KR100427600B1

KR100427600B1 - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 이를 포함하는 사료 첨가제

Info

Publication number: KR100427600B1
Application number: KR1020030014412A
Authority: KR
Inventors: 신정균; 최지혁; 최예훈; 조지현; 백점현; 강경희
Original assignee: (주)한국바이오케미칼
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2004-04-28

Abstract

본 발명은 장내 유해 세균 억제 활성을 갖는 내열성 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주 및 이를 포함하는 사료첨가제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시트레이트 및 나이트레이트를 이용하고 장내 유해 세균 억제 활성을 갖고 있으며 열에 대한 내성이 뛰어난 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121 및 상기 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 장내 유해 세균 억제 활성이 뛰어나며, 내열성이 강하기 때문에 이를 이용한 사료 제조시 80℃ 이상의 열풍 건조에 의해서도 미생물이 사멸하지 않아 가축에 식이하였을때 장내 유해 세균을 효과적으로 억제할 수 있어 가축의 건강 증진을 위한 사료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 이를 포함하는 사료 첨가제{Bacillus amyloliquefaciens and additional animal food containing the same}

본 발명은 장내 유해 세균 억제 활성을 갖는 내열성 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 이를 포함하는 사료 첨가제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 장내 유해 세균 억제 활성을 갖고 있으며 고온에서의 내성이 강한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 및 상기 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제에 관한 것이다.

동물의 몸 속에 들어와 장에 살고 있는 세균을 총칭하여 장내 세균이라고 하는데, 사람의 장에는 보통 약 100조개의 장내 세균이 존재하며 그 종류만도 400여 종 이상이다. 동물에 존재하는 장내 세균에는 유익한 세균 및 유해한 세균이 있는데, 장내 유해 세균이 과다하게 존재하는 경우 장내 환경은 부패환경으로 변하면서 악취가 심해진다. 더구나 장내세균 중 대장균이나 웰시균과 같은 부패균은 단백질이나 아미노산의 일부분의 변화시켜 암모니아, 인돌, 황화수소 등과 같은 악취를 뿜어내는 유해물질을 만든다. 이런 유해 물질은 장근육 운동에 영향을 미쳐 설사나 변비를 유발하고 두통, 어깨결림, 거친피부, 노화를 촉진시키며, 심지어 니트로소화합물 같은 것은 미량으로 존재하여도 강한 발암 작용을 나타낸다. 물론 이러한 유해물질은 간에서 대부분 해독작용을 거치지만 독성물질이 많아지면 간기능이 저하되어 피로해지고 각종 성인질환을 유발하는 원인이 된다.

장내 유해 세균으로는 살모넬라(Sallmonella sp.), 시겔라(Shigella sp.), 대장균(E. coli) 및 엔테로코커스(Enterococcus sp.) 등이 있다. 살모넬라에 감염되면 패혈증, 만성 설사, 회맹결장염 및 만성소모성질병을 유발한다. 돼지가 대장균에 감염되면 1주령 이전에 황백색 또는 회백색의 점액성 설사변이 나오는 조발성대장균증이 유발되고, 3주령 정도에는 회색 또는 백색의 설사변이 나오는 지발성대장균증이 유발된다. 또한, 엔테로코커스가 감염되게 되면 심내막염, 복막염 또는 요로 감염증을 유발된다.

현재 국내외에서 장내 유해세균을 억제하기 위해 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagluans) 및 유산균 등을 이용하여 생균제 및 가축 사료첨가제를 개발하고 있다. 유산균은 장내 유해 세균을 억제하고 정장 작용, 장내 부패산물 억제, 암 억제 효과, 변비와 설사의 예방, 영양분의 소화흡수 증진 효과, 비타민 합성 및 장내에서 스테롤 물질을 성장에 이용함으로써 장으로부터 콜레스테롤 섭취를 감소시켜 순환기 계통의 건강 유지에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 대한민국 특허등록 제211529호에는 유해 미생물 억제 활성을 갖는 신규 내산성 락토바실러스 속 미생물 및 이를 함유하는 가축용 생균활성제가 개시된 바 있다. 그러나, 종래에 알려져 있는 균주들에 의한 장내 유해세균 억제 효과는 그리 높지 못하며 장내 유해세균에 의해 자주 설사나 혈변이 일어나고 있다. 또한, 바실러스 서브틸리스를 제외하고는 균주들이 열에 대한 내성이 약하여 사료첨가제를 생산하는 공정에서의 스팀 살균이나 열처리에 의해 사멸할 수 있어 생균제로 투여하였을때의 장내 유해 세균 생육저지 효과가 낮다.

