KR100878799B1

KR100878799B1 - 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 ｋ317

Info

Publication number: KR100878799B1
Application number: KR1020070024566A
Authority: KR
Inventors: 장영효; 정민영; 이문수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-03-13
Filing date: 2007-03-13
Publication date: 2009-01-14
Also published as: KR20080083840A; US9080219B2; US20100021576A1; WO2008111719A1; WO2008111719A8

Abstract

본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317에 대한 것으로, 상세하게는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액, 이로부터 분리한 항균 대사물질은 메티실린 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물인 Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis의 생장을 효과적으로 억제하며 항균 능력을 보이므로 항생제 내성 병원성 미생물 및 장내 유해 미생물을 대상으로 하는 생장 억제용 조성물, 건강식품 및 프로바이오틱스로 유용하게 이용될 수 있다.

항생제 내성 병원성 미생물, 메티실린, 장내 유해 미생물, 프로바이오틱스.

Description

항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 Ｋ317{Bacillus amyloliquefaciens K317 for suppressing the growth of antibiotics-resistant pathogenic microorganism or enteropathogenic microorganism}

도 1은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K317 균주를 분리하기 위한 항생제 내성 병원성 미생물의 생장억제 실험 결과이다.

도 2는 16S rRNA 서열을 바탕으로 한 본 발명의 K317 균주와 기존 균주 간의 계통발생적 분지도(phylogenetic tree)이다.

도 3은 MRSA(methicillin-restistent Staphylococcus aureus) 30 균주에 대한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 항균력 실험 결과이다.

도 4는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주와 MRSA 균주를 혼합배양한 후 생장억제를 관찰한 실험 결과이다.

도 5는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 장내 유해 미생물에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 6은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 1, MRSA 2, MRSA 3, MRSA 4, MRSA 5에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이 다.

도 7은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 6, MRSA 7, MRSA 8, MRSA 9, MRSA 10에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 8은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 11, MRSA 12, MRSA 13, MRSA 14, MRSA 15에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 9는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 16, MRSA 17, MRSA 18, MRSA 19, MRSA 20에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 10은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 21, MRSA 22, MRSA 23, MRSA 24, MRSA 25에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 11은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액의 희석 농도별로 MRSA 26, MRSA 27, MRSA 28, MRSA 29, MRSA 30에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 12는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액으로부터 분리해낸 희석 농도별, 배양시간대 별로 MRSA 1 및 MRSA6에 대한 생장억제를 나타낸 그래프이다.

도 13은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액 내 항균 대사 물질의 MRSA에 대한 항균력을 관찰한 결과이다.

본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액, 이로부터 분리한 항균 대사물질에 대한 것이다.

병원성세균 중 현재 전 세계적으로 가장 문제시 되고 있는 황색포도구균(Staphylococcus aureus)은 전체 인구의 약 30%에서 검출되는 그람양성구균으로, 병원 내 감염증을 유발하는 병원체로 널리 알려져 있다(Isabel C.V, Robert S.K., Francisco A.K., J. Am . Acad . Dermatol. 50:845-849, 2004). 상기 세균은 일차적으로 피부와 연부조직에 감염을 일으켜 농피증(pyoderma)의 원인이 되고, 골수염, 심내막염, 패혈증과 균혈증 등 생명을 위협하는 중한 전신 감염증을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Henry Shinefield, M.D. et al ., The New England J. of Med. 346:491-496, 2002). 페니실린(Penicilin), 메티실린(methicillin) 등 포도상구균 항균제는 그 효과가 우수하여 지난 수십년 간 본 감염증의 주요 치료약제로 사용되어 왔으나, 1961년 영국에서 메티실린에 내성을 보이는 균주(methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)가 처음 보고된 이후 전 세계적으로 지속 적인 증가 추세를 보이고 있다(Standing Medical Advisory Committee, Department of Health, 1998).

우리나라에서도 항생제의 무분별한 오남용으로 인한 내성 균주 출현은 특히 문제가 심각하여 메티실린 내성율은 50% 내외로 매우 높으며, 대한병원 감염관리학회가 최근 조사한 결과에 따르면 대부분의 대학병원과 종합병원에서 분리되는 MRSA 균주는 70～80%에 이른다고 한다. 이러한 문제점이 대두되면서 위생학적으로 안전하고 효과적인 치료제의 개발이 절실한 실정이다.

