W/V)의 NaCl 첨가, 1%(W/V) 글루코스의 첨가가 된 MRS배지에서 30℃에서 2-3일간 배양에서 얻어짐을 알 수 있었다. 그러므로 상기의 최적 조건에서 5일간 배양하여 이때의 세포생육도와 가바의 생산량을 도 10에 나타내었다. 도 10에서 A는 상기의 최적조건에서 락토바실러스 부취너리 MS를 배양하였을때의 균체 생육도이고 B는 대조구로 MRS 배지에서 5% MSG만을 가하여 30℃에서 균체를 배양한 것이다. C는 상기의 최적조건에서 균체배양 후(A) 그 배양상징액으로부터 GABA를 정량한 것이고, D는 MRS 배지에 5% MSG를 가한(B)조건에서 생산된 GABA를 정량한것이다.
락토바실러스 부취너리 MS를 5% MSG가 첨가된 MRS 배지에서 pH 5.0, NaCl 1%, glucose 1% 첨가하여 30℃에서 정치배양 하였을 때 36시간에 최대균체량 7.267 (표준오차 : ±0.099)을 보였고, 5% MSG를 첨가한 MRS 배지에서 36시간 최대균체량 보다 53% 증가한 값이다. 또한 5일에 최적배지에서 251mM(± 0.333)의 GABA를 얻을 수 있었으며, 이때 전구체 MSG에서 GABA로의 전환율은 94%였다. 5% MSG를 첨가한 MRS 배지에서 GABA 생성량은 215mM(± 0.484)로 최적 배지는 17% 증가율을 보였다.
<실시예 4> 락토바실러스 부취너리 MS 배양물의 신경세포사 보호기능
4-1. 유산균 배양물이
신경세포주에
미치는 영향
신경세포 PC12는 0.5% 말의 시럼(horse serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 함유한 RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute) 배지에서 5% CO2 하의 습도조절 배양기(humidified incubator)에서 37℃에서 배양하였다. 실험에는 계대수가 5 이내인 세포를 사용하였다. PC12 신경세포를 96 well plate에 2 X 105 cell/well로 하루 동안 37℃에서 배양 후, 0.5% 말의 시럼이 함유된 상기의 RPMI 1640 배지로 바꾸어준 후 준비된 유산균 배양액을 처리하여 24시간 배양하였다. 유산균 배양물은 다음과 같이 분리되었다. 락토바실러스 부취너리 MS 배양액을 8,000rpm에서 원심분리 후 0.45μm membrane filteration을 통하여 완전 제균 후 냉동건조시켰다. 냉동건조된 유산균 배양물은 3차 증류수에 100μg/ml 또는 1mg/ml 농도가 되게 녹여 신경세포주 PC12에 처리하였다. MTT(3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(0.5mg/ml)로 4시간 동안 염색 후 well내의 배지를 제거하고, 200μl의 dimethylsulfoxide(DMSO)를 가하여 20분간 흔들어 준 후, ELISA reader(Bio-Tek)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 다음 식에 의하여 구하였다. 이 때 대조구는 아무것도 처리하지 않고 신경세포 PC12만을 배양한 것으로 하였다.
세포 생존율(% 대조구) = 100 X (유산균 배양액이 처리된 세포의 흡광도)/ 대조구의 흡광도
도 11에서와 같이 락토바실러스 부취너리 MS의 배양물을 처리한 구에서는 100μg/ml, 1mg/ml의 두 농도에서 모두 처리하지 않은 대조군보다 오히려 신경세포 성장이 120-140% 이상 촉진되는 것을 확인하였다.
4-2. 신경세포사멸 보호기능
PC12 신경세포는 96 well plate에 2 X 105 cells/well로 하루동안 37℃ 배양 후 0.5% 말의 시럼, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640 배지로 바꾸어 준 후 신경세포 사멸을 일으킬 수 있는 화학물질을 농도별로 첨가한 경우와, 신경세포에 농도별 신경세포유발 화학물질과 유산균 배양물을 100μg/ml, 1mg/ml로 각각 첨가한 경우로 나누어 시험하였다. 이 때 사용된 화학물질은 모두 Sigma- Aldrich 제품을 사용하였다. 이 때 대조구는 신경세포 PC12 자체만을 배양한 경우로 삼았다. 본 실험에서 신경세포 사멸을 유도하기 위해 사용된 화학물질과 그 농도는 50μM, 100μM, 200μM의 H2O2, 1μM, 10μM, 100μM의 Rotenone, 100μM, 500μM, 1mM의 SNP(sodium nitroprusside), 10μM, 1mM, 2mM의 Paraquat, 10mM, 20mM, 40mM의 Dieldrin 그리고 100μM, 250μM, 500μM의 MnCl2였다.
균체를 제외한 GABA 생산-유산균 배양액을 동결건조한 후 여러 농도로 신경세포주인 PC12에 처리한 결과 GABA가 함유된 유산균 배양액을 처리하지 않은 대조군보다 오히려 신경세포가 성장이 촉진되는 것을 확인하였다(도 11). 다양한 방식의 신경세포사를 유발한 실험에서도 GABA함유 유산균 배양물을 전처리 했을때 상당 부분 신경세포사로부터 보호됨을 알 수 있었다(도 11).
