KR100864006B1 - 김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 - Google Patents
김치로부터 분리된 유산균 및 그의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori)의 요소분해효소(urease) 억제활성이 있으며, 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 서브틸리스 균주, 단구성 리스테리아 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주에 대해서 항균활성을 가진 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei, KFCC 11383P), 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물, 상기 항균조성물을 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것으로, 본 발명의 경우 헬리코박터 필로리를 포함한 위해 미생물에 대한 항균활성이 뛰어날 뿐만 아니라, 산성 환경 및 장내환경에서 생존 가능하여 생균활성제로서 사용이 가능하므로 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.
김치유산균, 헬리코박터 필로리, 항균활성, 생균활성제
Description
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 16S rDNA를 이용한 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori) 억제 활성을 가진 유산균의 동정과정을 나타낸 개략도이고,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 그람 염색 결과를 나타내는 사진이며,
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 16S rRNA의 염기서열이고,
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이며,
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리균에 대한 억제활성을 나타내는 억제환이 생성된 평판배지를 나타내는 사진이고,
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리 균주의 요소분해효소에 대한 억제활성을 나타낸 그래프이며,
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 배양시간에 따른 생육도를 흡광도를 이용하여 측정한 생육곡선이고,
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 배양배지의 NaCl 농도에 따른 생육도를 흡광도를 이용하여 측정한 생육곡선이며,
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 배양배지의 초기 pH에 따른 생육도를 흡광도를 이용하여 측정한 생육곡선이고,
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 단순 산성pH에 대한 내성을 측정한 그래프이며,
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 인공위액에 대한 내성을 측정한 그래프이고,
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 황소의 담즙이 함유된 인공담즙에 대한 저항성을 측정한 그래프이며,
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 안전성 여부를 확인하기 위한 적혈구의 용혈성 시험 결과를 나타낸 사진이고,
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 사케이 SN31의 항암효과를 측정하기 위하여 정상세포와 암세포에 대한 MTT Assay를 시행한 결과를 나타내는 그래프이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 김치로부터 분리된 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei), 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물, 상기 항균조성물을 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것이다.
[종래기술]
헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori,H. pylori)는 만성 활동성 위염, 위십이지장궤양의 원인균이며, 위암과 위점막연관 림프 조직형 위림프종의 중요 인자로 인식되고 있는 균이다(Jung Mogg. Kim. M. D. Current Research on the virnlence Factors of Helicobacter pylori. 대한 소화기학회지 41:77-86(2003); Lee. J. J., S. H. Kim B. S. Chang, J. B. Lee, C. S. Huh, T. J. Kim and Y. J. Beak. The antimicrobial activity of medicinal plants extracts aginst Helicobacter pylori. kor. J. Food Sci. Technol:31:764-770(1999); N. O. Kim, J. G. Kim, J. H. Kim. Risk factors of Helicobacter pylori infection in asymptomatic Korean population. 대한내과학회지 : 제59권 제 4 호(2000)). 헬리코박터 필로리는 1982년 Warren과 Marshall이 위염환자의 위 점막 점액층에서 최초로 분리해서 배양하는데 성공하였고, 1994년에 World Health Organization(WHO)에서 헬리코박터 필로리를 위암의 제1군 발암 인자로 규정하여 그 중요성이 부각되었다. 또한, 헬리코박터 필로리의 병리학적 위장질환에 대한 발병기전을 밝히기 위하여 많은 연구가 이루어지고 있다.
헬리코박터 필로리의 세균학적 특성은 그람 음성균으로 만곡형의 간균형 의(bacillary) 형태를 갖는 것이 일반적이지만, 주위 환경에 따라 형태를 구균형의(coccoid) 형태로 바꾸는 것으로 알려져 있고(H. S. Lee and T. B. Choe. Morphologic conversion of Helicobacter pylori from bacillary to coccoid by environmental Stress. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997;25(3):240-247), 그 길이는 2.5 내지 5.0 ㎛이며, 그 폭은 0.5 내지 1.0 ㎛이고, 30 ㎛ 정도의 단편모(unipolar flagella)가 있어서 운동성이 강한 것으로 보고 되고 있다(Lee. J. J., S. H. Kim B. S. Chang, J. B. Lee, C. S. Huh, T. J. Kim and Y. J. Beak. The antimicrobial activity of medicinal plants extracts aginst Helicobacter pylori. kor. J. Food Sci. Technol:31:764-770(1999)).
헬리코박터 필로리의 특징적 성상은 위벽 상피세포에 군락을 형성하고, 요소분해효소(urease)를 생성하는 것이다. 상기 요소분해효소는 헬리코박터 필로리가 위내 강한 산성의 환경에서도 균 주변의 pH를 중성으로 유지하면서 생존할 수 있도록 한다(B. R. Won, E. H. Song, G. H. Kang, M. W. Chang and Y. H. Yoon. Inhibitory Effect of Lactobacillus heiviticus CU631 on urease and vacuolating toxin activity of Helicobacter pylori J. Anim. Sci & Technol(kor) 2001;43(6):931-940; Young-Je Cho, Sung-Sook Chu, Jeung-Hoan Kim and So-Jung Yoon. Inhibition against Helicobacter pylori and Biological Activity by Rue Extracts. J. Korean Soc Food sci Nutr34(4):460-465 (2005)). 즉, 헬리코박터 필로리가 분비하는 요소분해효소는 주변의 pH를 상승시켜 위액의 강한 산성 조건에서도 헬리코박터 필로리가 생육할 수 있도록 도와주며, 헬리코박터 필로리의 생존 율은 상기 요소분해효소에 의해서 생성되는 암모니아 존재시 증가하는 것으로 보고 되고 있다(C. E. Park, C. H. Park. Inhibition of urease activity of Helicobacter pylori by artemisia asiatica nakai korean J. Biotechnol Bioeng. 2004;19(5):348-351). 헬리코박터 필로리의 감염은 개발도상국에 많으며 10세까지 약 50%가 감염되어 영유아기에 감염률이 높은 반면 선진국에서는 영유아기는 적으나, 나이가 많아질수록 점차 증가되어 약 70%의 유병률을 나타낸다(최종영, 박충상, 양영상, 박수헌, 채현석, 최명규, 정인식, 박두호, 김부성 : 한국에서의 Helicobacter pylori감염의 유병률. 대한내과학회지 1995;47). In vivo에서의 일반적인 헬리코박터 필로리의 제균 방법은 크게 4가지로 구분된다. Bismuth(BIS) 제제를 근간으로 하는 3중 요법, proton pump inhibitor(PPi)를 근간으로 하는 3중 요법, ranitidine bismuth citrate(RBC)를 근간으로 하는 3중 요법 그리고 BIS를 근간으로 하는 3제 요법에 PPi를 추가 하는 4중 요법 등을 사용하고 있다(J. M. Kim, J. S. Kim, H. C. Jung. Antibiotic resistance of Helicobacter pylori isolated from korean patients in 2003. 대한소화기학회지 44:126-135(2004); Jong-Gil Park, Suk-Young Yun, SeJong Oh, Jung-Gul Shin and Young-Jin Bark. Probiotic Characteristics of Lactobacillus acidophilus KY1909 Isolated from Korean Breast-Fed Fufant Korean. J. Food Sci Technol. 35(6):1244-1247(2003); N. Y. Kim. The Effect of Antibiotic Resistance on the Eradication of Helicobacter pylori. 대한소화기학회지 47:82-86(2006)). 위의 약제를 사용한 제균에는 어느 정도 성공을 거두고 있으나, 항생제를 장기간 투여하는 것은 이에 따 른 항생제 내성을 갖는 새로운 균주가 나타나고 사용한 약물에 의한 부작용이 있기 때문에 다른 접근 방식이 요구 되었다(Kobayashi, Y., Tohyama, K. and Terashima, T. Studies on biological characteristics of Lactobacillus: Ⅱ. Tolerance of the multiple antibiotic resistance strain, L. casei PSR3002, to artificial digestive fluids. Jpn. J. Microbiol. 29:691-698(1974)). 따라서 헬리코박터 필로리에 직접적으로 작용하거나, 항생제와 수반된 임상적 부작용을 최소화 시키면서 헬리코박터 필로리에 대한 치료 역할을 할 수 있는 생균활성제 특히, 유산균을 포함하는 생균활성제에 대한 관심이 증대되고 있다.