이에, 본 발명자들은 사료 첨가제를 연구하던 중 장내 유해 세균에 대해 억제 활성이 뛰어나고 고온에서도 안정하고 활성이 유지되는 신규한 바실러스속 균주를 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 장내 유해 세균 억제 활성 및 내열성이 뛰어난 미생물 및 상기 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 균주와 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준균주의 장내 유해세균에 대한 생육저지 효과를 비교한 사진이다.

도 2는 본 발명의 균주 배양액의 장내 유해 세균 생육저지 효과를 나타낸 사진이다.

A: 엔테로코커스(Enterococcus),

B: 반코마이신 저항성 엔테로코시(Vancomycin-resistantEnterococci),

C: 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)

도 3은 80℃, 100℃ 및 121℃로 열처리한 본 발명의 균주 배양액의 장내 유해 세균 생육저지 효과를 나타낸 사진이다.

도 4는 본 발명의 균주 배양액을 100℃에서 120분간 노출시킨뒤 20분 간격으로 수득하여 장내 유해 세균에 대한 생육저지 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 균주의 배양 온도에 따른 생장 정도를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 균주의 pH에 대한 내성을 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 시트레이트 및 나이트레이트를 이용하고, 장내 유해 세균 억제 활성 및 내열성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121(수탁번호: KCTC 10411BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 시트레이트(citrate) 및 나이트레이트(nitrate)를 이용하고, 장내유해 세균 억제 활성 및 내열성이 뛰어난 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121을 제공한다.

본 발명의 미생물은 경남 의령군 일원의 산림토에서 분리한 것으로 상기 미생물의 특성을 조사한 결과, 세포 직경이 1.0 ㎛ 이상을 넘지 않고, 스포어가 원형을 형성하지 못하였다. 또한, 카탈라제를 생성하고, 보게스-프로스카우어 테스트에서 양성 반응을 나타내었으며, D-글루코스, L-아라비노스, D-자일로스 및 D-만니톨로부터 산을 형성하고, 글루코스로부터 가스를 형성하지 않았다. 또한, 카세인, 젤라틴 및 전분을 가수분해하고, 시트르산을 이용하고, pH 6.8 내지 pH 5.7에서 성장을 하고 NaCl 2%, 5%, 7%에서 성장을 하였다. 그리고 30℃내지 50℃에서 성장을 하고 인돌을 형성하지 않으며 질산염을 환원하였다(표 1참조). 상기 생리, 생화학적 특징을 통해 본 발명의 균주는 바실러스 서브틸리스속 미생물인 것으로 판명되었다. 또한, 이의 자세한 동정을 위해 16S rDNA 분석 및 gyraseA 염기서열 분석을 수행한 결과 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 가장 유사함을 알 수 있었다. 그러나, 본 발명의 미생물은 기존의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준 균주와는 달리 시트레이트(citrate) 및 나이트레이트(nitrate)를 이용하였으며, 표준 균주가 30℃에서 성장하는데 반해 본 발명의 미생물은 50℃에서도 성장하였고, 표준 균주는 장내 유해세균 억제활성이 없는 반면 본 발명의 미생물은 장내 유해세균 억제활성을 갖고 있었다.

이에, 본 발명의 미생물을 신규한 미생물로 판정하고 "바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121"이라 명명하였으며, 2003년 1월 14일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10411BP).

본 발명의 미생물의 최적 생장 온도는 30 내지 60℃가 바람직하고, 50℃인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 미생물은 pH 5 이상에서 성장하는 것이 바람직하며, 최적 pH는 7이다. 그러나, pH 5에서 성장을 하고 pH 3에서도 성장이 유지되기 때문에 장내의 산성 조건에서도 충분히 성장할 수 있는 내산성을 가진다.