최근 출원된 항생제 내성균 억제 관련 특허로는 토양에서 분리한 스렙토마이세스 레이드로진스(Streptomyces laidlogenes) DS684(대한민국 특허출원 제 2004-55648)는 메티실린과 반코마이신 내성균주의 억제효능이 있다고 보고되었으며, 락토바실러스 루미니스(Lactobacillus ruminus) SPM0211(대한민국 제 654370호)균주가 반코마이신 내성균주의 억제효능이 있는 것으로 보고되었다.

프로바이오틱스(probiotics)는 장내 미생물 균형에 도움을 주는 미생물, 항균 활성과 효소 활성을 가진 미생물, 및 그들이 생산해 내는 생산물을 말한다(Fuller, R. J Appl Bacteriol . 66(5):365-378, 1989). 아울러 프로바이오틱스는 사람이나 동물에 건조된 세포형태나 발효 산물 형태로 공급되어 사람이나 동물 숙주의 장내 균총을 개선함으로서 좋은 영향을 주는 단일 또는 복합 균주 형태의 생균으로 정의되고 있다. 프로바이오틱스가 갖추어야 할 특성은 인간의 장내를 서식지로 하고, 비병원성, 무독성, 장으로 가는 동안 살아 남아야한다. 더 나아가서 전달 식품 안에서 소비되기 전에 생존율과 활성을 유지 및 감염 예방으로 사용되는 항생제에 대해 민감해야하며, 항생제 내성을 갖는 플라스미드를 보유하지 않아야 한다. 또한 장내 환경에서 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추어야한다(Mishra , C. et al ., Asia Pacific J Clin Nutr . 5:20-24, 1996).

이러한 프로바이오틱스들로는 소화효소(amylase, protease, lipase, cellulase, phosphatase) 생성능력이 우수한 바실러스 종(Bacillus sp.), 유기산을 생성하여 저분자 탄수화물을 분해하는 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.), 젖산으로 전환시켜 장내 흡수를 용이하게 하고 비타민(Vitamin) B 합성과 비타민(Vitamin) E 흡수를 촉진하는 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 가축의 분변에 남아있는 악취 유발물질(암모니아, 황화수소, 아민류 등)을 대사과정에 이용하여 악취유발을 막는 광합성 박테리아(Photosynthetic bacteria) 등을 그 예로 들 수 있다.