유산균은 당류를 발효해서 50% 이상 젖산을 생성하는 세균으로, 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물이다. 음식물뿐만 아니라 포유동물의 구강과 소화관, 토양 등 자연계에 널리 분포하고 있다. 또한 식품의 보존과 관능적 특성에도 중요한 역할을 하며, 덱스트란의 제조 및 아미노산, 비타민의 미생물 정량에도 이용되는 등 인간생활에 유익한 균주이다. 유산균이 건강에 좋다는 인식이 확산되면서 유산균 함유 식품을 통하여 건강을 유지하고, 질병을 예방하려는 노력이 증대되었으며, 최근 유산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 프로바이오틱 유산균의 선발기준에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다(Gasser, F. E. Safety of lactic acid bacteria and their occurrence in human clinical infection, Bull. Inst. Pasteur., 1994;92:45-67; Tamine, A. Y. and Robinson, R. K. In Yoghurt : science and technology, 2nd Ed, CRC Press, N. Y., pp.358-360(1999)). 프로바이오틱 유산균으로서 가져야할 가장 중요한 특 성은 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이어야 하고, 동물의 장내에서 생존력이 커야 하며, 대장균이나 살모넬라와 같은 위해 미생물의 생육 억제 능력이 커야 한다는 점이다.
한편, 김치는 특별한 지식 없이도 가정에서 누구나 전래의 보편적인 방법으로 제조 가능한 식품으로, 대표적인 발효식품중 하나이다. 상기 유산균에 대한 연구는 주로 유제품에 대해서 진행되어 왔으며, 오랜 역사에 비해 김치발효과정에 관여하는 유산균에 대해서는 최근에서야 체계적이고 과학적인 연구가 진행되고 있다.
따라서, 우리의 전통 발효음식인 김치발효과정에 관여하는 유산균 중에서 프로바이오틱 유산균 또는 위해 미생물에 대한 항균작용을 할 수 있는 유산균에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
본 발명은 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori)의 요소분해효소(urease) 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 박기 항균조성물을 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori)의 요소분해효소(urease) 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei, KFCC 11383P)를 제공한다. 바람직하게는 상기 균주는 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 서브틸리스 균주, 단구성 리스테리아 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주에 대해서 항균활성을 가진 락토바실러스 사케이 균주(KFCC 11383P)이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 항균조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균조성물을 포함하는 생균활성제(probiotics)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori)의 요소분해효소(urease) 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei)에 관한 것이다. 상기 균주는 바람직하게는 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 서브틸리스 균주, 단구성 리스테리아 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주에 대해서 항균활성을 가진 락토바실러스 사케이 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 사케이 SN31일 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이 균주 SN31(Lactobacillus sakei SN31)은 서울특별 시 서대문구 홍제 1동 361-221번지 유림빌딩에 위치한 한국미생물보존센터에 2007년 2월 27일자로 기탁되어, 수탁번호 KFCC 11383P를 부여 받았다.
상기 락토바실러스 사케이 균주 SN31은 김치로부터 분리한 유산균으로, 그람 양성의 간균이다. 상기 락토바실러스 사케이 균주 SN31의 콜로니는 둥근형이고, 표면은 부드러우며, 크림색을 나타낸다.
16S rDNA 염기서열 분석결과, 본 발명의 분리된 락토바실러스 사케이 균주 SN31은 락토바실러스 사케이 AY204895와 99%의 높은 상동성을 나타낸다.
본 발명인 락토바실러스 사케이 SN31은 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori, H. pylori) 억제 활성 및 헬리코박터 필로리의 요소분해효소 억제활성을 가지고, NaCl 농도 0%에서 5%범위에서 잘 생육하는 내염성을 가지며, pH 5.0에서 pH 10.0의 배지에서도 잘 생육하며 특히 생육 최적 pH가 pH 6.0으로 산성 영역에서 잘 생육한다.
또한, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 산성환경인 pH 3.0으로 조정한 0.05 M 인산 나트륨(sodium phosphate)용액과 펩신(pepsin)을 함유한 인공위액에서 2시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기 균수의 90% 이상을 유지하며 높은 저항성을 나타낸다. 또한 소의 담즙액(oxgall)이 0.3% 및 0.5% 함유된 인공담즙에서도 24시간 동안 초기 균수를 유지하며 높은 담즙액 저항성을 나타냈다.
또한, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 적혈구와 함께 배양한 경우에도 용혈반응이 일어나지 않아 인체에는 무독하다는 것이 확인되었다.
또한, 상기 락토바실러스 사케이 SN31 또는 상기 균주를 배양한 배양배지는 위해 미생물에 대한 항균활성을 갖는다. 상기 균주를 배양한 배양배지는 바람직하게는 상기 균주를 배양한 배양액일 수 있다.
본 발명에서 배양배지란 동물세포, 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체배지 또는 액체배지를 의미하며, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다.
상기 위해 미생물은 일예로 헬리코박터 필로리를 비롯하여, 쿠로토박테리움속 균주(Curtobacterium sp.), 패혈증을 일으키는 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas sp.), 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사 균주(Pseudomonas aeruginosasp), 분변오염의 지표가 되는 대장균(E.coli), 바람직하게는 대장균 O-157 균주(Escherichia coli O-157), 식중독의 원인균인 살모넬라 속 균주(Salmonella sp.), 바람직하게는 살모넬라 타이피뮤리움 균주(Salmonella typhimurium), 리스테리아 속 균주(Listeria sp.), 바람직하게는 단구성 리스테리아 균주(Listeria monocytogenes), 바실러스 속 균주(Bacillus sp.), 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis), 스트렙토코커스 속 균주(Streptococcus sp.), 바람직하게는 대변연쇄구균(Streptococcus faecalis) 또는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 마이크로코커스 속 균주(Micrococcus sp.), 바람직하게는 마이크로코커스 루터스(Micrococcus luteus) 또는 스타필로코커스 속 균주(Stahylococcus sp.), 바람직하게는 황색포도상구균(Stahylococcus aureus)일 수 있다.
바람직하게는 상기 위해 미생물은 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 서브틸리스 균주, 단구성 리스테리아 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 정상세포에 대해서는 세포독성을 가지고 있지 아니한 반면, 암세포, 바람직하게는 위암세포에 대한 항암활성을 가지고 있다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리 억제 활성 및 헬리코박터 필로리의 요소분해효소 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 활성성분으로 포함하는 위해미생물에 대한 항균조성물에 관한 것이고, 바람직하게는 헬리코박터 필로리의 생육을 저해하는 항균조성물에 관한 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이 균주는 바람직하게는 락토바실러스 사케이 SN31(KFCC 11383P)일 수 있다.