본 발명의 미생물의 최적 탄소원, 질소원 및 인산염 이용 능력의 경우, 탄소원으로는 수크로즈 및 락토즈, 질소원으로는 트립톤 및 효모 추출물, 인산염으로는 K₂HPO₄를 가장 잘 이용한다. 또한, 본 발명의 미생물 및 이의 배양액은 100℃이내의 고온에 안정하여 장내 유해 세균 억제 활성을 그대로 유지한다.

본 발명의 미생물 또는 이의 배양액은 장내 유해 세균 억제 활성이 뛰어나며 내열성이 뛰어나 사료첨가제를 생산하는 공정에서의 스팀 살균이나 열처리에 의해 사멸하지 않아 가축에 식이하였을때의 효과가 높다. 또한,표 4에서 보는 바와 같이 리파아제 및 파이테아제와 같은 장내 효소를 분비하기 때문에 이러한 소화효소의 작용에 의해 소화율을 증대시키고 축분의 악취발생을 억제할 수 있음을 알 수있었다. 이에, 본 발명자들은 상기 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제를 제조하였다.

상기에서, 본 발명의 사료 첨가제를 투여하여 억제시킬 수 있는 장내 유해 세균은 엔테로코커스(Enterococcus), 시겔라(Shigella), 모가넬라 모가니(Morganella morgani), 스타필로코커스 아우시어스(Staphylococcus auseus), 세라티아(Serratia sp.), 대장균(E. coli), 크렙시엘라(Klebsiella sp.) 및 살모넬라(Sallmonella sp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 엔테로코커스인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사료 조성물은 본 발명의 미생물 또는 그 배양액을 포함하는 것으로 바람직하게는, 적당한 배양배지에 본 발명의 균주를 접종하여 배양한 후 배양액 또는 상기 배양액을 회수하고 남은 미생물 균체 및 침전물에 정제수를 가하여 희석한 것을 포함한다.

상기에서 배양 배지는 일반적인 배양배지를 사용해도 무방하며 바람직하게는 탄소원으로 수크로즈 및 락토즈, 질소원으로 트립톤 및 효모 추출물, 인산염으로 K₂HPO₄를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 배지에 포함될 탄소원은 0.1 내지 5%로 포함되는 것이 바람직하며, 2% 포함되는 것이 더욱 바람직하다. 질소원은 0.1 내지 5%로 포함되는 것이 바람직하며, 1.5% 포함되는 것이 더욱 바람직하다. 인산염은 0.05% 내지 1%로 포함되는 것이 바람직하며, 0.2% 포함되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 미생물을 배양하는 온도로는 30 내지 50℃인 것이 바람직하고 35℃인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 사료에 첨가되는 미생물의 유효량은 1×10⁵CFU/g 내지 1×10⁶CFU/g인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 장내 유해 세균 억제 활성을 가진 미생물의 동정

<1-1> 내열성 균주의 분리

경남 의령군에서 제조된 재래식 된장 분말을 80℃ 정도의 열에 1시간 노출 시킨 후 내열성을 가진 균주들을 분리하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 세포 직경이 1 ㎛ 이상을 넘지 않고, 스포어는 원형을 형성하지 않았다. 그리고 버기의 매뉴얼에 의한 생화학 테스트(Berggy's manual of systematic bacteriology volume 2, 1986, Williams Wilkins)를 수행한 결과 본 발명의 균주는 카탈라제를 생성하고, 보게스-프로스카우어테스트(Voges-Proskauer test)에서 양성 반응을 나타내었으며, D-글루코스, L-아라비노스, D-자일로스 및 D-만니톨로부터 산을 형성하고, 글루코스로부터 가스를 형성하지 않았다. 또한, 카세인, 젤라틴 및 전분을 가수분해하고, 시트르산을 이용하며, 시트르산을 이용하고, pH 6.8 내지 pH 5.7에서 성장을 하고 NaCl 2%, 5%, 7%에서 성장을 하였다. 그리고 30℃내지 50℃에서 성장을 하고 인돌을 형성하지 않으며 질산염을 환원하여 바실러스 서브틸리스와 가장 유사한 균주인 것으로 확인되었다(표 1).