특히 바실러스 종(Bacillus sp.)과 락토바실러스 종(Lactobacillus sp.)은 유산균(lactic acid bacteria : LAB) 이라 칭하고, 식품으로부터 분리되는데 상기 종들에는 식품 부패를 방지를 위해 부패균에 대한 항균물질을 생산하는 균주들이 존재하기 때문에, 매우 유용한 프로바이오틱스이다(Tagg, G. U. et al ., Bacteriol . Rev . 40:772-756, 1976). 이들 유산균들은 항생제 내성 기작과 관련이 없는 항균 기작을 가지는 박테리오신(Bacteriocin)이라는 항균 펩타이드를 생산한다. 박테리오신은 전통적인 항생제와는 다르기 때문에 정확하게 정의 내릴 수 없다. 박테리오신은 분자량, 생화학적 성질, 숙주에 대한 항균 범위나 기작이 상당 히 다른 다형적 특징을 가지고 있다. Klaenhammer은 박테리오신을 생산하는 박테리아와 근접한 종들에 대한 직접적인 항균 활성을 가진 단백질 또는 단백질복합체라고 정의하고 있다(Klaenhammer, TR. Biochimie 70:337-379, 1998). 또한 이런 전형적인 정의와 맞지 않지만 항균 능력을 가진 물질들을 "박테리오신 유사 물질(Bacteriocin-like substance)로 제시한다(Tagg, G. U. et al ., Bacteriol . Rev . 40:772-756, 1976). 항생제(Antibiotics), 박테리오신, 마이크로신(Microcins)을 나누는 뚜렷한 경계는 없지만, 박테리오신은 좁은, 광범위 활성 차이로 정균제(bacteriostatic), 살균제(bacteriocidal)로 나누고, 펩티드 항생제(peptide antibiotics) 그룹에 포함된다. 항생제는 여러 단계의 효소 기작에 의한 비-리보좀(non-ribosomal) 합성이다. 반면, 박테리오신은 리보좀 합성에 의해 이루어지고, 내성 발생이 드물지만 내성 가능성은 제시되고 있다(Hurst A. Adv Appl Microbiol 27:85-123, 1981; Harvis, B., Farr, J. Biochim Biophys Acta 227:232-340, 1971; Harris, LJ. et al ., J Food Prot 52:384-387, 1989). 많은 항생제들은 화학적 합성이 가능하지만, 박테리오신은 아직까지 화학적 합성에 대한 보고는 없다. 그러나 유전공학 기술에 의한 박테리오신의 유사체들이 재구성, 재조합되고 있는데, 지질(Lipid)나 탄수화물(carbohydrate) 부분이 박테리오신 복합체의 부분을 이루고 관련되어있다. 상기 박테리오신은 세포에 부착되어 있거나 외부로 방출될 수 있고, 성장 주기(growth cycle) 전,후에 생성될 수 있으며, 단백질 분해 효소(protease) 같은 효소에 저항력을 가지며, pH, 온도에서도 안정적이다. 상기 박테리오신의 항균 기작은 거의 알려져 있지 않으며, 세포막 채널(cell membrane channel)에 박혀 세포 용해(cell lysis)를 유도한다는 점이 보고되었다. 세포 용해는 곧 세포 죽움(cell death)와 관련되어 있고, 비특이적 수용체 자리(receptor site)와 특이적 수용체 자리를 가진 민감한 박테리아에 의존하는 편이다(Bhunia, AK. et al ., J Appl Bacteriol 57:492-498, 1991). 이러한 특징을 가지는 박테리오신은 항생제 대체제로써 부각되고 있으며, 식품의 부패방지제로 사용되는 항균물질이기 때문에 더욱 안정한 항균제라 할 수 있다.

바실러스(Bacillus)는 많은 펩티드 항생제를 생산하고, 다양한 산업에 중요한 종으로써 식품과 산업용으로 안정성을 가지고 있어 항균 활성에 관한 흥미로운 종이다(Paik, H.D. et al ., J. Ind . Microbiol. Biotechnol . 19:294-298, 1997). 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacilllus subtilis ) 및 바실러스 슈린지에스(Bacillus thuringiensis ) 등 이미 많은 바실러스 종들이 박테리오신(bacteriocins)과 박테리오신 유사 물질(bacteriocin-like substances)을 생산하는 것으로 알려져 있다(Paik, H.D. et al ., J. Ind . Microbiol . Biotechnol . 19:294-298, 1997; Zheng, G. et al ., J. Bacteriol . 181:7346-7355, 1999; Bizani, D., Brandelli, A. J. Appl. Microbiol . 93:512-519, 2002).

이에 본 발명자들은 안전한 전통식품인 김치에서 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K317 균주(KCTC 11042BP)를 분리해 내었을 때, 상기 균주의 배양액 및 그로부터 분리된 항균 대사물질이 30종의 MRSA 균주뿐만 아니라 여러 종의 병원성 장내세균에도 강력한 억제효능을 나타냄을 확인함으 로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항생제 내성 미생물 및 장내 미생물의 생장을 억제하는 신규한 균주, 이의 배양상등액 및 이로부터 회수된 항균 대사물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) K317 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양 상등액을 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균즈의 배양 상등액에서 회수한 항균 대사물질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양 상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양 상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 저해용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양 상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 억제용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양 상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 억제용 사료 첨가제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciebs) K317 균주를 제공한다.