본 발명에서 배양배지란 동물세포, 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체배지 또는 액체배지를 의미하며, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 상기 배양액은 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 상기 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 상기 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.
상기 위해미생물이란 헬리코박터 필로리, 쿠로토박테리움속 균주(Curtobacterium sp.), 슈도모나스 속 균주(Pseudomonas sp.), 대장균(E.coli), 살모넬라 속 균주(Salmonella sp.), 리스테리아 속 균주(Listeria sp.), 바실러스 속 균주(Bacillus sp.), 스트렙토코커스 속 균주(Streptococcus sp.), 마이크로코커스 속 균주(Micrococcus sp.) 또는 스타필로코커스 속(Stahylococcus sp.) 균주일 수 있으며, 바람직하게는 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 속 균주, 리스테리아속 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 헬리코박터 필로리 균주, 바실러스 서브틸리스 균주 균주, 단구성 리스테리아 균주 및 쿠로토박테리움속 균주로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주일 수 있고, 가장 바람직하게는 헬리코박터 필로리 균주일 수 있다.
상기 슈도모나스 속 균주는 바람직하게는 슈도모나스 애루지노사 균주(Pseudomonas aeruginosasp)일 수 있고, 상기 대장균은 바람직하게는 대장균 O-157 균주(Escherichia coli O-157)일 수 있으며, 상기 살모넬라 속 균주는 바람직하게는 살모넬라 타이피뮤리움 균주(Salmonella typhimurium)일 수 있고, 상기 리스테리아 속 균주는 바람직하게는 단구성 리스테리아 균주(Listeria monocytogenes)일 수 있으며, 상기 바실러스 속 균주는 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis)일 수 있고, 상기 스트렙토코커스 속 균주는 바람직하게는 대변연쇄구균(Streptococcus faecalis) 또는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)일 수 있으며, 상기 마이크로코커스 속 균주는 바람직하 게는 마이크로코커스 루터스(Micrococcus luteus)일 수 있고, 상기 스타필로코커스 속 균주는 바람직하게는 황색포도상구균(Stahylococcus aureus)일 수 있다.
상기 항균조성물에 포함되는 상기 활성성분의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전제 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 1 내지 75 중량부일 수 있다. 상기 항균조성물에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균조성물을 포함하는 생균활성제를 제공한다.
본 발명에서 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위해서는, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지되어야 한다. 상기 락토바실러스 사케이 SN31(KFCC 11383P)은 위해 미생물에 대한 항균활성을 나타낼 뿐만 아니라, 산성환경, 펩신을 함유하는 인공위액 및 소의 담즙액을 포함하는 인공담즙에 대한 높은 저항성을 나타내고, 적혈구와 함께 배양한 경우 용혈반응이 일어나지 않는 것으로부터 확인되 바와 같이, 인체에 무독하므로 생균활성제로 기능하기 위한 조건을 모두 만족한다.
상기 생균활성제에 포함되는 항균조성물의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는 전제 조성물을 기준으로 0.01 내지 99 중량부, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 90 중량부일 수 있다. 상기 생균활성제에는 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 김치로부터 분리되고 헬리코박터 필로리 억제 활성 및 헬리코박터 필로리의 요소분해효소 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 식품 또는 퍼스널 케어 제품을 제공한다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량 %로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다. 또한, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하기로는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살 균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 퍼스널 케어 제품이란 피부, 머리카락 및 손발톱과 같은 신체에 적용하기 위한 제품을 의미하는 것으로서 샴푸, 컨디셔너, 크림, 로션, 화장품 및 비누를 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 상기 화장품이란 인체를 정결 또는 미화하기 위하여 도찰, 살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 의미하며, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 엣센스, 팩, 유화용 파운데이션 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 외에 본 발명의 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 및 상기 생균활성제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 생균활성제는 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 복합생약제 추출물 100중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<
실시예
1> 헬리코박터
필로리
억제 활성을 가진
유산균주의
분리 및 동정
1-1 헬리코박터
필로리의
억제 활성을 가진
유산균주의
분리
광주·전남 지역의 가정집, 식당 및 사찰 등에서 수집된 김치의 내용물 전체를 마쇄한 다음, 무균적으로 여과하고 멸균수를 추가하여 적정배율로 희석하였다. 상기 희석물을 Lactobailli MRS(Difco Co., France)배지에 24시간 이상 정치배양하였다. 상기 배양물을 이쑤시개를 이용하여 탄산칼슘(CaCO3, Amersco Inc., USA)이 2% 함유된 MRS(Difco Co., France)배지에 접종한 후, 30℃에서 정치배양하여, 투명환을 형성하고, 그람양성(Gram stain kit BD Co., USA), 카탈라아제(Biomrieux Co., France) 음성인 집락(colony)을 유산균으로 잠정적으로 확인하여 분리하였다.
상기 김치로부터 분리되고 유산균으로 확인된 김치유산균주의 헬리코박터 필로리 균주의 생장 억제력 여부는 원판여지법(paper disk 법)을 이용하였으며(정후길, 김응률, 전선락. Helicobacter pylori 생육을 특이적으로 억제하는 유산균 선발. J. Micro 2001;37(2):151-157; Y. S. Yoon, S. H. Lee, N. I. Beak, H. Y. Kim and C. H. Park. Inhibition of Cell Growth and Urease Activity of Helicobacter pylori by Medicinal Plant Extracts. Korean. J. Biotechnol Bioeng. 19(3):187-191(2004)), 상기 원판여지법에 의해 헬리코박터 필로리 균주에 대한 억제능을 가진 유산균을 SN31로 명명하였다.
상기 헬리코박터의 생장 억제력 여부 실험을 위해 사용된 헬리코박터 필로리균은 한국미생물보존센터에서 분양받은 헬리코박터 필로리 균주(KCCM 41756DMF)를 사용하였다. 상기 헬리코박터 필로리 균주의 배양은 10% horse serum(Gibco Co., USA)이 첨가된 brucella(BD Co., France)와 BHI(BD Co., France)를 이용하였다. 상기 헬리코박터 필로리 균주의 배양조건은 CO2 incubator에서 37℃ 및 10%의 CO2 농도 조건으로 24시간 미호기적으로 배양하였다.
1-2 헬리코박터
필로리의
억제 활성을 가진
유산균주의
동정
상기 실시예 1-1에서 분리된 헬리코박터 필로리 균주에 대한 억제능을 보이는 유산균은 그람염색(Gram stain kit, BD Co., USA)을 비롯한 형태학적 특성, API kit(50CHL, Biomrieux Co., France)을 이용한 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
상기 형태학적 특성에 대한 분석은 상기 실시예 1-1의 분리균주를 MRS 액체배지에 접종하여 24시간 혐기배양하고 그람역색한 후에, 광학현미경으로 관찰하여 수행하였다. 또한, 상기 생화학적 특성에 대한 분석은 API 50CHL kit(Biomrieux Co., France)을 사용하여 당 대사능을 검토하여 수행하였다.