신경세포사의 가장 흔한 직접적인 원인이 되는 산화적 스트레스를 H2O2를 통해 주었을때 PC12 세포는 농도에 따라 30-40% 정도 사멸하였으나, 고농도(1mg/ml) 의 유산균 배양물 전처리에 의해 100% 살아남음으로써 기대 이상의 효과를 보여주었다.
유산균 배양물을 전처리하고 미토콘드리아 전자전달계의 complex Ⅰ을 저해하는 rotenone 또는 NO-donor 인 SNP를 처리한 실험에서는 신경보호효과가 없었다.
또한, 환경 독성물질인 paraquat와 manganese chloride에 의한 신경세포사를 고농도(1mg/ml)의 유산균 배양물 전처리가 완전하게 막아주는 결과를 확인하였다.
살충제 성분이면서 파킨슨병을 유발하는 것으로 알려진 dieldrin에 의한 신경세포사는 dieldrin의 농도에 따라 다른 결과를 보였지만 20μM 이하의 dieldrin 농도에 대해서는 고농도(1mg/ml)의 유산균 배양물 전처리가 좋은 효과를 보이는 것으로 확인하였다.
본 발명의 락토바실러스 부취너리 MS는 가바 생성능이 뛰어나고 내염성 및 항균활성의 특징을 지니고 있다. 본 발명에서의 락토바실러스 부취너리 MS는 활용면에 있어 단순히 가바의 생산용 균주로서 뿐만 아니라 식품가공 및 저장시 문제가 되는 포자형성균(Bacillus 속), 병원성 균, 부패세균에 대한 항균 활성은 천연식품보존제로서의 활용도 기대된다. 본 발명에서 상기균의 5%(W/V) NaCl 하에서도 세포성장과 가바생성량이 크게 영향을 받지 않아 김치류와 같이 염장 처리가 되는 발효식품 등에 적용시 발효종균으로서 뿐만아니라, 안정적인 가바 생성 균주로서 발효에 의한 가바 함유 발효식품 등을 생산할 수 있어 산업적 활용가치가 크다고 할 수 있다. 또한 락토바실러스 부취너리 MS의 배양물은 신경세포 성장 촉진 작용과 함께 세포독성 없이 환경독성물질, 산화적 스트레스 원인물질, 살충제, 파킨슨 병 유발물질과 같은 유해 화합물질들로부터 신경세포 사멸을 막아주는 뛰어난 신경세포사멸 보호기능을 지니고 있다. 이와 같이 본 발명에의 균주 락토바실러스 부취너리 MS는 단순한 식품가공이나 저장 유용하게 활용 될 수 있는 발효균주로서 뿐만 아니 라 신경세포사 보호기능 및 신경세포 성장 촉진용 기능성 발효식품의 종균이나 식품 신소재 및 의약 신소재 생산용 균으로서도 가치가 크다.
<110> CHANG, HAE CHOON
<120> LACTIC ACID BACTERIA SEPARATED FROM KIMCHI AND r-AMINOBUTYRIC
ACID PRODUCED THEREBY
<160> 1
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA from Lactobacillus
buchneri MS
<400> 1
gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgcacg cgtctccatt aatgatttta ggtgcttgca 60
tttgaaagat ttaacattga gacgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggtaacctgc 120
ccttgaagta ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca accaaaacca 180
cctggttttg gtttaaaaga cggcttcggc tgtcacttta ggatggaccc gcggcgtatt 240
agcttgttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgatgatac gtagccgacc tgagagggta 300
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360
cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgatgaa gggtttcggc 420
tcgtaaaact ctgttgttgg agaagaacag gtgtcagagt aactgttgac atcttgacgg 480
tatccaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540
aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta ggtctgatgt 600
gaaagccttc ggcttaaccg gagaagtgca tcggaaaccg ggagacttga gtgcagaaga 660
ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720
cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 780
gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc 840
gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcagggt 900
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960
tgctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttctgc caacctaaga gattaggcgt 1020
tcccttcggg gacagaataa caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattgttag ttgccagcat tcagttgggc 1140
actctagcaa gacagccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1200
gccccttatg acctgggcta cacacgcgct acaatggacg gtacaacgag tcgcgaaacc 1260
gcgaggtcaa gctaatctct taaagccgtt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1320
tacatcaagt tggaatcgct agtaatcgtg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1380
ggtc 1384
Claims (7)
- 김치로부터 분리되고 γ-아미노부틸산을 생성하는 락토바실러스 부취너리 MS(Lactobacillus buchneri MS)(KCTC 10922BP) 균주.
- 삭제
- 제 1 항에 따른 균주의 배양액.
- 제 1 항에 따른 균주의 배양액의 농축액.
- 제 1 항에 따른 균주의 배양액의 건조물질.
- 제 1 항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양액의 농축액 및 상기 균주의 배양액의 건조물로 이루어지는 군중에서 선택된 1종 이상을 활성성분으로 포함하는 식품.
- MRS(deMan Rogasa Sharpe)배지에, ⅰ) 5%(W/V) 모노소디움 글루타메이트, ⅱ) 3%(W/V) NaCl, 및 ⅲ) 1-2%(W/V) 글루코스, 1-2%(W/V) 말토스, 0.5-0.6%(W/V) 아라비노스, 2%(W/V) 갈락토스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 탄소원으로 첨가한 배지에서, 제 1 항의 균주를 30℃ 배양온도에서 배양하여 γ-아미노부티르산(GABA, γ-aminobutyric acid)를 생산하는 방법.
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-
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