특성	결과
세포 직경 > 1.0 ㎛	-
스포어 원형(spore round)	-
카탈라제(catalase)	+
보게스-프로스카우어 테스트(Voges-Proskauer test)	+
D-글루코스로부터 산 형성	+
L-아라비노스로부터 산 형성	+
D-자일로스로부터 산 형성	+
D-만니톨로부터 산 형성	+
글루코스로부터 가스 형성	-
카세인의 가수분해	+
젤라틴의 가수분해	+
전분의 가수분해	+
시트르산 이용	+
pH 6.8에서 성장	+
pH 5.7에서 성장	+
NaCl 2%에서 성장	+
NaCl 5%에서 성장	+
NaCl 7%에서 성장	+
NaCl 10%에서 성장	-
5℃에서 성장	-
10℃에서 성장	d
30℃에서 성장	+
40℃에서 성장	+
50℃에서 성장	+
55℃에서 성장	d
60℃에서 성장	d
65℃에서 성장	-
인돌 형성	-
질산염 환원(Nitrate reduced to nitrite)	+

상기에서 ＋: 90% 혹은 그 이상일 때 양성을 띰,

－: 90% 혹은 그 이하일 때 음성을 띰,

d: 11 내지 89%일 때 양성.

<1-2> 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 유사도 분석

상기 실시예 <1-1>에서 본 발명의 균주가 바실러스 서브틸리스 속 균주임을 확인하였다. 이에 더 자세한 동정을 하기 위해 균주로부터 염색체 DNA를 분리한 후 상기 분리된 염기서열 분석기를 통해 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 균주의 16S rDNA는 636 bp 크기의 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가짐을 알 수 있었다. 분석된 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 이용하여 유사도 분석(Jukes, T. H. and Cantor, C. R.Mammalian protein metabolismNew York: Academic Press, 1969, 21-132; Saitou, N. and Nei, M.,Mol Biol Evol,1987, 4, 406-425)을 한 결과,표 2에 기재된 바와 같이 본 발명의 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(bacillus amyloluquefaciens)와 가장 유사한 균주임을 확인하였다.

균주명	유사도(%)	차이나는 뉴클레오티드 수	Accession No.
Bacillus amyloliquefaciens	99.68	2/626	X60605
Bacillus atrophaeus	99.50	3/596	X60607
Bacillus vallismortis	99.37	4/634	AB021198
Bacillus subtilissubsp.subtilis	99.21	5/633	X60646
Bacillus mojavensis	98.90	7/634	AB021191
Bacillus subtilissubsp.spizizenii	98.90	7/634	AF074970
Bacillus licheniformis	97.47	16/633	X68416
Bacillus pumilus	95.45	28/616	X60637
Bacillus pseudofirmus	94.48	35/634	X76439
Bacillus sporothermodurans	94.31	36/633	U49078
Bacillus oleronius	93.80	39/629	X82492

그러나, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스는 바실러스 서브틸리스 군(complex)에 속하는 하기에 기재된 7가지 균종의 하나이기 때문에 더 정확한 균주 동정을 하기 위해 gyraseA 염기 분석(Goodfellow, M., Manfio, G. P. and Chun, J.,The Units of Biodiversity - Species in Practice, 1997, 25-59; Chun. J., Bae, K. S.,Antonie van Leeuwenhoek,2000, 78, 123127; F. G. Priest.et al., Int. J. Syst. Bacteriology., 1987, 37, 69-71)을 실시하였다.

그 결과, 본 발명의 균주의 gyrase A 유전자는 944 bp 크기의 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖고 있으며, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖고 있음을 확인하였다. 상기 gyrase A 유전자의 염기서열을 이용하여 하기표 3에 기재된 여러 종류의 바실러스 서브틸리스 군의 미생물의 gyrase A 염기서열과 비교한 결과 바실러스 서브틸리스 군 중에서도 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 가장 유사한 균주임을 확인하였다.