또한, 상기 16S rRNA 염기서열 분석을 이용한 동정과정은 도 1에 나타내었다. 상기 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 균주 동정을 위하여 분리균주로부터 염색체 DNA(chromosomal DNA)의 추출은 Genome DNA kit(Q-Biogene, USA)을 사용하였으며, 16S rRNA 염기서열 분석을 위해 사용한 프라이머쌍에 대하여 표 1에서 각각 포워드 프라이머(Forward primer)와 리버스 프라이머(Reverse primer)를 나타내었다.
| Primers | 서열 (5'→3') | 서열번호 |
| LeuP Forward | GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG | 1 |
| LeuP Reverse | GACCCGGGAACGTATTCACCGCGGC | 2 |
중합효소연쇄반응(Polymer Chain Reaction, PCR)은 Palmcycler(Corbett Reaserch, Australia)을 사용하여 수행하였다. 상기 중합효소연쇄반응의 수행 조건을 하기 표 2에 나타내었다.
| 단계(step) | 온도 | 반응시간 |
| First(1st) denaturation | 95℃ | 3 minutes |
| Second(2nd) denaturation | 95℃ | 30 seconds |
| Annealing | 61℃ | 30 seconds |
| Extension | 72℃ | 90 seconds |
| Cycle | go to 2nd denaturation | 30 cycle |
| Final Extension | 72℃ | 10 minutes |
상기 도 1에 나타낸 바와 같이, 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭된 단편은 Qiaquik gel extraction kit(Qiagen Co., Germany)을 사용하여 회수한 후, pGEM-T easy vector(Promega Co., USA)에 ligation하여 재조합 플라스미드(plasmid DNA)를 제조하였다. 상기 제조된 재조합 플라스미드 및 숙주세포(E. coli TG1)을 이용하여 형질전환체를 제조하였으며, 상기 제조된 형질전환체는 항생제인 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/mL)이 함유된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 12시간 평판배양하였다. 상기 암피실린이 포함된 LB 고체배지에 형성된 집락은 50 ㎍/mL의 암피실린이 함유된 LB 액체배지에 37℃에서 12시간 진탕배양하여 Qiaprep spin miniprep kit(Qiagen Co., Germany)으로 plasmid DNA를 추출하였다. 상기 재조합 플라스미드(plasmid DNA)는 제한효소 EcoRⅠ(TaKaRa Co., Japan)으로 절단하여 삽입된 단편의 크기를 확인한 후, 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 상동성 검사는 Gene Bank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(heep://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.chi(2006))에 의해 실행하였다(정후길, 김응률, 전선락. Helicobacter pylori생육을 특이적으로 억제하는 유산균 선발. J. Micro 2001;37(2):151-157; Adams. M. R, Hall C. J. Growth inhibition of food-born pathogens by lactic acid and their mixtures. International. J. Food Sci. Technol. 23:287-292; B. R. Won, E. H. Song, G. H. Kang, M. W. Chang and Y. H. Yoon. Inhibitory Effect of Lactobacillus heiviticus CU631 on urease and vacuolating toxin activity of Helicobacter pylori J. Anim. Sci & Technol(kor) 2001;43(6):931-940).
상기 실시예 1-1의 분리균주인 SN31의 형태학적 분석을 통한 형태학적 특성의 결과를 표 3 및 도 2에 나타내었다.
| 특징 | SN31 |
| Gram 염색(Gram-stain) | + |
| 형태(morphology) | rod |
| 콜리니 형태(colony morphology) | circular |
| 콜로니 표면(colony surface) | smooth |
| 콜로니색깔(colony color) | white color |
| 콜로니 불투명도(colony opacity) | opaque |
상기 표 3 및 도 2에 나타낸 분리균주의 형태학적 분석과 관련하여, SN31은 그람양성의 간균이었고, 콜로니는 둥근형이었으며, 표면은 부드러웠고, 콜로니의 색깔은 크림색이었다.
상기 실시예 1-1의 분리균주인 SN31의 생화학적 특성 즉, 상기 분리균주의 당대사능을 검토한 결과를 표 4에 나타내었다.
| Reaction | SN31 | Reaction | SN31 |
| control | - | Esculine | + |
| Glycerol | - | Salicine | + |
| Erythritol | - | Cellobiose | + |
| D-Arabinose | - | Maltose | - |
| L-Arabinose | + | Lactose | + |
| Ribose | + | Melibiose | + |
| D-Xylose | - | Saccharose | + |
| L-Xylose | - | Trehalose | + |
| Adonitol | - | Inuline | - |
| β-Methyl-xyloside | - | Melezitose | - |
| Galactose | + | D-Raffinose | - |
| D-Glucose | + | Amidon | - |
| D-Fructose | + | Glycogene | - |
| D-Mannose | + | Xylitol | - |
| L-Sorbose | - | β -Gentiobiose | + |
| Rhamnose | - | D-Turanose | - |
| Dulcitol | - | D-Lyxose | - |
| Inositol | - | D-Tagatose | - |
| Mannitol | - | D-Fucose | - |
| Sorbitol | - | L-Fucose | - |
| α-Methyl-D-mannoside | - | D-Arabitol | - |
| α-Methyl-D-Glucoside | - | L-Arabitol | - |
| N-Acetyl glucosamine | + | Gluconate | + |
| Amygdaline | - | 2 keto-gluconate | - |
| Arbutine | - | 5 keto-gluconate | - |
+ : 양성 반응, - : 음성 반응
상기 실시예 1-1의 분리균주인 SN31의 16S rRNA 염기서열 분석과 관련하여, 분리균주 SN31의 경우 총 1,383 bp의 16S rRNA를 결정하였고, 그 결과로 얻은 염기서열을 도 3 및 서열번호 3에 나타내었다. 결정된 SN31의 16S rRNA의 서열분석은 Blast program으로 상동성 검색을 실시하였으며, 그 결과를 기초로 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 분리균주 SN31은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) AY204895와 99%의 높은 상동성을 나타내었다. 상기한 바와 같이, 도 4는 SN31의 경우 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei)로 최종 동정되었다는 것을 나타내며, 그 결과 SN31을 락토바실러스 사케이 SN31로 명명하였고, 서울특별시 서대문구 홍제 1동 361-221번지 유림빌딩에 위치한 한국미생물보존센터에 2007년 2월 27일자로 기탁하여, 수탁번호 KFCC 11383P를 부여 받았다.
<실시예 2> 헬리코박터 필로리 및 요소분해효소 억제 활성 측정
2-1 헬리코박터 필로리 억제활성 측정
상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리 생장 억제력을 조사하기 위하여, 10% horse serum(Gibco Co., USA)이 첨가된 brucella(Difco Co., France) 액체배지에 헬리코박터 필로리 배양액을 1%(v/v) 접종하고, CO2 incubator(Astec Co., Japan)에서 37℃ 및 10%의 CO2 농도 조건으로 24시간동안 배양하였다. 상기 배양은 미호기적인 조건을 맞추어주기 위해 Lacker(Vision Co., Korea)를 사용하여 교반하면서 수행하였다.
상기 배양한 헬리코박터 필로리 배양액을 2배 희석한 후에, 고체배지인 brucella 평판배지에 상기 헬리코박터 필로리 희석 배양액 400 μL를 분주하여 도말한 다음 멸균된 paper disk(Advantec Co., Japan)를 올리고 제균된 유산균 농축 배양여액을 100 μL 분주하였다. 상기 유산균 농축 배양여액을 분주한 후, 상기의 CO2 incubator에서 37℃ 및 10%의 CO2 농도 조건으로 24시간 미호기적으로 배양하여 disk 주위의 억제환의 생성유무를 확인한 후, 억제환의 크기를 측정하였으며, 상기 억제환이 생성된 평판배지를 도 5에 나타내었다.
상기 유산균 농축 배양여액은 변형된 MRS 배지에서 배양된 유산균 배양액을 9,950 x g 및 4℃의 조건으로 5분간 원심분리한 후에, 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과한 배양여액을 동결건조한 후, 농축하여 제조하였다.