본 발명자들은 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA(methicillin-resistant Stapylococcus aureus)에 항균 활성을 나타나는 미생물을 선별하기 위하여 MRSA 균주가 도발된 플레이트에 김치 국물을 희석하고 함께 배양하여 투명환을 나타내는 콜로니(colony)를 선별하였다(도 1 참조). 이 후 선별된 집락을 순수 분리하였으며, 최종 선별된 균주를 동정하여 “바실러스 sp.(Bacillus sp .) K317"이라 명명하였고, 대한민국 대전시 유성구에 위치한 한국생명공학연구원 내 생명자원센터에 2006년 12월 4일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 11042BP).

이후 본 발명의 균주의 병원성 미생물에 대한 생장 억제 특성을 조사하기 위 하여 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받은 Salmonella typhimurium , Edwardsiella tarda , E. coli , Staphylococcus epidermidis 및 서울여대 항생제내성균주은행에서 분양받은 항생제 내성세균 MRSA 30균주를 적절한 배지에 배양한 후 생균수를 일정하게 고정하여 MH 배지에 도말한 후 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주를 스트리킹하여 배양한 다음, 투명환 형성을 관찰하였다. 그 결과, 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주를 스트리킹한 주변에 투명환이 형성됨으로 병원성 미생물의 생장을 효과적으로 억제함을 확인하였다(도 3 참조). 또한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주와 MRSA 균주와 혼합 배양을 수행하여 관찰한 결과, 혼합 배양 초기에는 MRSA 균주와 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주가 함께 콜로니를 형성하나, 혼합배양 24시간 후에는 MRSA 균주의 콜로니가 발견되지 않았다(도 4 참조). 이를 통해 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주는 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA 균주 및 장내 유해 미생물의 생장을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.

본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액을 희석하여 병원성 미생물을 대상으로 생장 억제 능력을 조사하였다. 대상 균주로는 Salmonella typhimurium, Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis 및 항생제 내성세균 MRSA 30 균주를 이용하였다.

그 결과, Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis를 대상으로 했을 때, 원액 또는 1/2 희석액에서 생장을 효과적으로 억제함을 관찰하였다(도 5 참조). 아울러 MRSA 30종을 대상으로 했을 때, 대부분 1/4까지 희석한 배양상등액에서 억제 효과가 관찰되었으며, 원액 및 1/2 희석액에서는 MRSA 균주의 생장이 거의 이루어지지 못할 만큼 강한 효과를 관찰할 수 있었다(도 6 내지 도 12 참조). 이를 통해 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액은 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA 균주 및 장내 유해 미생물의 생장을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 배양상등액에서 회수한 항균 대사물질을 제공한다.

본 발명자들은 상기 배양상등액으로부터 분자량 10 kDa 이상 및 10 KDa 이하의 대사물질을 분리하여, 항생제 내성 병원성 미생물을 대상으로 항균 활성을 조사하였다. 그 결과, 분자량 10 KDa 이상의 대사물질을 처리한 페이퍼 디스크에서 투명환을 형성하는 것을 관찰하였다(도 13 참조). 이를 통해 상기 배양상등액에서 분리한 분자량 10 KDa 이상의 대사물질은 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA 균주 및 장내 유해 미생물의 생장을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스를 제공한다.

상기 내용에서 알 수 있듯이, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액, 또는 배양상등액에서 분리한 항균 대사물질은 장내 유해 미생물인 Edwardsiella tarda , E. coli , Staphylococcus epidermidis 를 대상으로 항균 능력을 보유하고 있고, 안전한 전통식품인 김치 국물에서 선별하였으므로 안전하고 독성 없는 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 프로바이오틱스는 가축을 비롯한 동물을 대상으로 사용될 수 있으며 식품 또는 동물 사료에 첨가할 수 있다. 또한 동물 의약품 및 의약품에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 저해용 조성물을 제공한다.

상기 항생제 내성 병원성 미생물로는 메티실린 내성 황색포도구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus:MRSA)인 것이 바람직하며, 장내 유해 미생물로는 Edwardsiella tarda , E.coli, Staphylococcus epidermidis인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이 러한 고형 제제는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 배양상등액으로부터 분리된 향균 대사물질에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질이 약 0.001 ~ 100 ㎎/kg이고, 바람직하게는 5 ~ 50 ㎎/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질을 레트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/kg으로 나타나, 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 병원성 미생물 즉 MRSA 균주 및 장내 유해 미생물인 Edwardsiella tarda , E.coli, Staphylococcus epidermidis가 유발시킬 수 있는 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 억제용 건강식품을 제공한다.