균주명	Accession No.	유사도(%)	차이나는뉴클레오티드의 수
Bacillus amyloliquefaciensKCTC 1660T	AF272015	95.19	45/935
Bacillus mojavensisNRRL B-14698T	AF272019	84.34	122/779
Bacillus subtilissubsp.spizizeniiNRRL B-23049T	AF272020	82.94	138/809
Bacillus subtilissubsp.subtilisKCTC 3135T	AF272021	82.59	132/758
Bacillus atrophaeusKCTC 3701T	AF272016	82.48	151/862
Bacillus vallismortisNRRL B-14890T	AF272025	81.89	161/889
Bacillus licheniformisKCTC 1918T	AF272017	77.79	189/851

상기의 생리, 생화학적 특성 분석, 16S rDNA 염기서열 분석 및 gyrase A 유사도 분석을 통해 본 발명의 균주는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 가장 유사한 균주임을 확인하였다.

이에, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준균주(기탁번호: KCTC 1660)의 생화학적 테스트, 최적 생장 온도 및 장내세균 억제활성 여부와 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 균주는 현존하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준 균주와는 달리 시트레이트(citrate) 및 나이트레이트(nitrate)를 이용할 수 있었으며(표 4), 최적 생장 온도는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준 균주가 30℃인데 반해 본 발명의 균주는 50℃이고, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 표준 균주는 장내세균 억제 능력이 없는 반면 본 발명의 균주는 장내세균 억제 능력이 있었기 때문에(표 5및도 1) 신균주인 것으로 판명하였다.

	본 발명의 균주	바실러스 아밀로리쿼파시엔스KCTC1660
그람테스트	+	+
운동성	-	-
카탈라제	+	+
당발효	+	+
H₂S	-	-
메틸레드	-	-
보게스 프로스카우어테스트	+	+
옥시다제	-	-
우레아제	+	+
시트레이트	+	-
나이트레이트	+	-
아밀레이즈	+	+
프로테아제	+	+
셀룰레이즈	+	+
리파아제	+	-
파이타아제	+	+

대상균주	투명환(mm)
대상균주	본 발명의 균주	바실러스 아밀로리쿼파시엔스KCTC1660
Sallmonellasp.	10	0
Klebsiellasp.	7	0
E.coli	15	0
Serratia sp.	22	0
Staphylococcus auseus	16	0
Morganella morgani	11	0
ShigellaB	17	0
ShigellaD	18	0
Enterococcus	26	0

이에 본 발명의 균주를 "바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121"이라 명명하고, 이를 2003년 1월 14일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10411BP).

<실시예 2> 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 배양액의 장내 유해 세균 생육저지 분석

본 발명의 균주의 배양액이 장내 유해 세균 생육저지 효과를 가지는지 확인하기 위해 아가 홀 방법(Yousten, A.A. and E. W. Davidson,Appl. Environ. Microbiol., 1982, 44, 1449-1455; 신영준, 정명주, 정영기, 한국생물공학회지, 2000, 15, 6: 584-588)을 수행하였다. 구체적으로, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121을 기본 배지인 루리아 브로쓰(Luria broth)(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 0.5%)에 접종하여 35℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양액 70 ㎕를 수득하였다. 아가 플레이트(트립톤 1%, 효모 추출물 0.5%, NaCl 0.5%, Agar 1.5%)에 병원균인 엔테로코커스(Enterococcus), 반코마이신 저항성 엔테로코시(Vancomycin-Resistant Enterococci) 및 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus)를 각각 도말한 후 여기에 상기에서 수득한 본 발명의 균주 배양액 70 ㎕를 아가홀 법에 의해 침지한 후 1일 후 투명환의 지름을 측정하여 병원균에 대한 생육 저지를 살펴보았다.