상기 변형된 MRS 배지는 통상의 MRS배지 성분 중 sodium acetate, tween 80과 같은 성분이 헬리코박터 필로리의 생육을 억제할 수 있다는 Midolo 등(1995)과 Coconnier 등(1998)의 보고를 참고하여(M. H. Coconnier, et al., Antagonistic Activity against Helicobacter Infection In Vitro and In Vivo by the Human Lactobacillus acidophilus Strain Lb. APPLIED AND ENVIRONENT. MICROBIOLOGY. 4573-4580(1998); P. D. Midolo, et al., In vitro inhibition of Helicobacter pylori NCTC11637 by organic acids and lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology 1995, 79, 475-479(1995)), 본 실험에서는 위의 두 가지 성분을 제외하고, 배지 1 L 당 proteose peptone NO.3 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 10 g, dextrose 20 g, ammonium citrate 2 g, magnesium sulfate 0.1 g, manganese sulfate 0.05 g, dipotassium phosphate 2 g이 포함되도록 조제하였다.
대조구는 락토바실러스 사케이 SN31을 접종하지 않은 상기 변형 MRS배지를 100 μL 분주하였다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군의 경우 억제환의 크기가 증가하지 아니하였으나, 락토바실러스 사케이 SN31의 경우 억제환의 크기가 16.11 mm로 나타나 억제환의 크기가 증가되는 것을 확인하였다. 상기 사실로부터 락토바실러스 사케이 SN31이 헬리코박터 필로리에 억제활성을 가지고 있음을 확인하였다.
2-2 헬리코박터 필로리 요소분해효소의 억제활성 측정
헬리코박터 필로리에 관한여 보고된 생리학적 특성 중 가장 주목할 만한 것은 다량의 요소분해효소 생성능력에 관한 것이다(B. R. Won, et al., Inhibitory Effect of Lactobacillus heiviticus CU631 on urease and vacuolating toxin activity of Helicobacter pylori J. Anim. Sci & Technol(kor) 2001;43(6):931-940). 상기 요소분해효소는 pH를 상승시켜 위액의 강한 산성 조건에서도 헬리코박터 필로리가 생존할 수 있도록 도와주는 것으로 보고 되어 있다. 따라서, 헬리코박터 필로리의 생존율은 요소분해효소에 의해 생성되는 암모니아가 존재하는 경우 증가한다.
상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리에 대한 억제활성을 간접적으로 측정하기 위하여, 헬리코박터 필로리의 요소분해효소의 억제활성을 조사하였다.
상기 헬리코박터 필로리의 요소분해효소의 활성 측정은 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
우선, 헬리코박터 필로리를 BHI(Difco., France) 액체배지에 계대배양 후, 상기 계대배양된 헬리코박터 필로리 배양액 5 mL를 9,950 x g 및 4℃의 조건에서 10분간 원심분리하고 인산완충용액(phosphate buffer saline, PBS)으로 2회 세척 후, 다시 인산완충용액을 가하여 전체 부피를 5 mL로 맞추었다.
상기 인산완충용액으로 현탁시킨 헬리코박터 필로리 배양액을 BHI액체 배지에 2%(v/v)의 농도로 접종하였다. 한편, 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 MRS 액체배지에 접종한 후, 30℃로 24시간 배양하였다. 상기 실시예 2-1과 같이, 상기 배양한 유산균 배양액을 9,950 x g 및 4℃의 조건으로 5분간 원심분리한 후에, 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과시켜 배양여액을 제조하였다. 상기 제조된 배양여액을 상기 인산완충용액으로 현탁시킨 헬리코박터 필로리 배양액 2%(v/v)가 접종된 BHI액체 배지에 10%(v/v) 및 20% (v/v)의 농도로 첨가하고, 상기의 CO2 incubator에서 37℃ 및 10%의 CO2 농도 조건으로 24시간 배양하였다(Adams. M. R, Hall C. J. Growth inhibition of food-born pathogens by lactic acid and their mixtures. International. J. Food Sci. Technol. 23:287-292). 요소를 포함하는 액체배지 2 mL에 상기 헬리코박터 필로리와 유산균 배양여액이 첨가된 배양액을 5%(v/v) 즉, 100 μL를 접종 후 3 시간 동안 30분 간격으로 3번씩 A560에서 Ultro spec 2100pro(Amersham Bioscience Co., England)을 이용하여 흡광도 변화를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다(B. R. Won, et al., Inhibitory Effect of Lactobacillus heiviticus CU631 on urease and vacuolating toxin activity of Helicobacter pylori J. Anim. Sci & Technol(kor) 2001;43(6):931-940; C. E. Park, et al., Inhibition of urease activity of Helicobacter pylori by artemisia asiatica nakai korean J. Biotechnol Bioeng. 2004;19(5):348-351; Hyun-Dong Paik, et al., Characterization of Bacillus polyfermenticus SCD for oral bacteriotherapy of gastrointestinal disorders. Korean J. Food Sci. Technol. 34(1):73-78(2002); M. H. Coconnier, et al., Antagonistic Activity against Helicobacter Infection In Vitro and In Vivo by the Human Lactobacillus acidophilus Strain Lb. APPLIED AND ENVIRONENT. MICROBIOLOGY. 4573-4580(1998)).
대조구는 상기 유산균 배양여액을 첨가하지 않고 헬리코박터 피롤리만 첨가된 배양액을 요소를 포함하는 액체배지 2 mL에 100 μL 분주하였다.
상기 도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 헬리코박터 필로리 배양액에 락토바실러스 사케이 SN31 배양여액을 첨가한 경우, 그렇지 않은 대조구에 비하여 헬리코박터 필로리의 요소분해효소에 대한 활성억제능력이 높아, 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리의 요소분해효소 억제활성이 뛰어난 것으로 확인되었다. 또한, 상기 제조된 배양여액을 10%(v/v)의 농도로 첨가한 경우에 비하여, 20%(v/v)의 농도로 첨가한 경우, 헬리코박터 필로리의 요소분해효소에 대한 억제활성이 2배 이상 향상되는 것을 확인하여 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 헬리코박터 필로리의 요소분해효소 억제활성이 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 농도에 비례한다는 것을 확인하였다.
상기와 같이 상기 헬리코박터 필로리의 요소분해효소에 대한 억제활성이 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 농도에 비례한다는 사실로부터 헬리코박터 필로리의 생육을 억제하는 기작이 요소분해효소의 활성 억제 때문이라고 예상할 수 있었다(E. A. Bae, et al,. Anti-Helicobacter pylori activity of Bifidobacterium spp J. Microbiol. Biotechnol. 2000;10(4):532-534).
<
실시예
3>
락토바실러스
사케이
SN31
의 생육 특성 확인
3-1 배양시간에 따른 생육도
상기 실시예 1-2의 분리균주의 배양시간에 따른 생육도를 조사하기 위하여 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 40시간 정치배양 하면서 매 4시간마다 A600에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 상기 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 분리균주를 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 7에 기재하였다.
상기 도 7에서 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 사케이 SN31은 모두 4시간부터 16시간까지 대수적으로 증가하였으며 16 내지 20시간에서 최대가 되었고, 그 이후에는 정지기로 들어가는 것을 관찰할 수 있었다.
3-2 배지의
NaCl
농도에 따른 생육도
배지의 초기 NaCl 농도가 분리균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, NaCl을 0, 1, 3, 5 및 7%(w/v)로 첨가한 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 정치배양한 후 A600에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 상기흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 분리균주를 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 8에 기재하였다.