상기 항생제 내성 병원성 미생물로는 메티실린 내성 황색포도구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus:MRSA)인 것이 바람직하며, 장내 유해 미생물로는 Edwardsiella tarda , E.coli, Staphylococcus epidermidis인 것이 바람직하다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 함유하는 건강식품으로는 상기 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 병원성 미생물 생장 억제를 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 억제용 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 병원성 미생물의 생장 억제에 우수할 뿐 아니라 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질은 병원성 미생물의 생장 억제를 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 각각을 그대로 참가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질이 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포 도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질 100 g당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.

상기 외의 본 발명의 혼합 생약 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 그로부터 분리된 항균 대사물질을 함유하는 건강식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액 또는 항균 대사물질 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장 억제용 사료 첨가 제를 제공한다.

본 발명의 사료첨가제는 동물 사료에 첨가할 수 있다. 상기 사료첨가제는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액, 또는 상기 항균 대사물질을 통상의 동물 사료 100 중량부에 대하여 1 ~ 20 중량부로 참가하는 것이 바람직하며, 10 ~ 20 중량부로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 사료 첨가제는 MESA 균주 및 장내 유해 미생물인 Edwardsiella tarda , E. coli , Staphylococcus epidermidis에 대한 항균 효과 및 생장억제 효과를 가짐을 기대할 수 있다(도 4 내지 12 참조).

이하 본 발명을 실시예 및 제제예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제제예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 항균활성을 나타내는 미생물의 분리

항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA(methicillin resistant staphylococuus Aureus)에 항균활성을 나타내는 미생물을 얻기 위하여 MRSA를 지시균으로 미리 도 말한 Tryptic soy agar(TSA, Difco)배지에 김치 국물을 적당량 희석 도말하여 37℃, 48시간 배양하였다. 배양 후 지시균의 주위에 투명환을 나타내는 수십 개의 집락을 선발 분리하였다(도 1). 본 실험의 김치 제조방법으로 배추는 다듬어 가로 방향으로 2등분하여 약 7%(w/w)의 소금물에 넣어서 실온(약 25℃)에서 14시간 정도 절인 후, 수돗물로 3회 세척하고 2시간 동안 탈수하여 준비하고 4× 4 ㎝ 정도의 크기로 자른 무, 파와 부재료를 넣어서 김치를 제조하였다. 이때 사용한 부재료는 저린굴젓, 멸치젓, 새우젓, 잡젓이 혼합된 젓갈과, 마늘, 생강, 고춧가루, 찹쌀풀, 설탕을 첨가하여 제조하였으며 5℃에서 저장, 발효한 김치를 사용하였다. 또한 선발된 집락은 3차에 걸쳐 새로운 TSA 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였다. 순수 분리 배양된 미생물 균주는 20% 글리세롤에 담아 영하 80℃에서 보존하였다.