그 결과, 병원균은 본 발명의 균주에 대해 내성이 없어 본 발명의 균주 주위에 투명환이 생겼다(도 2). 따라서, 본 발명의 균주는 병원균에 대해 생육저지 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 본 발명의 균주 배양액을 이용하여 장내 세균인 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 아시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumannii), 크렙시엘라(Klebsiella sp.), 대장균(E. coli), 세라티아(Serratiasp.), 스타필로코커스 아우시어스(Staphylococcus auseus), 모가넬라 모가니(Morganella morgani), 살모넬라(Salmonella), 시겔라 B(Shigella B), 시겔라 D, 엔테로코커스(Enterococcus sp.), 반코마이신 저항성 엔테로코시 및 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스에 대한 생육 저지 효과를 분석하였다. 또한, 본 발명의 균주가 사료 첨가제로 사용할 수 있을지의 여부를 확인하기 위해 장내 유익세균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 락토바실러스 애시도필리스(Lactobacillus acidophilis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 아시네토박터 바우마니이(Acinetobacter baumannii) 및 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 균주를 이용하여 생육 저지 효과를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 균주 배양액은 장내 세균에 대해서 억제 효과가 있고 그 중에서 특히 엔테로코커스에 대한 생육저지 효과가 가장 뛰어났다. 또한, 장내 유익 세균에 대해서는 생육 저지 효과가 없어 사료 첨가제의 용도로 사용될 수 있음을 알 수 있었다(표 6).

대상균주	투명환(mm)
Bacillus subtilis	0
Bacillus amyloliquefaciens	0
Pseudomonassp.	0
Lactobacillus acidophilis	0
Lactobaillus plantarum	0
Saccharomyces cerevisiae	0
Acinetobacter baumannii	0
Enterobactersp.	0
Sallmonellasp.	10
Klebsiellasp.	7
E.coli	15
Serratia sp.	22
Staphylococcus auseus	16
Morganella morgani	11
ShigellaB	17
ShigellaD	18
VRE	20
MRSA	13
Enterococcus	26

<실시예 3> 열 처리한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주 또는 이의 배양액의 장내 유해 세균 생육저지 분석

장내 유해 세균 생육 저지 활성을 가진 본 발명의 균주 또는 이의 배양액이 사료 첨가물로 사용할 수 있을지 여부를 확인하기 위해 균주 또는 이의 배양액을 열처리하여 생존 여부 및 장내 유해 세균에 대한 생육저지 효과를 분석하였다.

<3-1> 균주의 내열성 분석

본 발명의 균주가 열에 대한 내성을 가지는지 확인하기 위해 본 발명의 균주를 배양하여 세포 농도가 2.5 ×10⁷CFU/㎖이 되었을 때 이를 각각 60℃, 80℃ 및 100℃의 온도에서 1시간 동안 방치시켰다. 방치 후 생존한 세포를 계수하여 열처리후의 생존 여부를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 100℃까지 온도가 올라가더라도 세포가 생존함을 확인하여 내열성이 있음을 알 수 있었다(표 7).

온도	60℃	80℃	100℃
세포수(CFU/㎖)	3.2 x 10⁸	1.5 x 10⁷	0.5 x 10⁷

<3-2> 균주 배양액의 내열성 및 장내 유해 세균 생육 저지 효과 분석

본 발명의 균주 배양액을 필터 멸균한 뒤 80℃에서 10분, 100℃에서 10분 및 121℃에서 15분 동안 열처리한 후 엔테로코커스가 포함된 아가 배지에 침지한 후 아가 홀 방법을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 균주 배양액을 121℃로 처리한 경우를 제외하고는 모두 열에 의해 변형되지 않아 장내 유해 세균 생육을 저지함을 알 수 있었다(도 3).

또한, 본 발명의 균주 배양액을 필터 멸균한 뒤 100℃에서 120분 동안 노출시키면서 20분 간격으로 배양액을 수득하여 엔테로코커스가 포함된 아가배지에 아가 홀 방법에 따라 침지하여 항균활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 균주 배양액은 시간이 경과함에 따라 항균 활성이 감소하는 경향을 보였으나 전체적으로 내열성이 있어 엔테로코커스에 대한 생육저지 활성이 유지됨을 알 수 있었다(도 4).

<실시예 4> 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주의 최적 생장 조건 분석

본 발명의 균주 및 이의 배양액은 장내 유해 세균 억제 활성이 뛰어나기 때문에, 이를 이용하여 사료 첨가용 미생물 제제를 제조할 수 있다. 이에 본 발명의 균주의 최적 생장 온도 및 pH 조건을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 최적 생장 온도를 알아보기 위하여본 발명의 균주를 10℃ 내지 60℃의 조건으로 24시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 세포 배양액을 수득하고 600 nm의 흡광도에서 세포의 농도를 측정하여 균주의 생장 정도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 30℃ 내지 50℃에서 성장 정도가 우수하였으며 50℃에서 가장 활발한 생장을 보였다(도 5).