상기 도 8에서 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 사케이 SN31은 NaCl 농도 0% 내지 3%범위에서 A600에서의 흡광도가 5.0 이상으로 나타나 상기 NaCl 농도범위에서도 잘 생육하는 것으로 확인되었다. 한편, NaCl 농도 0% 내지 5%범위에서 최적의 생육도를 나타낸 0% NaCl 함유 MRS 배지에서의 생육도의 60% 이상을 나타내었으나, 7% NaCl 농도에서는 생육도의 감소정도가 상기 0%에서 5%범위에 비하여 다소 많아지는 것을 확인할 수 있어, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 0% 내지 5%범위에서 내염성을 나타내는 것으로 확인되었다.
3-3 배지의 초기
pH
에 따른 생육도
배지의 초기 pH가 분리균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 1 N NaOH 또는 1 N HCl로 pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0 및 10.0으로 보정한 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 정치배양한 후 A600에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 상기 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 분리균주를 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 9에 기재하였다.
상기 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 사케이 SN31은 pH 6.0에서부터 pH 10.0까지의 범위에서도 잘 생육하였으며, 생육 최적 pH는 pH 6.0으로 나타나 약산성 영역에서 가장 잘 생육하는 것으로 나타났다.
<실시예 4> 락토바실러스 사케이 SN31의 장내 생존성 및 안전성
4-1.
내산성
및 인공위액 저항성
구강을 통하여 섭취된 균이 최종 목적 부위인 장에 도달하기 위해서는 강산성의 위액을 통과하여 생존해야 한다. 따라서 김치로부터 분리한 락토바실러스 사케이 SN31에 대하여 내산성 시험 및 인공위액 하에서의 시험을 실시하였다.
상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31의 단순 산성 pH에 대한 내성의 측정 즉, 내산성 시험은 1 N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 0.05 M 인산나트륨용액 하에서 수행하였다(Jong-Gil Park et al., Probiotic Characteristics of Lactobacillus acidophilus KY1909 Isolated from Korean Breast-Fed Fufant Korean. J. Food Sci Technol. 35(6):1244-1247(2003)). 산 저항성 여부는 생균수를 측정하였으며, 상기 생균수는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 락토바실러스 사케이 SN31을 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 10에 기재하였다.
인공위액 하에서의 저항성은 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액을 조제하여 실시하였다. 인공위액의 조제는 Kobayashi 등의 방법(Kobayashi, Y. et al., Studies on biological characteristics of Lactobacillus: Ⅱ. Tolerance of the multiple antibiotic resistance strain, L. casei PSR3002, to artificial digestive fluids. Jpn. J. Microbiol. 29:691-698(1974))을 변형한 것 즉, 1 N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체배지(Difco, France)에 펩신(Sigma Co., USA) 1,000 unit/mL가 되도록 첨가하는 방법으로 수행하였다. 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 MRS 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24 시간 배양한 후, 9,950 x g 및 4℃의 조건에서 5분간 원심분리하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 다음 pH 3.0의 0.05 M 인산나트륨용액과 상기에서 제조한 인공위액을 각각 상징액과 동량으로 첨가하여 30℃에서 2시간 배양하였다. 2시간 배양 후 0.05 M 인산나트륨용액과 인공위액으로 처리된 유산균을 멸균수로 10 배씩 101 내지 107배 까지 희석한 후 잘 혼합한 후 고체배지에 100 μL 도말하여 배양하였다. 30℃에서 48시간 배양 후 형성된 집락의 수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 비교하였다. 인공위액에 대한 저항성 여부는 생균수를 측정하였으며, 상기 생균수는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 락토바실러스 사케이 SN31을 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 11에 기재하였다.
대조군은 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 MRS에 접종하여, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 측정한 생균수로 하였다.
상기 도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31은 pH 3.0으로 조정한 0.05 M 인산 나트륨용액과 위액에 대한 내성을 알아보기 위하여 제조된 펩신이 함유된 인공위액에서 2시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기균수(109CFU/mL)의 90% 이상의 생균수를 유지하며 높은 산 저항성 및 위액에 대한 저항성을 나타내었다. 이는 락토바실러스 사케이 SN31이 위에서 생존하여 장으로 이동할 수 있다는 가능성을 제시한 결과라 할 수 있겠다. 순수한 위액의 pH는 1.4 내지 2.0 정도로 거의 대부분 미생물은 여기에서 사멸하게 되지만 섭취한 음식물의 완충작용으로 인해 위의 pH가 높아진다는 것을 고려한다면, 생존율은 더욱 높아질 것으로 판단된다.
4-2. 인공담즙 저항성
락토바실러스 사케이 SN31은 인공위액에서의 높은 생존율로 인해 위를 통과하여 장으로 이동할 수 있을 것으로 예측하였다. 위를 거쳐 장에 도달하기 위해서는 그 전에 췌장과 십이지장을 통과하게 되는데, 이 부위에서는 담즙액이 분비된다. 따라서 최종적으로 장내로 들어오기 위해서는 담즙액에 대한 내성 또한 갖추어야 할 중요한 특성이다. Gilliland 등은 생균활성제로 사용되는 생균이 가져야 할 담즙액에 대한 내성은 황소의 담즙(oxgall)이 0.3% 함유된 배지에서 성장할 수 있다고 보고한바 있으나, 실제로 생균활성제로서의 기능을 정상적으로 수행하려면 장내 담즙의 농도(0.6 g/L)보다 훨씬 많은 황소의 담즙(3.0 g/L)이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가져야 한다(Hyun-Dong Paik et al., Characterization of Bacillus polyfermenticus SCD for oral bacteriotherapy of gastrointestinal disorders. Korean J. Food Sci. Technol. 34(1):73-78(2002)).
인공담즙의 조제는 MRS 액제배지(Difco, France)에 0.45 ㎛filter(Milipore Co.,USA)로 여과 제균된 황소의 담즙(oxgall, Sigma chemical Co., USA) 용액을 0.3% 및 0.5%가 되도록 첨가하였다. 상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31의 인공담즙에 대한 내성은 상기 실시예 4-1의 인공위액에서 2시간 동안 처리하기 전 및 처리한 배양액을 대상으로 이를 9,950 x g의 조건에서 5분간 원심분리하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 후 인공담즙액을 각각 상기에서 제거된 상징액과 동량으로 첨가하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 생균수를 측정하여 인공담즙에 대한 저항성을 비교하였다. 인공담즙에 대한 저항성 여부는 생균수를 측정하였으며, 상기 생균수는 실험에서의 오차를 줄이기 위해, 락토바실러스 사케이 SN31을 각각 3번씩 배양하여 측정하였고, 상기 각각의 측정값의 평균값을 측정결과로 사용하였으며, 상기 측정결과를 도 12에 기재하였다.
대조군은 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 MRS에 접종하여, 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 측정한 생균수로 하였다.
상기 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31은 0.3%(v/v) 및 0.5%(v/v)의 oxgall이 함유된 인공답즙에서 모두 초기균수(108 내지 109 CFU/mL)를 유지하며, 초기균수의 90 내지 100%의 높은 생존율을 나타내었다. 또한, 상기 실시예4-1의 인공위액에서 2시간 처리 후, 0.3%(v/v)의 oxgall이 함유된 인공답즙에서 24시간 처리하여 생존율을 확인한 결과, 초기균수의 70 내지 90%의 높은 생존율을 나타내었다. 상기와 같은 결과로부터, 본 발명인 락토바실러스 사케이 SN31은은 인공위액에 대한 저항성뿐만 아니라, 높은 농도의 담즙액에 대한 생존가능성을 나타내, 생균활성제로서의 기능을 갖추어 목적부위인 장에 도달하여 인체에 정장작용을 할 수 있을 것으로 기대되었다.