< 실시예 2> 분리한 K317 균주의 동정

실시예 1에서 최종 선발된 K317 균주의 동정은 형태분류학적 방법과 최신 분자계통분류학적 방법으로 실시하였다. K317 균주는 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco) 배지에서 적정온도 30 ~ 37℃로 배양하였을 때 가장 잘 성장하였다. 형태적인 특성은 그람염색법을 통하여 그람양성의 간균임을 확인하였고, 16S rRNA 유전자 염기서열결정 및 분석법을 통하여 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었다. 염기서열결정 및 분석방법은 다음과 같다. DNA 분리는 배양한 균체를 모아 STES 버퍼(0.4 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl(pH 7.6), 0.01 M EDTA, 1% SDS) 100 ㎕에 현탁시켰다. 시료에 글래스 비드(glass bead)를 첨가하여 5분간 TOMY(micro tube mixer MT-360)로 파쇄하여 세포질을 용출시켰다. 세포 용출액을 TE 버퍼(pH 8.0) 200 ㎕, 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 200 ㎕에 현탁하여 원심분리를 수행하였고, 상층액에 RNase A 5 ㎕로 처리하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 다시 클로로포름 200㎕를 첨가하여 12,000 rpm에서 5분간 원심분리를 수행하였다. 원심분리한 시료의 상등액을 에탄올로 2회 세척한 다음 건조(vacuum dry: SpeedVac)시켰다. 최종적으로 회수한 DNA는 멸균 증류수에 녹여 보존하였다. 16S rDNA의 PCR 증폭에는 PCR premix(바이오니아, 대한민국)와 정방향 프라이머(5' - GAG TTT GAT CCT GGC TCA G - 3': 서열번호 1) 및 역방향 프라이머(5' - GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3': 서열번호 2)로 이루어진 유니버셜 프라이머(universal primer)를 사용하였다. PCR 증폭 반응액의 부피는 총 20 ㎕로 맞추어 수행하였고 PCR 조건은 하기와 같다. DNA 변성화(denaturation)를 위해 94℃에서 1분, 프라이머의 결합을 위해 50℃에서 1분, DNA 가닥의 합성을 위해 72℃에서 1분 50초 과정을 30 회 반복하였다. 증폭된 DNA의 염기서열결정(서열번호 3) 및 계통분류학적 분석은 장 등(Chang et al., Int . J. Syst . Evol . Microbiol. 52: 377-381, 2002)의 방법에 따라 실시하였다(도 2 및 표 1). 동정된 K317 균주는 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원 내 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2006년 12월 4일에 기탁하였다(KCTC 11042BP).

< 실시예 3> 바실러스 아밀로리퀴페시언스 ( Bacillus amyloliquefaciens ) K317 균주의 병원성 미생물 생장억제 특성 조사

실시예 2에서 동정한 K317의 병원성균 생장억제 능력을 조사하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 실험균주 K317은 TSA 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였으며, 장내 병원성 미생물은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받은 Salmonella typhimurium, Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis 및 서울여대 항생제내성균주은행에서 분양받은 항생제 내성세균 MRSA 30균주를 대상으로 실시하였다. 병원성균 생장억제 실험은 모두 Mueller Hinton 배지(MH, Difco, USA)를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 집락 주위에 투명환을 형성하는 균주만을 억제능이 있는 것으로 판정하였다. 본 발명자들은 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco) 배지에서 배양된 각각의 병원성 미생물의 생균수를 10^6~7CFU/㎖로 조정하여 MH 배지에 도말한 후, K317 균주를 배지 위에 스트리킹하여 배양하였다.

그 결과, 배양 후 병원성 세균 및 MRSA 균주 주위에 투명환을 형성함으로써 이들에 대한 생장 억제력을 확인하였다(도 3).

본 발명자들은 노란 콜로니 색상을 지닌 MRSA 2 균주(1번과 6번)에 대한 K317 균주의 생장억제력을 혼합배양법으로 조사하였다. K317 균주와 MRSA 균주를 10^6~7 CFU/㎖로 동일하게 농도 조정한 후 1:1(v/v)로 혼합하여 37℃에서 24시간 동안 MH 액체배지에 혼합 배양하였다. 이 후 PBS(Phosphate-Buffered Saline, 바이오니아, 대한민국)에 희석하고 TSA 배지에 도말하여 생균수를 측정하였다.

그 결과, 혼합 배양 전의 생균수가 모두 10^6~7 CFU/㎖를 나타냈던 MRSA 균주는 K317 균주와의 혼합배양 24시간 후 모두 집락을 보이지 않았다(도 4). 이를 통해 K317 균주가 MRSA 균주의 성장을 억제하는 탁월한 능력을 가지고 있는 것으로 판명되었다.