또한, 본 발명의 균주 생장의 최적 pH를 알아보기 위해 기본 배지인 루리아 브로쓰를 NaOH 또는 HCl을 이용하여 pH를 3, 5, 7 및 9로 조절한 후 여기에 본 발명의 균주를 접종하여 배양하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 pH 5 내지 pH9의 범위에서 성장하였고, pH 3에서는 성장을 하지 못하고 유지만 되는 수준이었다. 그러나, 세포가 죽지 않고 생존이 유지되기 때문에 장내에 도달하였을 때 활성을 보일수 있음을 알 수 있었다(도 6).

<실시예 5> 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 균주의 최적 생장 배지 분석

본 발명의 균주를 배양하기 위한 최적 생장 배지를 알아보기 위해 탄소원, 질소원 및 인산염을 달리한 배지에서 배양한 후 균주의 생장 정도 및 장내 유해 세균의 생육저지 효과를 분석하였다.

<5-1> 탄소원 이용능력 및 장내 유해세균 생육저지 효과

기본 배지인 루리아 브로쓰에 하기표 8에 기재된 바와 같이 탄소원의 종류를 달리하여 각각 1% 첨가하여 배양 배지를 제조하였다. 상기 배지에 본 발명의 균주를 접종하여 30℃에서 배양한 후 세포 배양액을 수득해 660 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 생장 정도를 측정하였다. 또한, 상기 배지 조성으로 아가 플레이트를 제조한 후 여기에 장내 유해 세균인 엔테로코커스를 도말하고 여기에 본 발명의 균주를 아가 홀 법에 의해 침지하여 투명환의 크기를 측정해 각 탄소원에 따른 장내 유해 세균에 대한 생육저지 효과를 분석하였다.

그 결과, 아라비노스, 프룩토스, 수크로즈, 라피노즈가 포함된 배지에서의 생장 정도가 높았고, 장내 유해 세균에 대한 생육을 저지하기 위해서는 수크로즈 및 락토즈를 가장 잘 이용하였다(표 8).

탄소원	흡광도(OD₆₆₀)	투명환(mm)
Arabinose	1.261	0
Fructose	1.264	0
Galartose	1.138	12
Ribose	0.261	0
Sorbitol	1.072	12
Mannitol	1.044	13
Sucrose	1.281	17
Raffinose	1.438	16
Trehalose	0.789	15
Dextrose	1.050	14
Xylose	1.130	12
Sodium acetate	0.117	0
Lactose	0.470	19
Soluble stach	1.151	16

<5-2> 질소원 이용능력 및 장내 유해세균 생육저지 효과

본 발명의 균주의 질소원 이용능력을 알아보기 위해 기본 배지인 루리아 브로쓰에 포함된 질소원인 트립톤, 효모 추출물을 제거시키고 상기 실시예 <5-1>에서 장내 유해 세균에 대한 생육 저지 효과가 뛰어남을 확인한 탄소원인 수크로즈와 락토즈를 1% 첨가한 후 하기표 9에 기재된 질소원을 각각 첨가하여 배양 배지를 제조하였다. 상기 배지에 본 발명의 균주를 접종하여 배양한 후 세포 배양액을 수득하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 질소원에 따른 최적 생장 정도를 분석하였다. 또한, 상기 배지 조성으로 아가 플레이트를 제조한 후 장내 유해 세균인 엔테로코커스를 도말하고 여기에 본 발명의 균주를 아가 홀 법에 의해 침지시켜 투명환의 크기를 측정하여 각 질소원에 따른 장내 유해 세균의 생육저지 효과를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 트립톤, 소고기 추출물, 시스테인 및 효모 추출물을 질소원으로 포함하는 배지에서 생장 정도가 높았고, 장내 유해 세균의 생육 저지를 위해서는 트립톤 및 효모 추출물을 가장 잘 이용하였다(표 9).