4-3
분리균주의
안전성
상기 실시예 1-2의 락토바실러스 사케이 SN31의 인체에 대한 안전성을 측정하기 위하여, 적혈구를 이용하여 용혈성 검사를 시행하였다.
상기 용혈성 검사는 Blood agar base(OXOID., England)를 멸균 후에 7% horse blood(OXOID., England)를 첨가하고 평판배지를 만들고, 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 접종하고 도말(streaking)한 후에, 30℃에서 48시간 배양하여 균체 주위에 투명환의 생성여부로 용혈성을 판단하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
상기 도 13에 나타낸 바와 같이, 용혈성 검사에서 균체 주위에 적혈구가 파괴되어 생기는 투명환을 생성하지 않아, 용혈반응이 일어나지 않은 것으로 확인되었으므로 분리균주를 생균생활성제로 이용할 경우의 안전성이 확인되었다.
<실시예 5> 락토바실러스 사케이 SN31의 항균 활성 측정
상기 락토바실러스 사케이 SN31의 항균활성의 확인은 하기 표 5에 기재한 지시 균주 각각에 대한 생육억제 저해환 확인 실험을 통하여 실시하였다. 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 항균활성을 확인한 실험방법은 균체를 직접 가하는 직접방법(Tagg, T. R., Dajani, A. S. and Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria, 1976) 및 원판여지법(Tagg, T. R., and Mcgiven, A. R. Assay system for bacteriocin. Appl. Microbiol. 21:943, 1971)을 이용하였다.
상기 직접방법은 위해균주를 최종 농도가 1%가 되도록 접종하고 도말하였으며, 상기 도말된 배지에 직경 5 mm로 구멍을 내고 그 구멍에 락토바실러스 사케이 SN31을 soft-agar에 함유시켜 넣어 30℃에서 24시간 배양하여, 위해균주에 대한 저해환을 검토하면서 항균생성력의 여부를 관찰하였다.
상기 원판여지법은 유해균주를 최종 농도가 1%가 되도록 접종하고 도말하였으며, 상기 도말된 배지에 조항균 물질을 원판여지(diameter 8.0 mm, Advantec Co., Japan)에 점적하고 이를 30℃에서 24시간 배양하여, 위해균주에 대한 저해환을 검토하면서 항균생성력의 여부를 관찰하였다.
상기 항균활성을 측정하기 위한, 락토바실러스 사케이 SN31은 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 30℃에서 24시간 계대 배양한 후, 100 mL MRS 액체배지에 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 또한, 상기 배양액을 9,950 x g의 조건에서 20분간 원심부리한 후에, 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과시켜 제균하고, 배양여액을 제조하여 이를 상기의 조항균물질로 사용하였다. 상기의 항균활성은 diamatic caliper (Mitutoyo Co., Japan)로 측정하였다. 또한, 유해균주로는 E.coli O-157외 9 종의 그람 양성 및 그람 음성 균주를 사용하였다.
항균활성은 저해환의 형성 유무에 따라 하기와 같이 구분하였고, 실험결과는 직접방법의 경우 표 5에 나타내었고, 원판여지법의 경우 표 6에 나타내었다.
상기 표 5의 항균활성 표기와 관련하여 '++++'는 저해환의 크기가 16.56 내지 19.43 mm인 것을 의미하고, '+++'는 저해환의 크기가 13.66 내지 16.55 mm인 것을 의미하며, '++'는 저해환의 크기가 10.76 내지 13.65 mm인 것을 의미하고, 상기 표 6의 항균활성 표기와 관련하여 '+++'는 저해환의 크기가 12 내지 13.59 mm인 것을 의미하며, '++'는 저해환의 크기가 10.3 내지 11.9 mm인 것을 의미하고, '+'는 저해환의 크기가 8.5 내지 10.2 mm인 것을 의미하며, '-'는 저해환이 검출되지 아니한 것을 의미한다.
| Group | 지시 균주 | SN31의 항균활성 |
| Gram(+) | Bacillus subtilis ATCC 6633 | ++ |
| Streptococcus faecalis ATCC 29212 | + | |
| Streptococcus mutans ATCC 25175 | + | |
| Micrococcus luters ATCC 9341 | + | |
| Staphylococcus aureus ATCC 29213 | + | |
| Listeria monocytogenes ATCC 19113 | ++ | |
| Curtobcterium sp. Cf 3 | +++++ | |
| Gram(-) | Salmonella typhimurium ATCC 19430 | ++ |
| Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853 | +++ | |
| Escherichia coli O-157 | ++ |
| Group | 지시 균주 | SN31의 항균활성 |
| Gram(+) | Bacillus subtilis ATCC 6633 | +++ |
| Streptococcus faecalis ATCC 29212 | - | |
| Streptococcus mutans ATCC 25175 | - | |
| Micrococcus luteus ATCC 9341 | - | |
| Staphylococcus aureus ATCC 29213 | - | |
| Listeria monocytogenes ATCC 19113 | - | |
| Curtobcterium sp. Cf 3 | - | |
| Gram(-) | Salmonella typhimurium ATCC 19430 | ++ |
| Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853 | ++ | |
| Escherichia coli O-157 | + |
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 직접방법에서는 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 대장균 O-157을 포함한 10종의 공시균주 모두에 대하여 넓은 항균활성을 보였으며, 특히 쿠로토박테리움속 균주와 슈도모나스 애루지노사 균주에 대해서는 강한 항균활성을 보였다.
또한, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 원판여지법에서는 일부 공시균주에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 확인되었으나 살모넬라 타이피뮤리움 균주와 슈도모나스 애루지노사 균주에서 항균활성을 보였으며, 바실러스 서브틸리스 균주에 대해서는 강한 항균활성을 보였다.
상기한 결과는 식품가공 등의 이용에 있어서 유산균체나 그 배양여액을 이용하여 통조림식품에서의 포자 형성균의 제어나 발효유, 발효알콜음료, 유제품 등 여러 가지 식품 및 사료에 천연보존제로 사용함으로써 저장성 향상뿐만 아니라 열 처리량 감소에 의한 영양적 가치, 맛, 조직 감 향상 및 저온성 균, 병원성 균 그리고 부패미생물의 제어에도 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.
<실시예 6> 락토바실러스 사케이 SN31의 항암효과 측정
6-1 대상 세포주의 배양
상기 락토바실러스 사케이 SN31의 항암효과 및 인체안전성을 측정하기 위하여, 위암세포주와 정상세포주를 대상으로 실험을 수행하였다. 상기 위암세포주는 인체 위암 세포주 AGS(ATCC No. CRL-1739)를 사용하였고, 상기 위암 세포주 AGS의 배양은 100 units/mL의 penicilin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640(Hyclone,USA)을 사용하였으며 상기 위암 세포주와 대조군으로 사용하는 정상 세포주는 인체 포낭 정상 세포주 BJ를 사용하였으며(ATCC No. CCL-110), 상기 정상 세포주 BJ의 배양은 100 units/mL의 penicilin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 DMEM(Hyclone,USA)을 사용하였다. 상기 세포의 배양 및 수집은 상기 배지에 접종한 세포를 일주일 동안 3회 refeeding하고 7일째에 PBS로 세척한 후, 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 세포에 배지를 넣고 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합한 다음 7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하는 방법으로 수행하였다. 상기 계대 배양 시 각각의 passage number를 기록하였고, passage number가 10회 이상일 때는 새로운 세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.