< 실시예 4> 바실러스 아밀로퀴페시언스 K317 균주의 배양액을 이용한 생장억제 조사

MH 액체배지에서 37℃에서 24시간 배양한 K317 균주의 액체 배양액을 대상으로 0.2 ㎛ 막 필터(membrane filter; Satorius, Germany)를 사용하여 균체를 제거한 후 나머지 상등액만을 취하여 실험에 이용하였다. K317 균주의 상등액은 멸균된 MH broth를 사용하여 1/512 희석배율까지 준비하였다. 96-웰 플레이트에 분주한 각각의 Salmonella typhimurium , Edwardsiella tarda , E. coli , Staphylococcus epidermidis 및 MRSA 30 균주와 K317 균주의 희석 상등액을 농도별로 혼합 첨가하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, ELISA(Benchmark microplate reader, BIO-RAD, USA)를 사용하여 흡광도 595 nm에서 성장도(Optimal Density)를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주는 Edwardsiella tarda, E. coli , Staphylococcus epidermidis에 대해 원액과 1/2 희석액에서 억제효과가 나타났다(도 5). MRSA 30균주에서는 대부분 1/4까지 희석한 상등액에서 억제효과가 나타났으며, 원액과 1/2 희석액은 거의 생장이 이뤄지지 못할 만큼 강한 억제력을 보였다(도 6 내지 11).

본 발명자들은 정확한 생장억제곡선을 구하기 위하여 K317 균주의 배양상등액을 1/32 배율까지 희석하여 상위와 같은 실험방법으로 MRSA 1번과 6번에 대한 생장억제 곡선을 3시간 간격으로 측정하였다. 음성 대조군(Negative control)은 균주를 배양하지 않은 멸균된 MH 액체배지를, 양성 대조군(positive control)은 K317 균주의 배양상등액을 첨가하지 않고 MRSA 균주만 배양한 것을 사용하였다.

실험 결과, MRSA 균주는 대부분의 희석배율에서 생장억제가 나타나며, 1/4 희석배율 이상, 특히, 1:1과 1:1/2 희석배율에서는 거의 모든 MRSA 균주의 생장이 전혀 이뤄지지 않았을 만큼 강한 억제력을 보였다(도 12).

< 실시예 5> 바실러스 아밀로퀴페시언스 K317 이 생산하는 항균 대사물질 조사

K317 균주를 100 ㎖ TSB 배지에서 배양한 후, 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 균체를 제거한 배양상등액을 준비하였다. 상등액은 Centricon YM-10(Milipore, USA)을 사용하여 3,000 ×g에서 농축 원심분리하여 대사물질을 분자량 10 KDa 이하 및 이상 물질로 분리 수득하였다. 분자량 크기로 분리된 배양액을 사용하여 페이퍼 디스크(직경 6mm, Toyo Roshi Kaisha, Japan)방법으로 항균활성을 조사하였다. 각각의 1부터 30번까지의 MRSA 균주를 TSA (Tryptic Soy Agar, Difco) 에서 배양한 후 10^6～7CFU/㎖로 생균수를 조정하여 MH 배지에 도말한 후 페이퍼 디스크를 얹고, 상기 분자량 크기로 원심분리된 분리물질 20 ㎕씩을 떨어뜨려 흡수시켰다. 배양 후 10 KDa 이상 크기의 분리물질을 흡수한 페이퍼 디스크 주위에 투명환이 형성되는 것으로 나타났다. 따라서 MRSA 균주의 생장을 강하게 억제하는 물질은 K317 균주가 생성하는 배양 상등액내에 존재하며, 이들의 분자량은 10 kDa 이상 크기의 항균성 물질임을 확인하였다(도 13).

< 실시예 6> 급성 독성 실험

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질의 급성 독성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 레트를 사용하였으며, 군당 2마리씩 나누었다. 상기 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다.

시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질은 모두 레트에서 1,000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

< 제제예 1> 식품의 제조

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 배양상등액 또는 항균 대사물질을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 0.2 ~ 10 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 토마토케첩 및 소스의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액 0.2 ~ 1.0 중량%를 토마토케첩 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토케첩 또는 소스를 제조하였다.

3. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 항균 대사물질 0.1 ~ 5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

4. 스프 및 육즙( gravies )의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액 0.1 ~ 1.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

6. 유제품( dairy products )의 제조

본 발명의 항균 대사물질 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 요구르트, 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

7. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 항균 대사물질을 진공 농축기에서 감압·농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 항균 대사물질의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30중량%, 율무 15중량%, 보리 20중량%),

종실류(들깨 7중량%, 검정콩 8중량%, 검정깨 7중량%),

본 발명의 항균 대사물질의 건조분말(1 중량%),

영지(0.5중량%),

지황(0.5중량%)

< 제제예 3> 음료의 제조

1. 탄산음료의 제조

설탕 5~10%, 구연산 0.05~0.3%, 카라멜 0.005~0.02%, 비타민 C 0.1~1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79~94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85~98℃에서 20~180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5~0.82% 주입하여 본 발명의 항균 대사물질을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

2. 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3. 야채쥬스의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액을 0.5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

4. 과일쥬스의 제조

바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액을 0.1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

< 제제예 4> 사료의 제조

1. 약 50 kg까지의 비육돈용 순수사료

a) 조단배질 최소 16 중량%,

라이신 최소 0.8 중량%,

조지방 최대 8 중량%,

조섬유 최대 6 중량%,

전분 최소 33 중량%,

칼슘 최소 0.7 중량%,

인 최소 0.5 중량%,

나트륨 최소 0.15 중량%,

b) 구리 최소 20 mg,

아연 최소 50 mg,

비타민 A 최소 4,000 IU,

비타민 D 최소 500 IU,

c) 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스

K-317 균주의 배양상등액 0.02 - 20 ppm.

2. dir 80 kg 이상의 비육 송아지용 우유 대체 사료

a) 조 단백질 최소 17 중량%,

라이신 최소 1.25 중량%,

조지방 15 ~ 30 중량%,

조섬유 최대 2 중량%,

조회분 최대 10 중량%,

칼슘 최소 0.9 중량%,

인 최소 0.7 중량%,

나트륨 최소 0.2 중량%,

마그네슘 최소 0.13 중량%,

분유 최소 25 중량%,

b) 구리 최대 15 mg,

비타민 A 최소 8,000 IU,

비타민 D 최소 1,000 IU,

비타민 E 최소 20 mg,

c) 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스

K317 균주의 배양상등액 0.02 ~ 20 ppm.

본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주, 이의 배양상등액, 및 이로부터 회수된 항균 대사물질은 병원성 미생물인 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA 균주 및 장내 유해 미생물에서 효과적으로 그 생장을 억제하며 항균 효과를 보임으로 상기 병원성 미생물 생장 억제용 조성물, 건강식품 및 프로바이오틱스로 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Bacillus amyloliquefaciens K317 for supressing the growth of antibiotics-resistant pathogenic microorganism or en teropathogenic microoranism <130> 6p-12-46 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA sequence <400> 3 ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 60 cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga 120 accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg 180 cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 240 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 300 gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 360 cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt 420 gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480 gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct 540 gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca 600 gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc 660 agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg 720 aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 780 tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 840 aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900 ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag 960 gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg 1020 agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt 1080 tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1140 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg 1200 aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac 1260 tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt 1320 tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt 1380 gaggtaacc 1389

Claims

항생제 내성 병원성 미생물 또는 장내 유해 미생물의 생장을 억제하고 수탁번호 KCTC 11042BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloiquefaciens) K317 균주.
제 1항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주.
제 1항에 있어서, 장내 유해 미생물은 Edwardsiella tarda , E. coli , Staphylococcus epidermidis인 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주.
삭제
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주의 배양상등액.
삭제
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스(probiotics).
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 저해용 조성물.
제 8항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 저해용 조성물.
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 장내 유해 미생물 생장 저해용 조성물.
제 10항에 있어서, 장내 유해 미생물은 Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis인 것을 특징으로 하는 장내 유해 미생물 생장 저해용 조성물.
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품.
제 12항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품.
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 장내 유해 미생물 생장 억제용 건강식품.
제 14항에 있어서, 장내 유해 미생물은 Edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis인 것을 특징으로 하는 장내 유해 미생물 생장 저해용 건강식품.
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.
제 16항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.
제 1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 K317 균주 또는 제 5항의 배양상등액을 유효성분으로 하는 장내 유해 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.
제 18항에 있어서, 장내 유해 미생물은 Salmonella typhimurium edwardsiella tarda, E.coli, Staphylococcus epidermidis인 것을 특징으로 하는 장내 유해 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.