질소원	흡광도(OD₆₆₀)	투명환(mm)
Arginine	0.027	0
Tryptone	1.110	24
Beef extract	1.238	21
Lysin	0.060	0
Malt extract	0.271	15
Polypeptone	0.277	14
KNO₃	0.067	0
Cystein	0.919	0
NaNO₂	0.044	0
(NH₄)₂SO₄	0.033	0
(NH₄)Cl	0.049	0
NH₄NO₃	0.039	0
Soy bean meal	0.416	12
Yeast extract	0.920	27

<5-3> 인산염 이용능력 및 장내 유해세균 생육저지 효과

본 발명의 균주의 인산염 이용능력을 알아보기 위해 기본 배지인 루리아 브로쓰에 상기 실시예 <5-1> 및 <5-2>에서 확인한 최적의 탄소원인 수크로즈와 락토즈, 질소원인 트립톤, 효모 추출물을 각각 1%씩 첨가한 후 하기표 10에 기재된 인산염을 각각 0.2%씩 첨가하여 배지를 제조하였다. 상기 배지에 본 발명의 균주를 접종하여 배양한 후 세포 배양액을 수득하여 660 nm에서 흡광도를 측정하여 인산염에 따른 최적 생장 정도를 분석하였다. 또한, 상기 배지 조성으로 아가 플레이트를 제조한 후 장내 유해 세균인 엔테로코커스를 도말한 후 여기에 본 발명의 균주를 아가 홀 법에 의해 침지시켜 투명환의 크기를 측정하여 각 인산염에 따른 장내 유해 세균의 생육저지 효과를 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 균주는 NaH₂PO₄ㆍ2H₂O, Na₃PO₄ㆍ12H₂O 및 K₂HPO₄가 포함된 배지에서 생장 정도가 좋았으며, K₂HPO₄가 포함된 배지에서의 엔테로코커스 생육저지 효과가 가장 뛰어나 본 발명의 균주는 인산염으로 K₂HPO₄를 가장 잘 이용함을 알 수 있었다(표 10).

인산염	흡광도(600nm)	투명환(mm)
NH₂PO₄	0.5580	5
(NH₄)₃PO₄·3H₂O	0.7520	9
(NH₄)₂HPO₄	0.5150	7
NaH₂PO₄·2H₂O	1.2150	15
Na₃PO₄·12H₂O	1.6250	16
K₂HPO₄	1.7060	19
KH₂PO₄	0.5460	9
NH₄H₂PO₄	0.6250	6

상기 결과를 통해 본 발명의 균주는 30 내지 50℃에서 잘 자라고 50℃에서 가장 최적으로 생장하며, pH5 내지 pH9에서 생장하고 pH7에서 최적으로 생장하며 pH 3에서도 생장이 유지되기 때문에 내산성이 있음을 알 수 있다. 또한 100℃까지의 온도에도 열에 의한 변성이 일어나지 않으면서 장내유해 세균 억제 활성을 유지함을 확인하여 열내성이 뛰어난 균주임을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 균주는 탄소원으로 수크로즈 및 락토즈, 질소원으로는 트립톤 및 효모 추출물 그리고 인산염으로는 K₂HPO₄를 가장 잘 이용하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 미생물 또는 이의 배양액은 장내유해 세균 억제 활성이 뛰어나며 열에 대한 내성도 뛰어나 사료 첨가제의 제조에 용이하게 사용될 수 있다.

Claims

시트레이트(citrate) 및 나이트레이트(nitrate)를 이용하고, 장내 유해 세균 억제 활성 및 내열성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스.
제 1항에 있어서, 시트레이트 및 나이트레이트를 이용하고, 장내 유해 세균 억제 활성 및 내열성을 갖는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 KBC1121(수탁번호:KCTC 10411BP).
제 1항의 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는 사료 첨가제.
제 3항에 있어서, 상기 사료 첨가제는 가축의 장내 유해 세균인 엔테로코커스, 시겔라, 스타필로코커스 아우시어스, 세라티아, 크렙시엘라, 살모넬라 및 모가넬라 모가니로 구성된 군으로부터 선택되는 장내 유해 세균을 억제하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.