6-2
MTT
Assay
에 의한 세포
생존률
측정
MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase 작용을 받아 MTT에 의하여 생성되는 dark blue formazan의 양을 측정하는 방법이다(E. R. Kim, et al., Basic physiological activities of Bifidobacterium infantis Maeil-K9 and Lactobacillus plantarum KCTC3099 selected by anticarcinogenic activities. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 2003;31(4):348-354). Dark blue formazan의 생산량은 대사적으로 활성이 있는 살아있는 세포수와 거의 비례하는 것으로 알려져 세포의 생육과 분화를 측정하는데 아주 효과적으로 사용되고 있다.
상기 MTT assay는 상기 실시예 6-1의 배양된 세포주를 96 well plate에 well 당 2 x 104 cells/mL가 되도록 100 μL씩 분주하고 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 조건으로 배양기에서 세포를 부착시킨 후 상기 락토바실러스 사케이 SN31 배양여액을 일정양으로 첨가하며 48시간 배양하였다. 상기 락토바실러스 사케이 SN31 배양여액은 상기 락토바실러스 사케이 SN31을 30℃에서 24시간 배양한 후, 상기 배양액을 9950 x g의 조건에서 20분간 원심분리한 후에, 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과시켜 제균하여 제조하였다. 상기 첨가된 배양여액을 3, 4, 5 및 6 μL의 양으로 첨가하였다. 상기 배양된 세포에 인산생리식염수에 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT용액 20 μL를 첨가하여 동일한 배양조건에서 4시간 동안 더 배양하였다. 상기 추가 배양 후, 생성된 formazan결정을 DMSO 200 μL에 녹여서 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 상기 도 14에서는 각 세포의 유산균 배양 상징액 무첨가구(대조구)를 100%로 하여 상대적인 세포 성장률을 구한 값을 나타내었다.
한편, 상기 도 14에서 알 수 있듯이, 정상세포 BJ와 위암세포 AGS에서의 유산균 배양 배지인 MRS broth의 첨가량이 5 μL부터 세포 증식 저하에 다소 영향이 있음이 확인되었다. 이러한 결과는 시험관내 실험(in vitro test)의 특성상 각 세포에 대한 유산균 배지 성분의 삼투압에 의한 세포증식 저하작용이 일어난 것으로 판단되었다. 상기와 같은 결과로부터, 정상세포 BJ와 위암세포 AGS에 대한 세포증식 저하에 MRS broth사용에 의한 배지 삼투압작용이 있음을 고려하여 정상세포 BJ와 위암세포 AGS 대한 각각의 분리 유산균 배양여액의 첨가량도 최대 6 μL가 넘지 않도록 조절하였다.
상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 정상세포 BJ에서는 낮은 세포 성장 저해율을 나타내어 BJ에 대한 락토바실러스 사케이 SN31의 세포독성이 거의 없음이 확인되었다. 즉, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 정상세포 BJ에 대하여 각각 그 배양 상징액을 3 μL 내지 6 μL첨가 시, 80% 이상의 정상세포 BJ에 대한 생존력을 나타내었다.
한편, 상기 도 14에 나타낸 바와 같이, 위암세포 AGS에 대한 생육 억제 활성을 측정한 결과 분리 유산균 배양 상징액의 첨가량이 증가될수록 살아있는 위암세포 AGS의 수가 정상세포 BJ보다 상대적으로 적은 것으로 나타났다. 즉, 상기 락토바실러스 사케이 SN31은 위암세포 AGS에 대하여 각각 그 배양 상징액을 3 μL 내지 6 μL첨가 시, 최대 79%의 억제력을 나타내었다. 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 배양여액은 정상세포인 BJ의 생육에는 큰 영향을 미치지 않으면서 위암세포인 AGS에는 특이적으로 세포 생육을 크게 저해시키는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 상기 락토바실러스 사케이 SN31의 배양물이 안전하면서도 강력한 항암활성을 지니고 있음을 잘 나타내는 결과이다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 사케이 SN31은 산성 조건 및 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성이 높을 뿐만 아니라 헬리코박터 필로리를 포함한 다양한 위해 미생물에 대한 항균활성을 가짐으로써 생균활성제로 활용할 수 있고, 또한, 정상 세포주의 세포 생육에는 영향을 미치지 아니하면서도 암 세포주 특히, 위암 세포주를 저해하므로, 암의 예방과 관련된 다양한 식품 및 의약품에 사용될 수 있어 산업적 이용가치가 매우 크다할 것이다.
<110> CHANG, HAE CHOON
<120> LACTIC ACID BACTERIA SEPARATED FROM KIMCHI AND USES THEREOF
<130> DPP20070410KR
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LeuP forward primer
<400> 1
gcggcgtgcc taatacatgc aagtcg 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LeuP Reverse rDNA
<400> 2
gacccgggaa cgtattcacc gcggc 25
<210> 3
<211> 1383
<212> DNA
<213> Lactobacillus sakei SN 31 16S rDNA
<400> 3
gacccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccggcttca 60
tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaatggt tttaagagat tagctacctc 120
gcggtctcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg 180
gcatgatgat ttgacgtcgt ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tctcactaga 240
tctcactaga gtgcccaact taatgctggc aactagtaat aagggttgcg ctcgttgcgg 300
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactttg 360
tccccgaagg gaaagctcta tctctagagt ggtcaaagga tgtcaagacc tggtaaggtt 420
cttcgcgttg cttcgaatta cttcgaatta tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc 480
ctttgagttt caaccttgcg gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgcg 540
gcactgaagg gcggaaaccc tccaacacct agcactcatc gtttacggca tggactacca 600
gggtatctaa tcctgtttgc tacccatgct ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga 660
cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga 720
gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc ttcggttgag 780
ccgaaggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc 840
cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt 900
tctggttgga taccgtcact acctgatcag ttactatcag atacattctt ctccaacaac 960
ctccaacaac agagttttac gatccgaaaa ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc 1020
agactttcgt agactttcgt agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc 1080
ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg attaccctct caggtcggct 1140
atgcatcacg gtcttggtga gcctttacct caccaactaa gcgggtccat cctaaagtga 1200
tagccgaaac catctttcaa ccctacacca tgcggtgtta ggttttatgc ggtattagca 1260
tctgtttcca aatgttatcc cccactttag ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc 1320
cgccactcac tcaaatgttt atcaatcagg agcaagctcc ttcaatctaa acgagagtgc 1380
gtt 1383
Claims (6)
- 김치로부터 분리되고, 바실러스 서브틸리스 균주(Bacillus subtilis), 단구성 리스테리아 균주(Listeria monocytogenes), 쿠로토박테리움속 균주(Curtobacterium sp.), 슈도모나스 애루지노사 균주(Pseudomonas aeruginosasp), 대장균 O-157 균주(Escherichia coli O-157), 살모넬라 타이피뮤리움 균주(Salmonella typhimurium), 대변연쇄구균(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 마이크로코커스 루터스(Micrococcus luteus) 및 황색포도상구균(Stahylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주에 항균활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei, KFCC 11383P).
- 제 1 항에 있어서, 상기 락토바실러스 사케이 균주는 추가로 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주에 항균활성이 있고, 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 균주의 요소분해효소(urease) 억제활성이 있는 락토바실러스 사케이 균주(Lactobacillus sakei, KFCC 11383P).
- 제 1 항 또는 제2항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 활성성분으로 포함하는 항균조성물.
- 제 3 항의 항균조성물을 포함하는 생균활성제(probiotics).
- 제 1 항 또는 제2항의 균주를 포함하는 식품.
- 제 1 항 또는 제2항의 균주를 포함하는 퍼스널 케어 제품.
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